JPH05130866A - Stabilization of peroxidase in solution - Google Patents
Stabilization of peroxidase in solutionInfo
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- JPH05130866A JPH05130866A JP3047737A JP4773791A JPH05130866A JP H05130866 A JPH05130866 A JP H05130866A JP 3047737 A JP3047737 A JP 3047737A JP 4773791 A JP4773791 A JP 4773791A JP H05130866 A JPH05130866 A JP H05130866A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、酵素免疫測定法（以下
ＥＩＡと略す）などに用いることのできるペルオキシダ
ーゼ又はペルオキシダーゼと配位子との結合体の溶液状
態での安定化方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for stabilizing a peroxidase or a conjugate of a peroxidase and a ligand in a solution state, which can be used in an enzyme immunoassay (hereinafter abbreviated as EIA).
【０００２】[0002]
【従来の技術】溶液状態でのペルオキシダーゼの安定化
方法としては特開昭６１−２３９８９０号においてパラ
ヒドロキシフェニルカルボン酸を用いる方法が記載され
ている。2. Description of the Related Art As a method for stabilizing peroxidase in a solution state, a method using para-hydroxyphenylcarboxylic acid is described in JP-A-61-239890.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、パラヒ
ドロキシフェニルカルボン酸を用いた場合、少量の添加
で１〜３ヶ月という長期間酵素活性を失う事なく保存す
ることは困難であった。However, when para-hydroxyphenylcarboxylic acid was used, it was difficult to store it for a long period of time of 1 to 3 months without losing the enzyme activity even if it was added in a small amount.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、さらに安
定性のよいペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ
と配位子との結合体の安定化法を開発すべく鋭意検討し
た結果本発明に到達した。Means for Solving the Problems The present inventors have arrived at the present invention as a result of extensive studies to develop a more stable method for stabilizing peroxidase or a conjugate of a peroxidase and a ligand.
【０００５】すなわち、本発明はパラヒドロキシベンズ
アルデヒド、パラシアノフェノール、これらのアルカリ
金属塩もしくは下記一般式化２（式中Ｒは水素原子、炭
素数１〜４のアルキル基、ハロゲン原子、シアノ基、フ
ェニル基、アミノ基、ニトロ基もしくはモルホリノ基
で、ＯＸ基に対してオルト位またはパラ位に置換されて
いる。式中Ｘは水素原子、ナトリウム原子、カリウム原
子を表す）で表される化合物から選ばれるフェノール系
化合物と、必要により血清あるいは血清由来蛋白からな
る溶液中のペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ
と配位子との結合体の安定化法に関するものである。That is, the present invention relates to parahydroxybenzaldehyde, paracyanophenol, alkali metal salts thereof or the following general formula 2 (wherein R is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a halogen atom, a cyano group, Substituted with a phenyl group, an amino group, a nitro group or a morpholino group at the ortho position or the para position with respect to the OX group, wherein X represents a hydrogen atom, a sodium atom or a potassium atom) The present invention relates to a method for stabilizing a peroxidase or a conjugate of a peroxidase and a ligand in a solution containing a selected phenolic compound and optionally serum or serum-derived protein.
【０００６】[0006]
【化２】 [Chemical 2]
【０００７】この一般式で示される化合物として好まし
い化合物としてはパラヒドロキシベンズアルデヒド、パ
ラシアノフェノール、４−（メチルチオ）フェノール、
４−（エチルチオ）フェノール、４−（プロピルチオ）
フェノール、４−（ブチルチオ）フェノール、４−（ペ
ンチルチオ）フェノール、４−（フルオロメチルチオ）
フェノール、４−（ブロモメチルチオ）フェノール、４
−（クロロメチルチオ）フェノール、４−（ヨードメチ
ルチオ）フェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノ
ール、４−（ベンジルチオ）フェノール、４−（アミノ
メチルチオ）フェノール、４−（ニトロメチルチオ）フ
ェノールもしくは４−（モルホリノメチルチオ）フェノ
ール、などが挙げられるが、特に好ましくはパラヒドロ
キシベンズアルデヒド、パラシアノフェノール、４−
（メチルチオ）フェノール、４−（エチルチオ）フェノ
ール、４−（プロピルチオ）フェノール、４−（ブチル
チオ）フェノール、４−（ペンチルチオ）フェノール、
４−（フルオロメチルチオ）フェノール、４−（ブロモ
メチルチオ）フェノール、４−（クロロメチルチオ）フ
ェノール、４−（ヨードメチルチオ）フェノール、４−
（シアノメチルチオ）フェノール、４−（ベンジルチ
オ）フェノールである。Preferred compounds represented by the general formula include parahydroxybenzaldehyde, paracyanophenol, 4- (methylthio) phenol,
4- (ethylthio) phenol, 4- (propylthio)
Phenol, 4- (butylthio) phenol, 4- (pentylthio) phenol, 4- (fluoromethylthio)
Phenol, 4- (bromomethylthio) phenol, 4
-(Chloromethylthio) phenol, 4- (iodomethylthio) phenol, 4- (cyanomethylthio) phenol, 4- (benzylthio) phenol, 4- (aminomethylthio) phenol, 4- (nitromethylthio) phenol or 4- (morpholino) Methylthio) phenol, and the like, but particularly preferably parahydroxybenzaldehyde, paracyanophenol, 4-
(Methylthio) phenol, 4- (ethylthio) phenol, 4- (propylthio) phenol, 4- (butylthio) phenol, 4- (pentylthio) phenol,
4- (fluoromethylthio) phenol, 4- (bromomethylthio) phenol, 4- (chloromethylthio) phenol, 4- (iodomethylthio) phenol, 4-
(Cyanomethylthio) phenol and 4- (benzylthio) phenol.
【０００８】該フェノール化合物の添加量としては、本
発明の溶液中１０-4〜１ w/v %、好ましくは１０-3〜
０．５w/v %である。また、これらの化合物は単独で添
加することも、複数個組合わせて添加することも可能で
ある。The amount of the phenol compound added is 10 -4 to 1 w / v%, preferably 10 -3 to 1 in the solution of the present invention.
It is 0.5 w / v%. Further, these compounds may be added alone or in combination of two or more.
【０００９】本発明においてペルオキシダーゼとして
は、西洋ワサビ、牛乳、白血球、赤血球等から抽出され
たペルオキシダーゼが挙げられ、特に好ましくは西洋ワ
サビのペルオキシダーゼである。In the present invention, examples of the peroxidase include peroxidase extracted from horseradish, milk, leukocytes, erythrocytes and the like, and horseradish peroxidase is particularly preferable.
【００１０】また、ペルオキシダーゼは遊離のペルオキ
シダーゼでも、免疫活性物質に結合したペルオキシダー
ゼでも、また両者の混合物でもよい。The peroxidase may be free peroxidase, peroxidase bound to an immunoactive substance, or a mixture of both.
【００１１】この免疫活性物質は、特に限定されるもの
ではないが、例えばα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍マーカー抗原、およ
びその抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、甲
状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（Ｌ
Ｈ）などのホルモン抗原およびその抗体、あるいはサイ
ロキシン、トリヨードサイロニンなどのハプテンおよび
その抗体、もしくはプロテインＡ、アビジン、ビオチン
などが挙げられる。また、抗体としてはポリクローナル
抗体でもモノクローナル抗体のいずれでもよい。The immunologically active substance is not particularly limited, but for example, α-fetoprotein (AFP),
Tumor marker antigens such as carcinoembryonic antigen (CEA) and its antibodies, human chorionic gonadotropin (HCG), thyroid stimulating hormone (TSH), luteinizing hormone (L
H) and other hormone antigens and their antibodies, or thyroxine, triiodothyronine and other haptens and their antibodies, or protein A, avidin, biotin and the like. The antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
【００１２】ペルオキシダーゼと抗体あるいは抗原を結
合させる方法を例示すると種々の公知の方法、例えばグ
ルタルアルデヒドを用い、ペルオキシダーゼと抗体、抗
原のアミノ基の間で結合する方法［アブラメス等：イム
ノケミストリー、第６巻、４３ページ（１９６９年）］
あるいは、ペルオキシダーゼに含まれる糖鎖を過ヨウ素
酸で開裂させアルデヒド基を導入した後、抗体、抗原の
アミノ基との間にシッフ塩基を形成させ結合する方法
［ナカネ等：ジェー、ヒストケム、サイトケム、第２２
巻、１０８４ページ（１９７４年）］などがある。Examples of the method for binding peroxidase to an antibody or an antigen include various known methods, for example, a method in which glutaraldehyde is used to bind between an amino group of an antibody and an antigen [Abrames et al .: Immunochemistry, No. 6]. Volume 43 pages (1969)]
Alternatively, a method in which a sugar chain contained in peroxidase is cleaved with periodate to introduce an aldehyde group, and then a Schiff base is formed between the antibody and the amino group of the antigen to form a bond [Nakane et al .: J, Histochem, Cytochem, 22nd
Vol., P. 1084 (1974)].
【００１３】本発明の溶液に用いられる溶媒としてはリ
ン酸緩衝液、トリス緩衝液、バルビタール緩衝液、炭酸
緩衝液などの緩衝液が挙げられる、緩衝液の種類および
そのｐＨは特に限定されるものではなく、その目的、用
途に応じて最も適した緩衝液の種類、ｐＨを選択するこ
とが肝要である。Examples of the solvent used in the solution of the present invention include buffer solutions such as a phosphate buffer solution, a Tris buffer solution, a barbital buffer solution and a carbonate buffer solution. The kind of the buffer solution and its pH are not particularly limited. Instead, it is important to select the most suitable buffer solution type and pH according to the purpose and application.
【００１４】本発明において血清あるいは血清由来蛋白
を添加したほうがより一層ペルオキシダーゼの安定化に
効果がある場合がある。この場合、かかる血清としては
家兎血清、人血清、馬血清、牛胎児血清、牛血清、マウ
ス血清、ラット血清などが挙げられ、また血清由来蛋白
としては牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）、家兎
血清アルブミンなどが挙げられる。血清または血清由来
蛋白の添加量は、血清の場合溶液中０．１〜５０ w/v
%、血清由来蛋白の場合０．０１〜１０w/v % 用いるの
が好ましい。In the present invention, the addition of serum or serum-derived protein may be more effective in stabilizing peroxidase. In this case, such serum includes rabbit serum, human serum, horse serum, fetal bovine serum, bovine serum, mouse serum, rat serum, and the like, and serum-derived proteins include bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA), Examples include rabbit serum albumin. The amount of serum or serum-derived protein added is 0.1 to 50 w / v in the case of serum.
%, In the case of serum-derived protein, 0.01 to 10 w / v% is preferably used.
【００１５】その他、シュークロース、ラクトース、マ
ンニトールなどの糖類、酵素免疫測定法において非特異
的吸着を防止するのに用いられる界面活性剤等、カゼイ
ン、ゼラチンような血清成分の影響を防止する血清由来
でない蛋白質、またはチメロサールなどの防腐剤をそれ
ぞれの適量含有させてもよい。In addition, saccharides such as sucrose, lactose, and mannitol, surfactants used to prevent nonspecific adsorption in enzyme immunoassay, and serum-derived substances that prevent the influence of serum components such as casein and gelatin Non-preserved proteins or preservatives such as thimerosal may be contained in appropriate amounts.
【００１６】かくして得られた本発明による溶液はＥＩ
Ａ用キットなど、保存安定性を要求される用途向けに好
適である。The solution thus obtained according to the invention has an EI
It is suitable for applications requiring storage stability, such as A kit.
【００１７】[0017]
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例１ １．ペルオキシダーゼ標識抗原溶液の調製 ペルオキシダーゼ標識サイロキシン（Ｔ４）を０．２％
ＢＳＡ含有０．０２（モル／リットル）バルビタール緩
衝液（ｐＨ８．６）に溶解した。この溶液に４−（メチ
ルチオ）フェノール、４−（エチルチオ）フェノール、
４−（プロピルチオ）フェノール、４−（ブチルチオ）
フェノール、４−（ペンチルチオ）フェノール、４−
（フルオロメチルチオ）フェノール、４−（ブロモメチ
ルチオ）フェノール、４−（クロロメチルチオ）フェノ
ール、４−（ヨードメチルチオ）フェノール、４−（シ
アノメチルチオ）フェノール、４−（ベンジルチオ）フ
ェノール、パラハイドロキシベンズアルデヒド、パラシ
アノフェノール各々を０．１（w/v %）濃度になるよう
添加溶解した。また、これらフェノール系化合物を添加
しない上記溶液も同時に用意した。次いで各溶液を４℃
にて３ヶ月保存した。The present invention will be further described below with reference to examples, but the present invention is not limited thereto. Example 1 1. Preparation of peroxidase-labeled antigen solution 0.2% of peroxidase-labeled thyroxine (T4)
It was dissolved in 0.02 (mol / liter) barbital buffer solution (pH 8.6) containing BSA. 4- (methylthio) phenol, 4- (ethylthio) phenol,
4- (propylthio) phenol, 4- (butylthio)
Phenol, 4- (pentylthio) phenol, 4-
(Fluoromethylthio) phenol, 4- (bromomethylthio) phenol, 4- (chloromethylthio) phenol, 4- (iodomethylthio) phenol, 4- (cyanomethylthio) phenol, 4- (benzylthio) phenol, parahydroxybenzaldehyde, para Each cyanophenol was added and dissolved to a concentration of 0.1 (w / v%). In addition, the above-mentioned solution to which these phenolic compounds were not added was also prepared. Then each solution at 4 ℃
Stored for 3 months.
【００１８】２．安定性の評価 アッセイ用試験管にＴ３、Ｔ４フリー血清２０μｌと上
記個々の溶液を５００μｌ加え、均一溶液とした。次い
で抗Ｔ４抗体（ウサギ）結合ガラスビーズを加え、３７
℃で６０分間インキュベートした。反応終了後、未反応
物をアスピレーターで除去し、さらに生理食塩水１mlで
３回洗浄した。その後、０．３％ｏ−フェニレンジアミ
ン、０．０４％過酸化水素含有の基質溶液を加え、３７
℃で６０分間インキュベートした。１Ｎ硫酸５mlで反応
を停止させた後、各々について４９２nmの吸光度を測定
した。本測定をペルオキシダーゼ標識Ｔ４抗原を溶解し
た直後から１ヶ月毎に実施した。その結果を吸光度の低
減の度合に基づき検討開始時のペルオキシダーゼ活性を
１００％とし残存活性を百分率で表１に示した。2. Evaluation of Stability 20 μl of T3 and T4 free serum and 500 μl of each of the above solutions were added to a test tube for assay to make a homogeneous solution. Then add anti-T4 antibody (rabbit) conjugated glass beads,
Incubated at 60 ° C for 60 minutes. After completion of the reaction, unreacted substances were removed by an aspirator and further washed 3 times with 1 ml of physiological saline. Then, a substrate solution containing 0.3% o-phenylenediamine and 0.04% hydrogen peroxide was added,
Incubated at 60 ° C for 60 minutes. After stopping the reaction with 5 ml of 1N sulfuric acid, the absorbance at 492 nm was measured for each. This measurement was performed every month immediately after the peroxidase-labeled T4 antigen was dissolved. Based on the results, the peroxidase activity at the start of the study was set to 100% based on the degree of reduction in absorbance, and the residual activity was shown in Table 1 as a percentage.
【００１９】[0019]
【表１】 [Table 1]
【００２０】実施例２ １．ペルオキシダーゼ標識抗体溶液の調製 ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を
０．０２（モル／リットル）リン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）に溶解した。この溶液に４−（メチルチオ）フェノ
ール、４−（エチルチオ）フェノール、４−（プロピル
チオ）フェノール、４−（ブチルチオ）フェノール、４
−（ペンチルチオ）フェノール、４−（フルオロメチル
チオ）フェノール、４−（ブロモメチルチオ）フェノー
ル、４−（クロロメチルチオ）フェノール、４−（ヨー
ドメチルチオ）フェノール、４−（シアノメチルチオ）
フェノール、４−（ベンジルチオ）フェノール、パラハ
イドロキシベンズアルデヒド、パラシアノフェノールを
各々０．１（w/v %)濃度になるよう添加溶解した。ま
た、これらフェノール系化合物を添加しない上記溶液も
同時に用意した。次いで各溶液を４℃にて３ヶ月保存し
た。Example 2 1. Preparation of Peroxidase-Labeled Antibody Solution Peroxidase-labeled anti-CEA monoclonal antibody was added to 0.02 (mol / liter) phosphate buffer (pH 7.
It was dissolved in 2). 4- (methylthio) phenol, 4- (ethylthio) phenol, 4- (propylthio) phenol, 4- (butylthio) phenol, 4
-(Pentylthio) phenol, 4- (fluoromethylthio) phenol, 4- (bromomethylthio) phenol, 4- (chloromethylthio) phenol, 4- (iodomethylthio) phenol, 4- (cyanomethylthio)
Phenol, 4- (benzylthio) phenol, para-hydroxybenzaldehyde, and para-cyanophenol were added and dissolved to a concentration of 0.1 (w / v%) each. In addition, the above-mentioned solution to which these phenolic compounds were not added was also prepared. Then, each solution was stored at 4 ° C. for 3 months.
【００２１】２．安定性の評価 アッセイ用試験管にＣＥＡ ６０ng/ml溶液１００μｌと
上記個々の溶液を５００μｌ加え、均一溶液とした後抗
ＣＥＡ抗体（ウサギ）結合ガラスビーズを加え、３７℃
で６０分間インキュベートした。反応終了後、未反応物
をアスピレーターで除去し、さらに生理食塩水１mlで３
回洗浄した。その後、０．３％ｏ−フェニレンジアミ
ン、０．０４％過酸化水素含有の基質溶液を加え、３７
℃で６０分間インキュベートした。１Ｎ硫酸５mlで反応
を停止させた後、各々について４９２nmの吸光度を測定
した。本測定をペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクロ
ーナル抗体を溶解した直後から１ヶ月毎に実施した。そ
の結果を吸光度の低減の程度に基づき検討開始時のペル
オキシダーゼ活性を１００％とし残存活性を百分率で表
２に示した。2. Evaluation of stability 100 μl of CEA 60 ng / ml solution and 500 μl of each of the above solutions were added to a test tube for assay to make a homogenous solution, and anti-CEA antibody (rabbit) -bound glass beads were added, and the mixture was incubated at 37 ° C.
And incubated for 60 minutes. After the reaction was completed, unreacted substances were removed with an aspirator, and further washed with 1 ml of physiological saline.
Washed twice. Then, a substrate solution containing 0.3% o-phenylenediamine and 0.04% hydrogen peroxide was added,
Incubated at 60 ° C for 60 minutes. After stopping the reaction with 5 ml of 1N sulfuric acid, the absorbance at 492 nm was measured for each. This measurement was performed every month immediately after the peroxidase-labeled anti-CEA monoclonal antibody was dissolved. Based on the result, the peroxidase activity at the start of the study was set to 100% based on the degree of decrease in absorbance, and the residual activity was shown in Table 2 in percentage.
【００２２】[0022]
【表２】 [Table 2]
【発明の効果】本発明により、遊離のペルオキシダーゼ
および／またはペルオキシダーゼ結合体の酵素活性を長
期間維持することが可能となった。従って、ＥＩＡ用キ
ットなど保存安定性を要求される用途向けに好適であ
る。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it becomes possible to maintain the enzymatic activity of free peroxidase and / or peroxidase conjugate for a long period of time. Therefore, it is suitable for applications requiring storage stability such as EIA kits.
Claims (4)
ラシアノフェノール、これらのアルカリ金属塩もしくは
下記一般式化１（式中Ｒは水素原子、炭素数１〜４のア
ルキル基、ハロゲン原子、シアノ基、フェニル基、アミ
ノ基、ニトロ基もしくはモルホリノ基で、ＯＸ基に対し
てオルト位またはパラ位に置換されている。式中Ｘは水
素原子、ナトリウム原子、カリウム原子を表す）で表さ
れる化合物から選ばれるフェノール系化合物と、必要に
より血清あるいは血清由来蛋白からなる溶液中のペルオ
キシダーゼもしくはペルオキシダーゼと配位子との結合
体の安定化法。 【化１】 1. Parahydroxybenzaldehyde, paracyanophenol, an alkali metal salt thereof or the following general formula 1 (wherein R is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a halogen atom, a cyano group, a phenyl group, A phenol selected from the group consisting of an amino group, a nitro group and a morpholino group, which are substituted at the ortho or para position with respect to the OX group, where X represents a hydrogen atom, a sodium atom or a potassium atom. A method for stabilizing a peroxidase or a conjugate of a peroxidase and a ligand in a solution comprising a system compound and, if necessary, serum or serum-derived protein. [Chemical 1]
（w/v %）含有される請求項１に記載の方法。2. The compound to be added is 10 −4 to 1 in the solution.
The method according to claim 1, wherein (w / v%) is contained.
がペルオキシダーゼと抗原又は抗体の結合物である請求
項１または２記載の方法。3. The method according to claim 1 or 2, wherein the conjugate of peroxidase and the ligand is a conjugate of peroxidase and an antigen or antibody.
胎児血清、牛血清、マウス血清、ラット血清であり、血
清由来蛋白が牛血清アルブミン、家兎血清アルブミンで
ある請求項１または２もしくは３に記載の方法。4. The method according to claim 1, wherein the serum is rabbit serum, human serum, horse serum, fetal bovine serum, bovine serum, mouse serum, rat serum, and the serum-derived protein is bovine serum albumin or rabbit serum albumin. The method according to 2 or 3.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3047737A JP2526179B2 (en) | 1991-02-19 | 1991-02-19 | Peroxidase stabilization method in solution |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP3047737A JP2526179B2 (en) | 1991-02-19 | 1991-02-19 | Peroxidase stabilization method in solution |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05130866A true JPH05130866A (en) | 1993-05-28 |
| JP2526179B2 JP2526179B2 (en) | 1996-08-21 |
Family
ID=12783661
Family Applications (1)
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| JP3047737A Expired - Fee Related JP2526179B2 (en) | 1991-02-19 | 1991-02-19 | Peroxidase stabilization method in solution |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2526179B2 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0242982A (en) * | 1988-04-26 | 1990-02-13 | Konica Corp | Stable peroxidase composition and stable antibody composition |
-
1991
- 1991-02-19 JP JP3047737A patent/JP2526179B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0242982A (en) * | 1988-04-26 | 1990-02-13 | Konica Corp | Stable peroxidase composition and stable antibody composition |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| JP2526179B2 (en) | 1996-08-21 |
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