JPH07238096A - Antipolyubiquitin-monoclonal antibody and method for measuring polyubiquitin - Google Patents

Antipolyubiquitin-monoclonal antibody and method for measuring polyubiquitin

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JPH07238096A
JPH07238096A JP6028013A JP2801394A JPH07238096A JP H07238096 A JPH07238096 A JP H07238096A JP 6028013 A JP6028013 A JP 6028013A JP 2801394 A JP2801394 A JP 2801394A JP H07238096 A JPH07238096 A JP H07238096A
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polyubiquitin
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ubiquitin
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Masahiro Fujimuro
Nozomi Hibi
Hidekazu Nasu
Hitoshi Sawada
Koji Takada
Eiryo Yokozawa
望 日比
英良 横沢
均 沢田
雅弘 藤室
英和 那須
耕司 高田
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S R L:Kk
株式会社エスアールエル
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Abstract

PURPOSE: To obtain the subject antibody for measuring a polyubiquitin, etc., derived from an antibody-forming cell by immunization of an animal against a polyubiquitinized protein formed in vitro, being specifically reacted with polyubiquitin but not with monoubiquitin.
CONSTITUTION: Ubiquitin is reacted with a denatured lysozyme in 100mM tris- hydrochloric buffer solution (Ph 9.0) at 37°C for 1 hour to give a polyubiquitinized protein such as polyubiquitinized lysozyme. The polyubiquitinized protein is administered to BALB/c mouse and the mouse is immunized. After the final immunization, a splenocyte is collected, subjected to cell fusion with a mouse.myeloma cell to give a hybridoma. Then, a clone capable of producing an anti-polyubiquitin is selected from the hybridoma, the clone is cloned into a monoclone. The clone is cultured in a medium to give the objective anti-polyubiquitin.monoclonal antibody which is capable of specifically reacted with a polyubiquitin, but not with monoubiquitin and measuring polyubiquitin in high sensitivity.
COPYRIGHT: (C)1995,JPO

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【産業上の利用分野】本発明は、ポリユビキチンと特異的に結合する抗ポリユビキチン・モノクローナル抗体、 The present invention relates to a polyubiquitin and specifically anti-polyubiquitin monoclonal antibodies that bind,
および該モノクローナル抗体を用いるポリユビキチンの測定方法に関する。 And a method of measuring polyubiquitin using the monoclonal antibody.

【0002】 [0002]

【従来の技術】ユビキチン(ubiquitin )は、真核生物に普遍的に存在する蛋白質であり、下記(化1)に示すように、アミノ酸76残基を含むものである。 BACKGROUND OF THE INVENTION Ubiquitin (ubiquitin) is a protein present universally in eukaryotes, as shown in the following (Chemical Formula 1), is intended to include amino acid 76 residues. ユビキチンは、ヒトにおいても全身の細胞に存在し、以下に述べるように、重要な機能を有している。 Ubiquitin is present throughout the body of the cell in humans, as described below, has an important function.

【0003】 [0003]

【化1】 [Formula 1]

【0004】現在までに、ユビキチンは、選択的蛋白質分解の促進因子という役割を有することが明確にされている。 [0004] To date, ubiquitin is clearly to have a role in promoting factors of selective protein degradation. すなわち、細胞内において、E1(ユビキチン活性化酵素)、E2(ユビキチン結合酵素)、およびE3 That is, in cells, E1 (ubiquitin activating enzyme), E2 (ubiquitin-conjugating enzyme) and E3
(ユビキチン識別蛋白質)と呼ばれる酵素群の働きにより、ある標的蛋白質の中のリジン残基にユビキチン(化1)のC末端(Gly=グリシン)がイソペプチド結合する。 By the action of enzymes called (ubiquitin identification protein), C-terminus of ubiquitin (Formula 1) to a lysine residue in a given target protein (Gly = glycine) is isopeptide bonds. 次いで、その結合したユビキチン中のリジン残基に、更に別のユビキチンのC末端が結合する反応が連続して触媒されるため、結局、標的蛋白質にユビキチンの鎖状複合体(ポリユビキチン)が結合することとなる(この反応は、(ポリ)ユビキチン化反応と呼ばれている)。 Then, the lysine residue in the ubiquitin its bound, for further C-terminus of another ubiquitin binding reaction is continuously catalyst, after all, a chain complex of ubiquitin to the target protein (polyubiquitin) is coupled it become to (this reaction is called a (poly) ubiquitination reaction). このようにポリユビキチンが結合した標的蛋白質は、ポリユビキチン構造を認識する蛋白分解酵素により、直ちに分解される。 Thus polyubiquitin target protein bound, due recognizes proteolytic enzymes polyubiquitin structure is immediately degraded.

【0005】上記したユビキチン化反応が、どのような蛋白質を標的にするかという選択は、前記E3蛋白質が担うと考えられている。 [0005] ubiquitination reaction as described above is, choice of whether to what protein targets, the E3 proteins are thought to play. このようなユビキチン系において重要な点は、遊離状態のユビキチン(遊離型ユビキチン)が標的蛋白質に結合してポリユビキチンとなると、 Importantly in such ubiquitin system, when ubiquitin in a free state (free ubiquitin) is polyubiquitin bound to the target protein,
生化学的には別の物質として機能することである。 The biochemical is to act as another substance.

【0006】細胞や生物個体において、ユビキチンは熱ショック蛋白質(heat shock protein)の一種として知られており、一般的に種々の細胞侵襲に対応してその産生が昂進するが、このようなユビキチン産生の昂進は、 [0006] In cells or individual organisms, ubiquitin is known as a kind of heat shock protein (heat shock protein), although their production generally correspond to the various cell invasion is Koshin, such ubiquitin production It is of Koshin,
細胞等の侵襲時に増加する変性蛋白質の処理のためであると考えられている。 Believed to be due to the process of the modified protein is increased upon invasion of cells. 更に、ユビキチンは、アルツハイマー病、パーキンソン症侯群、ピック病、運動神経疾患などで特徴的に現れる細胞内封入体に蓄積されていることが、ユビキチンに対する抗体を用いた免疫組織化学的手法によって証明されている(Mayer, RJ et al., B Furthermore, ubiquitin, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, Pick's disease, be stored in intracellular inclusions which appear characteristically in such motor neuron diseases, demonstrated by immunohistochemistry using antibodies against ubiquitin are (Mayer, RJ et al., B
iochem. Biophys. Acta, 1089 , 141-157, 1991 )。 iochem. Biophys. Acta, 1089, 141-157, 1991). アルツハイマー病の細胞内封入体に蓄積されているユビキチンは、異常リン酸化タウ蛋白質に、ポリユビキチンとして結合しているものであることが最近確認されている(森島ら, 生化学, 65 , 662, 1993 )。 Ubiquitin stored in intracellular inclusions of Alzheimer's disease, abnormally phosphorylated tau protein, be those attached as polyubiquitin have been identified recently (Morishima et al., Biochemistry, 65, 662, 1993). これらの知見に基づき、上述したアルツハイマー病等の疾患においては、ポリユビキチン化された特定の蛋白質の分解が何等かの理由で不全となり、それが封入体に蓄積していく可能性と、変性蛋白質が封入体に隔離されてからポリユビキチン化を受ける可能性が考えられている(Mayer, R. Based on these findings, in diseases such as the above-mentioned Alzheimer's disease, degradation of polyubiquitinated specific protein becomes a failure for any reason, it the possibility of accumulating in inclusion bodies, denatured proteins There may undergo polyubiquitination is considered from isolated inclusion bodies (Mayer, R.
J. et al., Biochem.Biophys. Acta, 1089 , 141-157, J. et al., Biochem.Biophys. Acta , 1089, 141-157,
1991 )。 1991). この観点から、封入体内のユビキチンの消長は上記疾患の病状の進行と良く一致することが期待されるため、組織や体液中に含まれるポリユビキチンを定量することは、これらの疾患に関する臨床検査上、重要な意義を有する。 In this respect, Changes of ubiquitin inclusion bodies because it is expected that matches well with disease progression of the disease, quantifying the polyubiquitin contained tissues and in body fluids, clinical examination on for these diseases , it has an important significance.

【0007】 [0007]

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来技術においては、ポリユビキチン生成の分析は、放射性物質で標識されたユビキチンや、基質蛋白質を用いた煩雑な測定系を用いて行う必要があった。 [SUMMARY OF THE INVENTION However, in the prior art, analysis of the polyubiquitin generation, ubiquitin and labeled with a radioactive substance, it is necessary to perform using a complicated measurement system using the substrate protein.

【0008】より具体的には、従来におけるユビキチンの定量方法としては、ユビキチン活性化酵素(E1酵素)の存在下、[ 3 H]ATPとユビキチンとを酵素反応させ、酵素反応生成物である酵素−[ 3 H]ATP− [0008] More specifically, as a method for quantifying ubiquitin in conventional presence of ubiquitin-activating enzyme (E1 enzyme) is an enzyme reaction of [3 H] ATP and ubiquitin is an enzyme reaction product enzyme - [3 H] ATP-
ユビキチン複合体を測定するバイオアッセイ法(Rose, Bioassay to measure ubiquitin conjugate (Rose,
IA, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 , 14 IA, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 14
77-1481, 1987 );ユビキチン又はユビキチン−蛋白質複合体をニトロセルロース膜に固定化し、電気泳動を行った後、免疫染色してユビキチン−蛋白質複合体を測定する免疫染色法(Haas, AL and Bright, PM, J. 77-1481, 1987); ubiquitin or ubiquitin - protein complex immobilized on a nitrocellulose membrane, after electrophoresis, ubiquitin immunostaining - immunostaining (Haas measuring the protein complex, AL and Bright , PM, J.
Biol. Chem., 260 , 12464-12473, 1985 );ユビキチンに対する抗体を用いたラジオイムノアッセイ法; Mana .. Biol Chem, 260, 12464-12473 , 1985); radioimmunoassay using antibodies against ubiquitin; Mana
ka, H. et al., Neurosci. Lett., 13 9 , 147-149, 199 ka, H. et al., Neurosci . Lett., 13 9, 147-149, 199
2 );競合エンザイムイムノアッセイ(Wang, GP, e 2); competitive enzyme immunoassay (Wang, GP, e
t al., Acta Neuropathol. 82 , 6-12, 1991)等が知られている。 t al., Acta Neuropathol. 82 , 6-12, and 1991), and the like are known. これらの測定系は、遊離型ユビキチンの定量に有用であることが証明されているが、ポリユビキチンとの交差反応性に関する検討は全く為されていない。 These measuring system, it has proven useful for the determination of free ubiquitin, study on cross-reactivity with polyubiquitin is not at all made. 原理的にも、上述のバイオアッセイは、ユビキチンのC末端に対する反応を利用しているため、ポリユビキチンは測定し得ない。 Principle also, bioassays described above, because it uses the responses to the C-terminus of ubiquitin, polyubiquitin can not measure. また、上述のラジオイッムアッセイは、 Also, radio cum beam assay described above,
遊離型ユビキチンを抗原に用いて作成した抗体を用いている点で、更に、競合エンザイムイムノアッセイは遊離ユビキチンを競合相手に利用している点で、やはりポリユビキチンの定量には適さない。 The free ubiquitin in that it uses an antibody prepared by using the antigen, further competitive enzyme immunoassay in that it utilizes free ubiquitin in the competition, not suitable for quantification of still polyubiquitin.

【0009】実際、本発明者らの検討によれば、ユビキチン−キャリア蛋白質複合体を抗原として作成した通常のユビキチンに対する抗体(ポリクローナル抗体)を用いたラジオイムノアッセイにおいて、該抗体はポリユビキチンとは全く交差しないことが見出されている。 [0009] In fact, according to the study of the present inventors, the ubiquitin - in radioimmunoassay using antibodies (polyclonal antibodies) against the usual ubiquitin that created the carrier protein complex as an antigen, antibody completely polyubiquitin it has been found that do not intersect. このことは、免疫学的にも遊離型ユビキチンとポリユビキチンが別の物質として認識されることを意味している。 This means that the free ubiquitin and polyubiquitin in immunological is recognized as a different substance.

【0010】上述した従来の測定系を利用して、各種疾患の患者体液中のユビキチンを測定する試みがあるが、 [0010] Using the conventional measurement system described above measures the ubiquitin patient body fluids of various diseases, but there is an attempt,
この場合、得られたユビキチンの測定値は、上述した疾患の経過とは必ずしも一致していない(Manaka, H. et In this case, the resulting measured values ​​of ubiquitin do not necessarily coincide with the course of the disorders described above (Manaka, H. et
al., Neurosci. Lett., 139 , 147-149, 1992 )。 al., Neurosci. Lett., 139, 147-149, 1992). 本発明者の知見によれば、このような不一致の原因の一つとしては、上記ユビキチンの測定値がポリユビキチン濃度を反映していないことが挙げられる。 According to the findings of the present inventors, as one of the causes of this discrepancy, the measured value of the ubiquitin and the like may not reflect the polyubiquitin density.

【0011】本発明は、上記の従来技術の欠点を解消するポリユビキチンの測定方法を提供することにある。 [0011] The present invention is to provide a method of measuring polyubiquitin to overcome the drawbacks of the prior art described above.

【0012】より具体的には、本発明の目的は、簡便なポリユビキチン化反応の分析が可能なポリユビキチンの測定方法を提供することにある。 More specifically [0012] The object of the present invention is to provide a method of measuring the analytical capable polyubiquitin convenient polyubiquitin reactions.

【0013】本発明の他の目的は、検体中の微量なポリユビキチンを定量可能なポリユビキチンの測定方法を提供することにある。 Another object of the present invention is to provide a method of measuring quantifiable polyubiquitin a small amount of polyubiquitin in a sample.

【0014】本発明の更に他の目的は、高感度で再現性よくポリユビキチンを定量可能なポリユビキチンの測定方法を提供することにある。 A further object of the present invention is to provide a method of measuring with good reproducibility polyubiquitin quantifiable polyubiquitin with high sensitivity.

【0015】本発明の更に他の目的は、上記した特長を有するポリユビキチンの測定方法に好適に使用可能なモノクローナル抗体を提供することにある。 Still another object of the present invention is to provide a suitably usable monoclonal antibodies to the measuring method of polyubiquitin having the features described above.

【0016】 [0016]

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の結果、人工的(in vitro)に作成したポリユビキチン化蛋白質を抗原として動物に免疫した際に得られる抗体産生細胞を用いることが、ポリユビキチンに特異的な結合性を有し、モノユビキチンと実質的に反応しないモノクローナル抗体を得るために極めて有用であることを見出した。 The present inventors have SUMMARY OF THE INVENTION's intensive studies, the use of antibody-producing cells obtained in the polyubiquitination protein created artificially (in vitro) were immunized animal as an antigen , it has specific binding to polyubiquitin, was found to be extremely useful in order to obtain a monoclonal antibody which does not substantially react with monoubiquitin. 本発明者らは更に研究を続けた結果、このような特異的結合性を有するモノクローナル抗体を用いて免疫学的測定を行うことが、ポリユビキチンの特異的測定に極めて有用であることを見出した。 The inventors have found that further continued studies, performing the immunoassay using monoclonal antibodies having such specific binding has been found to be extremely useful for specific determination of polyubiquitin .

【0017】本発明のモノクローナル抗体は上記知見に基づくものであり、より詳しくは、インビトロで生成させたポリユビキチン化蛋白質の動物への免疫に基づく抗体産生細胞に由来するモノクローナル抗体であって、ポリユビキチンと特異的に反応し、モノユビキチンと実質的に反応しないことを特徴とするものである。 [0017] Monoclonal antibodies of the present invention is based on the above finding, and more particularly, a monoclonal antibody derived from the antibody-producing cells based on the immunization of the animal polyubiquitylated protein was generated in vitro, poly ubiquitinated specifically reactive, and is characterized in that does not substantially react with monoubiquitin.

【0018】本発明によれば、更に、インビトロで生成させたポリユビキチン化蛋白質の動物への免疫に基づく抗体産生細胞に由来するモノクローナル抗体であって、 According to the present invention, further, a monoclonal antibody derived from the antibody-producing cells based on the immunization of the animal polyubiquitylated protein was generated in vitro,
ポリユビキチンと特異的に反応し、モノユビキチンと実質的に反応しないモノクローナル抗体を用い;該抗体と、ポリユビキチンとの特異的結合性を利用して、ポリユビキチンを免疫学的方法で(すなわち、抗原−抗体反応を利用して)測定することを特徴とするポリユビキチンの測定方法が提供される。 Specifically react with polyubiquitin, using a monoclonal antibody which does not substantially react with monoubiquitin; and antibody, using the specific binding with the polyubiquitin, polyubiquitin with immunological methods (i.e., antigen - by using the antibody reaction) method of measuring polyubiquitin and measuring is provided.

【0019】以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明を詳細に説明する。 [0019] Hereinafter, with reference to the accompanying drawings as needed, the present invention will be described in detail.

【0020】(ポリユビキチン化蛋白質)本発明においては、インビトロで生成可能なポリユビキチン化蛋白質は、特に限定されないが、通常、生体内(in vivo )においてユビキチン依存的に分解されやすい蛋白質(すなわち、生体内で上記した酵素E1、E2、およびE3蛋白質の作用によりポリユビキチン化されやすい蛋白質、 [0020] In the (poly ubiquitinated proteins) the present invention, can generate polyubiquitinated protein in vitro, but are not limited to, usually, in vivo (in vivo) in the ubiquitin-dependent degraded susceptible proteins (i.e., enzyme E1, E2, and E3 proteins polyubiquitinated susceptible proteins by the action of the above-described in vivo,
以下「標的蛋白質」という)を用いることが好ましい。 It is preferable to use a hereinafter referred to as the "target protein").

【0021】より具体的には、本発明においては、下記〜の1つ以上(好ましくはいずれか2つ、特に〜 More specifically [0021] In the present invention, any two or more one of the following - (preferably, in particular -
の3つ)の条件を満たす蛋白質が好適に使用可能である。 Satisfying protein 3) of it can be preferably used.

【0022】分子中の適当な位置に、1個以上のリジン残基を有すること。 [0022] Suitable positions in the molecule, having one or more lysine residues.

【0023】N−末端アミノ酸が、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸;ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン等の疎水性アミノ酸;あるいはヒスチジン、アラニン、セリン、スレオニン等の一部の親水性アミノ酸のいずれかからなること。 The N- terminal amino acid, arginine, basic amino acids such as lysine; leucine, tryptophan, phenylalanine, hydrophobic amino acids tyrosine and the like; or histidine, alanine, serine, either part of the hydrophilic amino acid threonine, etc. it consists of.

【0024】蛋白質分子の「折り畳み状態」(foldin [0024] "folded state" of the protein molecule (foldin
g )が緩い(すなわち、unfolding な状態にある)こと。 g) is loose (ie, in the unfolding state) it.

【0025】本発明においては、このような蛋白質として、例えば、リゾチーム、リボヌクレアーゼA、ヘモグロビン等が好ましく用いられ、特に、熱的ないし化学的に変性させたリゾチーム、リボヌクレアーゼA、ヘモグロビン等が好ましく用いられる。 [0025] In the present invention, as such a protein, e.g., lysozyme, ribonuclease A, hemoglobin and the like are preferably used, in particular, lysozyme thermally or chemically denatured, ribonuclease A, hemoglobin, and the like are preferably used . 本発明においては、これらの他にも、種々の蛋白質が利用可能である(Ciecha In the present invention, in addition to these, various proteins are available (Ciecha
nover, A. and Schwartz, AL,TIBS, 14 , 48 nover, A. and Schwartz, AL, TIBS, 14, 48
3−488,1989;Rechsteiner, M.,Cell, 3-488,1989; Rechsteiner, M., Cell, 6
,615−618,1991;Vershavsky,A., Ce 6, 615-618,1991;. Vershavsky, A , Ce
ll, 69 ,725−735,1992)。 ll, 69, 725-735,1992).

【0026】(インビトロのポリユビキチン化反応系) [0026] (in vitro of poly-ubiquitination reaction system)
本発明においては、標的蛋白質のポリユビキチン化が可能である限り、インビトロにおけるポリユビキチン化反応系は特に制限されない。 In the present invention, as long as it is possible polyubiquitination of the target protein, poly-ubiquitination reaction system in vitro is not particularly limited. すなわち、真核生物由来のE In other words, the eukaryotic origin of E
1、E2、E3を含む系が使用可能である。 1, E2, systems containing E3 are available. 効率的な反応が可能な点からは、真核細胞として、ウサギ網状赤血球(比較的多くのE1、E2、E3を含む)、あるいは酵母が好適に使用可能である。 Efficient is from the point capable of reacting, as eukaryotic cells, (including a relatively large number of E1, E2, E3) rabbit reticulocyte, or yeast can be suitably used. これらの真核細胞は、そのホモジネート、懸濁液、ないし溶血液をそのまも用いてもよく、また必要に応じて、上記酵素を精製して(すなわち、上記酵素の純度を高めて)用いてもよい。 These eukaryotic cells, their homogenates, suspensions, or the hemolysate may be used Sonoma, and if necessary, by purifying the enzyme (i.e., to increase the purity of the enzyme) using it may be.

【0027】(動物)本発明においては、抗体産生細胞を採取すべき動物として、上記ポリユビキチン化蛋白質の免疫により抗体産生が可能な動物を特に制限なく用いることができる。 [0027] Animals in the present invention, as an animal should be obtained antibody-producing cells, in particular can be used without limitation that can produce the antibody animals by immunization of the polyubiquitinated protein. より具体的には例えば、ウシ、ブタ、 More specifically, for example, cattle, pigs,
ウサギ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等の哺乳動物が好ましく用いられる。 Rabbits, sheep, goats, dogs, cats, rats, mammals such as a mouse is preferably used. 効率的な免疫が可能な点からは、ラット、又はマウスが好ましく用いられ、 Efficient from immunity can point, rat, or mouse is preferably used,
抗体産生細胞との細胞融合の相手方たる腫瘍細胞(例えば、形質細胞腫)との適合性の点からは、マウス(例えば、BALB/Cマウス)が特に好ましく用いられる。 Counterpart serving tumor cells in the cell fusion between antibody-producing cells (e.g., plasmacytoma) in terms of compatibility with the mouse (e.g., BALB / C mice) are particularly preferably used.

【0028】(モノクローナル抗体の取得法)本発明のモノクローナル抗体の取得法としては、通常の方法(例えば、富山朔二・安東民衛編「単クローン抗体実験マニュアル」講談社、1987年を参照)を用いることが可能である。 [0028] (the acquisition method of monoclonal antibody) as the acquisition method of monoclonal antibody of the present invention, the usual way (for example, Toyama Tsuitachini-Ando MinMamoruhen "Monoclonal Antibody Experimental Manual" Kodansha, see 1987) is used It is possible.

【0029】より具体的には例えば、上記ポリユビキチン化蛋白質の適当量(通常、1〜100μg程度)からなる抗原を、必要に応じて当量のアジュバント(例えば、完全フロインド・アジュバント)とともに上記動物の腹腔内又は皮下に投与して該動物を免疫する。 [0029] More specifically, for example, an appropriate amount of the poly ubiquitinated proteins (usually about 1-100 [mu] g) an antigen consisting of equivalents optionally adjuvant (e.g., Complete Freund's adjuvant) along with the animal administered intraperitoneally or subcutaneously immunize animal. 必要に応じて、初回の免疫後、2〜3週の間隔で1回ないし数回の追加免疫を行ってもよい。 If necessary, after the initial immunization may be performed boosted once or several times at intervals of 2-3 weeks. 最終免疫の2〜3日後に脾細胞を取りだし、適当な腫瘍細胞と細胞融合させてハイブリドーマ(融合細胞)を得る。 Remove the spleen cells 2-3 days after the final immunization, to obtain a hybridoma (fused cell) with appropriate tumor cells and to cell fusion. このようにして得たハイブリドーマをクローニングすることにより、目的とするモノクローナル抗体産生株たるハイブリドーマを得ることができる。 By such cloning hybridoma thus obtained, it is possible to obtain a monoclonal antibody-producing strains serving hybridomas of interest.

【0030】(モノクローナル抗体の反応性)本発明のモノクローナル抗体は、ポリユビキチンと特異的に反応し、モノユビキチンと実質的に反応しないような特異的な結合性を有する抗体である。 [0030] Monoclonal antibodies of the present invention (reactive monoclonal antibodies) and polyubiquitin specifically reactive antibodies that have specific binding properties so as not to substantially react with monoubiquitin.

【0031】このような本発明のモノクローナル抗体の特異性は、例えば、以下のようにして評価することが可能である。 The specificity of the monoclonal antibodies of the present invention as described above, for example, it is possible to evaluate in the following manner.

【0032】すなわち、放射性ヨウ素( 125 I)標識ポリユビキチンと(特異性を測定すべき)モノクローナル抗体との結合に対する、非標識のポリユビキチン、並びに遊離型ユビキチン(モノユビキチン)の競合阻害度をラジオイムノアッセイ法により測定して、遊離型ユビキチン−モノクローナル抗体の結合性(A)に対するポリユビキチン−モノクローナル抗体の結合性(B)を測定する。 [0032] That is, (to be determined specificity) radioactive iodine (125 I) and labeled polyubiquitin on the binding of monoclonal antibodies, unlabelled polyubiquitin, as well as a competitive inhibition of the free ubiquitin (monoubiquitin) Radio measured by immunoassay methods, free ubiquitin - measuring the binding of monoclonal antibody (B) - polyubiquitin for binding of monoclonal antibodies (a). この際、本発明のモノクローナル抗体は、上記した結合性の相対比(B/A)が10 2以上であることが好ましく、10 3以上(特に10 4以上)であることが更に好ましい。 In this case, the monoclonal antibody of the present invention preferably has a relative ratio of binding as described above (B / A) is 10 2 or more, more preferably 10 3 or more (especially 10 4 or more).

【0033】上記ラジオイムノアッセイは、例えば、以下のようにして行うことができる。 [0033] The above radioimmunoassay, for example, can be carried out as follows.

【0034】本アッセイに用いる125 I標識ポリユビキチンは、後述する実施例7のポリユビキチン試料作成方法の一部を改変して得ることができる。 The 125 I-labeled polyubiquitin used in this assay can be obtained by modifying a part of the polyubiquitin sample preparation method of Example 7 to be described later. すなわち、実施例7の手法において、反応液に加えるユビキチンを125 That is, in the procedure of Example 7, a ubiquitin added to the reaction solution 125
I標識のものだけとし、且つ、その125 I標識ユビキチンの量を1000倍に増やす(約50,000,000 Only those of I-labeled, and increase the amount of the 125 I-labeled ubiquitin in 1000-fold (approximately 50,000,000
cpm、1μg相当)以外は実施例7と同様にして、高放射活性を有する125 I標識ポリユビキチン画分を得る。 cpm, 1 [mu] g equivalent) otherwise in the same manner as in Example 7 to give the 125 I-labeled polyubiquitin fraction having a high radioactivity. これを1%牛血清アルブミン(BSA)含有の10 This 1% bovine serum albumin (BSA) containing 10
mMリン酸緩衝液、150mM塩化ナトリウム、pH mM phosphate buffer, 150 mM sodium chloride, pH
7.2(PBS)からなるアッセイ緩衝液で約20,0 7.2 about in assay buffer consisting of (PBS) 20,0
00cpm/0.1mlに希釈し、 125 I標識ポリユビキチン液とする。 Diluted to 00cpm / 0.1ml, and 125 I-labeled polyubiquitin solution.

【0035】モノクローナル抗体液も、同様のアッセイ緩衝液で希釈して調製するが、この際の希釈率は、本アッセイ法で25〜50%程度の125 I標識ポリユビキチンが結合を示す程度のものであり、予め求めておく。 [0035] Monoclonal antibody solution also will be prepared by diluting with the same assay buffer, dilution at this time, of the order of 125 I-labeled polyubiquitin about 25-50% in this assay indicates binding , and the obtained in advance.

【0036】アッセイの1次反応は、この抗体液0.1 The primary reaction of the assay, the antibody solution 0.1
mlに、数10pg/mlから1μg/mlまでの希釈系列を持った非標識試料液(ポリユビキチン又は遊離型ユビキチン)0.1mlを加え、更に、 125 I標識ポリユビキチン液0.1mlと、アッセイ緩衝液0.2ml ml, and non-labeled sample solution with a dilution series of a few 10 pg / ml to 1 [mu] g / ml (the polyubiquitin or free ubiquitin) 0.1 ml was added, further, a 125 I-labeled polyubiquitin solution 0.1 ml, assay buffer 0.2ml
とを添加し、室温で15時間行う。 It was added the door, carried out for 15 hours at room temperature. 次いで、抗マウスイムノグロブリン・ヤギ血清(10倍希釈、オルガノンテクニカ社製)0.05mlと、2%正常マウス血清0. Then, anti-mouse immunoglobulin-goat serum (1:10 dilution, Organon Teknika Co.) and 0.05 ml, 2% normal mouse serum 0.
05mlと、7%ポリエチレングリコール6000の0.1ml(いずれも、溶媒はアッセイ緩衝液)とを加え、室温で1.5時間反応(2次反応)させた後、20 And 05Ml, (both the solvent assay buffer) 7% polyethylene glycol 6000 0.1 ml were added and after 1.5 hours at room temperature (secondary reaction), 20
00×g、30分間遠心し、抗体および抗原−抗体結合物からなる沈渣を得る。 Centrifuged at 00 × g, 30 minutes, antibody and antigen - obtaining a precipitate consisting of the antibody conjugate.

【0037】この沈渣の放射活性をガンマカウンターで測定することにより、抗体と結合している125 I標識ポリユビキチン量を求めることができる。 [0037] By measuring the radioactivity of the sediment in a gamma counter, it is possible to obtain a 125 I-labeled polyubiquitin amount which is bound to the antibody. 試料の結合性は、該試料の希釈系列によって得られる競合阻害曲線から求めることができる。 Binding of the sample can be determined from the competitive inhibition curve obtained by serial dilutions of the sample.

【0038】(免疫学的測定法)本発明のモノクローナル抗体は、上述したようにポリユビキチンに対して優れた結合性を有するため、このモノクローナル抗体とポリユビキチンとの抗原−抗体反応を利用した免疫学的測定法によれば、ポリユビキチンの選択的定量が可能となる。 [0038] Monoclonal antibodies of (immunoassay) the present invention has excellent binding to polyubiquitin, as described above, the monoclonal antibody and the antigen polyubiquitin - utilizing antibodies reactive immunity According to histological measurements, it is possible to selectively quantify polyubiquitin.

【0039】本発明で使用可能な免疫学的測定法は特に限定されないが、通常、各種のイムノアッセイ法(特に、標識イムノアッセイ法)が好適し使用可能である。 The immunoassay can be used in the present invention is not particularly limited, various immunoassay (particularly labeled immunoassay) are suitable to be used.
標識イムノアッセイにおける標識物としては、例えば、 As a labeling substance in the labeled immunoassay, e.g.,
放射性元素(ラジオイムノアッセイ;RIA)、酵素(エンザイムイムノアッセイ;EIAないしELIS Radioactive elements (radioimmunoassay; RIA), enzyme (enzyme immunoassay; EIA to ELIS
A)、蛍光物質(蛍光イムノアッセイ;FIA)が使用可能である。 A), a fluorescent substance (fluorescent immunoassay; FIA) can be used.

【0040】標識物質は、直接に抗原又は抗体に結合していてもよく、またビオチン−アビジン等の特異的結合性を有する物質の組合せを利用して間接的に標識されていてもよい。 The labeling substance, directly may be bonded to an antigen or antibody, also biotin - the combination of a substance having a specific binding of avidin or the like may be indirectly labeled using. 1つの標識物質(例えば、酵素標識ストレプトアビジン)を共通に用いてコストを低減すること等が可能な点からは、間接的標識法(例えば、ビオチン化抗原又は抗体と、酵素標識ストレプトアビジンとを組合せて、抗原又は抗体を酵素標識する)を用いることが好ましい。 One labeling substance (e.g., enzyme-labeled streptavidin) are terms that can or the like to reduce the cost by using a common, indirect labeling method (e.g., a biotinylated antigen or antibody, and an enzyme-labeled streptavidin combination, the antigen or antibody to an enzyme label) is preferably used.

【0041】イムノアッセイの手法は特に限定されず、 The immunoassay method is not particularly limited,
競合法、非競合法(サンドイッチ法等)、二抗体法等のいずれも使用可能である。 Competitive method, the non-competitive method (sandwich method), both of which are available, such as double antibody method. 高感度化が比較的容易な点からは、サンドイッチ法が特に好ましく用いられる。 From high sensitivity is relatively easy point, the sandwich method is particularly preferably used.

【0042】本発明においてイムノアッセイを使用する場合、上記した特異的結合性を有するモノクローナル抗体は、通常、固相に固定化するか、および/又は上記標識物で標識して用いればよい。 [0042] When using the immunoassay in the present invention, a monoclonal antibody having specific binding as described above may usually be immobilized on a solid phase, and / or may be used to label the above label. 例えば、サンドイッチ法イムノアッセイにおいては、固相化抗体又は標識抗体のいずれか1つを本発明の特異的モノクローナル抗体とし、他方を従来のポリクローナル抗体又は特異性の低い公知のモノクローナル抗体とすることも可能であるが、 For example, in the sandwich method immunoassays, one of the immobilized antibody or a labeled antibody and specific monoclonal antibodies of the present invention and the other can also be a conventional polyclonal or specificity low known monoclonal antibodies In Although,
定量性ないし感度を重視する場合には、固相化抗体および標識抗体の両方が本発明の特異的モノクローナル抗体であることが好ましい。 When emphasizing quantitative properties or sensitivity, it is preferred that both the immobilized antibody and the labeled antibody is specific monoclonal antibodies of the present invention.

【0043】このようなイムノアッセイの手法の詳細については、例えば、文献(Langone, JJ and Vunakis, [0043] For details of such immunoassay techniques, for example, literature (Langone, JJ and Vunakis,
HV, eds., "Methods in Enzymology" vol.92', Acad HV, eds., "Methods in Enzymology" vol.92 ', Acad
emic Press, 1983;Tijssen, P. 著、石川栄治監訳「エンザイムイムノアッセイ」東京化学同人、1989年; emic Press, 1983; Tijssen, P. al., Eiji Ishikawa Translation supervised "Enzyme Immunoassay" Tokyo Kagaku Dojin, 1989;
Chard, T. 著、北川ら訳「ラジオイムノアッセイ」東京化学同人、1990年)を参照することができる。 Chard, T. Author, Kitagawa et al translated "radioimmunoassay" Tokyo Kagaku Dojin, reference may be made to the 1990).

【0044】放射性物質の取扱・管理の煩雑さ、あるいは測定用器具(例えば、分光光度計)のコスト等の面からは、標識イムノアッセイ法の中でも、エンザイムイムノアッセイが特に好ましく用いられる。 The handling and management of the complexity of the radioactive material, or measuring instrument (e.g., spectrophotometer) from the viewpoint of cost and the like of, among the labeled immunoassay, enzyme immunoassay is particularly preferred.

【0045】以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。 [0045] Hereinafter, more detailed explanation of the present invention through examples.

【0046】 [0046]

【実施例】 実施例1 (ユビキチン化反応関連酵素E1、E2、およびE3蛋白質の調製)ウサギ網状赤血球に1.5倍量の1mMD EXAMPLE 1 (ubiquitination reaction related enzyme E1, E2, and preparation of E3 protein) of 1.5 times in a rabbit reticulocyte 1mMD
TT(ジチオスレイトール)と4mMMgCl 2を含む水溶液を加え5分間攪拌後、氷上で40分間放置して溶血させ、これを100,000×gで1時間遠心し、上清の網状赤血球溶解液を回収した。 TT After stirring (dithiothreitol) and 4MMMgCl 2 aqueous solution was added 5 minutes including, lysed and left on ice for 40 minutes, which was centrifuged for 1 hour at 100,000 × g, the reticulocyte lysate supernatant recovered. この溶解液300m This solution 300m
lを100,000×gで6時間遠心し、この上清を1 The l to 6 hours centrifuged at 100,000 × g, the supernatant 1
0mMリン酸緩衝液, 1mMDTT, pH7.0に透析した後、同緩衝液で平衡化したDEAEセルロースカラム (200ml) に添加した。 0mM phosphate buffer, 1 mM DTT, was dialyzed to pH 7.0, was added to the DEAE cellulose column equilibrated with the same buffer (200 ml). カラムを10mMリン酸緩衝液, 20mMKCl, 1mMDTT, pH7.0で洗浄後、50mMTris/HCl緩衝液, 0.5MK 10mM phosphate buffer column, 20mMKCl, 1mMDTT, washed with pH 7.0, 50 mM Tris / HCl buffer, 0.5 mK
Cl, 1mMDTT, pH7.5で吸着物質を溶出させた。 Cl, 1 mM DTT, and eluted with adsorbed material at pH 7.5. その溶出画分を60mg/ mlまで濃縮後、50m After concentrating the eluted fraction to 60 mg / ml, 50 m
MTris/HCl緩衝液, 0.2mMMgCl 2 , M Tris / HCl buffer, 0.2mMMgCl 2,
0.2mMDTT, 0.2mMATP(アデノシン 5 0.2mMDTT, 0.2mMATP (adenosine 5
´−三リン酸), 5%グリセロール, pH7.5に透析し、その後、ATPとMgCl 2を加え各々最終濃度5 '- triphosphate), 5% glycerol, and dialyzed to pH 7.5, then each final concentration of 5 plus ATP and MgCl 2
mMと10mMになるようにした。 It was set to mM and 10mM. この試料10ml This sample 10ml
に、50mMTris/HCl緩衝液, 10mMMgC To, 50 mM Tris / HCl buffer, 10MMMgC
2 , 0.2mMDTT, 5mMATP, 5%グリセロール, pH7.5で平衡化したユビキチン固定アガロースゲル10mlを加えて、室温で30分間攪拌し、該ゲルをカラム(内径16mm、長さ50mm)に詰めた。 l 2, 0.2mMDTT, 5mMATP, 5 % glycerol, in addition ubiquitin fixed agarose gel 10ml equilibrated with pH 7.5, stirred for 30 minutes at room temperature, packed the gel column (internal diameter 16 mm, length 50 mm) It was.

【0047】このカラムを上記した平衡化緩衝液で洗浄した後、50mMTris/HCl緩衝液, 20mMD [0047] After washing the column with equilibration buffer described above, 50 mM Tris / HCl buffer, 20MMD
TT, pH7.5でE1・ E2画分を溶出させ、50m TT, to elute the E1 · E2 fraction at pH7.5, 50m
MTris/HCl緩衝液, 1MKCl, 2mMDT M Tris / HCl buffer, 1MKCl, 2mMDT
T, pH9.0でE3画分を溶出させた。 T, was eluted E3 fraction at pH 9.0. E3画分は、 E3 Fraction,
直ちに1MTris/HCl緩衝液, pH7.5を加えて中和した。 Immediately 1M Tris / HCl buffer and neutralized by addition of pH 7.5. これらの溶出画分を、50mMTris/ These eluted fractions, 50 mM Tris /
HCl緩衝液, 1mMDTT, 1mMATP, 20%グリセロール, pH7.5に透析した後、限外濾過によりE1・ E2画分を0.5mg/ mlにまで、E3画分を1. 5mg/ mlにまでに濃縮して、−70℃で保存した。 HCl buffer, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 20% glycerol, was dialyzed to pH 7.5, the E1 · E2 fraction by ultrafiltration to a 0.5 mg / ml, up to 1. 5 mg / ml of E3 fraction and concentrated, and stored at -70 ℃.

【0048】 実施例2 (ポリユビキチン化蛋白質の調製)実施例1で得た0. [0048] obtained in Example 2 (Preparation of poly ubiquitinated proteins) Example 1 0.
15mg/ mlE1・ E2画分, および0.45mg/ 15mg / mlE1 · E2 fraction, and 0.45mg /
mlE3画分に、2. 5mg/ ml無機ピロホスファターゼ, 0.01mg/ mlクレアチンホスホキナーゼ, The mlE3 fraction, 2. 5 mg / ml inorganic pyrophosphatase, 0.01 mg / ml creatine phosphokinase,
10mMホスホクレアチン, 1mMDTT, 2mMAT 10mM phosphocreatine, 1mMDTT, 2mMAT
Pおよび10mMMgCl 2を含む100mMTris 100mMTris, including P and 10mMMgCl 2
/HCl緩衝液, pH9.0に最終濃度0.02mg/ / HCl buffer, final concentration in pH 9.0 0.02 mg /
mlの熱変性リゾチームと、最終濃度6mg/ mlのユビキチン(シグマ社製、商品名:ウシ赤血球ユビキチン、生化学試薬級)とを加えて37℃で1時間反応を行った。 And ml of heat-denatured lysozyme, final concentration 6 mg / ml of ubiquitin (Sigma, product name: bovine erythrocytes ubiquitin, biochemical reagent grade) for 1 hour at 37 ° C. was added a was performed. 氷冷により反応を停止させ、ポリユビキチン化蛋白質(ポリユビキチン化リゾチーム)液を調製した。 The reaction with ice-cold stopping, polyubiquitinated proteins (polyubiquitination lysozyme) solution was prepared.

【0049】他方、比較のため、ユビキチンを加えなかった以外は上記と同様の反応を行って対照反応液をも調製した。 [0049] On the other hand, for comparison, except for not adding the ubiquitin were also prepared the control reactions The reaction was carried out similar to the above.

【0050】 実施例3 (ポリユビキチン化蛋白質を認識するモノクローナル抗体産生細胞の調製)実施例2で得たポリユビキチン化蛋白質液300μlをアジュバント300μl(1回目はフロイント完全アジュバント、2回目以降は不完全アジュバント)とともに6週間に4回、BALB/Cマウスの腹腔内に投与して該マウスを免疫し、常法(富山朔二・安東民衛編「単クローン抗体実験マニュアル」講談社、1987年)によりハイブリドーマを作成した。 [0050] Example 3 (Preparation of monoclonal antibody-producing cells that recognize the polyubiquitinated protein) obtained in Example 2 was polyubiquitinated protein solution 300 [mu] l of adjuvant 300 [mu] l (1 round of Freund's complete adjuvant, the second and subsequent imperfect 4 times in 6 weeks with an adjuvant), was administered into the peritoneal cavity of BALB / C mice were immunized the mice, hybridoma by a conventional method (Toyama Tsuitachini-Ando MinMamoruhen "monoclonal antibody experimental manual" Kodansha, 1987) It was created. すなわち、上記マウスの脾細胞を採取し、マウス・ミエローマ細胞(ATCC (American Type Cuture Collectio That is, the spleen cells of the mice were collected, mouse myeloma cells (ATCC (American Type Cuture Collectio
n)由来、P3X63−Ag8.653)と細胞融合させてハイブリドーマを得た。 n) derived to obtain P3X63-Ag8.653) and then cell fusion hybridomas.

【0051】このようにして得たハイブリドーマの中から、目的とするポリユビキチン特異的抗体を産生しているクローンをスクリーニングするために、以下の(a) 〜 [0051] From among the hybridomas thus obtained, to screen for clones producing a polyubiquitin-specific antibody of interest, the following (a) ~
(e)の96ウェルマイクロプレートを調製した。 It was prepared 96-well microplate (e).

【0052】(a) ウサギ抗ユビキチンポリクロナール抗体をPBSで5μg/mlに希釈し、上記マイクロプレートの各ウエルに100μl ずつ加え、4℃で12時間反応させて該ウェルにウサギ抗ユビキチンポリクロナール抗体を吸着させた。 [0052] (a) a rabbit anti-ubiquitin polyclonal antibody was diluted to 5 [mu] g / ml with PBS, and added to each 100μl to each well of the microplate, 4 ° C. 12 hours by reacting with adsorbed rabbit anti-ubiquitin polyclonal antibody to the well It was. マイクロプレートをPBSで洗浄した後、PBS, 3%スキムミルクを200μl ずつ各ウェルに加え、室温で1時間放置しブロッキングを行った。 After the microplate was washed with PBS, and added to each well PBS, 3% skim milk by 200 [mu] l, it was left blocked 1 h at room temperature.

【0053】(b) 上記(a) のように処理したウェルに、 [0053] in treated wells as (b) above (a),
PBSで300倍に希釈したポリユビキチン化蛋白質液(実施例2で得たもの)を100μl ずつ加え、室温で2時間反応させた。 In addition polyubiquitinated protein solution diluted to 300-fold with PBS (obtained in Example 2) by 100 [mu] l, it was reacted at room temperature for 2 hours.

【0054】(c) PBSで200倍に希釈したポリユビキチン化蛋白質液(実施例2で得たもの)を、上記(a) [0054] (c) poly-ubiquitination was diluted 200-fold with PBS protein solution (obtained in Example 2), the (a)
と同様の方法で、マイクロプレートのウェルに吸着させ、スキムミルクでブロッキングを行った。 In a similar manner to, adsorbed to the wells of the microplate, blocking was performed with skim milk.

【0055】(d) 実施例2で比較のために得た対照反応液をPBSで200倍に希釈し、(a)と同様の方法で、 [0055] The control reactions obtained for comparison in (d) Example 2 was diluted to 200-fold with PBS, and in the same manner as in (a),
マイクロプレートのウェルに吸着させ、スキムミルクでブロッキングを行った。 Adsorbed to the wells of a microplate, blocking was performed with skim milk.

【0056】(e) ユビキチンをPBSで1mg/ ml、 [0056] (e) 1mg / ml ubiquitin with PBS, and
5mg/ ml、10mg/ ml、50mg/ mlに希釈し、(a) と同様の方法で、ウェルに吸着させ、スキムミルクでブロッキングした。 5mg / ml, 10mg / ml, diluted to 50 mg / ml, in the same manner as in (a), adsorbed to the wells were blocked with skim milk.

【0057】(a) 〜(e) の各種吸着処理をしたウェルをPBSで洗浄した後、上記で得たハイブリドーマの培養上清を100μl ずつ加えて、室温で2時間反応させた。 [0057] (a) After washing ~ wells in which the various adsorption process (e) with PBS, and added to the culture supernatant of the hybridomas obtained above by 100 [mu] l, was reacted at room temperature for 2 hours. 各ウェルをPBSで洗浄した後、PBSで500倍希釈したビオチン化抗マウスイムノグロブリン抗体(1. 5mg/ ml, Vector Laboratories )を100 Each well was washed with PBS, and biotinylated diluted 500-fold with PBS anti-mouse immunoglobulin antibody (1. 5mg / ml, Vector Laboratories) 100
μl ずつ加え、室温で1時間反応させた。 Added in [mu] l, and reacted at room temperature for 1 hour.

【0058】ウェルをPBSで洗浄した後、PBSで1 [0058] After the wells were washed with PBS, 1 with PBS
25倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン・ビオチン複合体(Vector Laboratories )を、100μl/ウェルで反応させた。 Peroxidase-labeled avidin-biotin complex was diluted to 25-fold (Vector Laboratories), it was reacted with 100 [mu] l / well. 次いで各ウェルをPBSで洗浄した後、50mMクエン酸緩衝液, pH5. 3, 0.2mg Then each well was washed with PBS, 50 mM citrate buffer, pH5. 3, 0.2mg
/ ml2, 2'-アジノ- ビス( 3- エチルベンゾチアゾリン- 6- スルホン酸) ジアンモニウム塩, 0.02% / Ml2, 2'-azino - bis (3-ethyl benzo thiazoline - 6-sulfonic acid) diammonium salt, 0.02%
22を200μl/ウェルで加えて、室温でウェル中の溶液を発色させ、405nmにおける吸光度を測定した。 The H 2 O 2 was added at 200 [mu] l / well, allowed to develop a solution in the wells at room temperature, the absorbance was measured at 405 nm. 上記細胞融合に用いたマウス・ミエローマ培養上清を用いた陰性コントロールを加えたウェルに比べて強く発色するウェルのものを陽性とした。 Those wells color stronger than the well plus the negative control using a mouse myeloma culture supernatant used for the cell fusion was positive.

【0059】このクローニングにおいては、上記(b) および(c) のウェルに対してはいずれも陽性で、且つ(a) [0059] In this cloning, in (b) above both for wells and (c) positive, and (a)
、(d) および(e) のウェルに対しては全て陰性である培養上清を与えるハイブリドーマを選択した。 Were selected hybridomas giving culture supernatant is all for the wells negative (d) and (e).

【0060】このようなクローニングの結果、遊離型ユビキチン(モノユビキチン)とは反応せず、ポリユビキチンと特異的に反応する抗体を産生する6種類のクローン(FK1, FK2, 31A, 99F, 135C, 16 [0060] As a result of these cloning, not react with the free ubiquitin (monoubiquitin), six clones producing antibodies specifically reactive with polyubiquitin (FK1, FK2, 31A, 99F, 135C, 16
9H)を得た。 9H) was obtained. 各モノクローナル抗体のモノユビキチンおよびポリユビキチンに対する反応性と、該抗体のサブクラスおよび軽鎖の種類とを下記表1に示す。 And reactivity to monoubiquitin and polyubiquitin of the monoclonal antibodies, a subclass and light chain type of the antibody are shown in Table 1 below.

【0061】 [0061]

【表1】 [Table 1]

【0062】上記表1において、ウェスタンブロッティングはTowbinらの方法(Towbin, H., et al., Proc. Na [0062] In Table 1, Western blotting Towbin et al. Method (Towbin, H., et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci., USA, 76 ,4350−4354,19 tl. Acad. Sci., USA , 76, 4350-4354,19
79)に従って行った。 It was performed according to 79). 記号「+」は陽性、「−」は陰性を意味する。 The symbol "+" is positive, "-" means negative. 陽性は、上記ウェスタンブロッティングにおいて、ニトロセルロース膜に転写された遊離型ユビキチン又はポリユビキチンにモノクローナル抗体が結合したことを示す。 Positive, in the above Western blotting, indicating that the monoclonal antibody binds to free ubiquitin or polyubiquitin were transferred to nitrocellulose membranes. より具体的には、結合したモノクローナル抗体にペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン(500倍希釈、ダコ・ジャパン)を結合させ、この酵素を利用した発色反応(PBS、0.05% 3, More specifically, bound monoclonal antibody peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin (500-fold dilution, Dako Japan) by binding, color development reaction (PBS using this enzyme, 0.05% 3,
3´−ジアミノベンチジン、0.02%過酸化水素で、 3'-diaminobenzidine, 0.02% hydrogen peroxide,
室温5分間)を行った。 Was carried out at room temperature for 5 minutes). 「+」記号が多い程、肉眼的に強く発色していることを示す。 As the "+" sign is large, indicating that it is visually strong color. ELISAは、上記エンザイムイムノアッセイの結果を意味しており、「+」記号が多い程、上記405nmにおける吸光度が大であったことを示す。 ELISA is meant the result of the enzyme immunoassay, as "+" sign is large, indicating that the absorbance at the 405nm was large.

【0063】 実施例4 (サンドイッチ法ELISA用抗体の精製)実施例3で得たFK2細胞をBALB/Cマウスに免疫して得た腹水を得た。 [0063] to afford Example 4 (Purification of sandwich method for ELISA antibody) FK2 cells obtained in Example 3 was obtained by immunizing BALB / C mice ascites. この腹水1mlに、等量の1M glicine - In this ascites 1ml, an equal volume of 1M glicine -
0.3MNaCl(塩化ナトリウム), pH8.6を加え24時間放置した。 0.3 M NaCl (sodium chloride) and allowed to stand for 24 hours added pH 8.6. この遠心上清を、0.1M borat The supernatant, 0.1M borat
e-0.15MNaCl, pH8.5で平衡化したprotei e-0.15MNaCl, protei equilibrated with pH8.5
n-Aカラム(商品名:ProSepA、ボクスイブラウン社製、4ml)に添加した。 n-A column (trade name: ProSepA, I Sui Brown Co., Ltd., 4ml) was added to. 該カラムを平衡化bufferで洗浄した後、0.1M citratepH4. 0で吸着画分を溶出させた。 After washing the column with equilibration buffer, it was eluted adsorbed fraction 0.1M citratepH4. 0. この溶出液を2MTrisで直ちに中和した後、PBSに対して透析し、限外濾過により濃縮したところ、腹水1mlあたり約7mgの高純度IgG1標品(精製FK2モノクローナル抗体)を得た。 After immediately neutralize the eluate 2M Tris, dialyzed against PBS, was concentrated by ultrafiltration to give about 7mg per ascites 1ml pure IgG1 preparation (purified FK2 monoclonal antibodies).

【0064】 実施例5 (ビオチン標識抗体の調製)実施例4で得た精製FK2 [0064] (Preparation of biotin-labeled antibody) Example 5 Purification obtained in Example 4 FK2
抗体溶液の一部を取り、限外濾過を用いてその溶媒を5 A portion of the antibody solution, the solvent 5 using ultrafiltration
0mM bicarbonatepH8.5に換えるとともに、抗体の濃度が約25mg/ mlになるように濃縮した。 With changing the 0mM bicarbonatepH8.5, and concentrated so that the concentration of the antibody is about 25 mg / ml. この抗体溶液に、NHS- LC-biotin (Pierse社製)を、 To this antibody solution, NHS- LC-biotin the (Pierse Co., Ltd.),
1mgの精製抗体あたり20μg添加し、氷冷下で2時間反応させた。 1mg was added the purified antibody per 20 [mu] g, it was reacted for 2 hours under ice cooling. 最後に未反応のビオチンを限外濾過で除去した。 Finally, to remove the biotin of unreacted by ultrafiltration.

【0065】 実施例6 (エンザイムイムノアッセイ)実施例5で得た精製FK [0065] Purified FK obtained in Example 6 (enzyme immunoassay) Example 5
2モノクローナル抗体をPBSで希釈して、該希釈液の5μg/mlマイクロプレートの各ウエルに100μl 2 monoclonal antibody diluted in PBS, 100 [mu] l to each well of 5 [mu] g / ml microplates of the diluent
ずつ加え、室温で4時間反応させて抗体を該ウェルに吸着させた。 It added portionwise, and the antibody reacted at room temperature for 4 hours adsorbed to the well. PBSに0.05%Tween20を含む液(PBS−T)で洗浄した後、3%牛血清アルブミン(BSA)- PBS−Tを250μl ずつ各ウェルに加え、4℃で1晩放置しウエルのブロッキングを行った。 After washing with the liquid (PBS-T) containing 0.05% Tween20 in PBS, 3% bovine serum albumin (BSA) - the PBS-T was added to each well 250 [mu] l, blocking overnight left wells 4 ° C. It was carried out.
ウェルをPBS−Tで2回洗浄した後、1%BSA- P After were washed twice with PBS-T the wells, 1% BSA-P
BS−Tで希釈した検体(被測定試料)100μl をウェルに入れ室温で12時間反応させて、固相化したFK BS-T with diluted sample is reacted at room temperature for 12 hours put (DUT) 100 [mu] l to the wells, immobilized FK
2モノクローナル抗体と検体中のポリユビキチンとを結合させた。 A polyubiquitin 2 monoclonal antibody in the sample was bound.

【0066】過剰の検体を除去した後、ウェルをPBS [0066] After removing the excess of the sample, the wells PBS
−Tで4回洗浄した。 It was washed four times with -T. 次いで、1%BSA- PBS−T Then, 1% BSA- PBS-T
で希釈した8μg/mlビオチン化FK2抗体100μ In diluted 8 [mu] g / ml biotinylated FK2 antibody 100μ
lをウェルに入れ、室温で6時間反応させて、固相化したFK2モノクローナル抗体に結合した(検体中の)ポリユビキチンと、ビオチン化FK2抗体とを結合させた。 Put l to the wells and allowed to react for 6 hours at room temperature, bound to FK2 monoclonal antibody immobilized and (in the sample) polyubiquitin, was bound to the biotinylated FK2 antibody.

【0067】過剰のビオチン化抗体液を除去し、ウエルをPBS−Tで4回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(DAKO社製)を約400ng/ [0067] remove excess biotinylated antibody solution was washed four times wells PBS-T, about the peroxidase-labeled streptavidin (DAKO Corporation) 400 ng /
ml含む1%BSA- PBS−Tをウェルあたり150 1% BSA-well per 150 PBS-T containing ml
μl加え、室温で0.5時間放置することにより、ビオチン−アビジン反応を利用してペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを上記ビオチン化FK2抗体を結合させた。 μl addition, by leaving at room temperature for 0.5 hours, biotin - using the avidin reaction was peroxidase-labeled streptavidin is bound the biotinylated FK2 antibody.

【0068】過剰の標識ストレプトアビジン液を除去し、PBS−Tで4回洗浄した後、150μlの100 [0068] remove excess labeled streptavidin solution, washed 4 times with PBS-T, 150 [mu] l of 100
mM citric acid, 0.4mg/ mlオルトフェニレンジアミン, 0.003%H 22 , pH5. 0を加え、 mM citric acid, 0.4mg / ml o-phenylenediamine, a 0.003% H 2 O 2, pH5 . 0 In addition,
室温で30分間反応させて、ペルオキシダーゼ存在下の発色反応を行った。 And reacted for 30 minutes at room temperature, was color reaction in the presence of peroxidase. 50μlの4N−HClを添加して発色反応を停止させた後、490nmにおける吸光度を測定した。 After stopping the color development reaction by adding 50μl of 4N-HCl, and the absorbance was measured at 490 nm.

【0069】本実施例の測定系における反応用緩衝液の最適pHは中性付近であり、最適NaCl濃度は0.0 [0069] Optimal pH of the reaction buffer in the measurement system of this embodiment is around neutral, the optimum NaCl concentration is 0.0
5〜0.2Mであることが確認された。 It was confirmed that the 5~0.2M. 本実施例においては、ビオチン化FK2抗体およびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンの濃度、および各種の反応温度・ In this embodiment, the concentration of biotinylated FK2 antibody and peroxidase-labeled streptavidin, and a variety of reaction temperature,
時間は、ほぼ最適範囲であることが確認されている。 Time is confirmed to be nearly optimal range.

【0070】 実施例7 (エンザイムイムノアッセイの評価)上記で用いたアッセイ系評価のために、遊離ユビキチン・ポリユビキチンの各型のユビキチン濃度が明確なポリユビキチン試料および対照試料を以下のように調製した。 [0070] For the assay system evaluation used in the above (evaluation of enzyme immunoassay) Example 7, ubiquitin concentration of each type of free ubiquitin-polyubiquitin prepare a clear polyubiquitin and control samples, as follows .

【0071】すなわち、10mMTris/HCl, 1 [0071] In other words, 10mMTris / HCl, 1
0mMNaCl, 25mMKCl,1. 1mMMgSO 0mMNaCl, 25mMKCl, 1. 1mMMgSO
4 ,0.1mMEDTA(エチレンジアミン四酢酸), 4, 0.1 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid),
1mMDTT, 0.1%CHAPS(3-[(3-cholamidop 1mMDTT, 0.1% CHAPS (3 - [(3-cholamidop
ropyl)-dimethylammoniol]-1-propanesulfonate ), 2 ropyl) -dimethylammoniol] -1-propanesulfonate), 2
mM hemin, および120μg/mlユビキチンからなる溶液に、実施例1で用いたウサギ網状赤血球溶解液のDEAEセルロースカラム吸着画分(最終濃度10mg mM Hemin, and 120 [mu] g / in ml consisting ubiquitin solution, rabbit reticulocyte lysate DEAE cellulose column adsorbed fraction (final concentration 10mg used in Example 1
/ ml)と、ATP供給用試薬(最終濃度1mMAT / Ml) and, ATP supply reagent (final concentration 1mMAT
P, 10mMホスホクレアチン, 20U/mlクレアチンキナーゼ)と、約50, 000cpmの125 I標識ユビキチン(約1pg相当)とを添加し、37℃で4時間反応させて、ポリユビキチン試料を作製した。 P, 10 mM phosphocreatine, and 20 U / ml creatine kinase), was added and 125 I-labeled ubiquitin about 50, 000cpm (about 1pg equivalent), for 4 hours at 37 ° C., to produce a polyubiquitin samples.

【0072】一方、ATP供給用試薬を添加しなかった以外は上記と同様の組成を有する反応液に、ATP枯渇化試薬(最終濃度で、50mMデオキシグルコース, 2 [0072] On the other hand, the reaction solution except for not adding the ATP supply reagent having the same composition as above, in ATP-depleted reagent (final concentration, 50 mM deoxyglucose, 2
0U/mlヘキソキナーゼ)を添加して、同様に対照試料を調製した。 0U / ml hexokinase) was added, was prepared in the same manner as the control sample.

【0073】各々の遊離ユビキチン、ポリユビキチンの各型ユビキチン濃度は、反応液の一部をゲル濾過カラムを用いてポリユビキチン画分と遊離ユビキチン画分とに分画し、各画分中の125 I放射活性を計測することで算出した。 [0073] Each of the free ubiquitin, each type ubiquitin concentration of polyubiquitin, a part of the reaction solution polyubiquitin fraction and fractionated free ubiquitin fraction and a two minutes using a gel filtration column, 125 in each fraction It was calculated by measuring the I radioactivity. このような計測の結果、ポリユビキチン試料のポリユビキチン、遊離型ユビキチンの濃度は、それぞれ45μg/mlおよび55μg/ml;対照試料中のポリユビキチン、遊離型ユビキチンの濃度は、それぞれ0 Such a result of measurement, polyubiquitin samples polyubiquitin, the concentration of free ubiquitin are each 45 [mu] g / ml and 55 [mu] g / ml; polyubiquitin in a control sample, the concentration of free ubiquitin are each 0
μg/mlおよび110μg/mlであった。 Was [mu] g / ml and 110 .mu.g / ml.

【0074】このようにして得たポリユビキチン試料および対照試料の両試料中のポリユビキチンと遊離型ユビキチンの濃度を、実施例6のエンザイムイムノアッセイで分析した。 [0074] The concentration of the polyubiquitin with free ubiquitin in both samples polyubiquitin and control samples obtained in this way was analyzed by enzyme immunoassay of Example 6. 測定結果を図1のグラフに示す。 The measurement results are shown in the graph of FIG. 図1においては、ポリユビキチン試料は該試料が含有するポリユビキチン濃度で表記され、一方対照試料は該試料が含有する遊離型ユビキチン濃度で表記されている。 In Figure 1, polyubiquitin samples is denoted by polyubiquitin density containing the sample, whereas the control samples are expressed in free ubiquitin concentration containing the sample.

【0075】図1のグラフに示したように、本実施例のエンザイムイムノアッセイによれば、0.3ng/ml [0075] As shown in the graph of FIG. 1, according to the enzyme immunoassay of the present embodiment, 0.3 ng / ml
から20ng/mlのポリユビキチンの定量が可能であることが確認された。 It from a possible quantification of 20 ng / ml of polyubiquitin were confirmed. 更に、100μg/mlまで遊離型ユビキチン濃度では、全く交差反応性が認められず、 Furthermore, the free ubiquitin concentration to 100 [mu] g / ml, not observed at all cross-reactivity,
遊離型ユビキチンの上記エンザイムイムノアッセイ系における交差反応性は、ポリユビキチンの0.0001% Cross-reactivity in the enzyme immunoassay system of free ubiquitin, 0.0001% of polyubiquitin
以下であることが確認された。 It is less than has been confirmed.

【0076】すなわち、本実施例のアッセイ系は、ポリユビキチンに極めて特異的であり、したがって微量のポリユビキチンが定量可能であることが判明した。 [0076] That is, the assay system of the present embodiment are highly specific to polyubiquitin, thus trace amounts of polyubiquitin have been found to be possible quantitative.

【0077】 [0077]

【発明の効果】上述したように本発明によれば、インビトロで生成させたポリユビキチン化蛋白質の動物への免疫に基づく抗体産生細胞に由来するモノクローナル抗体であって、ポリユビキチンと特異的に反応し、モノユビキチンと実質的に反応しないモノクローナル抗体が提供される。 Effects of the Invention According to the present invention as described above, a monoclonal antibody derived from the antibody-producing cells based on the immunization of the animal polyubiquitylated protein was generated in vitro, polyubiquitin specifically reactive and monoclonal antibodies that do not substantially react with monoubiquitin is provided.

【0078】このような本発明のモノクローナル抗体と、ポリユビキチンとの特異的結合性を利用してポリユビキチンを免疫学的方法で測定することにより、簡便な手法で、感度、定量性、および/又は選択性に優れたポリユビキチン測定が可能となる。 [0078] and monoclonal antibodies of the present invention, by measuring the polyubiquitin with immunological methods using specific binding to polyubiquitin, a simple technique, sensitivity, quantitation, and / or polyubiquitin measurement becomes possible with excellent selectivity.

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】実施例6のエンザイムイムノアッセイで分析した、ポリユビキチン試料および対照試料のポリユビキチン、遊離型ユビキチンの濃度を示すグラフである。 [1] was analyzed by enzyme immunoassay of Example 6 is a graph showing polyubiquitin samples and control samples polyubiquitin, the concentration of free ubiquitin.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 6識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/577 B //(C12P 21/08 C12R 1:91) (72)発明者 藤室 雅弘 北海道札幌市北区北20条西6丁目18番鶴見 荘33号 (72)発明者 沢田 均 北海道札幌市東区北13条東15丁目6番2 (72)発明者 横沢 英良 北海道札幌市中央区南19条西15丁目3番15 −501 ────────────────────────────────────────────────── ─── front page continued (51) Int.Cl. 6 identification symbol Agency Docket No. FI art display portion G01N 33/577 B // (C12P 21/08 C12R 1:91) (72) inventor Fujishitsu Masahiro Sapporo, Hokkaido, Kita-ku, Kita 20 Nishi 6-chome 18th Tsurumi Zhuang No. 33 (72) inventor Hitoshi Sawada Hokkaido, Sapporo Higashi-ku, Kita 13 Johigashi 15-chome No. 6 2 (72) inventor Yokozawa EiRyo Hokkaido Chuo-ku, Sapporo Minami 19 Jo Nishi 15-chome, No. 3 15 -501

Claims (10)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 インビトロで生成させたポリユビキチン化蛋白質の動物への免疫に基づく抗体産生細胞に由来するモノクローナル抗体であって、ポリユビキチンと特異的に反応し、モノユビキチンと実質的に反応しないことを特徴とするモノクローナル抗体。 1. A monoclonal antibody derived from the antibody-producing cells based on the immunization of the animal polyubiquitylated protein was generated in vitro, and polyubiquitin specifically react, it does not substantially react with monoubiquitin monoclonal antibody, characterized in that.
  2. 【請求項2】 前記ポリユビキチン化蛋白質が、ポリユビキチン化リゾチームである請求項1記載のモノクローナル抗体。 Wherein said polyubiquitination protein of claim 1, wherein the monoclonal antibody is a polyubiquitination lysozyme.
  3. 【請求項3】 前記動物が、BALB/Cマウスである請求項1記載のモノクローナル抗体。 Wherein the animal of claim 1, wherein the monoclonal antibody is a BALB / C mice.
  4. 【請求項4】 インビトロで生成させたポリユビキチン化蛋白質の動物への免疫に基づく抗体産生細胞に由来するモノクローナル抗体であって、ポリユビキチンと特異的に反応し、モノユビキチンと実質的に反応しないモノクローナル抗体を用い;該抗体と、ポリユビキチンとの特異的結合性を利用して、ポリユビキチンを免疫学的方法で測定することを特徴とするポリユビキチンの測定方法。 4. A monoclonal antibody derived from the antibody-producing cells based on the immunization of the animal polyubiquitylated protein was generated in vitro, and polyubiquitin specifically react, it does not substantially react with monoubiquitin using monoclonal antibodies; and antibody, using the specific binding with the polyubiquitin, measuring method of polyubiquitin and measuring the polyubiquitin with immunological methods.
  5. 【請求項5】 前記免疫学的方法が、標識イムノアッセイである請求項4記載のポリユビキチンの測定方法。 Wherein said immunological method is method of measuring a polyubiquitin of claim 4 wherein the labeled immunoassay.
  6. 【請求項6】 前記モノクローナル抗体が、標識物質で標識されている請求項5記載のポリユビキチンの測定方法。 Wherein said monoclonal antibody, method for measuring polyubiquitin according to claim 5 which is labeled with a labeling substance.
  7. 【請求項7】 前記モノクローナル抗体が固相化されている請求項5記載のポリユビキチンの測定方法。 7. A method of measuring the polyubiquitin according to claim 5, wherein said monoclonal antibody is immobilized.
  8. 【請求項8】 前記免疫学的方法が、エンザイム・イムノアッセイ(EIA)である請求項5記載のポリユビキチンの測定方法。 Wherein said immunological method is an enzyme immunoassay (EIA) method for measuring polyubiquitin claim 5, wherein.
  9. 【請求項9】 前記免疫学的方法が、ラジオ・イムノアッセイ(RIA)である請求項5記載のポリユビキチンの測定方法。 Wherein said immunological method is method of measuring a polyubiquitin according to claim 5, wherein the radio immunoassay (RIA).
  10. 【請求項10】 前記免疫学的方法が、蛍光イムノアッセイ(FIA)である請求項5記載のポリユビキチンの測定方法。 Wherein said immunological method is method of measuring a polyubiquitin according to claim 5, wherein the fluorescence immunoassay (FIA).
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