JPH05168493A - Monoclonal antibody against pseudomonas aeruginosa elastase - Google Patents
Monoclonal antibody against pseudomonas aeruginosa elastaseInfo
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- JPH05168493A JPH05168493A JP3316498A JP31649891A JPH05168493A JP H05168493 A JPH05168493 A JP H05168493A JP 3316498 A JP3316498 A JP 3316498A JP 31649891 A JP31649891 A JP 31649891A JP H05168493 A JPH05168493 A JP H05168493A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は緑膿菌エラスターゼに特
異的に結合し、その毒性中和活性を有するモノクローナ
ル抗体、該モノクローナ抗体を産生するセルライン、及
び該モノクローナル抗体を含有する緑膿菌感染症の予防
・治療剤に関する。本発明のモノクローナル抗体は緑膿
菌エラスターゼの酵素活性部位に直接相互作用すること
により強い阻害活性を発揮し、その結合が金属プロテア
ーゼ阻害剤によりにより阻害されることを特徴としてい
る。また、本発明のモノクローナル抗体は、緑膿菌エラ
スターゼに特異的に結合するが、トキソイド化された緑
膿菌エラスターゼには結合しないことを特徴とする。該
モノクローナル抗体は、緑膿菌エラスターゼの毒性中和
活性を有するので、有効な緑膿菌感染治療剤を提供す
る。さらに、本モノクローナル抗体により、極微量の緑
膿菌エラスターゼの検出法及び定量法を提供し、緑膿菌
感染症診断薬やエラスターゼ定量用試薬として応用され
る。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a monoclonal antibody that specifically binds to Pseudomonas aeruginosa elastase and has its toxicity-neutralizing activity, a cell line producing the monoclonal antibody, and Pseudomonas aeruginosa containing the monoclonal antibody. A preventive / therapeutic agent for bacterial infections. The monoclonal antibody of the present invention is characterized by exhibiting a strong inhibitory activity by directly interacting with the enzyme active site of Pseudomonas aeruginosa elastase, and its binding is inhibited by a metalloprotease inhibitor. Further, the monoclonal antibody of the present invention is characterized in that it specifically binds to Pseudomonas aeruginosa elastase but does not bind to toxoidized Pseudomonas aeruginosa elastase. Since the monoclonal antibody has the activity of neutralizing the toxicity of Pseudomonas aeruginosa elastase, it provides an effective therapeutic agent for Pseudomonas aeruginosa infection. Furthermore, the present monoclonal antibody provides a method for detecting and quantifying a trace amount of Pseudomonas aeruginosa elastase, and is applied as a diagnostic agent for Pseudomonas aeruginosa infection and a reagent for quantifying elastase.
【0002】[0002]
【従来の技術】細菌感染症の治療において問題となる病
原菌は、抗生物質の開発とともに変化している。すなわ
ち、臨床上用いられる抗生物質の種類の変遷に伴い細菌
感染症を引き起こす細菌、いわゆる起炎菌が交代してき
た。従来、低病原性又は弱毒性と言われた細菌、なかで
も特に緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa) による感染症
例が増加し、緑膿菌は近年、主要な病原菌の一つとなっ
ている。緑膿菌感染症は、免疫抑制剤の投与を受け免疫
能の低下している患者、又は癌患者や熱傷患者および新
生児などの免疫不全もしくは免疫能の低下した患者にお
いて重篤な症状を引き起こし死に至らしめる場合が多い
いわゆる日和見感染として知られている。緑膿菌の病原
性因子としては、菌体成分である内毒素,緑膿菌から産
生される外毒素・外酵素が挙げられる。緑膿菌臨床分離
株の約90%が蛋白質分解酵素である緑膿菌エラスター
ゼを産生する。緑膿菌エラスターゼは緑膿菌感染部位に
おいて生体組織を破壊するのみならず、生体防御物質で
ある免疫グロブリンや補体などの血清成分をも分解し免
疫能の低下を引き起こす緑膿菌の重要な病原因子であ
る。細菌感染を予防・治療する方法として、まず第一に
あげられるのが、抗生物質および合成抗菌剤を用いた化
学療法である。現在まで、β−ラクタム系(ペニシリン
系,セファロスポリン系)アミノグルコシド系,マクロ
ライド系などに分類される幾多の抗生物質が開発され、
その多くにブドウ球菌を代表とするほとんどのグラム陽
性球菌や、大腸菌などのグラム陰性菌が感受性を示し、
著効な臨床効果を示してきた。しかしながら、今日まで
の多くの研究開発にもかかわらず、緑膿菌に感受性を示
す薬剤は依然少ないのが現状であり、しかも、耐性菌の
出現頻度の高いことがこの菌の感染症をいまだ克服する
に至っていない大きな要因となっている。また、抗生物
質は細菌の増殖を抑制するものの、感染症の症状を悪化
させる細菌の産生する病原性因子、即ち外毒素や外酵素
が有する毒性を中和する活性の無いことも抗生物質療法
の大きな限界のひとつとして挙げられる。BACKGROUND OF THE INVENTION Pathogenic bacteria which are problematic in the treatment of bacterial infections are changing with the development of antibiotics. That is, with the transition of the types of clinically used antibiotics, bacteria causing bacterial infections, so-called pathogenic bacteria, have changed. Conventionally, the number of cases of infection with low pathogenic or weakly virulent bacteria, especially Pseudomonas aeruginosa has increased, and Pseudomonas aeruginosa has become one of the major pathogenic bacteria in recent years. Pseudomonas aeruginosa infection causes serious symptoms and causes death in immunocompromised patients who have been treated with immunosuppressive drugs, or in immunodeficient or immunocompromised patients such as cancer patients, burn patients and newborns. It is known as so-called opportunistic infection, which often leads to. Examples of the virulence factor of Pseudomonas aeruginosa include endotoxin, which is a bacterial cell component, and exotoxin / exoenzyme produced from Pseudomonas aeruginosa. About 90% of P. aeruginosa clinical isolates produce the protease, Pseudomonas aeruginosa elastase. Pseudomonas aeruginosa elastase not only destroys biological tissues at the site of Pseudomonas aeruginosa infection, but also decomposes serum components such as immunoglobulins and complements which are bioprotective substances It is a pathogenic factor. Chemotherapy using antibiotics and synthetic antibacterial agents is the first method for preventing and treating bacterial infections. To date, various antibiotics classified into β-lactams (penicillins, cephalosporins) aminoglucosides, macrolides, etc. have been developed,
Most of them, most Gram-positive cocci represented by Staphylococcus and Gram-negative bacteria such as Escherichia coli show sensitivity,
It has shown remarkable clinical effects. However, despite a lot of research and development to date, there are still few drugs that are sensitive to Pseudomonas aeruginosa, and the high frequency of resistant bacteria still overcomes the infectious disease of this bacterium. It has become a major factor that has not yet reached. In addition, although antibiotics suppress the growth of bacteria, they do not have the activity of neutralizing the toxicity of pathogenic factors produced by bacteria that exacerbate the symptoms of infectious diseases, that is, exotoxins and enzymes. It is one of the major limitations.
【0003】ところで、緑膿菌エラスターゼを中和する
ことによる感染症の治療・症状の軽減を目的とした療法
として、エラスターゼ阻害剤療法が考えられる。緑膿菌
エラスターゼは亜鉛イオンが酵素活性に必須な成分であ
る亜鉛金属プロテアーゼであることが知られている( M
orihara et al, Agricultural and Biological Chemist
ry 39, 1123-1128 (1975))。金属プロテアーゼは微生
物、セイツイ動物に広く分布するプロテアーゼの一種で
ある。金属プロテアーゼグループに属する阻害剤として
は、2 価金属イオンのキレート剤であるエチレンジアミ
ン4 酢酸(EDTA),O-phenanthroline あるいは金属キレー
トの作用をもつ官能基とペプチド部分から成るホスホラ
ミドン( Suda et al,Journal of Antibiotics 26, 621-
623(1973))やHO−NHCO−CH(CH2-CH-(CH
3)2)−CO−Ala−Gly−NH2 (Hudgin et al, L
ife Sciences 29,2593-2601 (1981)) 等が知られてい
る。後者の金属プロテアーゼ阻害剤は、金属キレート部
分で亜鉛イオンに配位し、その近傍に存在する酵素活性
部位に阻害剤のペプチド部分が相互作用して酵素活性を
阻害する、いわゆる活性部位指向型の阻害剤である。Incidentally, an elastase inhibitor therapy is considered as a therapy for the purpose of treating infections and reducing symptoms by neutralizing Pseudomonas aeruginosa elastase. Pseudomonas aeruginosa elastase is known to be a zinc metalloprotease whose zinc ion is an essential component for enzymatic activity (M
orihara et al, Agricultural and Biological Chemist
ry 39, 1123-1128 (1975)). Metalloproteases are a type of protease widely distributed in microorganisms and animals. Inhibitors belonging to the metalloprotease group include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), which is a chelating agent for divalent metal ions, O-phenanthroline, and phosphoramidon (Suda et al, Journal, which is composed of a functional group having a metal chelating function and a peptide moiety. of Antibiotics 26, 621-
623 (1973)) and HO-NHCO-CH (CH2 - CH- (CH
3 ) 2 ) -CO-Ala-Gly-NH 2 (Hudgin et al, L
ife Sciences 29,2593-2601 (1981)) and the like are known. The latter metalloprotease inhibitor is a so-called active site-directed type in which the metal chelate moiety coordinates to a zinc ion, and the peptide portion of the inhibitor interacts with the enzyme active site existing in the vicinity thereof to inhibit the enzyme activity. It is an inhibitor.
【0004】しかしながらこれらの阻害剤は、ホニュウ
類における重要な生理活性ペプチドである エンケフェ
リンやエンドセリンを生成する酵素をはじめとする多く
の金属プロテアーゼに属する多くのプロテアーゼに対し
ても阻害活性を示し、毒性・副作用を示すことが容易に
類推され、細菌感染症治療薬としては限界がある。一
方、細菌由来の毒素や酵素を中和および阻害することに
より細菌感染症を予防および治療すること目的のひとつ
とした療法として、免疫グロブリン療法(抗体療法)が
あり、抗生物質療法と併用、もしくはそれに代わるもの
として注目される。細菌に限らず毒素・酵素をウマやウ
サギ等の動物に能動的に免疫することによって該毒素・
酵素に対する抗体価の高い血清を得て、その血清を投与
する抗体療法は、ヒトに対してはジフテリア毒素や蛇毒
の例などで周知のことであるし、さらには各種の動物を
用いた実験的感染症において著効な治療効果を示すこと
が多くの実験にて実証されている。更には、抗体の特異
性を鑑みれば、生体内の金属プロテアーゼに対して影響
なく、目的の細菌由来酵素のみを中和することは言うま
でもない。緑膿菌においては、緑膿菌共通抗原(OE
P)、緑膿菌エラスターゼ、緑膿菌プロテアーゼに対す
る抗体価が比較的高い抗血清(ポリクローナル抗体)か
ら成る免疫グロブリン製剤が知られている。ヒト以外の
動物から得られた抗血清がたとえ高力価であったとして
も、ヒト以外のいわゆる異種蛋白をヒトの体内に移入す
るこの方法はアナフィラキシーやその他のアレルギー反
応などの重とくな副作用をひきおこす可能性がある。一
方、従来のヒト免疫グロブリン製剤は、健常人又は細菌
感染既応患者から血液を採取し、既知の方法にて免疫グ
ロブリン画分を分取・精製した後に、ポリエチレングリ
コール添加、蛋白分解酵素処理、スルホン化、DEAE−カ
ラムクロマトグラフィー等の凝集物を除去する方法によ
り筋肉注射用のみならず、静脈注射用に製剤化されたも
のである。これらヒト免疫グロブリン製剤は、いくつか
の欠点を持つ。第一に、細菌および細菌由来の毒素・
酵素に対する抗体価が低く、必ずしも充分な治療効果を
期待しえない。第二に、高力価の免疫グロブリンを大
量に安定して供給することが難しい。健常人ボランティ
アや患者より採取された血液を材料に製造されており、
高い力価の血清を一定して入手することは極めて難し
く、製造ロット毎に、抗体価が変動することがある。第
三に、任意にヒトの血液を材料に製造されることによ
り、免疫グロブリン製剤にHBs ウイルスなどの肝炎ウイ
ルスやATLV(Adult T cell leukaemia virus)、HIV(Hum
an immunodeficiency virus) 、あるいは非A非B肝炎
病原ウイルスなどの病原体の混入が起こり得る。かくし
て、細菌および細菌由来の毒素・酵素、特に、緑膿菌由
来のエラスターゼに対して高い抗体価を有し、細菌感染
症の治療効果の大きい安全な免疫グロブリン製剤の開発
が望まれている。[0004] However, these inhibitors also show inhibitory activity against many proteases belonging to many metalloproteases such as enzymes that produce enkeferin and endothelin which are important physiologically active peptides in Honshu, It is easily inferred to show toxicity and side effects, and there is a limit as a drug for treating bacterial infections. On the other hand, immunoglobulin therapy (antibody therapy) is one of the therapies aimed at preventing and treating bacterial infections by neutralizing and inhibiting toxins and enzymes derived from bacteria. It is attracting attention as an alternative. Not only bacteria but also toxins / enzymes can be produced by actively immunizing animals such as horses and rabbits.
Antibody therapy in which a serum having a high antibody titer against an enzyme is obtained and the serum is administered is well known to humans as examples of diphtheria toxin and snake venom, and further, experimental treatment using various animals. It has been proved in many experiments that it exhibits a remarkable therapeutic effect on infectious diseases. Furthermore, in view of the specificity of the antibody, it goes without saying that the target bacterial-derived enzyme is neutralized without affecting metalloproteases in vivo. Pseudomonas aeruginosa common antigen (OE
P), Pseudomonas aeruginosa elastase, and an immunoglobulin preparation comprising an antiserum (polyclonal antibody) having a relatively high antibody titer against Pseudomonas aeruginosa protease are known. Even if antisera obtained from animals other than humans have high titers, this method of transferring so-called heterologous proteins other than humans into the human body causes serious side effects such as anaphylaxis and other allergic reactions. There is a possibility of causing it. On the other hand, a conventional human immunoglobulin preparation is obtained by collecting blood from a healthy person or a patient who has already been infected with bacteria, and fractionating and purifying the immunoglobulin fraction by a known method, followed by polyethylene glycol addition, proteolytic enzyme treatment, It is formulated not only for intramuscular injection but also for intravenous injection by a method of removing aggregates such as sulfonation and DEAE-column chromatography. These human immunoglobulin preparations have several drawbacks. First, bacteria and toxins derived from bacteria
The antibody titer to the enzyme is low, and a sufficient therapeutic effect cannot always be expected. Second, it is difficult to stably supply a large amount of high titer immunoglobulin. It is made from blood collected from healthy volunteers and patients,
It is extremely difficult to constantly obtain a high titer serum, and the antibody titer may vary from production lot to production lot. Thirdly, by using human blood as a material, immunoglobulin preparations can be added to hepatitis viruses such as HBs virus, ATLV (Adult T cell leukaemia virus), and HIV (Hum).
an immunodeficiency virus), or contamination with pathogens such as non-A non-B hepatitis virus. Thus, development of a safe immunoglobulin preparation having a high antibody titer against bacteria and toxins / enzymes derived from bacteria, especially elastase derived from Pseudomonas aeruginosa, and having a large therapeutic effect on bacterial infections is desired.
【0005】[0005]
【発明が解決しようとする課題】PavlovskisとWretlind
の緑膿菌エラスターゼに対する抗血清が実験的マウス緑
膿菌感染症において著効を示すいう報告(Infect. Immu
n. (1979),Vol.24, p.181-187)からも、緑膿菌エラスタ
ーゼに対し強い中和活性を有する免疫グロブリン製剤の
開発が望まれている。感染症に対して著効のある免疫グ
ロブリン製剤を安定に製造するためには、緑膿菌エラス
ターゼに対し中和活性を持つモノクローナル抗体の利用
が考えられるが、エラスターゼの蛋白分解酵素活性を阻
害する、いわゆる中和活性を持つモノクローナル抗体
は、今迄に得られていない。緑膿菌エラスターゼに対す
るモノクローナル抗体に関してはLagaceとFrechette が
報告しているが(Infect. Immun. (1991), Vol.59, p.7
12-715) 、彼らは該抗体がエラスターゼに対する中和活
性を持つことを示していないし、更に、エラスターゼ産
生緑膿菌の感染治療に有効であることをも一切示してい
ない。エラスターゼ中和活性をもつモノクローナル抗体
を取得することが極めて困難であることは、エラスター
ゼが蛋白分解酵素でありモノクローナル抗体自体をも分
解し不活性化しうることからも予見される。すなわち、
単にエラスターゼに結合するだけのモノクローナル抗体
では不適である。即ち、エラスターゼ分子上に無数に存
在すると考えられるエピトープ(抗原決定基)のうち、
真にタンパク分解酵素活性を阻止しうる、中和活性に寄
与しうるエピトープを認識するモノクローナル抗体のみ
が、適していることになる。現在のエラスターゼに関す
る知識からでは、緑膿菌エラスターゼに対し強い中和活
性を持つモノクローナル抗体を予測することは困難であ
る。 一方では、抗体療法以外に毒素・酵素を無毒化し
たいわゆるワクチンを投与する能動免疫療法がある。緑
膿菌においては、緑膿菌共通抗原(OEP),緑膿菌エ
ラスターゼトキソイド,緑膿菌プロテアーゼトキソイド
からなるマルチコンポーネントワクチンの有効性が示さ
れている。(Hommma ら、Japanese Journal of Experime
ntal Medicine 48,111-133 (1987))[Problems to be Solved by the Invention] Pavlovskis and Wretlind
Reported that the antiserum against Pseudomonas aeruginosa elastase was significantly effective in experimental mouse Pseudomonas aeruginosa infection
(1979), Vol.24, p.181-187), the development of an immunoglobulin preparation having a strong neutralizing activity against Pseudomonas aeruginosa elastase is also desired. Monoclonal antibodies with neutralizing activity against Pseudomonas aeruginosa elastase may be used to stably produce immunoglobulin preparations that are highly effective against infectious diseases, but they inhibit the proteolytic enzyme activity of elastase. So far, no monoclonal antibody having so-called neutralizing activity has been obtained. Lagace and Frechette reported a monoclonal antibody against Pseudomonas aeruginosa elastase (Infect. Immun. (1991), Vol.59, p.7.
12-715), they do not show that the antibody has a neutralizing activity against elastase, nor do they show any efficacy in treating infection of elastase-producing Pseudomonas aeruginosa. The difficulty in obtaining a monoclonal antibody having elastase-neutralizing activity is predicted from the fact that elastase is a proteolytic enzyme and can also degrade and inactivate the monoclonal antibody itself. That is,
Monoclonal antibodies that simply bind elastase are unsuitable. That is, of the epitopes (antigenic determinants) that are considered to exist innumerably on the elastase molecule,
Only monoclonal antibodies that recognize an epitope that can contribute to neutralizing activity, which truly blocks proteolytic enzyme activity, will be suitable. From the current knowledge of elastase, it is difficult to predict a monoclonal antibody having a strong neutralizing activity against Pseudomonas aeruginosa elastase. On the other hand, in addition to antibody therapy, there is active immunotherapy in which a so-called vaccine in which toxins and enzymes are detoxified is administered. In Pseudomonas aeruginosa, the effectiveness of a multi-component vaccine comprising Pseudomonas aeruginosa common antigen (OEP), Pseudomonas aeruginosa elastase toxoid, and Pseudomonas aeruginosa protease toxoid has been shown. (Hommma et al., Japanese Journal of Experime
ntal Medicine 48,111-133 (1987))
【0006】緑膿菌エラスターゼトキソイドとは、ホル
マリン処理(Homma ら. Japanese Journal of Experime
ntal Medicine 48, 111-133 (1987)) 、あるいはクロル
アセチルペプタイド誘導体であるClCH2-CO−HO
Leu−Ala−Gly−NH2 ( HOLeuはN-ハイ
ドロキシ-L- ロイシン)(Moriharaら、Journal of Clini
cal Microbiology 23,53-55 (1986)) と処理することに
より酵素活性を欠失し、かつ抗原性保持を目的として調
製されたものである。この場合においても、エラスター
ゼ自身は酵素活性を失っており、肝心の酵素活性部位が
壊された状態の蛋白に対する抗体価だけが上昇し、真に
酵素の活性中心に結合して活性を中和する抗体価の上昇
は望めないことが考えられる。かといって、酵素活性の
あるエラスターゼはその毒性故に投与するわけにはいか
ない。こうした点からも、エラスターゼの酵素活性、即
ちその毒性を中和する性質を有する抗体だけからなる免
疫グロブリン製剤の有用性は高い。Pseudomonas aeruginosa elastase toxoid means formalin treatment (Homma et al. Japanese Journal of Experime
ntal Medicine 48, 111-133 (1987)) or ClCH 2 -CO-HO which is a chloroacetyl peptide derivative.
Leu-Ala-Gly-NH 2 (HOLeu is N- hydroxy -L- leucine) (Morihara et al, Journal of Clini
Cal Microbiology 23,53-55 (1986)), which was prepared for the purpose of retaining the antigenicity and lacking the enzyme activity. Even in this case, elastase itself has lost the enzyme activity, and only the antibody titer to the protein in the state where the essential enzyme active site is destroyed rises, and it truly binds to the active center of the enzyme and neutralizes the activity. It is conceivable that an increase in antibody titer cannot be expected. However, enzymatically active elastase cannot be administered because of its toxicity. From these points as well, the usefulness of the immunoglobulin preparation consisting only of the antibody having the property of neutralizing the enzyme activity of elastase, that is, its toxicity is high.
【0007】[0007]
【課題を解決するための手段】こうした状況に鑑み、酵
素活性を保持したエラスターゼを免疫原として、緑膿菌
エラスターゼに対する多くのモノクローナル抗体を作製
し、各モノクローナル抗体の性質を解析することによ
り、本発明を完成するに至った。具体的には、エラスタ
ーゼに対する特異抗体をスクリーニングする方法とし
て、従来から用いられている抗原を固相とする酵素免疫
測定法やラジオイムノアッセイではなく、酵素活性の中
和作用を判定する方法を開発・採用した。この方法によ
り、従来は、抗原を固相化あるいは放射性同位元素等で
標識する際に生じた抗体蛋白質の立体構造( コンフォメ
ーション) の変化により反応性が消失してしまうような
モノクローナル抗体をスクリーニングすることが可能と
なった。 この方法を用いて、緑膿菌エラスターゼに対
する多くのモノクローナル抗体を取得した。各モノクロ
ーナル抗体の治療効果を検討する一方、物理化学的、免
疫化学的および生物学的特性を詳細に解析した結果、緑
膿菌エラスターゼの酵素活性中心部位に直接相互作用
し、その蛋白分解活性に対し強い阻害効果を有するモノ
クローナル抗体を得ることに成功した。[Means for Solving the Problems] In view of these circumstances, by using elastase retaining enzyme activity as an immunogen, a number of monoclonal antibodies against Pseudomonas aeruginosa elastase were prepared, and the properties of each monoclonal antibody were analyzed. The invention was completed. Specifically, as a method for screening a specific antibody against elastase, a method for determining the neutralizing effect of the enzyme activity was developed instead of the enzyme immunoassay method or the radioimmunoassay using the conventionally used antigen as a solid phase. Adopted. By this method, conventionally, a monoclonal antibody is screened for which the reactivity disappears due to a change in the three-dimensional structure (conformation) of the antibody protein generated when the antigen is immobilized or labeled with a radioisotope. It has become possible. Using this method, a number of monoclonal antibodies against Pseudomonas aeruginosa elastase were obtained. While examining the therapeutic effect of each monoclonal antibody, detailed analysis of physicochemical, immunochemical and biological properties revealed that it directly interacts with the enzyme active center site of Pseudomonas aeruginosa elastase and We succeeded in obtaining a monoclonal antibody with a strong inhibitory effect.
【0008】本発明のモノクローナル抗体は、緑膿菌エ
ラスターゼの毒性中和活性を有することを特徴とする。
また、本発明のモノクローナル抗体は、緑膿菌エラスタ
ーゼに特異的に結合し、その結合が金属プロテアーゼ阻
害剤により阻害されることを特徴とする。さらに、本発
明のモノクローナル抗体は、緑膿菌エラスターゼに特異
的に結合するが、トキソイド化された緑膿菌エラスター
ゼには結合しないことを特徴とする。本発明は、上記の
免疫化学的・生物化学的特性を有するモノクローナル抗
体、該モノクローナル抗体産生セルライン及び該モノク
ローナル抗体を含む感染治療用の免疫グロブリン製剤に
関する。The monoclonal antibody of the present invention is characterized by having a toxicity neutralizing activity against Pseudomonas aeruginosa elastase.
Further, the monoclonal antibody of the present invention is characterized in that it specifically binds to Pseudomonas aeruginosa elastase and the binding is inhibited by a metalloprotease inhibitor. Furthermore, the monoclonal antibody of the present invention is characterized by specifically binding to Pseudomonas aeruginosa elastase, but not toxoidized Pseudomonas aeruginosa elastase. The present invention relates to a monoclonal antibody having the above-mentioned immunochemical / biochemical properties, a cell line producing the monoclonal antibody, and an immunoglobulin preparation for treating infections containing the monoclonal antibody.
【0009】緑膿菌エラスターゼと特異的に反応し上記
の特徴を有するモノクローナル抗体を連続的に産生する
細胞株は以下の方法で取得される。本発明のハイブリド
ーマは、免疫、細胞融合、融合細胞選択、アッセイおよ
びクローニングの五つの工程から成る。免疫工程は、動
物(ヒトを除く)を目的とする抗原で感作する過程であ
る。抗原としては、緑膿菌エラスターゼ精製品をフロイ
ンド完全又は不完全アジュバンドと混和した混和物をマ
ウス等の動物に1週間〜数か月の間隔で1〜6回注射す
ることによって感作する。ヒトにおいてはエラスターゼ
産生緑膿菌による自然感染がこの免疫に相当する。抗原
の投与経路として腹腔内投与、皮下投与、静脈内投与が
考えられるが、特に皮下投与が望ましい。細胞融合2〜
5日前に緑膿菌エラスターゼ精製品を追加感作すること
が望ましい。細胞融合工程は、免疫(感作)された動物
から摘出した脾臓細胞またはリンパ球B細胞と骨髄腫細
胞とを融合する工程から成る。リンパ球として血清中抗
緑膿菌エラスターゼ抗体価が高いヒトの末梢血、脾臓、
扁桃腺やリンパ節など由来のリンパ球を用いる事もでき
る。骨髄腫細胞としては、HPRT(hypoxanthine-guanine
phosphoribosyltransferase)欠損マウス骨髄腫細胞であ
るP3-X63-Ag8-U1(ATCCCRL1597)、P3-NS-1/1-Ag4-1 (ATC
C TIB 18) 、P3-X63-Ag8-653(ATCC CRL1580)、SP2/0-Ag
14(ATCC CRL8287)、SHM-D33(ATCC CRL 1668)などがその
代表として用いられるが、その他、細胞工学分野にて通
常用いられる動物およびヒト由来、またはヒト・マウス
ヘテロミエローマなどの異種間融合細胞由来のイムノグ
ロブリン非産生または非分泌の骨髄腫細胞やBリンパ芽
球様細胞をも用いることができる。融合法としてHVJ
法( センダイウイルスを用いる方法) 、ポリエチレング
リコール法(PEG法)や電気的融合法等が用いられ
る。PEG法においては、PEG 1,000-6,000を30-50%(w/
v) の濃度で用いる。レクチン,ポリ−L−リジンもし
くはDMSOなどを添加することにより融合効率を高めるこ
ともできる。融合方法はKoelerとMilsteinの方法(Natur
e 256, 495-497. (1975)) に準ずる。A cell line that specifically reacts with Pseudomonas aeruginosa elastase and continuously produces the monoclonal antibody having the above characteristics is obtained by the following method. The hybridoma of the present invention consists of five steps: immunization, cell fusion, fused cell selection, assay and cloning. The immunization process is a process of sensitizing animals (excluding humans) with a target antigen. As an antigen, a mixture obtained by mixing a purified product of Pseudomonas aeruginosa elastase with Freund's complete or incomplete adjuvant is sensitized by injecting it into an animal such as a mouse 1 to 6 times at intervals of 1 week to several months. In humans, natural infection with elastase-producing Pseudomonas aeruginosa corresponds to this immunity. The route of administration of the antigen may be intraperitoneal administration, subcutaneous administration, or intravenous administration, but subcutaneous administration is particularly preferable. Cell fusion 2
It is desirable to additionally sensitize Pseudomonas aeruginosa elastase purified product 5 days before. The cell fusion step comprises the step of fusing spleen cells or lymphocyte B cells extracted from the immunized (sensitized) animal with myeloma cells. Human peripheral blood, spleen, which has high serum anti-pseudomonas elastase antibody titer as lymphocytes
It is also possible to use lymphocytes derived from tonsils and lymph nodes. As myeloma cells, HPRT (hypoxanthine-guanine
phosphoribosyltransferase) -deficient mouse myeloma cells P3-X63-Ag8-U1 (ATCCCRL1597), P3-NS-1 / 1-Ag4-1 (ATC
C TIB 18), P3-X63-Ag8-653 (ATCC CRL1580), SP2 / 0-Ag
14 (ATCC CRL8287), SHM-D33 (ATCC CRL 1668), etc. are used as the representative, but in addition, animal and human origin usually used in the field of cell engineering, or heterologous fused cells such as human / mouse heteromyeloma Non-producing or non-secreting immunoglobulin-derived myeloma cells or B lymphoblastoid cells can also be used. HVJ as a fusion method
The method (method using Sendai virus), the polyethylene glycol method (PEG method), the electrical fusion method and the like are used. In the PEG method, PEG 1,000-6,000 is 30-50% (w /
Use at the concentration of v). The fusion efficiency can be increased by adding lectin, poly-L-lysine, DMSO or the like. The fusion method is the method of Koeler and Milstein (Natur
e 256, 495-497. (1975)).
【0010】融合細胞選択工程は、融合細胞のみが生育
できる適当な選択培地中で培養することにより融合細胞
を選別する工程である。HGPRT 欠損骨髄腫細胞を融合親
細胞として用いた場合、選択培地としてHAT(Hypoxanthi
ne, Aminopterin,Thymidine) 培地やHAz(Hypoxanthin
e, Azaserine)培地を用いる。2 〜4 日毎に新鮮な選択
培地に交換し10〜20日間培養する。その他、アクチノマ
イシンD ・エメチン併用法、ジメチルピロカーボネイト
法、ウアバイン法等公知の方法が用いられる。アッセイ
工程は、融合細胞のなかから、目的とする特異抗体産生
細胞を選別する工程である。抗原となる蛋白質の活性の
中和能、即ち本発明においては緑膿菌エラスターゼの基
質となるエラスチンなどの蛋白質やペプチドの加水分解
の阻害活性によって抗体を選別する。クローニング工程
は、目的の特異抗体産生細胞を一つのクローンから由来
した均一な細胞集団とする工程である。限外希釈法、軟
寒天法、単細胞マニュピレーション(Single cell manip
ulation)法などによって、モノクローン(単一性クロー
ン) から由来した緑膿菌エラスターゼと反応する抗体を
産生する細胞株、所謂ハイブリドーマを得る。The fused cell selection step is a step of selecting the fused cells by culturing in an appropriate selective medium in which only the fused cells can grow. When HGPRT-deficient myeloma cells were used as fusion parent cells, HAT (Hypoxanthi
ne, Aminopterin, Thymidine) medium and HAz (Hypoxanthin
e, Azaserine) medium is used. Change to fresh selection medium every 2 to 4 days and incubate for 10 to 20 days. In addition, known methods such as the actinomycin D / emetine combination method, the dimethylpyrocarbonate method, and the ouabain method can be used. The assay step is a step of selecting a target specific antibody-producing cell from the fused cells. Antibodies are selected by their ability to neutralize the activity of proteins that act as antigens, that is, in the present invention, the activity of inhibiting the hydrolysis of proteins and peptides such as elastin that serves as a substrate for Pseudomonas aeruginosa elastase. The cloning step is a step of forming the specific antibody-producing cells of interest into a uniform cell population derived from one clone. Ultra dilution method, soft agar method, single cell manipulation
cell line which produces an antibody that reacts with Pseudomonas aeruginosa elastase derived from a monoclone (single clone), a so-called hybridoma.
【0011】このハイブリドーマを公知の方法、例え
ば、DNA変異剤などの化学的処理およびUV照射など
物質的処理により、増殖能や抗体産生能を高めるなどの
改良を加えたハイブリドーマ子孫細胞を得ることができ
る。この子孫細胞が親ハイブリドーマと同じく、本発明
に記載の生物学的・物理学的特性を保持していることは
言うまでもない。また、このハイブリドーマから公知の
方法、例えば、Molecular Cloning 、 (Cold Spring Har
bor Laboratory) 記載の方法により抗体遺伝子ないし抗
体可変領域遺伝子をクローニングし該遺伝子を含む発現
プラスミドを作製、動物細胞を宿主として発現せしむる
事により本発明記載の抗体と同様の生物学的・物理学的
性質を有する抗体を得ることができる。また公知の方
法、例えば Morrison 等の方法(Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA. Vol .81, pp.6851-6855 (1984)) により抗体可
変領域遺伝子がヒト抗体定常領域遺伝子等他の適当な遺
伝子と結合した新規遺伝子を構築し、該遺伝子を含む発
現プラスミドを動物細胞ないし微生物を宿主として発現
せしむる事により本発明の抗体と同一の可変領域を有し
かつ本発明の抗体と同様の生物学的活性を有するハイブ
リッド分子を得ることが可能である。本発明の抗体は、
該ハイブリドーマを試験管内で無血清培地や血清を含む
通常の動物細胞用培地で培養した培養上清、又はプリス
タン(2,6,10,14-tetramethylpentadecane, Aldrich社)
あるいはフロイント不完全アジュバントを前投与したマ
ウス等の動物に接種し、生体内培養することによって得
た生体浸出液から精製される。すなわち得られた培養上
清又は生体浸出液を通常の蛋白精製に用いられる生化学
的手法, 例えば硫酸アンモニウムによる沈澱法、イオン
交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法および、プロテ
インA,プロテインGに代表される抗体結合蛋白質を樹
脂に固定化したアフィニティークロマトグラフィー法に
供することによって精製される。By subjecting this hybridoma to a known method, for example, chemical treatment with a DNA mutagen and physical treatment such as UV irradiation, hybridoma progeny cells having improved proliferative ability and antibody producing ability can be obtained. it can. It goes without saying that this progeny cell retains the biological / physical properties described in the present invention, like the parent hybridoma. In addition, a method known from this hybridoma, for example, Molecular Cloning, (Cold Spring Har
The same biological / physical properties as the antibody of the present invention can be obtained by cloning the antibody gene or antibody variable region gene by the method described in (Bor Laboratory), preparing an expression plasmid containing the gene, and expressing it in an animal cell as a host. Antibodies with biological properties can be obtained. Also, known methods such as Morrison's method (Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA. Vol. 81, pp. 6851-6855 (1984)) to construct a novel gene in which the antibody variable region gene is linked to another appropriate gene such as human antibody constant region gene, and an expression plasmid containing the gene is constructed. A hybrid molecule having the same variable region as that of the antibody of the present invention and having the same biological activity as that of the antibody of the present invention can be obtained by expressing the animal cell or microorganism as a host. The antibody of the present invention is
A culture supernatant obtained by culturing the hybridoma in a test tube in a normal animal cell medium containing serum or serum, or pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane, Aldrich)
Alternatively, it is purified from a biological exudate obtained by inoculating an animal such as a mouse pre-administered with Freund's incomplete adjuvant and culturing in vivo. That is, the obtained culture supernatant or bioexudate is used in a conventional biochemical method for protein purification, for example, ammonium sulfate precipitation method, ion exchange chromatography method, gel filtration method, and antibodies represented by protein A and protein G. It is purified by subjecting the bound protein to a resin-immobilized affinity chromatography method.
【0012】精製されたモノクローナル抗体は、生物学
的製剤の製剤化に通常用いられる方法によって製剤化さ
れる。基本的には、メンブレンフィルター等による濾過
除菌操作の後に、滅菌バイアルに充填される。凍結乾燥
されることもある。更には必要に応じて安定化剤が添加
される。本モノクローナル抗体製剤は、細菌感染治療・
予防剤として、緑膿菌エラスターゼに対する1種類のモ
ノクローナル抗体より成ることも可能であるが、更に好
ましくは、緑膿菌エラスターゼ分子の異なる抗原決定部
位を認識しうる、少なくとも2種類又はそれ以上のモノ
クローナル抗体と混合して用いられる。又は緑膿菌エラ
スターゼ以外の緑膿菌由来抗原、例えば外毒素、プロテ
アーゼなどの緑膿菌外毒素や外膜蛋白・内毒素構成成分
などを認識する従来型の抗体と混合して使用される。更
には、緑膿菌以外の細菌,ウイルス,真菌,原虫,癌細
胞に対する抗体に、本発明によって得られる緑膿菌エラ
スターゼに対するモノクローナル抗体を添加して用いる
ことができる。従来の免疫グロブリン製剤に、本発明に
よって得られるモノクローナル抗体を添加して、エラス
ターゼに対する高力価免疫グロブリン製剤とされる。本
発明によって得られるモノクローナル抗体は主としてク
ラスIg Gに属するがこれに限定されたものではない。
本モノクローナル抗体は、前記の特性を持つモノクロー
ナル抗体であれば、マウス抗体、ヒト抗体、マウス−ヒ
ト・キメラ抗体、クラス・サブクラス変換抗体など、す
べて含まれる。さらに緑膿菌エラスターゼに対し中和効
果を有する抗体のFab 断片、Fv断片も含まれる。本発明
のモノクローナル抗体を利用する緑膿菌エラスターゼの
定量およびエラスターゼ産生緑膿菌感染症の診断として
は、通常の抗体を用いる免疫化学的定量法および診断法
が考えられ、当該モノクローナル抗体が利用可能であれ
ば制限はない。例えば、酵素免疫測定法,ラジオイムノ
アッセイおよび凝集法等が例示される。The purified monoclonal antibody is formulated by a method usually used for formulation of biological products. Basically, it is filled in a sterile vial after filtering and sterilizing operation using a membrane filter or the like. It may be freeze-dried. Further, a stabilizer is added if necessary. This monoclonal antibody preparation
The preventive agent may consist of one kind of monoclonal antibody against Pseudomonas aeruginosa elastase, but more preferably at least two or more kinds of monoclonal antibodies capable of recognizing different antigenic determinant sites of Pseudomonas aeruginosa elastase molecule. Used as a mixture with antibodies. Alternatively, it is used as a mixture with an antigen derived from Pseudomonas aeruginosa other than Pseudomonas aeruginosa elastase, for example, a conventional antibody that recognizes Pseudomonas aeruginosa exotoxin such as exotoxin and protease, and outer membrane protein / endotoxin components. Furthermore, a monoclonal antibody against Pseudomonas aeruginosa elastase obtained by the present invention can be added to an antibody against bacteria, viruses, fungi, protozoa, and cancer cells other than Pseudomonas aeruginosa. The monoclonal antibody obtained by the present invention is added to a conventional immunoglobulin preparation to give a high titer immunoglobulin preparation against elastase. The monoclonal antibody obtained by the present invention mainly belongs to class IgG but is not limited thereto.
The present monoclonal antibody includes all mouse antibodies, human antibodies, mouse-human chimera antibodies, class / subclass conversion antibodies, etc., as long as they have the above-mentioned characteristics. Furthermore, Fab fragments and Fv fragments of antibodies having a neutralizing effect on Pseudomonas aeruginosa elastase are also included. As the quantification of Pseudomonas aeruginosa elastase using the monoclonal antibody of the present invention and the diagnosis of elastase-producing Pseudomonas aeruginosa infection, immunochemical quantification methods and diagnostic methods using ordinary antibodies are considered, and the monoclonal antibody can be used. If so, there is no limit. For example, an enzyme immunoassay method, a radioimmunoassay, an agglutination method and the like are exemplified.
【0013】[0013]
【実施例】次に実施例をあげて本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はこれのみに限定されないことは言
うまでもない。緑膿菌エラスターゼ抗体の検定に用いた
従来のELISA法を以下に示す。 (1)ELISA プレートの調製 緑膿菌エラスターゼをリン酸緩衝液(pH7.2 ; 組成Na
Cl(8g/1), KCl(0.2g/1), Na2 HPO4 ・12H
2 O(2.99g/1) およびKH2 PO4 ・(0.2g/1)) :以下
PBSと略す)へ10μg/mlの濃度に溶解し96ウェル
マイクロプレート(ファルコン #3912)(マイクロプレ
ートと略)に1ウェル当たり100μlずつ分注、4℃
で一晩インキュベートした。マイクロプレートからエラ
スターゼ溶液を除去した後3%ウシ血清アルブミン(以
下BSAと略称する)PBS溶液を1ウエルあたり12
0μl ずつ分注し37℃にて30分間インキュベートす
ることによりエラスターゼの未吸着部分をブロッキング
したマイクロプレートを抗原吸着プレートとして以後の
操作に用いた。EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but it goes without saying that the present invention is not limited to these. The conventional ELISA method used for the assay of Pseudomonas aeruginosa elastase antibody is shown below. (1) Preparation of ELISA plate Pseudomonas aeruginosa elastase was added to phosphate buffer (pH 7.2;
Cl (8g / 1), KCl (0.2g / 1), Na 2 HPO 4・ 12H
2 O (2.99 g / 1) and KH 2 PO 4 · (0.2 g / 1)): hereinafter abbreviated as PBS) and dissolved at a concentration of 10 μg / ml in a 96-well microplate (Falcon # 3912) (abbreviated as microplate) ), 100 μl / well, 4 ℃
Incubated overnight. After removing the elastase solution from the microplate, a 3% bovine serum albumin (BSA) PBS solution was added to the wells at a rate of 12 per well.
A microplate in which 0 μl of each of them was dispensed and incubated at 37 ° C. for 30 minutes to block the unadsorbed portion of elastase was used as an antigen adsorption plate in the subsequent operations.
【0014】(2)ELISA アッセイ前に抗原吸着プレートを5mM EDTAと0.05%Twee
n 20を含有するPBS(以下PBSTと略)で3回洗滌し
た。その後PBSTを1ウェルあたり50μl 分注、必要に
応じてPBSTで適宜希釈した試料(血清又は培養上清)を
1ウェルあたり50μl 加え、37℃で2時間インキュ
ベートした。その後試料を除去し、PBSTで3回洗浄し
た。続いて第2抗体液を1ウェルあたり100μl ずつ
加え、37℃で2時間インキュベートした。抗体価の測
定には第2抗体としてしPBSTで 500〜1,000 倍希釈した
ホスファターゼ標識アフィニティ精製抗マウス免疫グロ
ブリン抗体(Kirkegaard & Perry Lab. Inc.)を用い
た。第2抗体を除去し、PBSTで3回洗滌後、発色基質溶
液(3mgのp −ニトロフェニルリン酸−2−ナトリウム
塩を1mlのNaN3 (0.2mg/ml),MgCl2 ・6H2
O(0.1mg/ml)を含む10%ジエタノールアミン緩衝液
pH9.1に溶解した水溶液)を1ウェル100μlずつ加
え、37℃で反応させた。30分間反応後の405nm の吸
光度(A405)をマルチスキャン(Titertek)で測定し
た。また、本明細書におけるエラスチン分解活性の中和
による抗エラスターゼ抗体の検出は以下に示す方法に従
った。1 mM CaCl2を含有した0.1 M トリス・マレイン酸
緩衝液(pH 7.0)(以下、緩衝液I とする)に10 mg/mlの
濃度でFITC(fluorescein isothiocyanate)-標識エラス
チン(Elastin Products Company, ミズリー)を懸濁し
た基質溶液 60 μl,緩衝液I に0.3 μg/mlの濃度で溶
かしたエラスターゼ溶液 60 μl及びハイブリドーマ培
養上清(コントロールには培地を使用した) 60 μlを
V字底96ウェルマイクロプレートに分注し、37℃,
2時間インキュベートする。プレートを3 000 rpm, 5 m
inで遠心した後、上清100 μlを回収し、96ウェル平
底プレートに移す。この上清中の遊離のFITC量をコロナ
マイクロプレートリーダーMTP−32(Corona Elect
ric Co., Ltd.,茨城,日本)を用いて蛍光強度として測
定した。エラスチン分解阻害活性は、[(培養上清添加
時での蛍光強度)−(バックグラウンド)]/[(培地
のみ添加での蛍光強度)−(バックグラウンド)]。た
だしバックグラウンドはエラスターゼ非存在下での蛍光
強度を表す。(2) ELISA Before assaying the antigen adsorption plate with 5 mM EDTA and 0.05% Twee
It was washed 3 times with PBS containing n 20 (hereinafter abbreviated as PBST). Then, 50 μl of PBST was dispensed per well, and 50 μl of a sample (serum or culture supernatant) appropriately diluted with PBST was added per well, if necessary, and incubated at 37 ° C. for 2 hours. The sample was then removed and washed 3 times with PBST. Subsequently, the second antibody solution was added in an amount of 100 μl per well and incubated at 37 ° C. for 2 hours. For the measurement of the antibody titer, a phosphatase-labeled affinity-purified anti-mouse immunoglobulin antibody (Kirkegaard & Perry Lab. Inc.), which was diluted 500 to 1,000 times with PBST, was used as the second antibody. After removing the second antibody and washing three times with PBST, a color-developing substrate solution (3 mg of p-nitrophenylphosphoric acid-2-sodium salt was added to 1 ml of NaN 3 (0.2 mg / ml), MgCl 2 .6H 2
10% diethanolamine buffer containing O (0.1 mg / ml)
An aqueous solution dissolved in pH 9.1) was added to each well in an amount of 100 μl and reacted at 37 ° C. After reacting for 30 minutes, the absorbance at 405 nm (A 405 ) was measured by multiscan (Titertek). Further, the detection of the anti-elastase antibody by neutralizing the elastin-degrading activity in the present specification follows the method shown below. FITC (fluorescein isothiocyanate) -labeled elastin (Elastin Products Company, Missouri) at a concentration of 10 mg / ml in 0.1 M Tris-maleic acid buffer (pH 7.0) containing 1 mM CaCl 2 (hereinafter referred to as buffer I) ) Suspended substrate solution 60 μl, elastase solution 60 μl dissolved in buffer I at a concentration of 0.3 μg / ml and hybridoma culture supernatant (medium was used for control) 60 μl in V-bottom 96-well micro Dispense into a plate, 37 ℃,
Incubate for 2 hours. Plate 3 000 rpm, 5 m
After centrifuging in, 100 μl of supernatant is collected and transferred to a 96-well flat bottom plate. The amount of free FITC in this supernatant was determined by corona microplate reader MTP-32 (Corona Elect).
ric Co., Ltd., Ibaraki, Japan). The elastin degradation inhibitory activity is [(fluorescence intensity when adding culture supernatant)-(background)] / [(fluorescence intensity when adding only medium)-(background)]. However, the background represents the fluorescence intensity in the absence of elastase.
【0015】実施例1.マウスモノクローナル抗体の作
製 (1)抗原の調製 市販緑膿菌エラスターゼ精製品(長瀬生化学)を使用し
た。緑膿菌エラスターゼをリン酸緩衝液(pH 7.2;組成
NaCl(8 g/l), KCl(0.2 g/l), Na2HPO4 ・12H2O(2.99 g
/l) )およびKH2PO4(0.2 g/l) :以下PBSと略す)に対
し透析し免疫原として用いた。 (2)免疫脾臓細胞の調製 BALB/cマウス(雌、初回免疫時4週令、体重約15 g)を
免疫に供した。緑膿菌エラスターゼを1 mg/ml の濃度で
含有するPBS1容とフロイント完全アジュバント1容を
常法に従い混和し、マウス一匹あたり混和液)0.2ml
(緑膿菌エラスターゼ 0.5μg を含有)を皮下投与する
ことによって初回免疫した。以後、2週間隔にて4 回、
フロイント不完全アジュバントと混和した緑膿菌エラス
ターゼを100 μg皮下投与し、追加免疫を行なった。最
後の追加免疫の約1ケ月後、緑膿菌エラスターゼ100μg
を静脈内投与する事により最終免疫した。3 日後に脾臓
を摘出、イーグルのMEM培地(半井化学)に懸濁され
た脾臓細胞を得た。 (3)細胞融合 マウス骨髄腫細胞 P3X63-Ag8-653(ATCC CRL1580)を10%
ウシ胎児血清FCS(Gibco)添加RPMI-1640 培地 (半井化
学) 中で培養し、対数増殖期で細胞を集め細胞融合に用
いた。融合方法は、Koehler ら(Nature,256, 495-497,
1975)の方法に準じた。即ち、脾臓細胞と骨髄腫細胞と
を5 :1 の比率で血清不含のRPMI-1640 培地に懸濁し、
1,000rpm (トミー精工CD-100R)にて7 分間遠心分離し
た。沈査に、37℃に保温された45%(W/W)ポリエチレン
グリコール(PEG)4000,10%(V/V) ジメチルスルホキシド
の溶液1ml を1 分間かけて添加し、さらに37℃にて1 分
間静置した。Example 1. Production of mouse monoclonal antibody
Ltd. (1) antigen Preparation commercial Pseudomonas aeruginosa elastase purified product (Nagase Biochemical) was used. Pseudomonas aeruginosa elastase in phosphate buffer (pH 7.2; composition
NaCl (8 g / l), KCl (0.2 g / l), Na 2 HPO 4・ 12H 2 O (2.99 g
/ l)) and KH 2 PO 4 (0.2 g / l): hereinafter abbreviated as PBS) and used as an immunogen. (2) Preparation of immunized spleen cells BALB / c mice (female, 4 weeks old at the time of initial immunization, body weight about 15 g) were used for immunization. 0.2 ml of a mixture containing 1 volume of PBS containing Pseudomonas aeruginosa elastase at a concentration of 1 mg / ml and 1 volume of Freund's complete adjuvant according to a conventional method, per mouse)
Primary immunization was carried out by subcutaneous administration (containing 0.5 μg of Pseudomonas aeruginosa elastase). After that, 4 times at 2 week intervals,
100 μg of Pseudomonas aeruginosa elastase mixed with Freund's incomplete adjuvant was subcutaneously administered and booster immunization was performed. About 1 month after the last booster, 100 μg of Pseudomonas aeruginosa elastase
Was administered intravenously for final immunization. Three days later, the spleen was removed to obtain spleen cells suspended in Eagle's MEM medium (Hanai Kagaku). (3) Cell fusion 10% of mouse myeloma cells P3X63-Ag8-653 (ATCC CRL1580)
The cells were cultured in RPMI-1640 medium (Hansui Kagaku) supplemented with fetal bovine serum FCS (Gibco), and the cells were collected in the logarithmic growth phase and used for cell fusion. The fusion method is described by Koehler et al. (Nature, 256, 495-497,
1975). That is, spleen cells and myeloma cells were suspended in serum-free RPMI-1640 medium at a ratio of 5: 1,
Centrifugation was performed for 7 minutes at 1,000 rpm (Tomy Seiko CD-100R). To the precipitation, add 1 ml of 45% (W / W) polyethylene glycol (PEG) 4000, 10% (V / V) dimethylsulfoxide solution kept at 37 ° C over 1 minute, and then at 37 ° C for 1 minute. I let it stand.
【0016】次いで、血清不含RPMI-1640 培地2ml を1m
l /1minの割合で加え懸濁した。更に、血清不含 RPMI-
1640培地7ml を徐々に加え PEGを希釈した。37℃、20分
間静置の後1,000rpmで7 分間遠心分離、その後マウス骨
髄腫細胞として6 ×104 細胞/mlの細胞濃度が得られる
ように、10%FCS 含有 RPMI-1640培地に再懸濁し、96穴
マイクロプレート (住友ベークライトMS-3096F) に0.2
ml/ウェルずつ分注した。この融合細胞を5 %CO2 に
おいて37℃で培養した。細胞融合の1 日後に、半分量の
培地を新たな HAT培地(10-4M ヒポキサンチン、4 ×10
-7M アミノプテリン、1.6×10-5M チミジンを含むRPMI-
1640 培地) と交換した。以後、2 日毎にHAT培地に
よる半量交換を3 回行った。10日後には、70%のマイク
ロプレート穴で、細胞の増殖が観察された。ELISA もし
くはエラスチン分解の中和活性によるアッセイの結果、
42ウェルで特異抗体の産生が認められた。代表的な陽性
例を表1に示す。Then, 2 ml of serum-free RPMI-1640 medium was added to 1 m.
It was added and suspended at a ratio of l / 1 min. Furthermore, serum-free RPMI-
7 ml of 1640 medium was gradually added to dilute PEG. After standing at 37 ° C for 20 minutes, centrifuge at 1,000 rpm for 7 minutes, and then resuspend in RPMI-1640 medium containing 10% FCS to obtain a cell concentration of 6 × 10 4 cells / ml as mouse myeloma cells. Cloudy, 0.2 in a 96-well microplate (Sumitomo Bakelite MS-3096F)
Dispensed in ml / well. The fused cells were cultured at 37 ° C. in 5% CO 2 . One day after cell fusion, half the volume of medium was replaced with fresh HAT medium (10 -4 M hypoxanthine, 4 × 10
RPMI containing -7 M aminopterin and 1.6 × 10 -5 M thymidine
1640 medium). After that, half-volume exchange with HAT medium was performed 3 times every 2 days. After 10 days, cell proliferation was observed in 70% of the microplate wells. As a result of the assay by ELISA or elastin degradation neutralizing activity,
Production of specific antibody was observed in 42 wells. Table 1 shows typical positive examples.
【0017】[0017]
【表1】 [Table 1]
【0018】(4)腹水化 4週間前にプリスタン(2, 6, 10, 14−テトラメチルペ
ンタデカン; AldrichChemical Co. Inc.,Wisconsin )
を一匹あたり0.5 mlにて投与したBalb/Cマウスに、クロ
ーニング後試験管内培養にて増殖させたハイブリドーマ
5 ×106 細胞を腹腔内へ接種し、7〜14日後、マウスの
腹腔より腹水を採取した。 (5)精製 マウス腹水をプロティンAモノクローナル抗体精製シス
テムMAPSII(Bio-Rad; New York) にて精製した。すな
わち、腹水を脱リピド液(Repligen Corp.)で処理後、1
00,000xg, 1h, 15 ℃の超遠心を行う。得られた腹水とM
APSII結合バッファーpH 9.0(Bio-Rad)を1:1に混合
し、アフィゲルプロテインAカラム(Bio-Rad)に供し
た後、前出の結合バッファーで洗浄した。MAPSII溶出バ
ッファー(pH3.0 ; Bio-Rad)で溶出後ただちにPBS に
対して透析して、精製標品とした。(4) Ascites 4 weeks ago, pristane (2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecane; Aldrich Chemical Co. Inc., Wisconsin)
Hybridomas grown in in vitro culture after cloning in Balb / C mice treated with 0.5 ml per mouse
5 × 10 6 cells were inoculated into the abdominal cavity, and 7 to 14 days later, ascites was collected from the abdominal cavity of the mouse. (5) Purification Mouse ascites was purified by Protein A monoclonal antibody purification system MAPSII (Bio-Rad; New York). That is, ascites was treated with a lipid lipid solution (Repligen Corp.), and
Perform ultracentrifugation at 00,000xg, 1h, 15 ℃. Obtained ascites and M
APSII binding buffer pH 9.0 (Bio-Rad) was mixed 1: 1 and applied to an Affigel Protein A column (Bio-Rad), followed by washing with the above-mentioned binding buffer. After elution with MAPSII elution buffer (pH 3.0; Bio-Rad), it was immediately dialyzed against PBS to give a purified sample.
【0019】実施例2.モノクローナル抗体の性状検討 (1)In vitroエラスターゼ中和試験 1)ウシ血清アルブミンを基質としたSDS-PAGEによる定
性的解析 緑膿菌エラスターゼとウシ血清アルブミン(BSA) を表1
に示したマウスモノクローナル抗体の存在下反応させ、
緑膿菌エラスターゼによるウシ血清アルブミンの分解に
対する抗体の影響をSDS-PAGEにより解析した。緑膿菌エ
ラスターゼ(0.1 μg/ml, 10μl )にマウスモノクロー
ナル抗体(腹水 10 μl )を添加し37℃,30分プレ・イ
ンキュベートした後、BSA (5 mg/ml,100μl )を加え3
7℃2 時間反応させた。反応混合物を2 %SDS, 5% 2-
メルカプトエタノール、10%グリセロールを含む 125mM
トリス塩酸緩衝液pH 6.8中で 100℃、5 分間加熱処理
し、10-20 % linear gradientのアクリルアミド濃度で
SDS/ポリアクリルアミドゲル電気泳動をおこなった。ゲ
ル上の蛋白をクマジー・ブリリアント・ブルーにより染
色、BSA の分解を観察した。緑膿菌エラスターゼ・抗体
無添加の条件で認められたBSA のバンドは緑膿菌エラス
ターゼの添加により完全に分解された。ET-4D3の添加に
より緑膿菌エラスターゼによるBSA の分解は阻害されBS
A のバンドが認められた。一方、他のモノクローナル抗
体の添加ではBSA の分解は影響を受けなかった。Example 2. Characterization of monoclonal antibody (1) In vitro elastase neutralization test 1) Qualitative analysis by SDS-PAGE using bovine serum albumin as a substrate Table 1 shows Pseudomonas aeruginosa elastase and bovine serum albumin (BSA).
React in the presence of the mouse monoclonal antibody shown in
The effect of antibodies on the degradation of bovine serum albumin by Pseudomonas aeruginosa elastase was analyzed by SDS-PAGE. Mouse monoclonal antibody (10 μl of ascites) was added to Pseudomonas aeruginosa elastase (0.1 μg / ml, 10 μl), pre-incubated at 37 ° C for 30 minutes, and then BSA (5 mg / ml, 100 μl) was added.
The reaction was performed at 7 ° C for 2 hours. The reaction mixture is 2% SDS, 5% 2-
125 mM with mercaptoethanol and 10% glycerol
Heat-treat in Tris-HCl buffer pH 6.8 at 100 ° C for 5 minutes at 10-20% linear gradient acrylamide concentration.
SDS / polyacrylamide gel electrophoresis was performed. The protein on the gel was stained with Coomassie Brilliant Blue and the degradation of BSA was observed. The BSA band observed under the condition without addition of Pseudomonas aeruginosa elastase was completely decomposed by the addition of Pseudomonas aeruginosa elastase. Degradation of BSA by Pseudomonas aeruginosa elastase was inhibited by the addition of ET-4D3.
Band A was recognized. On the other hand, addition of other monoclonal antibodies did not affect BSA degradation.
【0020】(2)FITC- エラスチンを基質とした定量
的解析 緑膿菌エラスターゼの酵素活性をFITC- 標識エラスチン
(エラスチン・プロダクツ・カンパニー、ミズーリ)を
基質として用いた反応系に、モノクローナル抗体を共存
させたときの影響を検討した。エラスターゼによるエラ
スチンの分解はその分解にともなって可溶化されたFITC
を指標とした。緑膿菌エラスターゼ( 10,30 μg/ml; 7
5μl )にマウスモノクローナル抗体ET-4D3またはET-2B
1(100 μg/ml; 75μl )を添加し37℃,30 分プレ・イ
ンキュベートした後、FITC-標識エラスチン(5 mg/ml;
150μl )を加え37℃ 3時間暗所にて反応した。反応混
合物から標識エラスチンを遠沈除去し上清100 μl を採
取、96穴プレートに分注した。上清に含まれるFITCの量
を96穴プレート用自動光度計(コロナ MTP-32 )を用い
測定した。結果を表 2に示す。いずれのモノクローナル
抗体も緑膿菌エラスターゼによる蛋白分解を阻害した。
ET-4D3は抗体1 分子又はそれ以上の分子で緑膿菌エラス
ターゼ1 分子を50%以上阻害した。一方 ET-2B1 による
分解の阻害は ET-4D3 と比較し弱かった。(2) Quantitative analysis using FITC-elastin as a substrate The enzymatic activity of Pseudomonas aeruginosa elastase was used in a reaction system in which FITC-labeled elastin (Elastin Products Co., Missouri) was used as a substrate to coexist with a monoclonal antibody. We examined the effect of this. Degradation of elastin by elastase solubilized FITC
Was used as an index. Pseudomonas aeruginosa elastase (10,30 μg / ml; 7
5 μl) mouse monoclonal antibody ET-4D3 or ET-2B
1 (100 μg / ml; 75 μl) was added and pre-incubated at 37 ℃ for 30 minutes, then FITC-labeled elastin (5 mg / ml;
150 μl) was added and reacted at 37 ° C. for 3 hours in the dark. The labeled elastin was removed by centrifugation from the reaction mixture, and 100 μl of the supernatant was collected and dispensed into a 96-well plate. The amount of FITC contained in the supernatant was measured using an automatic photometer for 96-well plates (Corona MTP-32). The results are shown in Table 2. Both monoclonal antibodies inhibited proteolysis by Pseudomonas aeruginosa elastase.
ET-4D3 inhibited more than 50% of one molecule of Pseudomonas aeruginosa elastase with one or more antibody molecules. On the other hand, the inhibition of degradation by ET-2B1 was weaker than that of ET-4D3.
【0021】[0021]
【表2】 [Table 2]
【0022】3)合成基質を用いた緑膿菌エラスターゼ
酵素活性のモノクローナル抗体ET−4D3の中和活性 緑膿菌エラスターゼの酵素活性を合成基質であるフリル
アクリロイル−グリシル−ロイシン アミド(以下、F
AGLAと略記;ペプチド研究所(大阪))を用いて測
定した。この反応系にET−4D3を添加して酵素活性
中和能を検討した。0.1Mトリス−マレイン酸緩衝液
(pH7.0)に2.5mMの濃度で溶解したFAGL
A200μlに緑膿菌エラスターゼ(長瀬生化学より購
入)0.5μg、更に種々の濃度のET−4D3のPB
S(−)溶液100μlを混和、37℃1時間インキュ
ベートした後、0.7Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH
6.0)を400μl添加して反応を停止させた。酵素
を添加していない反応混液を作製し対照とし、345n
mの吸光度の減少((対照の吸光度)−(反応後の吸光
度))を測定、酵素1μg,1時間あたりの吸光度変化
(−ΔA345 /h・μg蛋白)を酵素活性とした。ET
−4D3の中和能は、添加していないときの酵素活性を
100%として、相対残存酵素活性で表した。抗体の比
較対象としてマウス抗エラスターゼ抗体ET−2B1、
酵素(エラスターゼ)の比較対象として緑膿菌エラスタ
ーゼと酵素活性部位の類似した金属プロテアーゼ(Beve
rとIglewski, Journal of Bacteriology 170, 4309-431
4 (1988)) であるサーモリシン(Bacillus thermoprot
eolyticus rokko株由来。、シグマ社)0.3μgを用
いた。結果を表3に示す。合成基質を用いた場合、ET
−4D3のみに中和活性が認められ、ET−2B1では
全く中和活性を認めなかった。さらに、ET−4D3,
ET−2B1ともにサーモリシンに対する中和活性は全
く認められなかった。3) Neutralizing Activity of Monoclonal Antibody ET-4D3 with Pseudomonas aeruginosa Elastase Enzymatic Activity Using Synthetic Substrate Furyl acryloyl-glycyl-leucine amide (hereinafter, F
Abbreviated as AGLA; measured using Peptide Institute (Osaka). ET-4D3 was added to this reaction system to examine the enzyme activity neutralizing ability. FAGL dissolved in 0.1 M Tris-maleic acid buffer (pH 7.0) at a concentration of 2.5 mM
Pseudomonas aeruginosa elastase (purchased from Nagase Biochemical) 0.5 μg in 200 μl of A, and PB of ET-4D3 at various concentrations
After mixing 100 μl of S (−) solution and incubating at 37 ° C. for 1 hour, 0.7 M sodium phosphate buffer (pH
The reaction was stopped by adding 400 μl of 6.0). A reaction mixture containing no enzyme was prepared and used as a control.
The decrease in the absorbance at m ((absorbance of control)-(absorbance after reaction)) was measured, and the enzyme activity was defined as 1 μg of enzyme and the change in absorbance per hour (−ΔA 345 / h · μg protein). ET
The neutralizing ability of -4D3 was expressed as a relative residual enzyme activity with the enzyme activity when not added as 100%. Mouse anti-elastase antibody ET-2B1 as a comparison target of the antibody,
Pseudomonas aeruginosa elastase and a metalloprotease with a similar enzyme active site (Beve)
r and Iglewski, Journal of Bacteriology 170, 4309-431
4 (1988)) is a thermolysin (Bacillus thermoprot
Derived from the eolyticus rokko strain. , Sigma) 0.3 μg was used. The results are shown in Table 3. When using a synthetic substrate, ET
Neutralizing activity was found only in -4D3, and no neutralizing activity was found in ET-2B1. Furthermore, ET-4D3
Neither ET-2B1 nor neutralizing activity against thermolysin was observed.
【0023】[0023]
【表3】 表3より、少なくとも1分子の抗体が緑膿菌エラスタ
ーゼ1分子の蛋白分解酵素活性を50%阻害することが
判明した。[Table 3] From Table 3, it was found that at least one molecule of the antibody inhibited the proteolytic enzyme activity of one molecule of Pseudomonas aeruginosa elastase by 50%.
【0024】実施例3.抗エラスターゼ抗体ET−4D
3のFab断片の調製と該断片によるエラスターゼの中
和活性 (1)モノクローナル抗体ET−4D3のFab断片の
調製 モノクローナル抗体ET−4D3(PBS(−)溶液)
10mgを20mMりん酸/10mM EDTA緩衝液
(pH7.0)に対して透析した後、限外濾過装置にて
約0.5mlまで濃縮した。得られたIgG溶液(0.
5ml)と20mMのシステイン塩酸を添加した20m
Mりん酸緩衝液(pHを7.0に調整)0.5mlとを
混和し、さらにパパイン固定化Agarose(PIERCE, Rockfo
rd, Illinois USA) の懸濁液を1ml添加し、激しく攪
拌しながら37℃で16時間インキュベートした。反応
後、固定化パパインを濾別した。得られた濾液にAffi-P
rep Protein A MAPS II Binding buffer (Bio-Rad Labo
ratories, Richmond, CA USA) を等量添加し、Protein
A-Cellulofine (生化学工業)カラム(φ0.8cmx2cm)
に供した。Affi-Prep Protein A Binding bufferでカラ
ムを洗浄し、素通りの画分を適当な量にまで濃縮し、Su
perose 6カラム (φ1cm x30cm; PharmaciaLKB, Uppsal
a, Sweden) にてゲル濾過を行い、280nmの吸光度で検出
した蛋白画分を集め、ET−4D3のFab断片標品と
した。 (2)モノクローナル抗体ET−4D3のFab断片に
よる合成基質を用いた緑膿菌エラスターゼ酵素活性の中
和 ET−4D3のFab断片の酵素活性中和の有無を実施
例2−(3)に従ってフリルアクリロイル−グリシル−
ロイシン アミド(FAGLA)を用いて検討した。検
討条件は実施例2−(3)に準じて実施した。結果を表
4に示す。Example 3. Anti-elastase antibody ET-4D
Preparation of Fab fragment of 3 and elastase by the fragment
Somatic activity (1) Preparation of Fab fragment of monoclonal antibody ET-4D3 Monoclonal antibody ET-4D3 (PBS (-) solution)
10 mg was dialyzed against 20 mM phosphoric acid / 10 mM EDTA buffer (pH 7.0) and then concentrated to about 0.5 ml with an ultrafiltration device. The obtained IgG solution (0.
5m) and 20m added with 20mM cysteine hydrochloric acid
0.5 ml of M phosphate buffer (pH adjusted to 7.0) is mixed, and papain-immobilized Agarose (PIERCE, Rockfo
rd, Illinois USA) suspension (1 ml) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 16 hours with vigorous stirring. After the reaction, the immobilized papain was filtered off. Affi-P was added to the obtained filtrate.
rep Protein A MAPS II Binding buffer (Bio-Rad Labo
ratories, Richmond, CA USA) in an equal amount
A-Cellulofine (Seikagaku) column (φ0.8cm x 2cm)
I went to Wash the column with Affi-Prep Protein A Binding buffer and concentrate the flow-through fraction to an appropriate volume.
perose 6 column (φ1cm x 30cm; PharmaciaLKB, Uppsal
a, Sweden), and the protein fractions detected by the absorbance at 280 nm were collected and used as the ET-4D3 Fab fragment preparation. (2) Neutralization of Pseudomonas aeruginosa elastase enzyme activity using a synthetic substrate by the Fab fragment of the monoclonal antibody ET-4D3 Whether or not the Fab fragment of ET-4D3 was neutralized according to Example 2- (3) was furylacryloyl. -Glycyl-
It was examined using leucine amide (FAGLA). The examination conditions were carried out according to Example 2- (3). The results are shown in Table 4.
【0025】[0025]
【表4】 [Table 4]
【0026】(3)ET−4D3のFab断片による蛍
光標識エラスチンを基質として用いた緑膿菌エラスター
ゼ活性の中和 ET−4D3のFab断片のエラスターゼ活性の中和を
実施例3−(2)と同様にFITC−標識エラスチンを
用いて検討した。ET−4D3もしくはET−4D3の
Fab断片のPBS(−)溶液100μl,0.1Mト
リス−マレイン酸緩衝液(pH7.0)に10mg/m
lの濃度で懸濁したFITC−エラスチン懸濁液100
μl,及びエラスターゼ溶液(200μg/ml)5μ
lを混和、激しく攪拌しながら37℃,2時間インキュ
ベートした。反応後、混液を10,000rpm,3分間遠心して
得られた上清のうち100μlを回収し、上清中のFI
TC量を実施例2−(2)に従って測定した。結果を表
5に示す。(3) Neutralization of Pseudomonas aeruginosa elastase activity using fluorescence-labeled elastin as a substrate with Fab fragment of ET-4D3 Neutralization of elastase activity of Fab fragment of ET-4D3 was carried out in Example 3- (2). Similarly, FITC-labeled elastin was used for the study. 10 mg / m of ET-4D3 or Fab fragment of ET-4D3 in 100 µl of PBS (-) solution and 0.1 M tris-maleic acid buffer (pH 7.0).
FITC-elastin suspension 100 suspended at a concentration of 1
μl, and elastase solution (200 μg / ml) 5 μ
1 was mixed and incubated at 37 ° C. for 2 hours with vigorous stirring. After the reaction, the mixed solution was centrifuged at 10,000 rpm for 3 minutes, and 100 μl of the obtained supernatant was recovered and FI in the supernatant was collected.
The amount of TC was measured according to Example 2- (2). The results are shown in Table 5.
【0027】[0027]
【表5】 [Table 5]
【0028】以上の結果から、ET−4D3は、Fab
断片でもインタクトのIgGと同等に緑膿菌エラスター
ゼに対する高い中和活性を有することが示された。即
ち、酵素中和活性は、基質として合成ペプチド基質もし
くは蛍光標識エラスチンいずれを用いたときでも、ET
−4D3及び該抗体のFab断片に同様の中和活性が認
められた。From the above results, ET-4D3 was Fab
It was shown that the fragment also has a high neutralizing activity against Pseudomonas aeruginosa elastase as well as intact IgG. That is, the enzyme-neutralizing activity is determined by ET regardless of whether a synthetic peptide substrate or a fluorescently labeled elastin is used
-4D3 and the Fab fragment of the antibody showed similar neutralizing activity.
【0029】実施例4.モノクローナル抗体とエラスタ
ーゼの結合に対する各種金属プロテアーゼ阻害剤の影響 (1)ゲル濾過法による抗原抗体結合反応の解析 抗原であるエラスターゼとモノクローナル抗体の結合を
ゲルクロマトグラフィーで解析した。モノクローナル抗
体(10μg)とエラスターゼ(4.3μg)を混和
し、PBSで最終容量を500μlとした直後にSupero
se 6 カラム (φ1cmx30cm)に供した。この際のモノク
ローナル抗体とエラスターゼのモル比は1:2である。
280nmの吸収で蛋白の溶出位置を知った。結果を図
1に示した。エラスターゼ単独(イ)では29.3分,
モノクローナル抗体(ロ)はクローンに関わらず24.
9分,エラスターゼと抗エラスターゼモノクローナル抗
体のモル比2:1の混合物(ハ)では抗原−抗体複合体
が23.8分の溶出時間に認められた。 (2)金属プロテアーゼ阻害剤による抗原−抗体の結合
に及ぼす影響 エラスターゼ(4.3μg),モノクローナル抗体(1
0μg)およびエラスターゼの酵素活性を100%阻害
できる濃度の金属プロテアーゼ阻害剤を混和、最終容量
を500μlとして、実施例4−(1)に従ってSupero
se 6カラムに供した。なお、ホスホラミドンはペプチド
研究所より、HO−NHCO−CH(CH2-CH-(CH
3)2)−CO−Ala−Gly−NH2 はCalbiochem Cor
p. (SanDiego, CA, USA) より、エチレンジアミン四酢
酸(EDTA)およびo-phenanthrolineは同仁化学より
購入した。結果を図2に示す。ET−4D3のエラスタ
ーゼへの結合は100μMのホスホラミドンもしくは1
0μMのHO−NHCO−CH(CH2-CH-(CH3)2)
−CO−Ala−Gly−NH2 の添加によって阻害さ
れた(図2−イ,ロ)。一方、EDTAおよびO-phenan
throlineに関しては、エラスターゼ活性をほぼ100%
阻害する量の10倍量(1mM)添加してもET−4D
3とエラスターゼの結合に対して影響は認められなかっ
た(図2−ハ,ニ)。また、表1に示したET−4D3
以外の抗エラスターゼモノクローナル抗体についてはい
ずれの阻害剤を添加しても、抗原抗体反応に対する影響
は全く認められなかった。以上の結果は、ET−4D3
の抗原結合能が、エラスターゼの活性部位に指向性のあ
る阻害剤(ここではホスホラミドン,HO−NHCO−
CH(CH2 - H-(CH3)2)−CO−Ala−Gly−
NH2 )によって特異的に阻害されることを示してい
る。一方、エラスターゼの酵素活性に必須な亜鉛イオン
を金属キレート剤で取り除くことでは、ET−4D3を
初めとしてどのモノクローナル抗体もその抗原結合能に
影響は認められなかった。Example 4. Effect of various metalloprotease inhibitors on the binding between monoclonal antibody and elastase (1) Analysis of antigen-antibody binding reaction by gel filtration The binding between antigen elastase and monoclonal antibody was analyzed by gel chromatography. Immediately after mixing the monoclonal antibody (10 μg) and elastase (4.3 μg) to a final volume of 500 μl with PBS, immediately
It was applied to a se 6 column (φ1 cm × 30 cm). At this time, the molar ratio of the monoclonal antibody and elastase is 1: 2.
The elution position of the protein was known by absorption at 280 nm. The results are shown in Fig. 1. 29.3 minutes for elastase alone (a),
Monoclonal antibody (b) is 24.
At 9 minutes, an antigen-antibody complex was observed at an elution time of 23.8 minutes in the mixture (c) of the elastase and the anti-elastase monoclonal antibody in a molar ratio of 2: 1. (2) Effect of metalloprotease inhibitor on antigen-antibody binding Elastase (4.3 μg), monoclonal antibody (1
0 μg) and a metalloprotease inhibitor at a concentration capable of inhibiting 100% of the enzyme activity of elastase to give a final volume of 500 μl according to Example 4- (1).
It was applied to a se 6 column. Incidentally, phosphoramidon than Peptide Institute, HO-NHCO-CH (CH 2 -CH- (CH
3) 2) -CO-Ala- Gly-NH 2 is Calbiochem Cor
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and o-phenanthroline were purchased from Dojindo Chemical Co., Ltd. from p. (SanDiego, CA, USA). The results are shown in Figure 2. The binding of ET-4D3 to elastase was 100 μM phosphoramidon or 1
0μM of HO-NHCO-CH (CH 2 -CH- (CH 3) 2)
It was inhibited by the addition of -CO-Ala-Gly-NH 2 ( Fig. 2 b, b). On the other hand, EDTA and O-phenan
Almost 100% elastase activity for throline
ET-4D even when 10 times the amount of inhibition (1 mM) is added
No effect was observed on the binding between 3 and elastase (Fig. 2-C, D). In addition, ET-4D3 shown in Table 1
With respect to the anti-elastase monoclonal antibodies other than the above, no effect was observed on the antigen-antibody reaction by adding any inhibitor. The above results are ET-4D3
The ability to bind the antigen to the active site of elastase (here, phosphoramidon, HO-NHCO-
CH (CH 2 - H- (CH 3) 2) -CO-Ala-Gly-
It is shown to be specifically inhibited by NH 2 ). On the other hand, by removing the zinc ion essential for the enzymatic activity of elastase with a metal chelating agent, no influence was observed on the antigen-binding ability of any monoclonal antibody including ET-4D3.
【0030】(3)エラスターゼトキソイドに対するモ
ノクローナル抗体ET−4D3の結合性 エラスターゼ・トキソイドの調製は、以下の方法で行っ
た。市販緑膿菌エラスターゼ( 長瀬生化学) を 0.1M ト
リス緩衝液(pH7.5 ; 2mMCaCl2 含有)に対し1晩
透析した後、蛋白濃度が 0.5mg/ml となるように調製し
た。Moriharaらの方法(Journal of Clinical Microbiol
ogy 23, 53-55 (1986)) に従って作製したエステラーゼ
・トキソイドをトキソイド−Iと呼ぶ。具体的には(Cl
CH2-CO−HOLeu−Ala−Gly−NH2 、ペ
プチド研究所)を1mg/ml の濃度になるよう添加し室温
にて1晩反応し、トキソイド−I標品を作製した。さら
に、ホルマリンを用いて本間等の方法(Japanease Jour
nal of Experimental Medicene48, 111-133 (1978))に
従って作製したトキソイドをトキソイド−IIと呼ぶ。具
体的には、エラスターゼ(最終濃度2mg/ml)を4
%ホルマリン/0.2Mほう酸緩衝液(pH9.0)で
4℃,一夜反応させる。得られた生成物をSephadex G-5
0 (Pharmacia LKB カラムクロマトグラフィーに供し、
分子量約25,000-50,000に相当する蛋白画分をプールし
てトキソイド−II標品とした。2種のトキソイドに対す
るET−4D3の結合性をSuperose 6ゲル濾過クロマト
グラフィーによって検討した。実験条件は実施例3−
(1)に従った。結果を図2に示す。ET−4D3はト
キソイド−I ,トキソイド−IIいずれに対しても全く結
合性を示さなかった(図2−ホ,ト)。一方、表1に示
したET−4D3以外の抗エラスターゼ抗体に関しては
いずれもトキソイド−I に、定量的に結合した。(図2
−ヘ)(3) Binding of monoclonal antibody ET-4D3 to elastase toxoid The elastase toxoid was prepared by the following method. Commercially available Pseudomonas aeruginosa elastase (Nagase Biochemical) was dialyzed against 0.1 M Tris buffer (pH 7.5; containing 2 mM CaCl 2 ) overnight, and then the protein concentration was adjusted to 0.5 mg / ml. The method of Morihara et al. (Journal of Clinical Microbiol
The esterase toxoid prepared according to Ogy 23, 53-55 (1986)) is called toxoid-I. Specifically, (Cl
CH 2 -CO-HOLeu-Ala- Gly-NH 2, the Peptide Institute) was reacted overnight at room temperature was added to a concentration of 1 mg / ml, to prepare a toxoid -I preparation. Furthermore, using formalin, the method of Homma (Japanease Jour
The toxoid prepared according to nal of Experimental Medicene 48, 111-133 (1978) is called toxoid-II. Specifically, elastase (final concentration 2 mg / ml) was added to 4
React with 4% formalin / 0.2 M borate buffer (pH 9.0) at 4 ° C. overnight. The product obtained is sephadex G-5
0 (Pharmacia LKB column chromatography,
The protein fractions having a molecular weight of about 25,000-50,000 were pooled and used as a toxoid-II preparation. The binding properties of ET-4D3 to the two toxoids were investigated by Superose 6 gel filtration chromatography. Experimental conditions are Example 3-
Followed (1). The results are shown in Figure 2. ET-4D3 showed no binding property to either toxoid-I or toxoid-II (Fig. 2-e, g). On the other hand, all the anti-elastase antibodies other than ET-4D3 shown in Table 1 quantitatively bound to toxoid-I. (Fig. 2
-F)
【図1】抗エラスターゼモノクローナル抗体とエラスタ
ーゼの結合性のSuperose6ゲルクロマトグラフィーによ
る解析。(イ)はエラスターゼ,(ロ)はET−4D
3,(ハ)はET−4D3とエラスターゼをモル比1:
2で混合したもの。FIG. 1 Analysis of binding of anti-elastase monoclonal antibody and elastase by Superose 6 gel chromatography. (A) Elastase, (b) ET-4D
3, (C) is a molar ratio of ET-4D3 and elastase 1:
Mixture of 2.
【図2】モノクローナル抗体ET−4D3とエラスター
ゼの結合に対する各種金属プロテアーゼ阻害剤の影響,
およびET−4D3のエラスターゼトキソイドに対する
結合性のSuperose 6 ゲルクロマトグラフィーによる解
析いずれも、ET−4D3とエラスターゼ(もしくはそ
のトキソイド)はモル比1:2で混和している。(イ)
はホスホラミドンを100μM添加,(ロ)はHO−N
HCO−CH(CH2-CH-(CH3)2)−CO−Ala−
Gly−NH2 )を10μM添加,(ハ)はEDTAを
1mM添加,(ニ)はo-phenanthrolineを1mM添加時
におけるクロマトグラム。(ホ)はET−4D3とトキ
ソイド−I ,(ヘ)はET−2B1とトキソイド−I ,
(ト)はET−4D3とトキソイド−IIをそれぞれモル
比1:2で混和したときのクロマトグラム。破線1,
2,3は、それぞれ図1で求めたモノクローナル抗体/
エラスターゼ複合体,モノクローナル抗体,エラスター
ゼの溶出位置を示す。[FIG. 2] Effects of various metalloprotease inhibitors on the binding of monoclonal antibody ET-4D3 and elastase,
In both analysis of the binding of ET-4D3 to elastase toxoid by Superose 6 gel chromatography, ET-4D3 and elastase (or its toxoid) were mixed at a molar ratio of 1: 2. (I)
Is phosphoramidon 100 μM, (b) is HO-N
HCO-CH (CH 2 -CH- ( CH 3) 2) -CO-Ala-
Gly-NH 2 ) at 10 μM, (c) at 1 mM of EDTA, (d) at o-phenanthroline at 1 mM. (E) is ET-4D3 and toxoid-I, (f) is ET-2B1 and toxoid-I,
(G) is a chromatogram when ET-4D3 and toxoid-II were mixed at a molar ratio of 1: 2. Dashed line 1,
2 and 3 are the monoclonal antibody /
The elution positions of elastase complex, monoclonal antibody, and elastase are shown.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C07K 15/28 7731−4H C12N 5/20 G01N 33/573 A 9015−2J 33/577 B 9015−2J // C12N 15/06 G01N 33/569 D 9015−2J (C12P 21/08 C12R 1:91) (72)発明者 野口 浩 兵庫県宝塚市高司4丁目2番1号 住友化 学工業株式会社内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification code Internal reference number FI Technical display location C07K 15/28 7731-4H C12N 5/20 G01N 33/573 A 9015-2J 33/577 B 9015- 2J // C12N 15/06 G01N 33/569 D 9015-2J (C12P 21/08 C12R 1:91) (72) Inventor Hiroshi Noguchi 4-2-1 Takashi, Takarazuka-shi, Hyogo Sumitomo Chemical Co., Ltd.
Claims (14)
性中和活性を有するモノクローナル抗体1. A monoclonal antibody which specifically binds to Pseudomonas aeruginosa elastase and has toxicity-neutralizing activity.
の結合が金属プロテアーゼ阻害剤によって阻害されるこ
とを特徴とするモノクローナル抗体2. A monoclonal antibody which specifically binds to Pseudomonas aeruginosa elastase, and the binding is inhibited by a metalloprotease inhibitor.
あるいはHO−NHCO−CH(CH 2-CH-(CH3)2)
−CO−Ala−Gly−NH2 であることを特徴とす
る請求項2記載のモノクローナル抗体3. A metalloprotease inhibitor is phosphoramidon.
Or HO-NHCO-CH (CH 2-CH- (CH3)2)
-CO-Ala-Gly-NH2Is characterized by
The monoclonal antibody according to claim 2.
が、トキソイド化された緑膿菌エラスターゼには結合し
ないことを特徴とするモノクローナル抗体4. A monoclonal antibody which specifically binds to Pseudomonas aeruginosa elastase but does not bind to toxoidized Pseudomonas aeruginosa elastase.
特徴とする請求項1、2、3あるいは4項記載のモノク
ローナル抗体5. The monoclonal antibody according to claim 1, 2, 3 or 4, wherein the monoclonal antibody is IgG.
ノクローナル抗体における抗原結合に関与する部位を含
む抗体断片6. An antibody fragment containing a site involved in antigen binding in the monoclonal antibody according to claim 1, 2, 3, 4 or 5.
する請求項6記載の抗体断片7. The antibody fragment according to claim 6, wherein the antibody fragment is a Fab site.
る請求項6記載の抗体断片8. The antibody fragment according to claim 6, wherein the antibody fragment is an Fv site.
ローナル抗体を産生することを特徴とする細胞株9. A cell line which produces the monoclonal antibody according to claim 1, 2, 3 or 4.
88号)10. The cell line ET-4D3 (122)
88)
ーナル抗体11. A monoclonal antibody produced by the cell line ET-4D3.
クローナル抗体を産生する細胞株を培養することを特徴
とするモノクローナル抗体の製造方法12. A method for producing a monoclonal antibody, which comprises culturing a cell line producing the monoclonal antibody according to claim 1, 2, 3 or 4.
88号)を培養することを特徴とするモノクローナル抗
体の製造方法13. A cell line ET-4D3 (122)
88), a method for producing a monoclonal antibody, which comprises culturing
あるいは11記載のモノクローナル抗体または抗体断片
を含む緑膿菌感染症予防・治療剤14. Claims 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
Alternatively, a prophylactic / therapeutic agent for Pseudomonas aeruginosa infection comprising the monoclonal antibody or antibody fragment described in 11 above.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3316498A JPH05168493A (en) | 1991-11-29 | 1991-11-29 | Monoclonal antibody against pseudomonas aeruginosa elastase |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3316498A JPH05168493A (en) | 1991-11-29 | 1991-11-29 | Monoclonal antibody against pseudomonas aeruginosa elastase |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05168493A true JPH05168493A (en) | 1993-07-02 |
Family
ID=18077775
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3316498A Pending JPH05168493A (en) | 1991-11-29 | 1991-11-29 | Monoclonal antibody against pseudomonas aeruginosa elastase |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH05168493A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998042308A1 (en) * | 1997-03-25 | 1998-10-01 | Kao Corporation | Preventives for skin aging |
-
1991
- 1991-11-29 JP JP3316498A patent/JPH05168493A/en active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998042308A1 (en) * | 1997-03-25 | 1998-10-01 | Kao Corporation | Preventives for skin aging |
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