JPH0454903B2 - - Google Patents
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Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、体液または尿中に含まれるハプテン
を検出するための試薬に関する。
〔技術の背景および従来技術の説明〕
ハプテン、低分子化合物で、それ自体は抗原性
を有しないが、蛋白質または多糖類などの高分子
物質と複合体を形成することによつて、抗原性を
示し、動物に非経口的に投与したときに、抗体を
生成するものである〔アドバンシズ イン イミ
ユノロジー（Advances in Immunology）第17
巻 第255〜310頁（1973年）アカデミツク プレ
ス、米国（Academic Press USA）〕。
血液等の体液または尿中に含まれるホルモン及
び薬物等のハプテンを含む生理活性物質を測定す
ることは、従来から病気の診断、予後判定及び治
療法の決定等に極めて有効な手段の一つである。
これらのハプテンの存在を測定するために、生物
学的、物理学的、化学的あるいは免疫学的方法が
知られている。特に免疫学的方法によるラジオイ
ミユノアツセイ（radio Immunoassay）、エンチ
ームイミユノアツセイ（enzyme Immunoassay）
等は、体液または尿中の微量成分を特異的かつ再
現性よく測定できるので臨床検査の分野で使用さ
れているが、放射性物質を扱うための危険性、酵
素を用いるために使用期間が限定される問題点あ
るいは特殊な機器を要し、手順が複雑で時間を要
するという問題点がある。そこで微粒子担体を用
いる免疫学的凝集あるいは凝集阻止反応による体
液または尿中の微量成分検出法が、簡易かつ迅速
であるが故に、広く実用に供されている。
この免疫学的方法として、たとえば、測定対象
のハプテンを血清アルブミンの如き高分子物質に
結合させた複合体を調製し、これを抗原として動
物に免疫して得られたハプテンに対する抗体（以
下「ハプテン抗体」と略記する）を得たのち、こ
のハプテン抗体と該ハプテン一高分子複合体を赤
血球等の微粒子担体に感作して得たハプテン感作
担体とを使用して、この間に生じる凝集反応を測
定対象のハプテンが阻止する反応（いわゆる凝集
阻止反応）に基づいて行なう方法があり、かかる
免疫学的測定法を関連して、赤血球の代りに合成
ラテツクス、ベントナイト、カオリン、コロジオ
ン、活性炭、石英等の非生物学的微粒子が担体と
して用いられる方法が知られている。（例えば特
開昭51−9715号公報）。更にハプテンの一種であ
るステロイドを牛血清アルブミン（BSA）に結
合させた複合体を抗原として用いることも知られ
ている〔ジヤーナル オブ バイオロジカル ケ
ミストリ（Journal of Biological Chemistry）
第228巻、第713〜27頁（1957年）〕。またハプテン
の一種であるテストステロン、エストラジオール
そしてモルフインを牛血清アルブミンに結合させ
た複合体を用い動物に免疫して得た各ハプテン抗
体と、該複合体の牛血清アルブミンをヒト血清ア
ルブミン（HSA）又は家兎血清アルブミン
（RSA）に置き換えたそれぞれのハプテン一血清
アルブミン複合体を赤血球に感作して得られる感
作担体とを組合せて、各々のハプテンを測定でき
ることが報告されている〔ネイチユアー
（Nature）第214巻第1044〜５頁（1967年）、及び
ジヤーナル オブ イミユノロジー（Journal of
Immunology）第106巻、第1684〜５頁（1971
年）。またハプテン抗体を担体に感作した抗体感
作担体と、該ハプテン抗体と反応するハプテンを
抗原性のキヤリアーに結合させたハプテン−キヤ
リアー結合物又は該結合物感作担体とを用いるハ
プテンの免疫学的測定法（特開昭53−41420号公
報）、更にハプテンとカルボキシル基含有モノオ
レフイン高分子化合物との結合物を化学的に高分
子ラテツクスに結合させた感作ラテツクスと該ハ
プテン抗体または該抗体感作担体を用いる方法が
提案されている（特開昭55−52945号公報）。また
ステロイドを凝集阻止反応に基づいて測定するた
めに使用するステロイド−アルブミン複合体感作
ラテツクスにおいて、該複合体のアルブミン１分
子当りのステロイドが0.5〜７分子である試薬の
製造法も提案されている（特開昭58−19222号公
報）。
これらの方法または試薬は各々一定の効果を見
い出し得るが、判定に要する時間が長いこと、陽
性と陰性の差が不明瞭であること、非特異的凝集
等被検液中のきよう雑物の影響を受けることある
いは工程が多くの試薬の調製が複雑であること等
のいくつかの問題点がある。
一方、ハプテンの免疫学的測定において、これ
までにハプテン−ガンマグロブリン複合体を赤血
球に感作した例はあるが（特開昭50−123819号公
報及び特開昭53−41420号公報）、ラテツクス粒子
等の非生物学的粒子に感作した例はなく、まして
やハプテンアシル化剤で化学的に修飾したガンマ
グロブリン（アシル化−GG）との複合体を微粒
子担体に感作した試薬を用いることは従来全く知
られてなかつた。
本発明者等は体液または尿中に存在する微量の
ハプテンを免疫学的に再現性よく、鋭敏な感度で
短時間に測定でき、しかも簡単に調製できる試薬
の開発を目標に研究を行なつた結果、ハプテン−
アシル化−ガンマグロブリン複合体をラテツクス
粒子に感作することによつて得られる免疫学的ハ
プテン測定試薬によつて、極めて有効に上記目標
を達し得ることを見出し、この知見に基づいて本
発明を完成した。
〔発明の目的及び発明の要約〕
本発明の目的は被検液中のきよう雑物の影響を
受けずに高感度で、かつ迅速にハプテンを測定し
得る試薬を提供することにある。
本発明の他の目的は、測定結果が明瞭であつて
結果の判定に個人差が生じ難いハプテン測定試薬
を提供することにある。
本発明は、ハプテンとアシル化剤で化学的に修
飾したガンマグロブリンとからなる複合体を感作
した微粒子担体を含むことを特徴とする免疫学的
ハプテン測定試薬である。
〔発明の具体的な説明〕
本明細書におけるハプテンは、低分子化合物
で、それ自体は抗原性を有しないが、蛋白質、多
糖類等の高分子化合物と複合体を形成することに
より抗原性を示し、動物に非経口的に投与された
時に抗体を生成するものである。かかるハプテン
として、例えばエストリオール、プレグナンジオ
ール等のステロイドホルモン類、ガストリン、オ
キシトシン等の低分子ペプチドホルモン類、プロ
スタグランジン、サイロキシン等の非ペプチドホ
ルモン類、エピネフリン、ドパミン等のカテコー
ルアミン類、葉酸、ビタミンＡ等の補酵素ビタミ
ン類、ジゴキシン、バルビツール酸等の薬物類、
ペニシリン、テトラサイクリン等の抗生物質類、
モルフイン、コデイン等のアルカロイド類、グル
クロン酸、乳糖等の低分子炭水化物、ピリミジ
ン、ヌクレオシド等の核酸成分、ベンズピレン、
アミノフルオレン等の発ガン物質、更にこれらの
代謝物等がある。本明細書では、ホルモン及び薬
物について記載するが、本発明は、これら例示の
ハプテンに限定されるものではない。
本発明におけるガンマグロブリン（GG）とし
ては市販の各種ほ乳動物の正常なガンマグロブリ
ンおよびその成分あるいは高度免疫を受けていな
い正常動物の血液から常法のアルコール分画、塩
析、イオン交換あるいはアフイニテイークロマト
グラフイー、ゲル濾過等の単独または併用によつ
て得られるガンマグロブリンおよびその成分など
のいかなるものであつても、これを使用すること
ができるが、家兎ガンマグロブリン（RGG）、牛
ガンマグロブリン（BGG）、馬ガンマグロブリン
（HoGG）、人ガンマグロブリン（HuGG）を使用
するのが好ましい。
本発明において微粒子担体に感作するハプテン
−アシル化−ガンマグロブリン複合体を得るに
は、ａ）ハプテン−ガンマグロブリン複合体を得
たのちアシル化剤でガンマグロブリン部分を修飾
するか、またはｂ）ガンマグロブリンをあらかじ
めアシル化剤で化学的に修飾したのちハプテンと
結合し、複合体とする。これらの選択は目的とす
るハプテンの性質を考慮して適宜行なわれる。
まずハプテン、ハプテン代謝物あるいはこれら
の化学的変性物とガンマグロブリンまたはアシル
化ガンマグロブリンとの複合体を公知の方法、た
とえばカルボジイミド法〔イミユノケミストリ
（Immunochemistry）第５巻、第55〜65頁（1968
年）〕〔ジヤーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリ（Journal of Biological Chemistry）第
228巻、第713〜27頁（1957年）〕、イソシアナート
法〔カナデイアン ジヤーナル オブ バイオケ
ミストリ アンド フイジオロジー（Canadian
Journal of Biochemistry and Physiology）第
36巻、第1177〜84頁（1958年）〕等により調製す
る。一例として混合酸無水物法について述べる
と、低温下でガンマグロブリン（平均分子量16万
と仮定する）またはアシル化剤−ガンマグロブリ
ンのモル比に換算して１〜75倍のカルボキシル基
を有するハプテンをジメチルホルムアミド
（DMF）に溶解し、これに活性化助剤としてトリ
−ｎ−ブチルアミンをハプテンと等モル加え、次
いで活性化剤としてイソブチルクロロホルメート
をハプテンと等モル加え、撹拌して混合液を調製
する。一方水にガンマグロブリンまたはアシル化
−ガンマグロブリンを溶解し、アルカリ液でPHを
８〜10に調製し、更にジメチルホルムアミドを前
記混合液との合計が水と等容量になるように加
え、これに前記混合液を滴下し、1.5時間撹拌反
応し複合体を合成する。その後ゲル濾過等により
不要の低分子物質を除去し、該複合体を得る。こ
こでガンマグロブリンまたはアシル化−ガンマグ
ロブリン１分子に結合しているハプテンの分子数
は平均0.5〜25、好ましくは１〜15である。
またガンマグロブリンまたはハプテン−ガンマ
グロブリン複合体のアシル化剤による修飾は、常
法によつて行なうことができる〔メソツズ イン
エンチモロジー（Methods in Enzymology）
第11巻、第481〜664頁（1967年）（アカデミツク
プレス）（Acadmic Press USA）〕。すなわち
ガンマグロブリンまたはハプテン−ガンマグロブ
リン複合体を水あるいは塩溶液に溶解し、アルカ
リ液でPHを７〜10に調整し、該蛋白質又は該複合
体の0.2〜200％（重量。以下同じ）、好ましくは
0.5〜100％のアシル化剤を冷却下に撹拌しながら
徐々に添加し、この間アルカリ液の適当量を適宜
添加することによりPHを７〜９に維持し、アシル
化剤を添加終了後PHの変動がなくなるまで反応を
継続し、その後透析、限外濾過、ゲル濾過等によ
り不要な低分子物質を除去して、アシル化−ガン
マグロブリンまたはハプテン−アシル化ガンマグ
ロブリン複合体を得る。
このアシル化剤としては、アシル化反応を行な
いうるものであれば、いかなるものであつても、
これを使用することができるが、化学的修飾によ
り免疫学的凝集阻止反応において非特異的凝集反
応を排除し、化学的修飾が定量的に進行し、修飾
後の不要物の除去が簡単であり、アシル化剤の取
扱いが容易であり、かつ安価であるものを使用す
るのが好ましい。このようなアシル化剤の具体例
としては、モノカルボン酸無水物（たとえば無水
酢酸、無水エトキシギ酸）、ジカルボン酸無水物
（たとえば無水コハク酸、無水マレイン酸、無水
シトラコン酸、無水テトラフルオロコハク酸、無
水3.3−テトラメチレングルタル酸）、その他のポ
リカルボン酸無水物、これらカルボン酸のハライ
ド、酸エステル等があり、特に好ましいのは無水
酢酸、無水コハク酸、無水マレイン酸である。
ガンマグロブリンをアシル化剤で処理すること
により、蛋白質としての荷電が変化する。すなわ
ち蛋白質分子中のリジン残基のε−アミノ基の正
荷電がアシル化されることにより、無電荷又は負
電荷となり、その結果、ガンマグロブリン分子全
体は未修飾のそれに比較して負側へ移行すること
になる。アシル化−ガンマグロブリンの荷電は使
用するアシル化剤の種類、量及び処理条件等によ
り異なるが、鋭敏な感度で短時間に測定でき、か
つ個人差の少ない測定結果を提供する試薬を得る
ため、ガンマグロブリンまたはハプテン−ガンマ
グロブリン複合体をアシル化剤で化学修飾する至
適条件は、使用するアシル化剤の種類により適宜
選択することができる。
本発明における緩衝液は、免疫学で使用される
ものであれば、いかなるものであつても、これを
使用することができるが、PH６〜10のもの、また
はグリシン緩衝食塩水を使用するのが好ましい。
本発明における微粒子担体、抗体または抗原を
感作しうるものであれば、いかなるものであつて
も、これを使用することができるが、ポリスチレ
ン、ポリビニルトルエン、ポリブタジエン、スチ
レン−ブタジエン共重合体、スチレン−ジビニル
ベンゼン共重合体、スチレン−アクリロニトリル
共重合体などのラテツクス微粒子、さらにこれら
の重合体にカルボキシル基、カルボアミド基など
の官能基を部分的に有するもの、また直径0.05〜
5μ（特に好ましくは0.1〜2μ）を有するものを使用
するのが好ましい。
次に微粒子担体にハプテン−アシル化−ガンマ
グロブリン複合体を常法により感作する。緩衝液
に溶解したハプテン−アシル化−ガンマグロブリ
ン複合体に同じく緩衝液にケン濁した微粒子担体
を加えて混合し、該複合体を微粒子担体に感作す
る。感作する該複合体の量は、その種類及び目的
とする試薬の種々の感度等の条件によつて適宜選
択決定すればよい。感作温度は４〜70℃、好まし
くは20〜56℃であり、感作時間は数分ないし数時
間であるが、好ましは、0.5〜３時間である。ま
た官能基を有する微粒子担体にカルボジイミド法
等により化学的に感作することもできる。このよ
うにして得られたハプテン−アシル化−ガンマグ
ロブリン複合体感作微粒子担体を遠心分離して沈
澱物を緩衝液あるいは免疫反応に関与しない蛋白
質、糖等を含む緩衝液、好ましくは前記と同様に
アシル化剤で化学的に修飾した蛋白質を含む緩衝
液に通常0.01〜３％、好ましくは0.05〜1.5％の濃
度でケン濁する。
以上のようにして本発明の免疫学的ハプテン測
定試薬は製造される。本発明の免疫学的ハプテン
測定試薬を用い免疫学的凝集阻止反応によつて、
体液または尿中の微量ハプテンを測定するには、
反応板上に一定量の被検液又は希釈被検液と、常
法によつて該ハプテン−高分子複合体を動物に免
疫して得られ、適当に希釈したハプテン抗体の一
定量又はハプテン抗体感作微粒子担体に本発明の
ハプテン−アシル化−ガンマグロブリン複合体感
作微粒子担体試薬を、中和してからあるいは競合
的に加えて反応させる。被検液中のハプテンによ
る抗原抗体反応に起因する凝集の阻止度合を反応
板を１〜２分間揺動した後、肉眼的に観察して測
定する。この測定において凝集阻止を陽性、凝集
を陰性と判定する。被検液中のハプテン濃度は、
検体を適宜希釈して測定を行なうとき凝集阻止の
陽性を示す最大希釈倍数に試薬の測定感度を乗ず
ることによつて求められる。
以上に示すとおり、本発明の免疫学的ハプテン
測定試薬は、簡単な操作で製造され、しかも後述
するように鋭敏な感度でかつ迅速に個人差の少な
い信頼性の高い測定結果を提供するものであり、
反応板に塗布した状態で使用することもできる。
なお、本発明の免疫学的ハプテン測定試薬の感度
は、微粒子担体に感作するハプテン−アシル化−
ガンマグロブリン複合体の量、アシル化−ガンマ
グロブリンに結合しているハプテン分子の数、該
複合体感作微粒子担体をケン濁する緩衝液中の安
定化の濃度、あるいは対応して用いる該ハプテン
抗体の希釈度又は微粒子担体に感作する抗体の量
等を調節するかあるいは以上のいくつかを組合せ
ることによつて調整される。
次に試験例を示して本発明を更に詳述する。
試験例 １
本発明の試薬と従来法の試薬を使用して、尿中
のエストロゲンを測定した時の非特異的凝集の有
無、測定感度および反応時間を比較した。
試薬の調製
Ａ） 本発明のエストロゲン測定試薬
本発明のエストロゲン測定試薬のエストリオ
ール−16α−グルクロナイド−マレイル−牛ガ
ンマグロブリン複合体感作ラテツクス試薬は、
実施例１と同様にして調製された。
Ｂ） 従来法のエストロゲン測定試薬 (1)
従来法のエストロゲン測定試薬のエストリオ
ール−16α−グルクロナイド−牛ガンマグロブ
リン複合体感作ラテツクス試薬は、参考例１の
と同様にして、エストリオール−16α−グル
クロナイド−牛ガンマグロブリン複合体を調製
し、これを実施例１におけるエストリオール−
16α−グルクロナイド−マレイル−牛ガンマグ
ロブリン複合体の代りに使用し、実施例１と同
様にして調製された。
Ｃ） 従来法のエストロゲン測定試薬 (2)
もう１つの従来法のエストロゲン測定試薬の
エストリオール−16α−グルクロナイド−家兎
血清アルブミン複合体感作ラテツクス試薬は、
参考例１のにおいて、牛ガンマグロブリンの
代りに家兎血清アルブミンを使用し、またエス
トリオール−16α−グルクロナイド対家兎血清
アルブミンのモル比を５対１とし、参考例１の
と同様にして、エストリオール−16α−グル
クロナイド−家兎血清アルブミンを調製し、こ
れを実施例１におけるエストリオール−16α−
グルクロナイド−マレイル−牛ガンマグロブリ
ン複合体の代りに使用し、実施例１と同様にし
て調製された。
Ｄ） 対応する抗体試薬 (1)
対応する抗体試薬の抗エストリオール−16α
−グルクロナイド抗体感作ラテツクス試薬は、
参考例７のと同様にして調製された。
Ｅ） 対応する抗体試薬 (2)
もう１つの抗体試薬の抗エストリオール−
16α−グルクロナイド抗血清は、参考例７の
における抗原用エストリオール−16α−グルク
ロナイド−牛血清アルブミン複合体を、参考例
７のと同様にして家兎に免疫し、得られた抗
血清の牛血清アルブミンで吸収処理した後、緩
衝液で希釈することによつて調製された。
試験方法
以下に示す試薬の組合せを使用し、参考例７の
と同様にして、エストリオール−16α−グルク
ロナイド標準液を使用するエストロゲン測定試薬
の感度の測定、および陽性または陰性の判定をす
るのに要する時間の測定を行ない、また妊婦尿を
使用した場合の非特異的凝集の有無を調べた。
試薬の組合せ
ａ：前記のＡ）の本発明のエストロゲン測定
試薬のエストリオール−16α−グルクロナイド
−マレイル−牛ガンマグロブリン複合体感作ラ
テツクス試薬と前記のＤ）の抗エストリオー
ル−16α−グルクロナイド抗体感作ラテツクス
試薬を組合せて使用した測定例。
ｂ：前記のＡ）の本発明のエストロゲン測定試
薬のエストリオール−16α−グルクロナイド−
マレイル−牛ガンマグロブリン複合体感作ラテ
ツクス試薬と、前記のＥ）の抗エストリオー
ル−16α−グルクロナイド抗血清を組合せて使
用した測定例。
ｃ：前記のＣ）の従来法のエストロゲン測定試
薬(2)のエストリオール−16α−グルクロナイド
−家兎血清アルブミン複合体感作ラテツクス試
薬と前記のＥ）の抗エストリオール−16α−
グルクロナイド抗血清を組合せて使用した測定
例。
ｄ：前記のＢ）の従来法のエストロゲン測定試
薬(1)のエストリオール−16α−グルクロナイド
−牛ガンマグロブリン複合体感作ラテツクス試
薬と前記のＥ）の抗エストリオール−16α−
グルクロナイド抗血清を組合せて使用した測定
例。
結果
試験の結果は、第１表に示すとおりであつた。
[Industrial Field of Application] The present invention relates to a reagent for detecting haptens contained in body fluids or urine. [Technical Background and Description of the Prior Art] Hapten is a low-molecular compound that does not have antigenicity itself, but has antigenicity by forming a complex with a high-molecular substance such as a protein or polysaccharide. and produce antibodies when administered parenterally to animals [Advances in Immunology, No. 17]
Vol. 255-310 (1973) Academic Press USA]. Measuring physiologically active substances, including hormones and haptens such as drugs, contained in body fluids such as blood or urine has traditionally been an extremely effective means for diagnosing diseases, determining prognosis, and determining treatment methods. be.
Biological, physical, chemical or immunological methods are known to measure the presence of these haptens. In particular, radioimmunoassay by immunological methods, enzyme immunoassay
etc. are used in the field of clinical testing because they can measure trace components in body fluids or urine with high specificity and reproducibility, but the period of use is limited due to the danger of handling radioactive materials and the use of enzymes. There are problems in that it requires special equipment, and the procedure is complicated and time-consuming. Therefore, methods for detecting trace components in body fluids or urine by immunological agglutination or agglutination inhibition reactions using microparticle carriers are simple and rapid, and are therefore widely put into practical use. This immunological method involves, for example, preparing a complex in which a hapten to be measured is bound to a polymeric substance such as serum albumin, and immunizing an animal with this complex as an antigen to obtain an antibody against the hapten (hereinafter referred to as "hapten After obtaining the hapten antibody and a hapten-sensitized carrier obtained by sensitizing the hapten-polymer complex to a fine particle carrier such as red blood cells, the agglutination reaction that occurs during this process is performed. There is a method based on the reaction inhibited by the hapten to be measured (so-called agglutination inhibition reaction), and in connection with this immunoassay, synthetic latex, bentonite, kaolin, collodion, activated carbon, quartz can be used instead of red blood cells. A method is known in which non-biological microparticles such as, for example, are used as carriers. (For example, Japanese Patent Application Laid-open No. 51-9715). Furthermore, it is also known that a complex made by binding a steroid, a type of hapten, to bovine serum albumin (BSA) can be used as an antigen [Journal of Biological Chemistry]
Vol. 228, pp. 713-27 (1957)]. In addition, each hapten antibody obtained by immunizing an animal with a complex of haptens such as testosterone, estradiol, and morphin bound to bovine serum albumin, and bovine serum albumin of the complex were combined with human serum albumin (HSA) or bovine serum albumin. It has been reported that each hapten can be measured by combining each hapten-serum albumin complex replaced with rabbit serum albumin (RSA) with a sensitized carrier obtained by sensitizing red blood cells [Nature ) Vol. 214, pp. 1044-5 (1967), and Journal of Immunology (1967)
Immunology) Vol. 106, pp. 1684-5 (1971
Year). Also, hapten immunology using an antibody-sensitized carrier sensitized with a hapten antibody and a hapten-carrier conjugate or a conjugate-sensitized carrier in which a hapten that reacts with the hapten antibody is bound to an antigenic carrier. (Japanese Unexamined Patent Publication No. 53-41420), and furthermore, a sensitized latex in which a conjugate of a hapten and a carboxyl group-containing monoolefin polymer compound is chemically bonded to a polymer latex, and the hapten antibody or the antibody. A method using a sensitized carrier has been proposed (JP-A-55-52945). In addition, a method for producing a reagent has been proposed in which steroid-albumin complex sensitized latex used to measure steroids based on aggregation inhibition reaction contains 0.5 to 7 molecules of steroid per molecule of albumin in the complex. (Japanese Unexamined Patent Publication No. 1982-19222). Each of these methods or reagents can be found to be effective to a certain extent, but the time required for determination is long, the difference between positive and negative is unclear, and there are problems with impurities in the test solution such as nonspecific agglutination. There are several problems, such as the susceptibility of the process and the complexity of the preparation of many reagents. On the other hand, in the immunoassay of haptens, there have been examples of sensitizing red blood cells with hapten-gamma globulin complexes (Japanese Patent Application Laid-open Nos. 123819-1982 and 41420-1980), but latex There are no examples of sensitization to non-biological particles such as particles, and even more so, using a reagent in which a fine particle carrier is sensitized with a complex of gamma globulin (acylated-GG) chemically modified with a hapten acylating agent. was previously completely unknown. The present inventors conducted research with the goal of developing a reagent that can immunologically reproducibly measure minute amounts of hapten present in body fluids or urine with high sensitivity, in a short time, and that can be easily prepared. As a result, hapten-
We have discovered that the above objectives can be achieved extremely effectively with an immunological hapten measurement reagent obtained by sensitizing latex particles with an acylated gamma globulin complex, and based on this knowledge, we have developed the present invention. completed. [Object of the Invention and Summary of the Invention] An object of the present invention is to provide a reagent that can measure haptens with high sensitivity and quickly without being affected by impurities in a test solution. Another object of the present invention is to provide a hapten measurement reagent that provides clear measurement results and is less susceptible to individual differences in determination of the results. The present invention is an immunological hapten measurement reagent characterized by containing a particulate carrier sensitized with a complex consisting of a hapten and gamma globulin chemically modified with an acylating agent. [Specific Description of the Invention] The hapten used herein is a low-molecular compound that does not have antigenicity itself, but has antigenicity by forming a complex with a high-molecular compound such as a protein or polysaccharide. and produce antibodies when administered parenterally to animals. Such haptens include, for example, steroid hormones such as estriol and pregnanediol, low molecular weight peptide hormones such as gastrin and oxytocin, non-peptide hormones such as prostaglandin and thyroxine, catecholamines such as epinephrine and dopamine, folic acid, and vitamin A. coenzyme vitamins such as, drugs such as digoxin, barbiturate,
Antibiotics such as penicillin and tetracycline,
Alkaloids such as morphine and codeine, low molecular weight carbohydrates such as glucuronic acid and lactose, nucleic acid components such as pyrimidine and nucleosides, benzpyrene,
There are carcinogens such as aminofluorene and their metabolites. Although hormones and drugs are described herein, the present invention is not limited to these exemplified haptens. The gamma globulin (GG) used in the present invention is commercially available normal gamma globulin of various mammals and its components, or conventional alcohol fractionation, salting out, ion exchange or affinization from the blood of normal animals that have not received hyperimmunity. Any gamma globulin or its components obtained by e-chromatography, gel filtration, etc. alone or in combination can be used, but rabbit gamma globulin (RGG), bovine gamma globulin, etc. (BGG), equine gamma globulin (HoGG) and human gamma globulin (HuGG) are preferably used. In the present invention, to obtain a hapten-acylated gamma globulin complex that sensitizes to a microparticle carrier, a) after obtaining the hapten-gamma globulin complex, the gamma globulin moiety is modified with an acylating agent, or b) Gamma globulin is first chemically modified with an acylating agent and then combined with a hapten to form a complex. These selections are made appropriately taking into consideration the properties of the target hapten. First, a complex of a hapten, a hapten metabolite, or a chemically modified product thereof with gamma globulin or acylated gamma globulin is prepared using a known method such as the carbodiimide method [Immunochemistry, Vol. 5, pp. 55-65]. 1968
)] [Journal of Biological Chemistry, No.
228, pp. 713-27 (1957)], Isocyanate Method [Canadian Journal of Biochemistry and Physiology]
Journal of Biochemistry and Physiology) No.
36, pp. 1177-84 (1958)]. As an example, referring to the mixed acid anhydride method, gamma globulin (assuming an average molecular weight of 160,000) or a hapten having a carboxyl group of 1 to 75 times the molar ratio of acylating agent to gamma globulin is prepared at low temperature. Dissolve in dimethylformamide (DMF), add tri-n-butylamine as an activation aid in an equal mole to the hapten, then add isobutyl chloroformate as an activator in an equal mole to the hapten, and stir to form a mixed solution. Prepare. On the other hand, dissolve gamma globulin or acylated gamma globulin in water, adjust the pH to 8 to 10 with alkaline solution, and add dimethylformamide so that the total volume with the above mixture is equal to that of water. The above mixed solution is added dropwise and reacted with stirring for 1.5 hours to synthesize a complex. Thereafter, unnecessary low-molecular substances are removed by gel filtration or the like to obtain the complex. Here, the average number of hapten molecules bound to one molecule of gamma globulin or acylated gamma globulin is 0.5 to 25, preferably 1 to 15. Furthermore, modification of gamma globulin or hapten-gamma globulin complex with an acylating agent can be carried out by a conventional method [Methods in Enzymology]
Vol. 11, pp. 481-664 (1967) (Academic Press USA)]. That is, gamma globulin or a hapten-gamma globulin complex is dissolved in water or a salt solution, the pH is adjusted to 7 to 10 with an alkaline solution, and 0.2 to 200% (by weight; the same applies hereinafter) of the protein or the complex is preferably dissolved. teeth
Gradually add 0.5 to 100% of the acylating agent while stirring while cooling. During this time, maintain the pH at 7 to 9 by adding an appropriate amount of alkaline solution. The reaction is continued until there is no fluctuation, and then unnecessary low-molecular substances are removed by dialysis, ultrafiltration, gel filtration, etc. to obtain an acylated gamma globulin or a hapten-acylated gamma globulin complex. The acylating agent may be any agent that can carry out the acylation reaction.
This can be used, but chemical modification eliminates non-specific agglutination reactions in immunological aggregation inhibition reactions, chemical modification proceeds quantitatively, and removal of unnecessary substances after modification is easy. It is preferable to use an acylating agent that is easy to handle and inexpensive. Specific examples of such acylating agents include monocarboxylic anhydrides (e.g. acetic anhydride, ethoxyformic anhydride), dicarboxylic anhydrides (e.g. succinic anhydride, maleic anhydride, citraconic anhydride, tetrafluorosuccinic anhydride). , 3,3-tetramethylene glutaric anhydride), other polycarboxylic acid anhydrides, halides and acid esters of these carboxylic acids, and particularly preferred are acetic anhydride, succinic anhydride, and maleic anhydride. By treating gamma globulin with an acylating agent, its charge as a protein changes. In other words, the positive charge of the ε-amino group of a lysine residue in a protein molecule is acylated, resulting in an uncharged or negative charge, and as a result, the entire gamma globulin molecule shifts to the negative side compared to its unmodified counterpart. I will do it. Acylation - The charge of gamma globulin varies depending on the type and amount of acylating agent used, processing conditions, etc., but in order to obtain a reagent that can be measured in a short time with high sensitivity and provides measurement results with little individual variation, Optimal conditions for chemically modifying gamma globulin or a hapten-gamma globulin complex with an acylating agent can be appropriately selected depending on the type of acylating agent used. As the buffer in the present invention, any buffer used in immunology can be used, but it is preferable to use one with a pH of 6 to 10 or glycine buffered saline. preferable. Any material can be used as long as it can sensitize the microparticle carrier, antibody, or antigen in the present invention, including polystyrene, polyvinyltoluene, polybutadiene, styrene-butadiene copolymer, and styrene. - Latex fine particles such as divinylbenzene copolymer, styrene-acrylonitrile copolymer, etc., and particles partially having functional groups such as carboxyl groups and carboxamide groups in these polymers, and particles with a diameter of 0.05~
It is preferable to use one having a diameter of 5μ (particularly preferably 0.1 to 2μ). Next, the microparticle carrier is sensitized with the hapten-acylated gamma globulin complex by a conventional method. A microparticle carrier suspended in the same buffer solution is added to the hapten-acylated-gamma globulin complex dissolved in a buffer solution and mixed to sensitize the complex to the microparticle carrier. The amount of the complex to be sensitized may be appropriately selected and determined depending on conditions such as the type thereof and various sensitivities of the target reagent. The sensitization temperature is 4 to 70°C, preferably 20 to 56°C, and the sensitization time is several minutes to several hours, preferably 0.5 to 3 hours. Further, fine particle carriers having functional groups can also be chemically sensitized by a carbodiimide method or the like. The thus obtained hapten-acylated-gamma globulin complex sensitized microparticle carrier is centrifuged and the precipitate is mixed with a buffer or a buffer containing proteins, sugars, etc. that are not involved in immune reactions, preferably in the same manner as above. The protein is suspended in a buffer containing a protein chemically modified with an acylating agent at a concentration of usually 0.01 to 3%, preferably 0.05 to 1.5%. The immunological hapten measurement reagent of the present invention is produced as described above. By immunological agglutination inhibition reaction using the immunological hapten measurement reagent of the present invention,
To measure trace amounts of haptens in body fluids or urine,
Place a certain amount of test solution or diluted test solution on a reaction plate and a certain amount of hapten antibody or hapten antibody obtained by immunizing an animal with the hapten-polymer complex by a conventional method and diluted appropriately. The hapten-acylated-gamma globulin complex sensitized fine particle carrier reagent of the present invention is added to the sensitized fine particle carrier after neutralization or competitively and reacted. The degree of inhibition of agglutination caused by the antigen-antibody reaction by the hapten in the test solution is measured by rocking the reaction plate for 1 to 2 minutes and then visually observing it. In this measurement, inhibition of agglutination is determined to be positive, and agglutination is determined to be negative. The hapten concentration in the test solution is
It is determined by multiplying the maximum dilution factor that shows positive agglutination inhibition by the measurement sensitivity of the reagent when the sample is appropriately diluted and measured. As shown above, the immunological hapten measurement reagent of the present invention can be manufactured by simple operations, and as described below, can provide highly reliable measurement results with high sensitivity and rapid individual differences. can be,
It can also be used in a state where it is applied to a reaction plate.
The sensitivity of the immunological hapten measurement reagent of the present invention is determined by the hapten-acylation-sensitizing particulate carrier.
the amount of gamma globulin complex, the number of hapten molecules bound to the acylated gamma globulin, the stabilizing concentration in the buffer that suspends the complex-sensitized microparticle carrier, or the corresponding concentration of the hapten antibody used. It can be adjusted by adjusting the dilution level, the amount of antibody that sensitizes the microparticle carrier, etc., or by combining some of the above. Next, the present invention will be explained in further detail by showing test examples. Test Example 1 Using the reagent of the present invention and the reagent of the conventional method, the presence or absence of nonspecific aggregation, measurement sensitivity, and reaction time were compared when estrogen in urine was measured. Preparation of reagent A) Estrogen measurement reagent of the present invention The estriol-16α-glucuronide-maleyl-bovine gamma globulin complex sensitized latex reagent of the estrogen measurement reagent of the present invention is as follows:
Prepared similarly to Example 1. B) Conventional estrogen measurement reagent (1) Estriol-16α-glucuronide-bovine gamma globulin complex sensitized latex reagent, which is a conventional estrogen measurement reagent, was prepared using estriol-16α-glucuronide in the same manner as in Reference Example 1. - Prepare a bovine gamma globulin complex, and use it as estriol in Example 1.
It was prepared in the same manner as in Example 1, using it in place of the 16α-glucuronide-maleyl-bovine gamma globulin complex. C) Conventional estrogen measurement reagent (2) Another conventional estrogen measurement reagent, estriol-16α-glucuronide-rabbit serum albumin complex sensitized latex reagent, is as follows:
In the same manner as in Reference Example 1, using rabbit serum albumin instead of bovine gamma globulin and setting the molar ratio of estriol-16α-glucuronide to rabbit serum albumin to 5:1, Estriol-16α-glucuronide-rabbit serum albumin was prepared and mixed with estriol-16α-glucuronide in Example 1.
It was prepared in the same manner as in Example 1, using instead of the glucuronide-maleyl-bovine gamma globulin complex. D) Corresponding antibody reagent (1) Corresponding antibody reagent anti-estriol-16α
- Glucuronide antibody sensitized latex reagent is
Prepared in the same manner as in Reference Example 7. E) Corresponding antibody reagent (2) Another antibody reagent anti-estriol
The 16α-glucuronide antiserum was obtained by immunizing a rabbit with the antigen-use estriol-16α-glucuronide-bovine serum albumin complex in Reference Example 7 in the same manner as in Reference Example 7, and using the obtained antiserum in bovine serum. It was prepared by absorbing with albumin and then diluting with a buffer. Test method: Using the combination of reagents shown below and in the same manner as in Reference Example 7, measure the sensitivity of the estrogen measurement reagent using the estriol-16α-glucuronide standard solution and determine whether it is positive or negative. The time required was measured, and the presence or absence of non-specific agglutination was investigated when pregnant women's urine was used. Combination of reagents a: The estriol-16α-glucuronide-maleyl-bovine gamma globulin complex sensitized latex reagent of the estrogen measurement reagent of the present invention in A) above and the anti-estriol-16α-glucuronide antibody sensitization in D) above. Example of measurement using a combination of latex reagents. b: Estriol-16α-glucuronide of the estrogen measurement reagent of the present invention in A) above
Measurement example using a combination of the maleyl-bovine gamma globulin complex sensitized latex reagent and the anti-estriol-16α-glucuronide antiserum of E) above. c: The estriol-16α-glucuronide-rabbit serum albumin complex sensitized latex reagent of the conventional estrogen measurement reagent (2) of C) above and the anti-estriol-16α- of E) above.
Example of measurement using a combination of glucuronide antisera. d: Estriol-16α-glucuronide-bovine gamma globulin complex sensitized latex reagent of B) conventional estrogen measurement reagent (1) and anti-estriol-16α- of E) above.
Example of measurement using a combination of glucuronide antisera. Results The results of the test were as shown in Table 1.
【表】
第１表によると、従来法のエストロゲン測定試
薬の牛ガンマグロブリン複合体を使用したｄで
は、非特異的凝集を示し、試薬としての機能を果
さないのに対して、本発明のエストロゲン測定試
薬のアシル化−牛ガンマグロブリン複合体を使用
したａおよぴｂ、および従来法の家兎血清アルブ
ミン複合体を使用したｃでは、非特異的凝集を示
さない。しかしながら、従来法の牛血清アルブミ
ン複合体を使用したｃに比べて、本発明のアシル
化−牛ガンマグロブリン複合体を使用したａおよ
びｂは、測定感度において５〜10倍高い値を示
し、反応時間も2/3〜1/3に短縮することができ
る。
本発明のアシル化−牛ガンマグロブリン複合体
を使用するエストロゲン測定試薬が非特異的凝集
を示さないのは、牛ガンマグロブリンをアシル化
剤で化学的に修飾することによつて、牛ガンマグ
ロブリンの蛋白質としての荷電が変化することに
よると考えられる。また本発明のアシル化−牛ガ
ンマグロブリン複合体を使用するエストロゲン測
定試薬が、従来法の家兎血清アルブミン複合体を
使用するものよりも、高感度で、反応時間も短縮
するのは、血清アルブミンの分子量は約6.5万で
あるのに対して、ガンマグロブリンの分子量は約
16万であつて、ガンマグロブリンの分子が大き
く、抗体との反応性が増大したことによると考え
られる。しかしながら、アシル化をしない牛ガン
マグロブリン複合体を使用した従来法のエストロ
ゲン測定試薬のｄでは、第１表に示すとおり、非
特異的凝集を示すので、そのままで使用すること
ができないが、本発明のアシル化−牛ガンマグロ
ブリン複合体を使用したエストロゲン測定試薬
は、前記のようにすぐれた効果を発揮する。
試験例 ２
本発明の試薬と従来法の試薬を使用して、凝集
像と凝集阻止像の明瞭性を比較した。
試薬の調製
使用した試薬は、試験例１と同様の方法で調製
した。
試験方法
エストリオール−16α−グルクロナイドをグリ
シン緩衝食塩水に溶解した標準液を使用し、参考
例７のと同様にして試験を行なつたが、本発明
の試薬ａおよびｂは、判定を２分間で行ない、そ
して従来の試薬ｃは、判定を３分間で行なつた。
試薬の組合せ
試薬の組合せは試験例１のと同じであるが、
測定感度の影響を受けることなく、凝集像と凝集
阻止像の明瞭性を比較することができるように、
各組合せ試薬の感度を0.1μｇ／ml（エストリオー
ルとして）に調整した。
結果
試験の結果は第２表に示すとおりであつた。[Table] According to Table 1, the conventional estrogen measurement reagent d using bovine gamma globulin complex shows non-specific aggregation and does not function as a reagent, whereas the present invention A and b using the acylated bovine gamma globulin complex of the estrogen measurement reagent, and c using the conventional rabbit serum albumin complex do not show non-specific agglutination. However, compared to c using the conventional bovine serum albumin complex, a and b using the acylated bovine gamma globulin complex of the present invention showed a 5 to 10 times higher measurement sensitivity, and the reaction The time can also be reduced by 2/3 to 1/3. The reason why the estrogen measurement reagent using the acylated bovine gamma globulin complex of the present invention does not show non-specific aggregation is that bovine gamma globulin is chemically modified with an acylating agent. This is thought to be due to a change in the charge as a protein. In addition, the estrogen measuring reagent using the acylated bovine gamma globulin complex of the present invention has higher sensitivity and shorter reaction time than the conventional method using the rabbit serum albumin complex, because serum albumin The molecular weight of gamma globulin is approximately 65,000, while the molecular weight of gamma globulin is approximately 65,000.
160,000, which is thought to be due to the large gamma globulin molecules and increased reactivity with antibodies. However, as shown in Table 1, the conventional estrogen measurement reagent d, which uses a non-acylated bovine gamma globulin complex, shows non-specific aggregation and cannot be used as is. The estrogen measurement reagent using the acylated bovine gamma globulin complex exhibits excellent effects as described above. Test Example 2 The clarity of agglutination images and agglutination inhibition images were compared using a reagent of the present invention and a conventional reagent. Preparation of Reagent The reagent used was prepared in the same manner as in Test Example 1. Test method A test was conducted in the same manner as in Reference Example 7 using a standard solution in which estriol-16α-glucuronide was dissolved in glycine buffered saline. With conventional reagent c, the determination was made in 3 minutes. Combination of reagents The combination of reagents is the same as in Test Example 1, but
In order to be able to compare the clarity of agglutination images and agglutination inhibition images without being affected by measurement sensitivity,
The sensitivity of each reagent combination was adjusted to 0.1 μg/ml (as estriol). Results The results of the test were as shown in Table 2.
参考例３で得たデヒドロエピアンドロステロン
−17−カルボキシメチルオキシム−アセチル−家
兎ガンマグロブリン複合体を使用し、実施例２と
同様にして、デヒドロエピアンドロステン−17−
カルボキシメチルオキシム−アセチル−家兎ガン
マグロブリン複合体感作ラテツクスのデヒドロエ
ピアンドロステン測定試薬を得た。
実施例 ４
（サイロキシン測定試薬）
参考例４で得たサイロキシン−サクシニル−家
兎免疫グロブリンＧ複合体を使用し、実施例１と
同様にして、サイロキシン−サクシニル−家兎免
疫グロブリンＧ複合体感作ラテツクスを得た。こ
れを、参考例３ので調製したアセチル−家兎ガ
ンマグロブリン0.1％を含有する緩衝液にケン濁
し、サイロキシン−サクシニル−家兎免疫グロブ
リンＧ複合体感作ラテツクスのサイロキシン測定
試薬を得た。
実施例 ５
（ジゴキシン測定試薬）
参考例５で得たジゴキシン−マレイル−馬ガン
マグロブリン複合体を、水に0.4％の割合で溶解
した液１容と、水で２回遠心洗浄したカルボキシ
ル基含有ラテツクス粒子の２％ケン濁液２容を混
合した。次いで新たに調製した１％濃度の１−シ
クロヘキシル−３−（２−モノホリエチル）カル
ボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホン酸１容を
加え、室温において撹拌しながら、一夜反応さ
せ、カルボキシル基含有ラテツクス粒子をジゴキ
シン−マレイル−馬ガンマグロブリン複合体で感
作した。反応液を２回遠心洗浄後、沈デン物を家
兎血清アルブミン（0.2％）含有グリシン緩衝食
塩水に、0.8％の濃度でケン濁し、ジゴキシン−
マレイル−馬ガンマグロブリン複合体感作ラテツ
クスのジゴキシン測定試薬を得た。
実施例 ６
（アスピリン測定試薬）
参考例６ので得たアスピリル−サクシニル−
牛ガンマグロブリン複合体を使用し、実施例２に
おいて、家兎血清アルブミン含有（0.2％）緩衝
液にケン濁する以外は、実施例２と同様にして、
アスピリル−サクシニル−牛ガンマグロブリン複
合体感作ラテツクスのアスピリン測定試薬を得
た。
参考例 ７
（エストロゲン測定試薬の感度およびエストロ
ゲンの測定）
対応抗体試薬の調製
参考例１のにおける牛ガンマグロブリンの代
りに、牛血清アルブミン2.0ｇを使用し、そして
エストリオール−16α−グルクロナイドを、エス
トリオール−16α−グルクロナイド対牛血清アル
ブミンのモル比が50対１になる量において使用
し、参考例１のと同様にして、抗原用エストリ
オール−16α−グルクロナイド−牛血清アルブミ
ン複合体1.7ｇを得た。
この複合体を生理食塩水に２mg／mlの濃度で溶
解した溶液１容に、コンプリートフロイントアジ
ユバント１容を加えて乳化し、この乳化物１mlを
１ケ月間隔で家兎の免疫し、得られた抗血清を牛
血清アルブミンで吸収処理した後、イオン交換ク
ロマトグラフイーにより抗エストリオール−16α
−グルクロナイド抗体を得た。
この抗エストリオール−16α−グルクロナイド
抗体50mgを使用し、参考例１のにおける無水マ
レイン酸の代りに、無水コハク酸粉末12mgを使用
し、参考例１のと同様にして、サクシニル−抗
エストリオール−16α−グルクロナイド免疫グロ
ブリン約50mgを得た。
次いで実施例１においてエストリオール−16α
−グルクロナイド−牛ガンマグロブリン複合体を
0.1％の濃度で使用する代りに、サクシニル−抗
エストリオール−16α−グルクロナイド免疫グロ
ブリンを0.09％の濃度で使用し、実施例１と同様
の方法によつて、対応する抗エストリオール−
16α−グルクロナイド抗体感作ラテツクス試薬を
得た。
エストロゲン測定試薬の感度および妊婦尿中
のエストロゲンの測定
実施例１で得たエストリオール−16α−グルク
ロナイド−マレイル−牛ガンマグロブリン複合体
感作ラテツクスのエストロゲン測定試薬および前
記の抗エストリオール−16α−グルクロナイド抗
体感作ラテツクス試薬を組合せ、グリシン緩衝食
塩水に溶解したエストリオール−16α−グルクロ
ナイド標準液を使用して、エストロゲン測定試薬
の感度を次の方法によつて測定した。
反応板上のサークル内に、エストリオール−
16α−グルクロナイド標準液50μおよび抗エス
トリオール−16α−グルクロナイド抗体感作ラテ
ツクスを20μ滴下し、次いでエストリオール−
16α−グルクロナイド−マレイル−牛ガンマグロ
ブリン複合体感作ラテツクスのエストロゲン測定
試薬を20μ滴下して混合した。次に反応板を１
〜２分間揺動し、凝集阻止の有無を肉眼で観察し
た結果、実施例１のエストロゲン測定試薬の感度
は、0.10μｇ／ml（エストリオールとして）であ
つた。
次に、前記のエストリオール−16α−グルクロ
ナイド標準液の代りに、妊婦尿を第３表に示す倍
率に希釈した希釈尿を使用し、前記と同様にし
て、胎児胎盤機能の指標となるエストロゲン濃度
を測定した。その結果を第３表に示す。
Using the dehydroepiandrosterone-17-carboxymethyloxime-acetyl-rabbit gamma globulin complex obtained in Reference Example 3, dehydroepiandrosten-17-
A reagent for measuring dehydroepiandrostene in carboxymethyloxime-acetyl-rabbit gamma globulin complex sensitized latex was obtained. Example 4 (Thyroxine measurement reagent) Using the thyroxine-succinyl-rabbit immunoglobulin G complex obtained in Reference Example 4, a thyroxine-succinyl-rabbit immunoglobulin G complex sensitized latex was prepared in the same manner as in Example 1. I got it. This was suspended in the buffer containing 0.1% acetyl-rabbit gamma globulin prepared in Reference Example 3 to obtain a thyroxine measuring reagent for thyroxine-succinyl-rabbit immunoglobulin G complex sensitized latex. Example 5 (Digoxin measurement reagent) 1 volume of a solution obtained by dissolving the digoxin-maleyl-horse gamma globulin complex obtained in Reference Example 5 in water at a ratio of 0.4%, and a carboxyl group-containing latex that was centrifugally washed twice with water. Two volumes of a 2% suspension of particles were mixed. Next, 1 volume of freshly prepared 1% concentration 1-cyclohexyl-3-(2-monopholethyl)carbodiimidometh-p-toluenesulfonic acid was added, and the reaction was allowed to proceed overnight with stirring at room temperature to transform the carboxyl group-containing latex particles into digoxin. -Mareil-sensitized with horse gamma globulin complex. After washing the reaction solution twice by centrifugation, the precipitate was suspended in glycine buffered saline containing rabbit serum albumin (0.2%) at a concentration of 0.8%, and digoxin-
A reagent for measuring digoxin from Malayl-horse gamma globulin complex sensitized latex was obtained. Example 6 (Aspirin measurement reagent) Aspiryl-succinyl- obtained in Reference Example 6
A bovine gamma globulin complex was used in the same manner as in Example 2, except that it was suspended in a buffer containing rabbit serum albumin (0.2%).
A reagent for measuring aspirin using aspiryl-succinyl-bovine gamma globulin complex sensitized latex was obtained. Reference Example 7 (Sensitivity of estrogen measurement reagent and measurement of estrogen) Preparation of corresponding antibody reagent 2.0 g of bovine serum albumin was used in place of bovine gamma globulin in Reference Example 1, and estriol-16α-glucuronide was Using the molar ratio of triol-16α-glucuronide to bovine serum albumin in an amount of 50:1, 1.7 g of estriol-16α-glucuronide-bovine serum albumin complex for antigen was obtained in the same manner as in Reference Example 1. Ta. This complex was dissolved in physiological saline at a concentration of 2 mg/ml, and 1 volume of Complete Freund's Adjuvant was added to emulsify it. 1 ml of this emulsion was used to immunize rabbits at monthly intervals. After absorbing the antiserum with bovine serum albumin, anti-estriol-16α was detected using ion-exchange chromatography.
- Glucuronide antibodies were obtained. Using 50 mg of this anti-estriol-16α-glucuronide antibody, succinyl-anti-estriol- Approximately 50 mg of 16α-glucuronide immunoglobulin was obtained. Then, in Example 1, estriol-16α
- Glucuronide - Bovine gamma globulin complex
Instead of using a concentration of 0.1%, succinyl-anti-estriol-16α-glucuronide immunoglobulin was used at a concentration of 0.09% and the corresponding anti-estriol-
A 16α-glucuronide antibody sensitized latex reagent was obtained. Sensitivity of estrogen measurement reagent and measurement of estrogen in pregnant woman's urine Estrogen measurement reagent of estriol-16α-glucuronide-maleyl-bovine gamma globulin complex sensitized latex obtained in Example 1 and the above-mentioned anti-estriol-16α-glucuronide antibody The sensitivity of the estrogen measurement reagent was determined by the following method using a sensitized latex reagent combined with an estriol-16α-glucuronide standard solution dissolved in glycine buffered saline. In the circle on the reaction plate, estriol-
Add 50μ of 16α-glucuronide standard solution and 20μ of anti-estriol-16α-glucuronide antibody sensitized latex, then add estriol-
20μ of the estrogen measurement reagent of the 16α-glucuronide-maleyl-bovine gamma globulin complex sensitized latex was added dropwise and mixed. Next, add 1 reaction plate
As a result of shaking for ~2 minutes and visually observing whether or not aggregation was inhibited, the sensitivity of the estrogen measurement reagent of Example 1 was 0.10 μg/ml (as estriol). Next, instead of the estriol-16α-glucuronide standard solution mentioned above, diluted urine obtained by diluting pregnant urine to the ratio shown in Table 3 was used, and the estrogen concentration, which is an index of fetoplacental function, was prepared in the same manner as above. was measured. The results are shown in Table 3.
【表】
参考例 ８
（プレグナンジオール測定試薬の感度およびプ
レグナンジオールの測定）
対応抗体試薬の調製
参考例２のと同様の方法によつて得たプレグ
ナンジオール−３−グルクロナイド−牛血清アル
ブミン複合体を抗原として山羊に免疫し、得られ
た抗プレグナンジオール−３−グルクロナイド抗
血清を牛血清アルブミンで吸収処理した後、緩衝
液で希釈し、対抗する抗プレグナンジオール−３
−グルクロナイド抗体試薬を得た。
プレグナンジオール測定試薬の感度および妊
婦尿中のプレグナンジオールの測定
実施例２で得たプレグナンジオール−３−グル
クロナイド−サクシニル−ヒトガンマグロブリン
複合体感作ラテツクスのプレグナンジオール測定
試薬および前記で得た抗プレグナンジオール−
３−グルクロナイド抗体試薬を組合せ、プレグナ
ンジオール−３−グルクロナイド標準液を使用
し、参考例７のにおける反応時間を１分とする
以外は参考例７のと同様にして、プレグナンジ
オール測定試薬の感度を測定した結果、実施例２
のプレグナンジオール測定試薬の感度は、0.10μ
ｇ／ml（プレグナンジオールとして）であつた。
次に、参考例７のと同様にして、胎盤機能の
指標となるプレグナンジオールを測定した。その
結果を第４表に示す。[Table] Reference Example 8 (Sensitivity of pregnanediol measurement reagent and measurement of pregnanediol) Preparation of corresponding antibody reagent Using the pregnanediol-3-glucuronide-bovine serum albumin complex obtained by the same method as in Reference Example 2 as an antigen, goat The anti-pregnanediol-3-glucuronide antiserum obtained was absorbed with bovine serum albumin, diluted with a buffer solution, and the anti-pregnanediol-3-glucuronide antiserum obtained was absorbed with bovine serum albumin.
- A glucuronide antibody reagent was obtained. Sensitivity of pregnanediol measurement reagent and measurement of pregnanediol in urine of pregnant women.
The sensitivity of the pregnanediol measurement reagent was measured in the same manner as in Reference Example 7, except that the 3-glucuronide antibody reagent was combined, the pregnanediol-3-glucuronide standard solution was used, and the reaction time was 1 minute. Results, Example 2
The sensitivity of the pregnanediol measurement reagent is 0.10 μ
g/ml (as pregnanediol). Next, in the same manner as in Reference Example 7, pregnanediol, which is an indicator of placental function, was measured. The results are shown in Table 4.
【表】
参考例 ９
（デヒドロエピアンドロステロン測定試薬の感
度およびデヒドロエピアンドロステロンの測
定）
対応抗体試薬の調製
参考例３のと同様の方法により得たデヒドロ
エピアンドロステロン−17−カルボキシメチルオ
キシム−牛血清アルブミン複合体を抗原として使
用し、参考例８のと同様にして、対応する抗デ
ヒドロエピアンドロステン抗体試薬を得た。
デヒドロエピアンドロステン測定試薬の感度
および男子血清中の総デヒドロエピアンドロステ
ンの測定
実施例３で得たデヒドロエピアンドロステロン
−17−カルボキシメチルオキシム−アセチル−家
兎ガンマグロブリン複合体感作ラテツクスのデヒ
ドロエピアンドロステロン測定試薬および前記
で得た抗デヒドロエピアンドロステロン抗体試薬
を使用し、参考例７のおける反応時間を２分と
する以外は、参考例７のと同様にして、デヒド
ロエピアンドロステロン測定試薬の感度を測定し
た結果、実施例３のデヒドロエピアンドロステロ
ン測定試薬の感度は、0.05μｇ／ml（デヒドロエ
ピアンドロステロンとして）であつた。
次に、男子血清をスルフアターゼで処理した
後、第５表に示す倍率に希釈し、参考例７と同様
の方法により、副腎皮質機能等の指標となる総デ
ヒドロエピアンドロステロンを測定した。その結
果を第５表に示す。[Table] Reference Example 9 (Sensitivity of dehydroepiandrosterone measurement reagent and measurement of dehydroepiandrosterone) Preparation of corresponding antibody reagent Dehydroepiandrosterone-17-carboxymethyloxime obtained by the same method as in Reference Example 3 A corresponding anti-dehydroepiandrostene antibody reagent was obtained in the same manner as in Reference Example 8 using a bovine serum albumin complex as an antigen. Sensitivity of dehydroepiandrostene measuring reagent and measurement of total dehydroepiandrostene in male serum Dehydroepiandrosterone-17-carboxymethyloxime-acetyl-rabbit gamma globulin complex sensitized latex obtained in Example 3 Dehydroepiandrosterone measurement reagent was prepared in the same manner as in Reference Example 7, except that the androsterone measurement reagent and the anti-dehydroepiandrosterone antibody reagent obtained above were used, and the reaction time in Reference Example 7 was changed to 2 minutes. The sensitivity of the reagent for measuring dehydroepiandrosterone of Example 3 was 0.05 μg/ml (as dehydroepiandrosterone). Next, the male serum was treated with sulfatase, diluted to the ratio shown in Table 5, and total dehydroepiandrosterone, which is an indicator of adrenal cortical function, etc., was measured in the same manner as in Reference Example 7. The results are shown in Table 5.
【表】
参考例 10
（サイロキシン測定試薬の感度およびサイロキ
シンの測定）
対応抗体試薬の調製
参考例４のと同様の方法によつて得たサイロ
キシン−牛血清アルブミン複合体を抗原として家
兎に免疫して得られた抗サイロキシン抗血清を使
用し、参考例７のにおいて、サクシニル−抗サ
イロキシン免疫グロブリンを0.11％の濃度で感作
する以外は、参考例７のと同様にして、対応す
る抗サイロキシン抗体感作ラテツクス試薬を得
た。
サイロキシン測定試薬の感度および男子血清
中の総サイロキシンの測定
実施例４で得たサイロキシン−サクシニル−家
兎ガンマグロブリン複合体感作ラテツクスのサイ
ロキシン測定試薬および前記で得た抗サイロキ
シン抗体感作ラテツクスを組合せ、サイロキシン
標準液を使用し、参考例９のと同様にして、サ
イロキシン測定試薬の感度を測定した結果、実施
例４のサイロキシン測定試薬の感度は、0.03μ
ｇ／ml（サイロキシン）であつた。
次に８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸
を添加した男子血清を牛血清アルブミン含有緩衝
液で第６表に示す倍率に希釈し、参考例９と同様
の方法によつて、甲状線機能等の指標となる総サ
イロキシンを測定した。その結果を第６表に示
す。[Table] Reference Example 10 (Sensitivity of thyroxine measurement reagent and measurement of thyroxine) Preparation of corresponding antibody reagent A rabbit was immunized with the thyroxine-bovine serum albumin complex obtained by the same method as in Reference Example 4 as an antigen. Using the anti-thyroxine antiserum obtained in Reference Example 7, the corresponding anti-thyroxine antibody was prepared in the same manner as in Reference Example 7, except that succinyl-anti-thyroxine immunoglobulin was sensitized at a concentration of 0.11%. A sensitized latex reagent was obtained. Sensitivity of thyroxine measurement reagent and measurement of total thyroxine in male serum The thyroxine measurement reagent of the thyroxine-succinyl-rabbit gamma globulin complex sensitized latex obtained in Example 4 and the anti-thyroxine antibody sensitized latex obtained above were combined, As a result of measuring the sensitivity of the thyroxine measuring reagent in the same manner as in Reference Example 9 using the thyroxine standard solution, the sensitivity of the thyroxine measuring reagent of Example 4 was 0.03μ.
g/ml (thyroxine). Next, the male serum to which 8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid had been added was diluted with a buffer containing bovine serum albumin to the ratio shown in Table 6, and in the same manner as in Reference Example 9, thyroid function, etc. Total thyroxine, an indicator, was measured. The results are shown in Table 6.
【表】
参考例 11
（ジゴキシン測定試薬の感度およびジゴキシン
添加血清におけるジゴキシンの測定）
対応抗体試薬の調製
参考例５のと同様の方法によつて得たジゴキ
シン−牛血清アルブミン複合体を抗原として家兎
に免疫し、得られた抗ジゴキシン抗血清を使用
し、参考例７のにおいて、サクシニル−抗ジゴ
キシン免疫グロブリンを0.125％の濃度で感作す
ることおよびサクシニル−抗ジゴキシン免疫グロ
ブリン感作ラテツクスを家兎血清アルブミン
（0.1％）含有緩衝液にケン濁すること以外は、参
考例７のと同様にして、対応する抗ジゴキシン
抗体感作ラテツクス試薬を得た。
ジゴキシン測定試薬の感度およびジゴキシン
添加血清におけるジゴキシンの測定
実施例５で得たジゴキシン−マレイル−馬ガン
マグロブリン複合体感作ラテツクスのジゴキシン
測定試薬および前記で得た抗ジゴキシン抗体感
作ラテツクス試薬を組合せ、家兎血清アルブミン
を含む（0.1％）緩衝液に溶解したジゴキシン標
準液を使用し、参考例９のと同様にして、ジゴ
キシン測定試薬の感度を測定した結果、実施例５
のジゴキシン測定試薬の感度は、0.02μｇ／ml
（ジゴキシン）であつた。
次に、男子血清にジゴキシンを添加した後、第
７表に示す倍率に希釈し、参考例９と同様の方法
によつて、この男子血清中のジゴキシンを測定し
た。その結果を第７表に示すが、実施例５のジゴ
キシン測定試薬は、血清中のきよう雑物の影響を
受けないことがわかつた。[Table] Reference Example 11 (Sensitivity of digoxin measurement reagent and measurement of digoxin in digoxin-added serum) Preparation of corresponding antibody reagent A digoxin-bovine serum albumin complex obtained by the same method as in Reference Example 5 was used as an antigen. Rabbits were immunized and the obtained anti-digoxin antiserum was used to sensitize them with succinyl-anti-digoxin immunoglobulin at a concentration of 0.125% in Reference Example 7, and succinyl-anti-digoxin immunoglobulin sensitized latex was administered at home. A corresponding anti-digoxin antibody-sensitized latex reagent was obtained in the same manner as in Reference Example 7 except that it was suspended in a buffer containing rabbit serum albumin (0.1%). Sensitivity of digoxin measurement reagent and measurement of digoxin in digoxin-added serum The digoxin measurement reagent of the digoxin-maleyl-horse gamma globulin complex sensitized latex obtained in Example 5 and the anti-digoxin antibody sensitized latex reagent obtained above were combined, The sensitivity of the digoxin measuring reagent was measured in the same manner as in Reference Example 9 using a digoxin standard solution dissolved in a buffer solution containing rabbit serum albumin (0.1%). As a result, Example 5
The sensitivity of digoxin measurement reagent is 0.02 μg/ml.
(digoxin). Next, digoxin was added to the male serum, diluted to the ratio shown in Table 7, and digoxin in the male serum was measured in the same manner as in Reference Example 9. The results are shown in Table 7, and it was found that the digoxin measuring reagent of Example 5 was not affected by impurities in serum.
【表】
参考例 12
（アスピリン測定試薬の感度およびアスピリン
添加尿におけるアスピリンの測定）
対応抗体試薬の調製
参考例６のと同様の方法で得られたアスピリ
ル−牛血清アルブミン複合体を、抗原として、家
兎に免疫し、得られた抗アスピリン抗血清を使用
し、参考例８のと同様にして、対応する抗アス
ピリン抗体試薬を得た。
アスピリン測定試薬の感度およびアスピリン
添加尿中のアスピリンの測定
実施例６で得たアスピリル−サクシニル−牛ガ
ンマグロブリン複合体感作ラテツクスおよび前記
で得た抗アスピリン抗体試薬を組合せ、アスピ
リン標準液を使用し、参考例９のと同様にし
て、アスピリン測定試薬の感度を測定した結果、
実施例６のアスピリン測定試薬の感度は0.05μ
ｇ／ml（アスピリン）であつた。
次に男子尿にアスピリンを添加し、これを第８
表に示す倍率に希釈し、参考例９のと同様にし
て、尿中のアスピリンを測定した。その結果を第
８表に示すが、実施例６のアスピリン測定試薬
は、尿中のきよう雑物の影響を受けないことがわ
かつた。[Table] Reference Example 12 (Sensitivity of aspirin measurement reagent and measurement of aspirin in aspirin-added urine) Preparation of corresponding antibody reagent The aspiril-bovine serum albumin complex obtained by the same method as in Reference Example 6 was used as an antigen. A corresponding anti-aspirin antibody reagent was obtained in the same manner as in Reference Example 8 using the anti-aspirin antiserum obtained by immunizing a domestic rabbit. Sensitivity of aspirin measurement reagent and measurement of aspirin in aspirin-added urine The aspiryl-succinyl-bovine gamma globulin complex sensitized latex obtained in Example 6 and the anti-aspirin antibody reagent obtained above were combined, and an aspirin standard solution was used. As a result of measuring the sensitivity of the aspirin measuring reagent in the same manner as in Reference Example 9,
The sensitivity of the aspirin measurement reagent of Example 6 is 0.05μ
g/ml (aspirin). Next, aspirin was added to the boy's urine, and this
It was diluted to the ratio shown in the table, and aspirin in urine was measured in the same manner as in Reference Example 9. The results are shown in Table 8, and it was found that the aspirin measurement reagent of Example 6 was not affected by impurities in urine.
本発明によつてもたらされる効果は次のとおり
である。
(1) 被検液中のきよう雑物の影響を受けず、高感
度でかつ迅速に被検液中のハプテンを測定する
ことができる。
(2) 測定における陽性と陰性の差が明瞭であつ
て、その判定に個人的なバラツキが入り難いの
で、測定の結果が正確である。
(3) 高感度で迅速に測定することのできる試薬を
簡単な方法で調製することができる。
The effects brought about by the present invention are as follows. (1) Haptens in a test solution can be measured quickly and with high sensitivity without being affected by impurities in the test solution. (2) The difference between positive and negative results in the measurement is clear, and individual variations are unlikely to enter into the determination, so the measurement results are accurate. (3) Reagents that can be measured quickly and with high sensitivity can be prepared using a simple method.
Claims (1)
ンマグロブリンとからなる複合体を感作した微粒
子担体を含むことを特徴とする免疫学的ハプテン
測定試薬。 ２ ハプテンとアシル化剤で化学的に修飾したガ
ンマグロブリンとからなる複合体を感作した微粒
子担体が緩衝液にケン濁されていることを特徴と
する特許請求の範囲第１項に記載の免疫学的ハプ
テン測定試薬。 ３ 複合体がアシル化剤で化学的に修飾したガン
マグロブリン１分子当り平均0.5〜25分子のハプ
テンを結合していることを特徴とする特許請求の
範囲第１項又は第２項に記載の免疫学的ハプテン
測定試薬。 ４ アシル化剤で化学的に修飾したガンマグロブ
リンのガンマグロブリン成分が、家兎ガンマグロ
ブリン、牛ガンマグロブリン、馬ガンマグロブリ
ンおよび人ガンマグロブリンからなる群より選択
されたものであることを特徴とする特許請求の範
囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の免疫学的
ハプテン測定試薬。[Scope of Claims] 1. An immunological hapten measurement reagent comprising a particulate carrier sensitized with a complex consisting of a hapten and gamma globulin chemically modified with an acylating agent. 2. The immune system according to claim 1, characterized in that a particulate carrier sensitized with a complex consisting of a hapten and gamma globulin chemically modified with an acylating agent is suspended in a buffer solution. Scientific hapten measurement reagent. 3. The immune system according to claim 1 or 2, wherein the complex binds an average of 0.5 to 25 molecules of hapten per molecule of gamma globulin chemically modified with an acylating agent. Scientific hapten measurement reagent. 4. A patent characterized in that the gamma globulin component of gamma globulin chemically modified with an acylating agent is selected from the group consisting of rabbit gamma globulin, bovine gamma globulin, horse gamma globulin, and human gamma globulin. An immunological hapten measurement reagent according to any one of claims 1 to 3.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22135184A JPS61100660A (en) | 1984-10-23 | 1984-10-23 | Reagent for immunological measurement of hapten |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22135184A JPS61100660A (en) | 1984-10-23 | 1984-10-23 | Reagent for immunological measurement of hapten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61100660A JPS61100660A (en) | 1986-05-19 |
| JPH0454903B2 true JPH0454903B2 (en) | 1992-09-01 |
Family
ID=16765436
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22135184A Granted JPS61100660A (en) | 1984-10-23 | 1984-10-23 | Reagent for immunological measurement of hapten |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61100660A (en) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0614047B2 (en) * | 1987-02-27 | 1994-02-23 | イーストマン コダック カンパニー | Agglutination reagent and method for producing the same |
| DE3740471A1 (en) * | 1987-11-28 | 1989-06-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | TEST SUPPLIER FOR THE ANALYSIS OF A SAMPLING FLUID AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF |
| JPH01280252A (en) * | 1988-05-02 | 1989-11-10 | P C C Technol:Kk | Detection of low molecular compound converted to glycoside by immunoassay |
-
1984
- 1984-10-23 JP JP22135184A patent/JPS61100660A/en active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61100660A (en) | 1986-05-19 |
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