JPH0454175B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、固定化酵素電極（以下酵素電極と略
す）を用いた測定方法に関し、特に反復測定によ
り起こる酵素電極の感度低下を回復させる方法に
関する。

〔従来の技術〕

酵素反応を生体物質や食品等に含まれる測定目
的物質の定量に用いることは、その反応速度の速
さ及び基質特異性を有する等の利点から広く行わ
れている。特に酵素電極を用いた測定方法は、微
量の酵素を反復利用する可能性を開き、その応用
範囲を医療、食品、薬品分析等に広げつつある。

しかし、酵素電極は測定を繰り返すにつれ、そ
の感度が徐々に低下する欠点がある。かかる感度
低下をもたらす要因には、 (a) 固定化された酵素自体の変性及び失活。

(b) 試料中の不純物が固定化酵素層へ吸着するこ
とにより、測定目的物質が固定化酵素層に拡散
する過程が妨害される。

(c) 酵素電極の導電体表面の変質。

などがある。これらのうち(a)の要因については、
酵素固定化技術そのものの改善が必要である。た
だし、この要因による感度低下は強酸、強塩基試
料等の測定を行わない限り比較的ゆるやかに進行
することから、時々標準液で校正を行えば、測定
誤差を実用上問題のない程度におさえることが可
能である。一方、(b)(c)の要因の対策としては測定
時に印加する電圧とは逆電圧を酵素電極に短時間
印加する方法が提案されている（特開昭57−
60255号、特開昭60−155959号）。しかし、急激に
逆電圧を印加するこれらの方法では電極に大きな
電流が流れ、白金等の導電体表面に損傷を起こす
可能性があること、また電位の復帰に伴う残余電
流の変動により測定が長時間にわたり困難になる
こと、また白金等の上に酵素を固定化した酵素電
極を作用極とし、酵素反応で生じた過酸化水素が
酸化されるとき生ずる電流を検出する測定方法に
おいて、通常印加されている＋0.6〜＋0.8V（対飽
和カロメル電極、以下SCEと略す）と逆電圧（−
0.6〜−0.8V対SCE）を印加すると、水の安定領
域を越え、酵素電極表面に水素の気泡が付着する
ことによつて以後の測定において電極の安定性が
阻害される欠点がある。ここで水の安定領域とは
水分子の電気分解や緩衝液、支持電解質の酸化還
元反応が起こらず、試料溶液中の測定目的物質を
酵素電極に流れる電流より測定出来る領域のこと
である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

かかる現状に鑑み本発明者等は、前述の問題を
解消し、酸素電極の感度低下を効果的に回復させ
る方法に関し鋭意研究の結果、特に三角波電位走
査を酵素電極に行うことにより、このような目的
が達成せられることを見出し本発明を完成するに
至つた。

〔問題を解決するための手段〕

本発明は、酸化還元酵素を導電体上に固定化し
た酵素電極を用い、測定目的物質を検出する測定
方法において、測定後に該酵素電極に三角波電位
走査を行うことを特徴とする酵素電極の活性化方
法である。

〔作用〕

図面に基づいて更に具体的に説明する。第１図
に本発明にかかるフロー型測定装置を示す。緩衝
液リザーバー１中の緩衝液は、定流量ポンプ２で
図中の矢印の方向へ送液される。測定試料は試料
注入口３よりマイクロシリンジにより注入され、
測定電極系４、排液リザーバー５へと導かれる、
測定中はポテンシオスタツト６により測定電極系
４に一定電圧を印加し、測定電極系４の電流を記
録することにより目的物質の定量を行う。このよ
うな測定を繰り返し行うと、試料に含まれる測定
目的物質以外の比較的高分子量の成分、つまり蛋
白質等は酵素電極８の酵素層表面に、また比較的
低分子の成分、つまり低分子アミンや有機酸等は
酵素層の内部にある白金等導電体表面に徐々に浸
透して吸着し、あるいは白金等導電体が、徐々に
酸化被膜等を形成し感度低下の原因となる。この
現象は長期間使用した酵素電極に最終的な電極反
応に関与する過酸化水素等を作用させた場合の応
答の低下や、サイクリツクボルタングラムのピー
クの歪、残余電流の上昇等により確認できる。

本発明の測定方法においては、このような反復
測定により徐々に感度が低下した酵素電極に感度
を回復させる目的でポテンシオスタツト６に付設
した直線電位走査ユニツト７により三角波電位走
査を行うことを特徴とするが、かかる電位走査は
水の安定領域内で行われ、その範囲は電極の材
質、緩衝液、支持電解質の種類によつて最適範囲
が異なる。中性付近の緩衝液中にあつては、酵素
電極に用いる導電体がグラフアイト極である場合
は−1.0〜＋1.5V、またはそれが金極である場合
は−0.4〜＋1.5V、更にそれが白金極である場合
には−0.5〜＋1.3V（いずれも対SCE）が好ましい
範囲である。走査速度は、ほぼ0.1〜1V／secで
行う。かかる走査は必ずしも各測定終了毎に行う
必要はないが、測定目的物質以外の蛋白質等を多
く含む試料の場合では試料注入10数回毎に行う必
要がある。三角波走査を行う場合の方法として
は、特に電位を濃度測定中の一定値から正方向に
直線的に走査した後、走査方向を逆転して下限電
位まで走査し、元の測定状態の一定電位へ戻すと
（第２図）、残余電流を速やかに安定させることが
出来るため特に好ましい。三角波電位走査を10秒
〜10分間くり返すことにより、静電的に吸着した
成分は、反発力を受けて流去せられ、また白金等
導電体表面の酸化被膜等が除去される結果、酵素
電極の感度を良好な状態にもどし、その寿命を延
ばす効果が得られる。本発明においては、三角波
電位走査を行うため白金等の導電体表面の損傷が
起こらず、さらに残余電流値が速やかに安定する
ため直ちに測定を行え、しかも走査後の感度が効
果的に初期の値に復する。

第１図に示す測定電極系４は白金等導電体に酵
素を固定した酵素電極８と白金等の対極９で構成
されるが、参照電極を加えた３電極系を用いても
良い。また本発明は酵素電極がフロー型測定装置
に組込まれた場合のみならず勿論バツチ型測定装
置の場合にも同様に応用出来る。

〔実施例〕

以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定さ
れるものではない。

実施例 １ 第１図に示す測定装置において酵素電極として
白金線上にグルコースオキシダーゼType（シ
グマ社製）とウシ血清アルブミンの１：１混合物
をグルタルアルデヒドで固定化したものを用い
た。対極としては白金線を用い、H₂O₂を検出す
ることによりグルコースの定量を行つた。

まず、緩衝液としてPH7.0の0.1Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液を1.0ml／minで流し、測定電極系に
＋0.6Vの電圧を印加した。最初に10mMグルコー
ス水溶液を20μl注入し、そのときに得られた電流
値を初期値として記録した。試料として缶ジユー
スを用い１分おきに試料を注入し、電流値を計測
した。そして50回に１回10mMグルコース水溶液
を20μl注入し、その時点の電流値を初期値と比較
した。100回注入した後、−0.5〜＋1.3Vの範囲を
1V／secで10分間三角波電位走査を行い10mMグ
ルコース水溶液20μlを注入し、相対感度を調べ
た。100回注入毎にこの操作を行い、計500回まで
注入した。第３図に示す如く、試料注入により起
きる感度の低下は100回注入毎に行われた三角波
電位走査により回復し、500回目においても初期
感度のレベルを保つことがわかつた。

比較例 １ 三角波電位走査を行わなかつた以外は実施例１
と同様に測定した。この場合、100回目には初期
値と比べて相対感度96％になり、500回目には84
％まで低下した（第３図）。

比較例 ２ 三角波電位走査を行わず、100回試料を注入後、
酵素電極に−0.6Vを30秒間印加した以外は実施
例１と同様に測定した。

−0.6Vを30秒間印加した結果、酵素電極表面
に気泡が発生し相対感度は初期値の60％まで低下
した。

〔効果〕

第３図に示す如く、本発明では三角波電位走査
を行うことにより酵素電極の感度低下を効果的に
回復させることが出来、安定した測定が可能とな
る。またかかる走査により酵素電極の寿命を長く
することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明にかかる酵素電極活性化方法の
実施例を示す。第２図は本発明で酵素電極に行う
三角波電位走査の例を示し、第３図は実施例１、
比較例１における測定結果を示す。 １……緩衝液リザーバー、２……定流量ポン
プ、３……試料注入口、４……測定電極系、５…
…排液リザーバー、６……ポテンシオスタツト、
７……電位走査ユニツト、８……酵素電極、９…
…対極。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 酸化還元酵素を導電体上に固定化した酵素電
   極を用い、測定目的物質を検出する測定方法にお
   いて、測定後に該酵素電極に三角波電位走査を行
   うことを特徴とする酵素電極の活性化方法。