JPH05184359A - Anti-superoxide dismutase monoclonal antibody and hybridoma producing the antibody - Google Patents
Anti-superoxide dismutase monoclonal antibody and hybridoma producing the antibodyInfo
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- JPH05184359A JPH05184359A JP4068215A JP6821592A JPH05184359A JP H05184359 A JPH05184359 A JP H05184359A JP 4068215 A JP4068215 A JP 4068215A JP 6821592 A JP6821592 A JP 6821592A JP H05184359 A JPH05184359 A JP H05184359A
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Abstract
Description
【0001】この発明はハイブリドーマにより産生され
る新規なモノクローナル抗体に関する。さらに詳しく
は、この発明は、ハイブリドーマにより産生される新規
な抗スーパーオキシドジスムターゼ抗体および該抗体を
産生するハイブリドーマに関する。以下スーパーオキシ
ドジスムターゼをSODと、また抗スーパーオキシドジ
スムターゼ抗体を抗SOD抗体、抗スーパーオキシドジ
スムターゼモノクローナル抗体を抗SODモノクローナ
ル抗体と記す。This invention relates to a novel monoclonal antibody produced by a hybridoma. More specifically, the present invention relates to a novel anti-superoxide dismutase antibody produced by a hybridoma and a hybridoma producing the antibody. Hereinafter, superoxide dismutase will be referred to as SOD, anti-superoxide dismutase antibody will be referred to as anti-SOD antibody, and anti-superoxide dismutase monoclonal antibody will be referred to as anti-SOD monoclonal antibody.
【0002】この発明の抗SODモノクローナル抗体
は、哺乳動物由来のSODにより免疫された哺乳動物か
ら採取した脾細胞と哺乳動物のミエローマ(骨髄腫)細
胞とを融合させて生ぜしめたハイブリドーマの細胞培養
によって調製できる。脾細胞とミエローマ細胞との融合
は、融合促進剤(例えばポリエチレングリコール)の存
在下に両者を接触させることにより達成させる。小割合
の脾細胞とミエローマ細胞とが融合されてハイブリドー
マを生成する。さらに、このようにして得たハイブリド
ーマは、融合された種々の脾細胞のそれぞれに応じて種
々の抗体を産生する。しかし、このようにして得たハイ
ブリドーマから所望の抗体を産生するハイブリドーマを
クローニングにより単離することが可能である。The anti-SOD monoclonal antibody of the present invention is a cell culture of a hybridoma produced by fusing spleen cells collected from a mammal immunized with a mammal-derived SOD and mammalian myeloma (myeloma) cells. Can be prepared by Fusion of splenocytes and myeloma cells is achieved by bringing them into contact with each other in the presence of a fusion promoter (eg, polyethylene glycol). A small proportion of splenocytes and myeloma cells are fused to produce hybridomas. Furthermore, the hybridomas thus obtained produce different antibodies depending on each of the different fused splenocytes. However, it is possible to isolate a hybridoma producing a desired antibody from the thus obtained hybridoma by cloning.
【0003】このようにして単離したハイブリドーマ
は、栄養培地中でまたは哺乳動物の腹腔内で増殖させる
ことができ、産生した抗体は培養上清またはその哺乳動
物の腹水または血清より天然または人工的な蛋白源から
蛋白を単離または精製するのに一般的に用いられる常法
で精製することができる。そのような方法としては、遠
心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、DEAE
セルロースを用いるカラムクロマトグラフィ、ゲル[例
えばセファロース4B、セファデックス等(ファルマシ
ア・ファイン・ケミカルズ社製)]を用いるゲル濾過、
イムノグロブリン結合ポリサッカライドを用いるアフィ
ニティカラムクロマトグラフィ、凍結乾燥等のような単
離および精製の方法が挙げられる。The hybridoma thus isolated can be grown in a nutrient medium or in the abdominal cavity of a mammal, and the produced antibody is natural or artificial from the culture supernatant or the ascites or serum of the mammal. Proteins can be purified by standard methods commonly used to isolate or purify proteins from various protein sources. Such methods include centrifugation, dialysis, salting out with ammonium sulfate, DEAE.
Column chromatography using cellulose, gel filtration using gel [eg Sepharose 4B, Sephadex, etc. (Pharmacia Fine Chemicals)],
Examples include isolation and purification methods such as affinity column chromatography using immunoglobulin-bound polysaccharide, lyophilization and the like.
【0004】この方法の利点は、免疫に用いられるSO
Dに対する他の抗原決定基の中のどれかと反応する抗体
によって、または用いられるSOD調製液中に含まれる
抗原性不純物によって汚染されていない特異的抗SOD
抗体の供給源を提供することである。この方法のもう一
つの利点は、大量の所望抗SOD抗体が容易に提供され
ることである。このようにして得たこの発明の抗SOD
モノクローナル抗体は、SODに対する結合能を有し、
SODの免疫吸着精製において免疫吸着剤として用いる
ことができる。さらに詳しくは、この発明の抗SODモ
ノクローナル抗体は、常法により活性ポリサッカライド
[例えばブロムシアン活性化セファロース4B(ファル
マシア・ファイン・ケミカルズ社製)]と反応させるこ
とによりポリサッカライドと結合させることができる。
さらに、抗SODモノクローナル抗体はSODのエンザ
イム・リンクト・イムノソーベント・アッセイ(酵素免
疫測定法)の試薬としても有用である。以下、この発明
の方法を実験の詳細をもって説明するが、それらは例示
のためのものであって、限定のためのものではない。The advantage of this method is that SO used for immunization
Specific anti-SOD uncontaminated by an antibody that reacts with any of the other antigenic determinants to D or by the antigenic impurities contained in the SOD preparation used
To provide a source of antibodies. Another advantage of this method is that large quantities of the desired anti-SOD antibody are readily provided. The anti-SOD of the present invention thus obtained
The monoclonal antibody has the ability to bind to SOD,
It can be used as an immunoadsorbent in the immunoadsorption purification of SOD. More specifically, the anti-SOD monoclonal antibody of the present invention can be bound to a polysaccharide by reacting with an active polysaccharide [eg, bromocyan-activated Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals)] by a conventional method.
Furthermore, the anti-SOD monoclonal antibody is also useful as a reagent for the enzyme linked immunosorbent assay (enzyme immunoassay) of SOD. The method of the present invention will now be described with experimental details, which are intended to be illustrative and not limiting.
【0005】実施例1 抗Cu,Zn−スーパーオキシドジスムターゼモノクロ
ーナル抗体(以下抗Cu,Zn−SODモノクローナル
抗体と記す)の調製 (I)免疫脾細胞の調製 Cu,Zn−スーパーオキシドジスムターゼ(以下抗C
u,Zn−SODという)(シグマ社製、ロット101
F−9325)をヒト赤血球より調製して、これを燐酸
緩衝食塩水(以下PBSという)に1mg/mlの濃度
になるよう溶かした。このCu,Zn−SOD溶液10
0μlをジフテリア・破傷風トキソイド・百日咳ワクチ
ン合剤(大阪大学微生物研究所製、1ml中百日咳菌2
×1010を含有)100μgと共に腹腔内注射によりB
ALB/cマウスの雌に投与した。28日後、さらにC
u,Zn−SOD溶液100μlを静脈内投与した。第
2回目の投与4日後にマウスを屠殺し、脾臓を採取し、
細胞融合に用いた。この目的のためにマウス4匹を用い
た。Example 1 Preparation of anti-Cu, Zn-superoxide dismutase monoclonal antibody (hereinafter referred to as anti-Cu, Zn-SOD monoclonal antibody) (I) Preparation of immune splenocytes Cu, Zn-superoxide dismutase (hereinafter anti-C)
u, Zn-SOD) (manufactured by Sigma, lot 101)
F-9325) was prepared from human red blood cells and dissolved in phosphate buffered saline (hereinafter referred to as PBS) to a concentration of 1 mg / ml. This Cu, Zn-SOD solution 10
0 μl of diphtheria / tetanus toxoid / pertussis vaccine mixture (manufactured by Osaka University Institute for Microbiology, 1 ml pertussis 2
X 10 10 containing) B by intraperitoneal injection with 100 μg
It was administered to female ALB / c mice. 28 days later, C
100 μl of u, Zn-SOD solution was intravenously administered. Four days after the second administration, the mice were sacrificed, their spleens were collected,
Used for cell fusion. Four mice were used for this purpose.
【0006】(II)ハイブリドーマの調製 上記で免疫した脾細胞をケーラーとミルスタインの方法
[ネイチャー、256巻、495−497頁(1975
年)]によりマウスミエローマ細胞P3×63Ag8U
lと融合した。すなわち、脾細胞をダルベッコ氏改変イ
ーグル氏・ミニマム・エッセンシャル・メディウム(最
小必須培地、以下D−MEMという)に浮遊させた。浮
遊液中の赤血球を0.83%塩化アンモニウム溶液(9
容量)と0.17Mトリスアミノメタン−塩酸緩衝液
(pH7.65、1容量)との混液で4℃で5分間処理
して破壊し、遠心分離により除去した。15%ウシ胎仔
血清加D−MEM中で培養したマウスミエローマ細胞と
脾細胞とをそれぞれ3回ずつD−MEMで洗浄した。(II) Preparation of hybridoma The spleen cells immunized as described above are subjected to the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495-497 (1975).
Year)] by mouse myeloma cells P3 × 63Ag8U
fused with l. That is, splenocytes were suspended in Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium (minimum essential medium, hereinafter referred to as D-MEM). The red blood cells in the suspension were mixed with 0.83% ammonium chloride solution (9
Volume) and 0.17 M trisaminomethane-hydrochloric acid buffer solution (pH 7.65, 1 volume) for 5 minutes at 4 ° C. to destroy and to remove by centrifugation. Mouse myeloma cells and splenocytes cultured in D-MEM supplemented with 15% fetal bovine serum were washed with D-MEM three times each.
【0007】マウスミエローマ細胞(6×107 個)の
浮遊液に脾細胞(3×108 個)の浮遊液を加えた。混
液を50mlのプラスチックチューブ(コーニング・グ
ラス・ワークス社製50mlコーニング遠心管)中でよ
く混合した。培地を遠心分離により除去した。細胞を水
浴中で37℃に加温した。この細胞に、振り混ぜなが
ら、45%ポリエチレングリコール(シグマ社製、平均
分子量4,000)溶液(1ml)を1分間かけて徐々
に加え、混合物を37℃で7分間放置した。反応混合物
に37℃で5分間かけてD−MEM15mlを滴加し
て、細胞融合反応を停止させた。大量のD−MEMを加
えた後、混合物を遠心分離して上清を除去した。残査に
15%ウシ胎仔血清(セントーラス社製、ロット75
7)、グルタミン2mM、2−メルカプトエタノール2
×10-5M、硫酸ストレプトマイシン100μg/m
l、ペニシリンG100U/ml、硫酸ゲンタマイシン
80μg/mlおよびファンギゾン0.25μg/ml
を補ったD−MEMになる完全培地(以下CMという)
を加えた。混合物を少し混ぜた後、生じた融合細胞浮遊
液を24ウエルのプレート(ヌンク社製)8枚に脾細胞
が1ウエル当り1×106 個になるよう各ウエル1ml
ずつ分注した。5%炭酸ガス気中37℃で培養した。1
日後、アミノプテリン(4×10-7M)、チミジン
(1.6×10-5M)およびヒポキサンチン(1×10
-4M)を含有するCM(HAT培地)1mlを各ウエル
に添加した。さらに1日後、各ウエルから半量の培地を
吸引除去し、各ウエルに2日または3日毎に8日間HA
T培地を添加し培地交換した。つぎに、各ウエルの培地
の半量をヒポキサンチン(1×10-4M)とチミジン
(1.6×10 -5M)とを含有するCM(HAT培地)
と交換した。さらに2日後、各ウエルの半量の培地をC
Mと交換した。細胞融合13日後にハイブリッド細胞の
増殖がほぼ全ウエルで認められた。Mouse myeloma cells (6 × 107Pieces)
Splenocytes (3 x 108Individual) suspension. Mixed
Use a 50 ml plastic tube (Corning
In a Las Works 50 ml Corning centrifuge tube)
Mixed well. The medium was removed by centrifugation. Water cells
Warmed to 37 ° C in bath. Shake this cell
45% polyethylene glycol (manufactured by Sigma, average
Gradually add 4,000) solution (1 ml) over 1 minute
In addition, the mixture was left at 37 ° C. for 7 minutes. Reaction mixture
15 ml of D-MEM was added dropwise to the mixture at 37 ° C for 5 minutes.
To stop the cell fusion reaction. Add a large amount of D-MEM
After that, the mixture was centrifuged to remove the supernatant. To the remnant
15% fetal bovine serum (Centour, Lot 75)
7), glutamine 2 mM, 2-mercaptoethanol 2
× 10-FiveM, streptomycin sulfate 100 μg / m
1, penicillin G100U / ml, gentamicin sulfate
80 μg / ml and Fungizone 0.25 μg / ml
Complete medium that becomes D-MEM supplemented with (hereinafter referred to as CM)
Was added. After mixing the mixture a little, the resulting fused cell suspension
Spleen cells into 8 24-well plates (Nunc)
1 x 10 per well61 ml for each well
We dispensed each. The cells were cultured at 37 ° C in a 5% carbon dioxide gas atmosphere. 1
A day later, aminopterin (4 × 10-7M), thymidine
(1.6 x 10-FiveM) and hypoxanthine (1 x 10
-Four1 ml of CM (HAT medium) containing M) in each well
Was added to. After another day, add half of the medium from each well.
Remove by suction and HA in each well every 2 or 3 days for 8 days
T medium was added and the medium was exchanged. Next, the medium of each well
Half the amount of hypoxanthine (1 x 10-FourM) and thymidine
(1.6 x 10 -FiveCM containing (M) and (HAT medium)
I replaced it with. After 2 more days, add half of the medium in each well to C
Exchanged for M. 13 days after cell fusion
Proliferation was observed in almost all wells.
【0008】 (III)抗Cu,Zn−SOD抗体のアッセイ 96ウエルのプレート(M−174、カップUリジッド
イミュロン、クック社製)の各ウエルにCu,Zn−S
OD(50μg/ml)の溶液100μlを添加し、ウ
エルがCu,Zn−SODで付着されるようにするため
プレートを37℃で3時間保った。つぎに、ウシ血清ア
ルブミン(10mg/ml)溶液を加えて、ウエルの未
付着部分を前記の蛋白により完全にブロックした。ブロ
ッキング溶液を除去した後、上記で得たハイブリドーマ
培養上清100μlを各ウエルに添加し、37℃で90
分間保った。PBSで3回洗浄した後、アフィニティカ
ラムクロマトグラフィで精製した 125I−標識ヤギ抗マ
ウスF(ab’)2 溶液(10,000cpm、比活性
5μCi/μgIgG)100μlを加え、4℃で一夜
保った。各ウエルの放射能をガンマーシンチレーション
カウンターで測定した。抗Cu,Zn−SOD活性は、
測定した173培養液中96培養液で検出された。(III) Assay of anti-Cu, Zn-SOD antibody Cu, Zn-S was added to each well of a 96-well plate (M-174, cup U rigid immulon, manufactured by Cook).
100 μl of a solution of OD (50 μg / ml) was added and the plate was kept at 37 ° C. for 3 hours to allow the wells to be attached with Cu, Zn—SOD. Then, a bovine serum albumin (10 mg / ml) solution was added to completely block the unattached portion of the wells with the above-mentioned protein. After removing the blocking solution, 100 μl of the hybridoma culture supernatant obtained above was added to each well and the mixture was incubated at 37 ° C. for 90 minutes.
Hold for a minute. After washing three times with PBS, 100 μl of 125 I-labeled goat anti-mouse F (ab ′) 2 solution (10,000 cpm, specific activity 5 μCi / μg IgG) purified by affinity column chromatography was added, and the mixture was kept at 4 ° C. overnight. The radioactivity in each well was measured with a gamma scintillation counter. Anti-Cu, Zn-SOD activity is
It was detected in 96 cultures in the measured 173 cultures.
【0009】(IV)抗Cu,Zn−SOD抗体産生ハ
イブリドーマのクローニング Cu,Zn−SODに対して高い結合能を示す10のハ
イブリドーマ培養液を、BALB/cマウスの胸腺細胞
をフィーダー層(5×106 細胞/ml)として用い、
96ウエル平底マイクロプレート(ヌンク社製)で限界
稀釈法によりクローニングした。(IV) Cloning of hybridoma producing anti-Cu, Zn-SOD antibody Ten hybridoma cultures showing high binding ability for Cu, Zn-SOD were fed to thymocytes of BALB / c mice in a feeder layer (5 x). 10 6 cells / ml),
Cloning was performed by a limiting dilution method in a 96-well flat bottom microplate (manufactured by Nunc).
【0010】 (V)抗Cu,Zn−SODモノクローナル抗体の精製 上記で得たハイブリドーマを、1週間前にテトラメチル
ペンタデカンを投与したBALB/cマウスの腹腔内に
移植した。1〜3週間後、マウスの腹腔より腹水を採取
し、その腹水から抗Cu,Zn−SOD抗体を50%飽
和硫酸アンモニウム溶液による沈降法により単離した。
すなわち、腹水からハイブリドーマ細胞を遠心分離によ
り除き、上清をかき混ぜながらこれに硫酸アンモニウム
をその最終濃度が50%飽和濃度となるまで徐々に加え
た。混合物を氷冷下30分間かき混ぜ、30分間静置し
た。遠心分離後、残渣を少量の10mMPBS(pH
8.0)に溶かし、10mMPBSに対して透析し、1
0mMPBS(pH8.0)で平衡化したDEAEセル
ロース(DE52、ワットマン・ケミカル・セパレーシ
ョン社製)カラムクロマトグラフィに付した。カラムを
通した溶液を集めCu,Zn−SOD精製プロセスの免
疫吸着剤として用いたが、その詳細は実施例2に述べ
る。(V) Purification of Anti-Cu, Zn-SOD Monoclonal Antibody The hybridoma obtained above was transplanted into the abdominal cavity of a BALB / c mouse to which tetramethylpentadecane was administered one week before. After 1 to 3 weeks, ascites was collected from the abdominal cavity of the mouse, and anti-Cu, Zn-SOD antibody was isolated from the ascites by a precipitation method using a 50% saturated ammonium sulfate solution.
That is, the hybridoma cells were removed from the ascites by centrifugation, and while stirring the supernatant, ammonium sulfate was gradually added thereto until the final concentration reached 50% saturation. The mixture was stirred under ice cooling for 30 minutes and allowed to stand for 30 minutes. After centrifugation, remove the residue with a small amount of 10 mM PBS (pH
8.0) and dialyzed against 10 mM PBS, 1
It was subjected to DEAE cellulose (DE52, Whatman Chemical Separation Co., Ltd.) column chromatography equilibrated with 0 mM PBS (pH 8.0). The solution passed through the column was collected and used as an immunosorbent in the Cu, Zn-SOD purification process, the details of which will be described in Example 2.
【0011】 (VI)抗体の免疫グロブリンクラスの同定 培養液上清(500ml)に等量の飽和硫酸アンモニウ
ムを加え、氷上で1時間放置した。遠心分離して得た沈
殿物を1/10量のPBS(50μl)に溶かした。こ
のようにして得た抗体の免疫グロブリンの同定をオクタ
ロニーの二重免疫拡散法により行った。ヤギポリクロー
ナル抗体(マイルズ社製)をモノクローナル抗体のサブ
クラスの同定に用いた。このようにして得た抗Cu,Z
n−SODモノクローナル抗体は以下の通りである。 (1) ハイブリドーマ1−9−2が産生した抗Cu,
Zn−SODモノクローナル抗体1−9−2: (a) サブクラス:IgG1 (2) ハイブリドーマ1−66−18が産生した抗C
u,Zn−SODモノクローナル抗体1−66−18: (a) サブクラス:IgG1 (3) ハイブリドーマ1−41−10が産生した抗C
u,Zn−SODモノクローナル抗体1−41−10: (a) サブクラス:IgG1 (VI) Identification of Antibody Immunoglobulin Class To the culture supernatant (500 ml), an equal amount of saturated ammonium sulfate was added, and the mixture was allowed to stand on ice for 1 hour. The precipitate obtained by centrifugation was dissolved in 1/10 amount of PBS (50 μl). The immunoglobulin of the antibody thus obtained was identified by the double immunodiffusion method of Octalony. Goat polyclonal antibody (Miles) was used to identify the subclass of monoclonal antibody. Anti-Cu, Z obtained in this way
The n-SOD monoclonal antibody is as follows. (1) Anti-Cu produced by hybridoma 1-9-2,
Zn-SOD monoclonal antibody 1-9-2: (a) Subclass: IgG 1 (2) Anti-C produced by hybridoma 1-66-18
u, Zn-SOD monoclonal antibody 1-66-18: (a) Subclass: IgG 1 (3) Anti-C produced by hybridoma 1-41-10
u, Zn-SOD monoclonal antibody 1-41-10: (a) Subclass: IgG 1
【0012】実施例2 抗Cu,Zn−SODモノクローナル抗体のCu,Zn
−SOD精製への応用 (1)抗Cu,Zn−SODモノクローナル抗体のブロ
ムシアン活性化セファロース4B(ファルマシア・ファ
イン・ケミカルズ社製)との結合 ブロムシアン活性化セファロース4B(1.3g)を1
mM塩酸で、ついで0.1M重炭酸ナトリウム(pH
8.0)と0.5M塩化ナトリウムとを含有するカップ
リング緩衝液で順次洗浄し、ブロムシアン活性化セファ
ロースのカップリング緩衝液(9ml)中懸濁液を調製
した。この溶液2mlに、実施例1で上記のカップリン
グ緩衝液に対して透析して調製した抗Cu,Zn−SO
Dモノクローナル抗体1−9−2、1−66−18およ
び1−41−10(蛋白5mg)のカップリング緩衝液
の溶液各1mlを加えた。生じた混液を4℃でカップリ
ングが完了するまで一夜振とうした。遠心分離後、これ
に0.2Mグリシン(pH8.0、2ml)を加え、抗
体結合セファロース4Bを室温で2.5時間振とうして
残った活性部位をブロックした。ブロック後、生ずる抗
体結合セファロース4Bを0.5M塩化ナトリウムと上
記のカップリング緩衝液とを含む0.1M酢酸緩衝液
(pH4.0)の溶液で続けて(2回)洗浄し、0.5
M塩化ナトリウムを含む25mM燐酸ナトリウム緩衝液
(pH7.4)で平衡した。このようにして得たブロム
シアン活性化セファロース4B結合抗Cu,Zn−SO
Dモノクローナル抗体(以下抗体結合セファロース、特
に各々カラム1−9−2、1−66−18または1−4
1−10という)をアフィニティカラムクロマトグラフ
ィ用のカラムの調製に用いた。Example 2 Cu, Zn of anti-Cu, Zn-SOD monoclonal antibody
-Application to SOD purification (1) Binding of anti-Cu, Zn-SOD monoclonal antibody to Bromocyan-activated Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals) 1 Bromocyan-activated Sepharose 4B (1.3 g)
mM hydrochloric acid, then 0.1M sodium bicarbonate (pH
8.0) and 0.5M sodium chloride in the coupling buffer, and the suspension was sequentially washed to prepare a suspension of bromocyan-activated sepharose in the coupling buffer (9 ml). Anti-Cu, Zn-SO prepared by dialyzing 2 ml of this solution against the above coupling buffer in Example 1.
Each 1 ml of a solution of a coupling buffer of D monoclonal antibodies 1-9-2, 1-66-18 and 1-41-10 (5 mg of protein) was added. The resulting mixture was shaken overnight at 4 ° C until the coupling was complete. After centrifugation, 0.2 M glycine (pH 8.0, 2 ml) was added thereto, and antibody-bound Sepharose 4B was shaken at room temperature for 2.5 hours to block the remaining active site. After blocking, the resulting antibody-bound Sepharose 4B is washed successively (twice) with a solution of 0.1 M acetate buffer (pH 4.0) containing 0.5 M sodium chloride and the above coupling buffer, 0.5
Equilibration was carried out with 25 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing M sodium chloride. The bromocyan-activated sepharose 4B-conjugated anti-Cu, Zn-SO thus obtained
D monoclonal antibody (hereinafter referred to as antibody-bound Sepharose, particularly column 1-9-2, 1-66-18 or 1-4, respectively)
1-10) was used to prepare the column for affinity column chromatography.
【0013】(II)Cu,Zn−SODの抗体結合セ
ファロース4Bを用いた吸着および溶出 抗体結合セファロース4B(0.6ml)を、0.5M
塩化ナトリウムを含む25mM燐酸ナトリウム緩衝液
(pH7.4)で平衡化したカラムに充てんする。C
u,Zn−SOD(シグマ社製、ロット52F−934
5、比活性:蛋白1mg当り2235チトクローム単位
あるいは13,000亜硫酸単位)(1,900亜硫酸
単位/148μg/0.2ml)をカラムにかけ、0.
5M塩化ナトリウム含有25mM燐酸緩衝液(pH7.
4)にて流速5ml/時で洗浄し、0.2Mグリシン塩
酸塩溶液(pH2.5)で溶出した。Cu,Zn−SO
Dをエルストナーら(アナリティカル・バイオケミスト
リー、第70巻、第616頁、1976年)にもとづく
改良亜硝酸塩法により測定した。この方法によると、5
0%阻害(1単位)を達成するために必要なCu,Zn
−SODの量はチトクローム法(マックコードら著、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第2
44巻、第6049頁、1969年)の1/6の量で十
分であった。すなわち、1チトクローム単位は6亜硝酸
単位に等しい。キサンチン−キサンチンオキシダーゼ系
をpH8.2で用いてスーパーオキシドラジカルを発生
させた。Cu,Zn−SOD活性は各カラムの素通り画
分には検出されなかったので、大部分のCu,Zn−S
ODはカラムに結合したと考えられた。溶出液を0.1
5M塩化ナトリウム含有25mM燐酸ナトリウム緩衝液
(pH7.4)に対して4℃で一夜透析した。(II) Adsorption and elution of Cu, Zn-SOD using antibody-bound Sepharose 4B Antibody-bound Sepharose 4B (0.6 ml) was added to 0.5M.
The column equilibrated with 25 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing sodium chloride is packed. C
u, Zn-SOD (manufactured by Sigma, lot 52F-934)
5. Specific activity: 2235 cytochrome units or 13,000 sulfite units per mg of protein (1,900 sulfite units / 148 μg / 0.2 ml) were applied to the column, and then 0.
25 mM phosphate buffer containing 5 M sodium chloride (pH 7.
The sample was washed with 4) at a flow rate of 5 ml / hour and eluted with a 0.2 M glycine hydrochloride solution (pH 2.5). Cu, Zn-SO
D was measured by a modified nitrite method based on Elstner et al. (Analytical Biochemistry, Vol. 70, p. 616, 1976). According to this method, 5
Cu, Zn required to achieve 0% inhibition (1 unit)
-The amount of SOD is the cytochrome method (McCord et al., Journal of Biological Chemistry, 2nd
Volume 1/6 of 44, 6049, 1969) was sufficient. That is, 1 cytochrome unit equals 6 nitrite units. The xanthine-xanthine oxidase system was used at pH 8.2 to generate superoxide radicals. Since no Cu, Zn-SOD activity was detected in the flow-through fraction of each column, most of Cu, Zn-S was detected.
The OD was considered bound to the column. Eluate 0.1
It was dialyzed overnight at 4 ° C. against 25 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing 5 M sodium chloride.
【表1】 [Table 1]
【0014】実施例3 抗体結合セファロース4Bを用いたヒト赤血球Cu,Z
n−SODの吸着と溶出 実施例2(I)で調製した抗体結合セファロース4B
(すなわちカラム1−9−2、カラム1−66−18、
カラム1−41−10)(0.6ml)の各カラムに、
土橋法により調製したヒト赤血球からのCu,Zn−S
OD抽出液(100亜硝酸単位/260μg蛋白/m
l、比活性:蛋白1mg当り280亜硝酸単位)をかけ
た。この場合、Cu,Zn−SODは完全にカラムに結
合した。溶出には0.2Mグリシン−塩酸緩衝液(pH
2.5)を用いた。活性ピークの比活性を測定した。Example 3 Human red blood cells Cu, Z using antibody-bound Sepharose 4B
Adsorption and elution of n-SOD Antibody-bound Sepharose 4B prepared in Example 2 (I)
(That is, columns 1-9-2, 1-66-18,
Column 1-41-10) (0.6 ml) in each column,
Cu, Zn-S from human erythrocytes prepared by the Tsuchihashi method
OD extract (100 nitrite unit / 260 μg protein / m
1, specific activity: 280 nitrite units per mg of protein). In this case, Cu, Zn-SOD was completely bound to the column. For elution, 0.2 M glycine-hydrochloric acid buffer (pH
2.5) was used. The specific activity of the activity peak was measured.
【表2】 [Table 2]
【0015】実施例4 抗体結合セファロース4Bを用いたヒト血清Cu,Zn
−SODの吸着および溶出 実施例2(I)で調製した抗体結合セファロース4B
(すなわちカラム1−9−2、カラム1−66−18、
カラム1−41−10)(0.5−0.6ml)の各カ
ラムに、市販のヒト血清、0.5M塩化ナトリウム含有
25mM燐酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)および市
販のヒトCu,Zn−SOD(シグマ社製、ロット52
F−9345、1mg/ml)(10:10:1)より
なる溶液をかけた。 総蛋白:185,000μg 総活性:2,650亜硝酸単位 比活性:蛋白1mg当り14亜硝酸単位 カラムを0.5M塩化ナトリウム含有25mM燐酸ナト
リウム緩衝液(pH7.4)溶液で、流速5ml/時
で、280nmの光学密度が0.05以下に達するまで
洗浄した。ついで、溶出速度10ml/時で、0.2M
グリシン塩酸塩(pH2.5)溶液で溶出した。溶出液
を同量のウシ血清アルブミン(200μg/ml)含有
10mM燐酸緩衝液(pH7.4)で希釈し、5mM燐
酸緩衝液に対して4℃で一夜透析した。Example 4 Human serum Cu, Zn using antibody-bound Sepharose 4B
-SOD adsorption and elution Antibody-bound Sepharose 4B prepared in Example 2 (I)
(That is, columns 1-9-2, 1-66-18,
Column 1-41-10) (0.5-0.6 ml) was applied to each column of commercially available human serum, 0.5 mM sodium chloride-containing 25 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), and commercially available human Cu, Zn-. SOD (manufactured by Sigma, lot 52
F-9345, 1 mg / ml) (10: 10: 1) was applied. Total protein: 185,000 μg Total activity: 2,650 Nitrite unit Specific activity: 14 Nitrite unit per mg of protein Column is a 25 mM sodium phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 0.5 M sodium chloride, flow rate 5 ml / hour Then, it was washed until the optical density at 280 nm reached 0.05 or less. Then, at an elution rate of 10 ml / hour, 0.2M
It was eluted with a glycine hydrochloride (pH 2.5) solution. The eluate was diluted with the same amount of 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing bovine serum albumin (200 μg / ml) and dialyzed against 5 mM phosphate buffer at 4 ° C. overnight.
【表3】 [Table 3]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // C12P 21/08 8214−4B (C12P 21/08 C12R 1:91) (72)発明者 大沢 重義 高槻市安岡寺町1−4−18─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 5 Identification number Office reference number FI technical display location // C12P 21/08 8214-4B (C12P 21/08 C12R 1:91) (72) Inventor Osawa Shigeyoshi 1-4-18 Anokaji-cho, Takatsuki-shi
Claims (2)
ローナル抗体。1. An anti-superoxide dismutase monoclonal antibody.
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ。2. A hybridoma that produces an anti-superoxide dismutase monoclonal antibody.
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GB8326508 | 1983-10-04 | ||
GB838326508A GB8326508D0 (en) | 1983-10-04 | 1983-10-04 | Monoclonal anti-superoxide dismutase antibody |
GB8330981 | 1983-11-21 | ||
GB838330981A GB8330981D0 (en) | 1983-11-21 | 1983-11-21 | Monoclonal antisuperoxide dismutase antibody |
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---|---|
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Family Applications (1)
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Country | Link |
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JP (1) | JPH05184359A (en) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57102195A (en) * | 1980-12-19 | 1982-06-25 | Toyo Jozo Co Ltd | Measuring method of superoxide dismutase |
-
1992
- 1992-03-26 JP JP4068215A patent/JPH05184359A/en active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57102195A (en) * | 1980-12-19 | 1982-06-25 | Toyo Jozo Co Ltd | Measuring method of superoxide dismutase |
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