JPH05215716A - キャピラリ電気泳動装置およびその方法 - Google Patents

キャピラリ電気泳動装置およびその方法

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JPH05215716A JP4186380A JP18638092A JPH05215716A JP H05215716 A JPH05215716 A JP H05215716A JP 4186380 A JP4186380 A JP 4186380A JP 18638092 A JP18638092 A JP 18638092A JP H05215716 A JPH05215716 A JP H05215716A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】タンパク質溶質とキャピラリ内壁との相互作用
を抑制して、高分解能でタンパク質の分離を可能にする
キャピラリ・ゾーン電気泳動装置及び方法。 【構成】本発明では、キャピラリ表面の電荷ゼロ点を所
望のpHになるように調整する両性コーティングでキャ
ピラリの内側表面を処理する。これにより、所望のpH
でキャピラリ・ゾーン電気泳動に用いることができ、外
部電場の印加によって電気浸透流の大きさと方向を制御
することが可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、一般に、タンパク質の
分離に関し、より詳細には外部電場の印加によって電気
浸透流が制御される所望のpHにおけるタンパク質のキ
ャピラリ・ゾーン電気泳動に関するものである。
【0002】
【従来技術とその問題点】微細のキャピラリ(75μm
またはそれ以下)内のキャピラリ・ゾーン電気泳動(C
ZE)は最初にヨルゲンソンとルーカクスによって説明
され、少量の溶質を分離するための効果的な方法として
有用なことが実証された(1981年発行のJ.Chr
omatog.218,209ページ及び1981年発
行のAnal.Chem.,53,1298ページ)。
分離プロセスは接線方向に印加された電場の影響の下で
の固体表面と接触する液体の流れとして一般に表わされ
る電気浸透効果に基づくものである。キャピラリ・ゾー
ン電気泳動による電気泳動分離のための魅力的な要因と
して、試料の大きさが小さくないこと、試料の前処理が
ほとんどまたは全くないこと、そして生物学的活性試料
定量および再現が可能であることが挙げられる。
【0003】キャピラリ・ゾーン電気泳動のただ一つの
最大の欠点はタンパク質などの巨大分子を分離しようと
するときにある。CZEによる巨大分子の分離はバイオ
ポリマーとシリカ・キャピラリの壁との好ましくない相
互作用をもたらす。
【0004】タンパク質のCZE分離に付随する問題に
対する一つの解決策として米国特許第4,931,32
8号に報告されており、ここでは界面層がキャピラリ管
の内壁に共有結合される改良された毛細管が述べられて
いる。界面層は内壁とタンパク質溶質との相互作用を減
少させるのに効果的であり、水和可能な両性相を含んで
いる。この両性相は確定できる等電点を有し、溶液のp
Hを選択することによって電気浸透流を制御することが
できる。
【0005】1990年発行のAnal.Chem.,
62,1550〜1552ページに、CZE技術につい
て報告しており、ここでは外部電場を利用して水溶液/
キャピラリ管内面におけるゼータ電位を変化させること
によって未処理のフェーズド・シリカ・キャピラリ電気
浸透が制御されている。
【0006】
【発明の目的】本発明の目的はタンパク質が生物学的に
活性な状態を保ったままタンパク質を分離するためのキ
ャピラリ・ゾーン電気泳動法および装置を提供すること
にある。本発明の他の目的は、キャピラリ内面の電荷ゼ
ロ点またはその近くでタンパク質が分離され、そしてキ
ャピラリ壁を横切る外部電場を調整することによって電
気浸透流が制御されるキャピラリ・ゾーン電気泳動法お
よび装置を提供することにある。本発明のその他の目的
および利点は本願明細書を詳細に検討することによって
当業者には自明である。
【0007】
【発明の概要】本発明の一実施例においては、相互作用
相がアミノ基を含む改善された内面を有するキャピラリ
管が調整される。このようなアミノ相カラムはあらかじ
め定められた電荷ゼロ点が設けられる。これらのカラム
は、電気浸透流の大きさと方向が外部から印加された電
場によって制御されると同時に、pHがあらかじめ定め
られたPZCまたはその付近になるように調節されるC
ZEにおいて用いられる。
【0008】
【発明の実施例】ゼロ電荷点(PZC)は一般に表面の
正味電荷がゼロになるpHとして定義される。米国特許
第4,931,328号に記載されているように、キャ
ピラリ管は界面層がキャピラリ管の内壁に共有結合され
るように改善することができる。内壁とタンパク質との
相互作用を最小化するのを助ける界面層は、水和可能な
両性相を含む。両性相は確定できる等電点を有する。し
たがって、両性相は特異なPZC特性を有する多様な表
面を提供することができる。
【0009】1990年の発行のAnal.Che
m.,62,1550〜1552ページには分離キャピ
ラリの外側から印加された付加電場を利用することによ
ってキャピラリ電気泳動における電気浸透流の直接的な
制御が述べられている。この技術は外部から印加された
電位をキャピラリの内部の緩衝溶液を横切る電位とベク
トル的に組合せる。キャピラリ壁を横切るこの電位勾配
はキャピラリ壁の内面へのゼータ電位の極性および大き
さを制御するものと考えられる。電気浸透の方向と流速
はゼータ電位の極性および大きさに依存している。溶液
条件がpHが5で、1mMリン酸塩緩衝液で、未処理の
フューズド・シリカ・キャピラリ電気泳動の電気浸透は
単に外部電位を変化させることによって直接制御され
る。
【0010】本発明はキャピラリ表面のPZCを任意の
所望のpHになるように調節するため、キャピラリ管の
内表面に被覆された(coated)界面層を用いるこ
とに部分的に基づくものである。この層はキャピラリ・
ボアに化学的に結合させるか、あるいは高度に物理的に
吸着させることができ、この層はキャピラリ分離条件の
下で安定である。界面層は塩基性あるいは酸性の平衡状
態を有する水和可能な両性相またはイオン化可能な種を
含むことができる。改良されたキャピラリ管は、電気浸
透流(EOF)の大きさと方向が外部から印加される電
場によって制御されると同時にpHが改良された表面の
あらかじめ定められたPZCまたはこれの付近になるよ
うに調節されるCZEにおいて利用することができる。
【0011】タンパク質に立体配座(及び機能)はpH
に非常に敏感なので、本発明はタンパク質の分離に特に
適している。タンパク質の分離には分離が行なわれる特
定のpHを選択することが望ましい。加えて、分離され
る成分の分解能を最適にするための制御が必要である。
【0012】
【実施例】相互作用相がアミノ基を含む改良された内表
面を有するキャピラリ管(ここではアミノ相カラムと呼
ばれ、本発明のイオン化可能な種の実施例を示す)は、
それぞれ米国特許第4,931,328号および第5,
006,313号に記載されており、2−アミノプロピ
ルトリエトキシシランの0.5%溶液(pH4.5)を
15分間キャピラリ管にポンピングさせた後、硬化させ
て調製した。アミノ相カラムは図1に示されるように、
システムの内側キャピラリとして使用した。
【0013】図1を参照すると、内径50μm、外径1
50μmで長さが25cmのキャピラリ205を内径2
00μm、外径350μmで長さが22cmのより大き
いキャピラリ206中に設置した。内側(試料)キャピ
ラリを貯蔵器201および204に結合し、大きい方の
(外側の)キャピラリを貯蔵器202および203に結
合した。貯蔵器と外側キャピラリに緩衝液を充満した。
双極性高電圧源207がライン208と電極209を介
して貯蔵器201中の緩衝液と接続させた。活性化され
ると、電源207は貯蔵器201と204の間の内側キ
ャピラリ管の内部に電場を生成させる。同様に、双極性
高電圧源210がライン211と電極212を介して貯
蔵器202と接続した。貯蔵器203中の緩衝液はライ
ン216と電極217を介して選択可能な抵抗はしご
(registor ladder)215と接続し、
次にはしごをライン214を経て双極高電圧源213と
接続させる。貯蔵器204を接地した。
【0014】例えば、貯蔵器201を+10kVに、貯
蔵器204を0Vに設定すると、10kVの軸方向の電
場を得ることができる。内側(試料)キャピラリ中に軸
方向内部電場を得た後、貯蔵器202と203の間に電
圧勾配を設けることによって二つの同軸キャピラリにお
けるキャピラリの間隙を横切る均一な放射方向の電場が
形成される。外部電場は正または負のどちらにもなりう
る。例えば、貯蔵器202および203における電位が
それぞれ+15kVおよび+5kVであるならば、軸方
向で正の放射方向の均一な外部電場が得られる。これ
は、キャピラリの間隙を横切る+5kVの放射方向の電
場を確立する。他方では、貯蔵器202および203に
おける電位がそれぞれ+5kVおよび−5kVになるよ
うに極性が変化されると、−5kVの負で放射方向の均
一な外部電場が形成される。
【0015】図2はpH3.0(50mMクエン酸塩)
において印加された外部電位勾配に対して電気浸透移動
度の絶対値をプロットしたグラフである。正の外部電場
はEOFを増加させ、すなわちアノード・フローの速度
が大きくなることが明らかである。負の外部電場を印加
すると、EOFが遅くなるが、逆にはしなかった。
【0016】pH4.0において前述の実験が繰返さ
れ、アミノ相カラムのゼロ電荷点から、実験的にゼロ電
荷点は4.5であると計算された。図3は印加された外
部電位勾配に対して電気浸透移動度をプロットしたグラ
フである。これより、+8kVの電位においては一般に
EOF(電気浸透流)が増加するが、−8kVのオフセ
ットは流れの方向を逆にすることが分る。
【0017】図4はアミノ相カラムを使用してpHに対
して電気泳動移動度をプロットしたグラフである。図5
はpHを4.0に固定した(10mMのクエン酸塩緩衝
液)ときの外部電場に対する電気泳動移動度をプロット
したグラフである。図6は界面活性剤を添加してpHを
4.0に固定した(10mM OAC緩衝液、CHAP
SO)ときの印加された電場に対する電気泳動移動度を
プロットしたグラフである。
【0018】図7aについて言えば、50μmのアミノ
相カラムが使用されて細菌ロドプシンと細菌オプシンと
の混合物がpH4.0において外部制御なしに、すなわ
ち外部電場を印加しないで分離された(検出器へ93m
m、λ210、10mM、OAC、18.0mM、CH
APSO、20V/cm)。図7bは+10kVの勾配
を適用した以外は同じ条件の下での同じタンパク質混合
物の分離を示している。0.11mm/秒(図7a)か
ら0.25mm/秒(図7b)への電気浸透流の増加は
EOSの増加に比例して溶離時間を短縮することができ
る。本発明は好適な実施例に関連させて詳述したが、本
願発明はこれら説明および実施例に限定されるものでは
ないことは明らかである。
【0019】
【発明の効果】以上説明したように、本願発明により、
より効果的にタンパク質を分離することが可能なキャピ
ラリ電気泳動を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明に用いられるキャピラリ・ゾーン電気泳
動装置の概略図。
【図2】本発明で得られるpH3.0における電気浸透
移動度と印加される外部電場勾配の関係を示す図。
【図3】本発明で得られるpH4.0における電気浸透
移動度と印加される外部電場勾配の関係を示す図。
【図4】本発明で得られるpHと電気浸透移動度の関係
を示す図。
【図5】本発明で得られるpH4.0における電気泳動
移動度と印加される外部電場勾配の関係を示す図。
【図6】本発明で得られる界面活性剤を添加し、pH
4.0における電気泳動移動度と印加される外部電場勾
配の関係を示す図。
【図7a】外部制御なしでおこなったタンパク質混合物
の分離結果を示す図。
【図7b】外部電場を印加しておこなったタンパク質混
合物の分離結果を示す図。
【符号の説明】
201、202、203、204:貯蔵器 205、206:キャピラリ 207、210、213:電圧源 209、212、217:電極 215:抵抗はしご

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】外側キャピラリ壁を画定するキャピラリ管
    と、 内側キャピラリ壁にはとタンパク質溶質との相互作用を
    減少させる化学的に結合または物理的に吸着された界面
    層が設けられ、 ボア軸に沿って内部電場を印加する手段と、 前記外側壁と内側壁にわたって外部電場を印加させる手
    段とから成るキャピラリ電気泳動装置。
  2. 【請求項2】請求項1のキャピラリ電気泳動装置におい
    て、前記界面層はタンパク質、ペプチトまたは両性物質
    から成る水和可能な両性層を含むことを特徴とするキャ
    ピラリ電気泳動装置。
  3. 【請求項3】請求項1のキャピラリ電気泳動装置におい
    て、前記界面層は酸性または塩基の平衡状態を有するイ
    オン化可能な種を含むことを特徴とするキャピラリ電気
    泳動装置。
  4. 【請求項4】次の(イ)から(ハ)より成る所望のpH
    の溶液で、タンパク質の分離に有益なキャピラリ電気泳
    動方法。 (イ)キャピラリ管の一方の端部を緩衡液貯蔵器に配置
    させ、前記キャピラリ管は外側キャピラリ壁と内側キャ
    ピラリ壁とボアを画定し、前記内側キャピラリ壁の表面
    は、内側壁とタンパク質溶質の相互作用を減少させる界
    面層が化学的に結合または物理的に吸着されており、
    (ロ)前記キャピラリ・ボアに沿った2つの点の間に内
    部電場を確立させ、(ハ)外側壁と内側壁にわたって外
    部電場を印加させる。
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