JPH04506898A - 圧電の細胞成長のバイオセンシング法およびシステム - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 圧電の細胞成長のバイオセンシング法およびシステム技術分野 本発明は、有機体の存在を検出する圧電バイオセンサー（ｐｉｅｚ。

ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）装置および、また、微生物の成長、代 謝の要件、抗体の応答、および特異的産生物を検出し、そして有機体の倍加速度 を決定するために圧電バイオセンサー装置を利用する方法およびシステムに関す る。有機体を適当な栄養培地中で成長させると、有機体の代謝産生物は代謝物応 答性ポリマーと反応する。この反応は圧電バイオセンサー装置の表面上に変更し たポリマーの付着または蓄積を誘発する。この装置の表面上の質量の変化は、圧 電バイオセンサー装置の共鳴振動数の変化を生ずる。本発明は、培養において成 長する有機体の成長速度、抗体の感受性および細胞の型を圧電発振器（ｐｉｅｚ ｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｏｓｉｌｌａｔｏｒ）により決定する融通性のある方法を 提供する。

発明の背景 細胞の成長およびタイプを特性決定するための従来の分析測定は実質的な弱点に 悩まされる。それ自体、細胞の形態学は細胞の同定の信頼性がない手段である。

形態学的特徴は首尾一貫して観測することができず、明確な同定に不適切である か、あるいは骨の折れる顕微鏡検査を必要とする。イムノアッセイおよびＤＮＡ プローブアッセイは細胞の感受性のある特異的な特性決定を提供することができ る。しかしながら、これらの技術は多数の欠点を有する。それらは調製が複雑で ありかつ困難な試薬の使用を必要とする。アッセイそれら自体は実施が複雑であ りかつ時間を必要とする。しばしば、アッセイの狭い特異性は、単一の細胞種の すべての系統に対して応答する試験の開発を排除する。

本発明は、有機体の代謝機能を利用することによってこれらの困難を克服し、そ して代替の分析手段を越えた有意の利点をもつ有機体の成長および型を特性決定 する道具を提供することを探求する。

微生物および細胞の成長の間に、栄養が有機体により代謝の最終産生物に転化す るとき、支持成長培地の組成は変化する。例えば、複雑な分子、例えば、炭水化 物および脂質は細胞の代謝のプロセスにより小さい分子、例えば、乳酸、コハク 酸、酢酸、または重炭酸塩に転化される。

ポリペプチドおよびタンパク質はアミノ酸を経てアンモニアおよび重炭酸塩に転 化される。こうして、成長が起こるにつれて、培地の水素イオンの含量は出発栄 養が代謝物に転化するとき変化する。

これらの作用は種々のマニュアルおよび自動化され試験装置を使用する微生物の 検出および同定について微生物学者により広（利用されてきているが、圧電発振 器は検出および分析の可能性を改良するために代謝産生物と組み合わせて従来使 用されてきていない。

圧電発振器の技術を生物学的活性に適用する従来の努力は時間を消費する調製工 程を必要とし、ここで１または２以上のレセプター物質、しばしば抗原または抗 体を圧電発振器の表面上に固定化する。圧電発振器の操作の間に、レセプター物 質は標的細胞または分析物を高度に選択的方法で結合する。溶液から抜き出され た分析物は相補的抗体、抗原、ＤＮＡ、または全細胞であることができる。分析 物の添加は結晶の共鳴振動数を変化させ（△ｆ）、その大きさは溶液の分析物濃 度に比例する。

このアプローチは英国特許出願第８６３０７１１５．５号（セイコー）に記載さ れている。

しかしながら、これらのレセプター修飾圧電装置の調製は手順的に複雑であり、 しばしば困難である。注意深い調製でさえ首尾一貫した結果を保証しない。レセ プター試薬は高価であり、固定化プロセスの間に不活性化し、そして固定死後結 晶表面から分離することがある。（Ｇ、　Ｇ。

Ｇｉｕｌｂａｕｌｔ、Ｊ、Ｈ，Ｌｕｏｎｇ、およびＥ、Ｐｕｒｓａｋ−Ｓｏｃｈ ａｃｚｅｗｓｋｉ、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎ。

１ｏｇｙ）　、Ｖｏ　１．７、ｐｐ、３４９−３５１．１９８９）、既知の技術 は、また、ＱＣＭの洗浄または乾燥あるいはＱＣＭの測定前に「遊離」または「 結合した」試薬の分離を必要とする。その結果、レセプター修飾圧電方法は代謝 物産生の連続的実時間の測定に不適当である。最後に、レセプター修飾圧電方法 の有用性は試薬の特異性により制限される。多数の異なる細胞の系統または型に 広く応答する単一の試薬を見いだすことが極端に困難であり、こうして異なる細 胞のタイプの存在を評価するために反復する試験が必要であった。

現存する技術の困難を克服する方法で、有機体の成長を検出し、測定し、そして 分析する圧電方法が要求されていることは、現在、明らかである。理想的な方法 は、操作が簡単であり、経済的であり、そして速い連続的検出の手段を提供し、 そして種々の異なる成長培地の組成物における試験に有用であるべきである。こ の方法は固定化されたレセプターまたは複合体の洗浄を必要としてはならない。

この方法は複雑でない試薬を使用する同時試験を可能とすべきである。イムノア ッセイまたはＤＮＡプローブのアッセイと異なり、この方法は所定の種から誘導 されすべての系統に広く適用可能であるべきである。この方法は、また、前辺て 純粋な培養物に分離しないで、混合したフロラ（ｆｌｏｒａ）の存在下に特定の 細胞および微生物を検出することができるべきである。こうして、混合した培養 物の実時間のモニターを利用できるであろう。さらに、この方法は蓄積したデー タの統計学的分析を便利に提供するために適合性のコンピューターと両立式（ｃ ｏｍｏａｔ　ｉｂ］　ｅ）であるべきである。これらの目的を達成する装置およ びシステムも、また、必要である。

発明の要約 圧電発振器により広範な種類の有機体を検出する方法、装置、およびシステムが 発見された。いったん有機体の代謝が培地の状態を変化させると、圧電発振器は 特異的代謝物応答性ポリマーと有機体により産生された特異的代謝物との複合体 を蓄積する。詳しくは、本発明の１つの面は、（１）代謝物応答性ポリマーおよ び成長調節因子を含有する培地を圧電発振器と接触させることによって、圧電発 振器の共鳴振動数を測定し、（２）代謝物を産生ずることができる有機体を前記 培地の中に導入し、（３）前記培地をインキュベーションし、（４）前記代謝物 を代謝物応答性ポリマーと反応させてポリマー−代謝物複合体を生成し、そして （５）ポリマー複合体の等電点に到達したとき、圧電発振器上のボ、リマーー代 謝物複合体の蓄積により引き起こされる圧電発振器の共鳴振動数の変化について 前記培地をモニターする、工程からなる、経時的に特定の有機体の存在またはそ の成長を検出する方法である。本発明の他の面は、（１）前述の代謝物および代 謝物応答性ポリマーの複合体がその上に付着する圧電発振器、（２）圧電発振器 に接続し、圧電発振器を活性化する電源、および（３）圧電発振器に接続し、そ の共鳴振動数の変化を測定する手段、からなる、有機体を検出する装置を包含す る。本発明のそれ以上の面は、（１）代謝物および代謝物応答性ポリマーの複合 体がその上に付着する圧電発振器、（２）試薬供給システム、（３）圧電発振器 に接続する電源、（４）圧電発振器に接続し、その圧電発振器の共鳴振動数の変 化を測定する手段、および（５）システムが発生したデータを集め、貯蔵し、そ して分析するコンピューター、からなる、有機体を検出するシステムを包含する 。

図面の簡単な説明 第１図は、代謝物応答性ポリマーを使用する本発明の一般原理を示す。

第２図は、Ｈｌと代謝物応答性ポリマーとの相互作用を示す本発明の線図である 。

第３図は、代謝物特異的結合部位を有する代謝物応答性ポリマーを示す本発明の 線図である。

第４図は、狭いおよび広い組成の分布をもつ物質のｐｌに到達する作用（ｅｆｆ ｅｃｔ）を示すグラフである。

第５図は、発振器回路、振動数カウンター、試薬供給システム、培養物を含有す る多重装置プレート、および生ずるデータを分析するコンピューターからなるシ ステムの要素の路線図である。１つの装置は引き伸ばした図で示されている。

第６ａ図は、溶液の中に含有されている代謝物応答性ポリマーの等電点に向かう 化学的操作の間のＱＣＭの共鳴振動数の変化を示すグラフである。

第６ｂ図は、溶液の中に含有されている代謝物応答性ポリマーの等電点に向かう 電気化学的操作の間のＱＣＭの共鳴振動数の変化を示すグラフである。

第７図は、カナマイシンを含有するか、あるいは含有しないＥ、ｃ。

１ｉ培養物についての経時的共鳴振動数の応答を比較するグラフである。

第８図は、Ｅ、ｃｏｌｉの異なる開始濃度からの圧電発振器の経時的応答を比較 するグラフである。

第９図は、異なる炭水化物の栄養に対するＥ、ｃｏｌｉの圧電発振器の応答を示 す棒グラフである。

第１０図は、Ｅ、ｃｏｌｉ細胞の倍加および代謝速度の定数にの報告された値を 使用する、異なる細胞濃度についての共鳴振動数の変化の予測される挙動を示す グラフである。

第１１図は、ｌｏｇ△ｆ／△ｔのプロットから決定したコロニー倍加のための時 間間隔を示すグラフである。

発明の詳細な説明 本発明は、圧電バイオセンサー装置、代謝物応答性ポリマーと生きている有機体 により産生された代謝産生物と相互作用を利用して生きている有機体の存在を検 出するシステムおよび方法に関する。これらの相互作用は、圧電バイオセンサー 装置の表面上のポリマー／代謝物複合体の付着または蓄積を誘発する。この装置 の表面上の質量変化は、圧電バイオセンサー装置の共鳴振動数の変化を生ずる。

本発明は、有機体の培地中の代謝物に関係する変化を圧電の検出原理を使用して モニターすることができる、融通性のある方法、装置、およびシステムを提供す る。

この開示に関して、ある数の用語を使用する。ここで使用するとき、「代謝物」 は細胞により代謝的に変換されるか、あるいは使用することは新しい化合物の合 成において使用することができる。代謝物は取り囲む培地中で、細胞表面に取り 付けるか、あるいは細胞内に含有されて見いだすことができる。「代謝物応答性 ポリマー」は、１）代謝物と相互作用することができ、２）代謝物の質量を増幅 し、３）代謝物との反応後、圧電発振器と相互作用して、その振動数を変更する ことができ、４）水溶性であり、モして５）生理学的適合性であるものである。

「両性ポリマー」は、酸または塩基として挙動する能力を有する代謝物応答性ポ リマーである。アミノ酸およびタンパク質は、酸性基（ＣＯＯＨ）および塩基性 基（ＮＨ２）の両者を有するので、両性である。「両性代謝物応答性ポリマー」 は、代謝物応答性ポリマーおよび両性ポリマーの特性を有するポリマーを呼ぶ。

「圧電発振器」、「水晶振動子微量てんびん（ｑｕａｒｔｚ　ｃｒｙｓｔａｌ　 ｍ１ｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）ＪおよびｒＱｃＭＪは、質量変化を検出する基礎と して圧電の原理を使用してバイオセンシング装置を呼ぶ３つの用語である。さら に、ＳＡＷ、バルクウニイブ（ｂｕｌｋｗａｖｅ）発振器、およびたわみ板（ｆ ｌｅｘｕｒａｌ）モードの装置は質量変化の検出において使用する別の装置であ る。ここで使用するとき、「有機体」は、その代謝の結果、本発明の方法により 検出または同定することができるその有機体に対して独特である産生物をつくる 、任意の有機体を包含する。しかしながら、本発明の最も有用である有機体は、 通常水性培地中で成長する微生物、例えば、バクテリア、菌類、および組繊細胞 である。「成長調節因子」は、有機体の成長を刺激または遅延する物質である。

「栄養」は、有機体により代謝されそして成長に必要な物質である。「レセプタ ー」は、分析物と特異的結合を形成する化合物である。これらは、キレート剤、 抗体、レクチン、組織レセプター、細胞付着因子、および配位子結合性タンパク 質の形態を取ることができる。

前述の早期の技術と異なり、本発明の好ましい実施態様は結晶表面をレセプター で前辺て修飾することに頼らない。その代わり、非修飾結晶表面をもつ圧電発振 器を使用する。本発明の目的を満足する他の手段を、また、記載する。

第１図は、微生物の検出および分析のための本発明の一般原理および要素を例示 する。有機体（０）は栄養を代謝物（Ｍ）、例えば、酸、緩衝イオン、塩、酵素 、タンパク質、炭水化物、および脂質に代謝する。

有機体を培養するために選択した成長培地は、栄養（Ｎ）に加えて、１）圧電バ イオセンサー（ＰＢ）と非反応性でありモして２）特定の代謝物（Ｍ）と反応性 であるように、特別に設計した代謝物応答性ポリマー（ＭＲＰ）を含有する。こ の代謝（Ｍ）を栄養培地の中に導入すると、代謝物応答性ポリマー（ＭＲＰ）を 変更し、そしてポリマー／代謝物複合体（Ｃ）を形成する。複合体は圧電バイオ センサー（Ｐ　Ｂ）の金電極と相互作用し、そして装置の共鳴振動数（↓ｆ）を 変化させる。この相互作用は矢印（１）で示されている。ポリマー／代謝物複合 体（Ｃ）は、培地のｐＨが複合体の等電点に近付くとき、発振器上に蓄積する。

共鳴振動数のシフトの程度は、有機体により産生されそして培地の中に存在する 代謝物の量に対して比例する。このようにして、共鳴振動数の変化は有機体の代 謝および成長速度に関係する。

ポリマーは、イオンの対形成、複合体化反応、レドックス反応、または共有カッ プリングを通して代謝物と反応するように選択または設計する。この種々の反応 は本発明を大きいまたは小さい分子量の代謝物に等しくよく適用可能とする。便 宜上、「複合体」は、ここで使用するとき、含まれる特定のメカニズムに無関係 に、代謝物応答性ポリマーと代謝物との反応から生ずる物質を意味する。第２図 は構造的に第１図に類似し、そして酸性代謝と反応するように設計されたポリマ ーの使用をさらに詳しく例示する。代謝の有機酸または二酸化炭素は成長培地を 酸性化するとき、代謝物により解放されたプロトンは両性代謝物応答性ポリマー （ＡＭＲＰ）上のプロトンレセプター基と反応する。プロトンの中和はポリマー 上の正味の電荷を変化させ、そしてポリマーの物理学的性質を変更する。等電点 のポリマー／代謝物複合体（Ｃ）は、培地のｐＨが複合体の等電点に近付くとき 、発振器上に蓄積する。複合体は圧電バイオセンサー（Ｐ　Ｂ）の金電極と相互 作用し、そして装置の共鳴振動数（↓ｆ）を変化させる。この相互作用は矢印（ １）により示されている。圧電発振器上の付着は対応する振動数の減少を与え、 これは電気的に読みとられ、代謝速度および培養物の細胞の成長速度を決定する ことができる。

ポリマー／代謝物の相互作用の選択性は、また、ポリマーの設計によりコントロ ールすることができる。例えば、抗体、ポリ核酸、レセプター、キレート剤、細 胞付着因子、および配位子結合性分子はポリマーに結合することができる。ポリ マー上のこれらのレセプター部位の数を変更することによって、本発明は特定の 代謝物について高度に選択的とするか、あるいはある数の代謝物に対して広（応 答性とすることができる。

第３図は第１図に類似し、そして本発明のこの応用をさらに詳しく例示する。す ぐれた例は有機体（０）により産生された抗原（ＡＧ）であり、これはレセプタ ーとして相補的抗体（ＡＢ）を含有する構成されたポリマー（ＭＲＰ）と複合化 する。生ずる抗原／抗体−ポリマー複合体（Ｃ）の溶解度および物理学的比率の 変化は、圧電バイオセンサー（ＰＢ）の表面とのアソシエーションを誘発する。

複合体は圧電バイオセンサー（ＰＢ）の金電極と相互作用し、そして装置の共鳴 振動数（↓ｆ）を変化させる。この相互作用は矢印（１）により示されている。

引用した他の例におけるように、圧電発振器の共鳴振動数のモニターは培地中の 代謝物の量または代謝速度の特定の測定を提供する。

圧電発振器 質量変化を記録する圧電発振器は文献によく記載されている。圧電発振器の１つ の型は、２つの電極の間にサンドイッチされた単結晶ウェーファー（ＱＣＭ）か ら成る。電極は水晶振動子をその共鳴振動数で推進する外部の発振器回路への接 続手段を有する。この振動数は結晶の質量、ならびに結晶の電極区域に制限され た層の質量に依存する。こうして、振動数は電極の表面上の質量またはそれらの 電極上の層の変化により変更する。一般に、これらの装置の共鳴振動数の変化は 質量変化に関係付けることができる。ＱＣＭおよび取り付けられた層が剛性の層 の挙動に従う場合、質量変化はサラアープレイ（Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ）の次の関 係式に従い共鳴振動数のシフトから決定される：ここで△ｆは測定した振動数の シフトであり、ｆ、は水晶振動子の親振動数であり、６ｍは質量変化であり、Ａ は圧電的に活性な面積であり、ρ、は水晶の密度（２，６４８ｇｃｒｖ３）であ り、モしてｍ、ｌは剪断弾性係数（２，９４７ｘｌＯ目ダインｃ　ｍ−”、ＡＴ 切断した石英について）である。

圧電発振器の共鳴振動数は、また、培地の粘度の変化により影響を受ける。粘度 変化のときの振動数のシフトは、次の関係式により決定することができる： △ｔ　＝　ｔｏ”２（ηρ／πμＱρ。）Ｉ／２ここでＮは培地の粘度であり、 そしてｒは培地の密度である。

表面音響波（ＳＡＷ）装置は、本発明に対して適用可能な他の圧電変換技術を表 す。これらの装置は、圧電石英支持体の表面上の統合された微小電極の列からな る。それらは、横方向の表面波の速度の変化から生ずるそれらの表面における質 量変化に関係づけることができる振動数の変化を示す。ＳＡＷ装置は、また、粘 度センサーとして使用されてきている。たわみ板のモードの装置は、圧電支持体 の表面における質量変化を測定できる他の別の技術を表す。これらの後者の２つ の装置は、質量変化に対してばかりでなく、かつまた結合した層の剛性係数の変 化に対して応答性であることにおいて、ＱＣＭと異なる。

代謝物応答性ポ°ツマ一 本発明の圧電バイオセンサー装置の実施例のために代謝物応答性ポリマーとして 使用する特定のポリマーは、両性のアクリル酸（ＡＡ）　、アルキルメタクリレ ート（１？、ＭＡ、）　、およびＮ、　Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレー ト（ＤＭＡＥＭＡ）のコポリマーまたはターポリマーである。構造的に、ポリマ ーは線状であるか、あるいは側鎖または架橋結合の鎖を含有することができる。

それらは２工程の方法を使用して調製することができる。第１工程はメチルアク リレート（ＭＡ）　、ＲＭＡおよびＤＭＡＥＭＡからポリマーを生成する。第２ 工程は、メチルアクリレートのセグメントをコントロールして選択的に加水分解 して、側鎖の酸の基および塩基の基を形成する。これらの反応は次のように表さ れる２工程の乳濁法は、次の理由で、直接の溶液重合より好ましい。アミンのア クリル酸モノマーへのミカエル（Ｍｉｃｈａｅｌ）付加はより容易に防止される 。プレポリマーの乳化重合は溶液重合より有意に速く、そしてより容易にコント ロールされる。さらに、ポリマー中のモノマー単位の組成分布は、コントロール した供給法により、なおいっそう容易に調節される。

ポリマーは、一般に、それらの等電点（ｐ　Ｉ）以外のすべてのｐＨにおいて水 溶性である。等電点は酸の基対塩基の基の比により決定され、こうして適当な比 でポリマーを合成することによって変化させることができる。本発明において使 用するポリマーについて好ましい比は、ポリマーのｐｉが生理学的範囲（約６． ２〜７．８）にあるような比である。

これはアクリル酸およびＤＭＡＥＭＡについて２．０〜０．８の酸対塩基の比に 相当する。（ｐｉは必然的に成分の基についてのｐＫａ値に依存する。）応答は 、また、成分の酸および塩基の部分に影響を及ぼしうる、中性の非イオン性セグ メントの性質および大きさにより影響を受けることがある。

ポリマーの溶解特性は、それらのイオン含量により強く影響を受ける。

有意の中性の炭化水素のセグメントを有するポリマーは、中性のセグメントがわ ずかであるか、あるいはそれらをもたないポリマーより、それらの等電点におい て水溶性が低い。本発明者らは、異なるアルキルメタクリレートを含有しそして 種々のセグメント部分を有し、すべてが生理学的範囲のｐｔをもつ、１系列のポ リマーを調製した。異なる溶解度および関連する特性を有するいくつかの他のポ リマーは、また、適当である事が予測される。これらのポリマーのいくつかを表 Ａに記載する。

表Ａ バクテリアの成長の電圧検出のための高分子良性電解質晶−ＭＭＡ−ＤＭＡＥＭ Ａ　１−１−１　−　４５３　−ＡＡ−ＭＭＡ−ＤＭＡＸＭＡｌ−１−１１４） １４／１−１２／１　６３５　６３００ｇ呟復 晶−ＭＭＡ−ＤＭ証ＭＡ　１−１−１　１２３／１２１／１　７コ９　五１友コ η ＡＡ−Ｍｈ４Ａ−ＤＭＡＩＥＭＡ　１−２−１　１ｊ１６／１４６／１　７．１ １　３９４００五α℃ 人Ａ−Ｅｂ４Ａ−ＤＭＡＥＭＡ　１−１−１　−　７ｊＯ１（ｊｃＤＸＪπ広η ＡＡ−ＢＭＡ−ＤＭＡＩｉ：ＭＡ　１−１−１　１Ｊ）ａ３／１／１　７．５０ 　３５Ｑ）Ｄ。

２４００Ｇ ＡＡ−ＭＭＡ−ＤＭＡＥＭＡ　１−３−１　１．α１５／３３／１　７．４６　 ９９０００ａｌ力 ＡＡ−ＭＭＡ−ＤＭＡＥＭＡ　４−５−１　４６９／６３６／１　５３７　４５ ６００ｙα℃ ＡＡ−ＭＭＡ−ＤＭＡＥＭＡ２−３−１２４）８／Ｌ２５／１６３７９７２００ ＡＡ＝アクリル酸 ＲＭＡ＝アルキルメタクリレート ＤＭＡＥＭＡ＝Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートＭＡ＝メチルアク リレート ＥＭＡ＝エチルメタクリレート ＢＭＡ＝ブチルメタクリレート ＭＭＡ＝メチルメタクリレート Ｍｗ＝重量平均分子量 Ｍ　ｖ　＝粘度平均分子量 ＊列挙された概算モル比 ｐＨの小さい変化に対するポリマーの感受性は、その組成の分布の狭さに大きく 依存する。これは第４図に表されている。狭い組成分布は反応培地中の反応する モノマーの比のコントロールにより発生する。この比はポリマーの中に見いださ れるが、構成モノマーの反応性の比により決定される。この比はバランスした供 給または供給不足の方法により維持することができる。米国特許第４，７３５， ８８７号および米国特許第４，７４９，７６２号に記載されているバランスした 供給方法は注意した反応のコントロールを必要とするが、高分子量の生成物の急 速な形成に導く。高分子量の生成物の急速な生成が不必要であるとき、供給不足 の方法は好ましい。供給不足の方法は、純粋な培地中のその全体の反応速度より 非常に低い速度で供給モノマーの添加を包含する。この反応は、モノマーがリビ ングラジカルを含有する乳濁粒子に直面するときにのみ起こる、リビングフリー ラジカル工程に本質的になる。十分な「バランスモノマー」を添加して水性相を 飽和しく溶液が半透明となり始める点として決定された）、次いで開始剤を添加 し始める。また、わずかに過剰のＭＡを維持して正しい生成物の組成をえるべき である。これは容易に達成される。なぜなら、アクリレート−メタクリレート系 について合計の固有の反応速度と反応性の比との間の関係が好適であるからであ る。

モノマーの多数の組み合わせは、生理学的ｐＨ範囲のｐｔを有するポリマーを生 成することができる。両性ポリマーは、次の記載するモノマーの組の種々の組み 合わせから調製することができる：Ａ１酸性モノマーー水素イオンを生成して新 しい物質を形成できる分子またはイオン性物質。例はアクリル酸、メタクリル酸 、およびリン酸およびスルフィン酸の基を含有するモノマーである。

Ｂ、塩基性モノマー−水素と結合して新しい化合物を形成できる分子またはイオ ン性物質。例はＤＭＡＥＭＡ、ジエチルアニノエチルメタクリレート、ｔ−ブチ ルアミノエチルメタクリレート、モルホリニノエチルメタクリレート、ピペリジ ノエチルメタクリレートメタクリレートである。

Ｃ１中性七ノマーー酸性または塩基性のいずれでもない分子またはイオン性物質 。例はアルキルメタクリレート（ＭＭＡ、ＥＭＡ、ＢＭＡ）、ヒドロキシエチル メタクリレート（ＨＥＭＡ）　、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ビニルピ ロリドン、酢酸ビニル（加水分解するとビニルアルコール）、アクリルアミド、 ビニルエーテル、およびスチレンである。

（反応性比が大きく異なるコモノマーの反応は非常に注意を要する反応のコント ロールを必要とし、したがって好ましくない。）上におよび表Ａに記載する例に 加えて、生理学的範囲のｐｉをもつ水性の可溶性ポリマーはｐＨ感受性代謝物応 答性ポリマーとして有用であることかある。特定の例は、次のものを包含する： １）ジメチルアミノエタノールおよび同様な化合物とメチルビニルエーテル／マ レイン酸無水物のコポリマー。

２）ビニルピロリドンとメチルアクリレートとのコポリマーの加水分解物。

なお他の代謝物応答性ポリマーは、抗体、ポリ核酸、レセプター、キレート剤、 細胞付着因子、および配位子結合剤を、側鎖のヒドロキシ、カルボキシル、アミ ノ、アルデヒド、無水物、イミドおよびエポキシ基を含有する水溶性ポリマーに 結合させることによって形成することができる。この方法において、これらの側 鎖の基の１または２以上を含有するポリマーを結合基と反応させて、代謝に向か って反応性である中間体の基を形成する。培養物の分析において、有機体により 発生した代謝は中間体のカップリング基との反応により活性化されたポリマーに 結合する。

グルタルアルデヒド、臭化シアン、ヒドラジン、ビスホキシラン、ジビニルスル ホン、エビクロロヒドリン、バーアイオデート、トリクロロトリアジン、ジアゾ ニウム塩、カルボニルジイミダゾール、カーポジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシ ンイミド、およびトシレートを包含する結合化学はこの分野において広く記載さ れてきている。これらの化学および手順の概観は、次の文献に記載されている： ［親和性クロマトグラフおよび関係する技術において使用するための実施の手引 （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｆｏｒ　ｕｓｅ　ｉｎ　Ａｆｆｊｎｉｔｙ 　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｓ）Ｊ、Ｒｅａｃｔｉｆｓ　ＩＢＦ−３ｏｃｉｅｔｅ　Ｃｈｉｍｉｑｕｅ　Ｐｏ ｔｎｔｅｔ−Ｇｉｒａｄ、Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ−Ｌａ−Ｇａｒｅｎｎｅ−Ｆｒ ａｎｃ、カルボニルジイミダゾールにより側鎖のヒドロキシ基の活性化について の特定の例は、Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ２５４　（１９７９Ｌ　２５７２および Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、２１９　（１９８１）　、ｐｐ、３５３．３６１に 記載されている。水溶性カーポジイミドにより側鎖のカルボン酸基の活性化は、 Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ。

１９９　（１９８１）　、ｐｐ、２９７．４１９に記載されている。Ｎ−ヒドロ キシスクシンイミドによりカルボン酸の活性化は、Ｂｉｏｃｈｅｍｊｓｔｒｙ　 １１１、（１９７２）　、ｐ、２２９１、およびＢｔｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　６ ７０　（１９８１）１６３に記載されている。

これらの手順により活性化することができる典型的な水溶性ポリマーは、ポリヒ ドロキシエチルメタクリレートおよびアクリレート、メチルビニルエーテルコポ リマー、ポリビニルアルコールおよびコポリマー、および前述の両性高分子電解 質を包含することができる。

こうして、本発明の目的のための特定の代謝物応答性ポリマーの設計は、それが 複合化する代謝物（すなわち、Ｈ“または抗体）により、およびアッセイすべき 有機体の環境の要件によりガイドされる。

成長培地 この系のために基本的な成長培地は、分析すべき特定の型の細胞による発酵のた めに選択した栄養物質を含有する。次いで、前述の型の特定の代謝物応答性ポリ マーを培地する。生ずる培地は必要に応じて成長調節因子、例えば、抗体、アミ ノ酸、ビタミン、塩類、または脂質を補充することができる。成長調節因子は、 別々にまたは組み合わせで使用して、培地を特定の細胞の型について高度に選択 性とするか、あるいは広いスペクトルの細胞の応答について低い選択性とするこ とができる。栄養培地の組成は、種々の分析の必要性に対する本発明の応答性を 柔軟にすることができる。

成長培地のための成分は、なかでも、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、ミシガン州デト ロイト、およびＢＢＬ、マリイランド州コツキイスビレから商業的に入手可能で ある。下の実施例においてＥ、ｃｏｌｉの検出に使用する培地は、１％Ｗ／Ｖの 炭水化物を補充したディフコ・パープル（Ｄｉｆｃｏ　ｐｕｒｐｌｅ）であった ［微生物学のための脱水培地および試薬のディフコ・マニュアル（Ｄｉｆｃｏ　 Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＤｅｈｙｄｒａｔｅｄ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉａ　ａｎ ｄ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ｐＩ）、７１２ −７１５（１９８４）、Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ミシガン州デ トロイト］。

下に記載する例示の実施例において使用する培地は、ＬｏｇのプロテオースＮｏ 、３．１ｇのビーフェキス、５ｇの塩化ナトリウム、およびブロモクレゾールパ ープル色素（２０ｍｇ）を１リツトルの精製した水中に溶解することによって調 製した。炭水化物の存在下に成長を検出するために、１％のマンニトールを成長 培地に添加した。マンノース、アラビノース、ラクトース、およびイノシトール をマンニトールの代わりに使用して、特定の炭水化物の影響について研究するこ とができる。

合成培地を包含する別の培地はよ（知られており、そして特性決定および同定に ついて研究する特定の有機体の成長を支持するために使用できる。

代謝物応答性ポリマーの濃度 慣用方法により滅菌後、培地を０．１％Ｗ／Ｖの合成代謝物応答性ポリマーと無 菌的に混合した。試験前に、栄養培地のｐＨを必要に応じて細胞培養の生理学的 要件およびポリマーの溶解度の要件と適合性の値に調節した。あるいは、ポリマ ーの性質に依存して、代謝物応答性ポリマーを含有する培地をこれらのｐＨ調節 後に滅菌することができる。

０．１〜２．０％Ｗ／Ｖの範囲の代謝物応答性ポリマーの濃度はすべての値にお いて有効な結果を生ずるが、本発明はこの範囲に限定されない。この範囲の下限 （０，１％）は３つの理由でより望ましいと考えられる。第１に、より低い濃度 はポリマーを保存する。第２に、活性細胞へのポリマーの有害な作用は回避され る。第３に、より低い濃度は成長培地の緩衝化能力を最小にして、圧電センサー 上への変更したポリマーの付着から生ずる応答を最適化する。原理的に、より低 いポリマー濃度は、緩衝化能力が最小となるとき、より大きい感度を生ずるであ ろうが、より高いポリマー濃度はより大きい動力学的範囲を与えることができる 。

細胞濃度の決定 所定の実験における細胞濃度は、ペトロソフーノ＼ウザー（Ｐｅｔｒ。

ｆｆ−Ｈａｕｓｅｒ）カンランティングチャンバーで顕微鏡的に推定した。まず 、０．１九のナトリウムアジド溶液の添加により、細胞の培養物の成長を阻止し た。ある場合において、ベト口・ソフーノ＼ウザー（Ｐｅｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓ ｅｒ）カンランティングチャンバーにおける細胞密度は、コンバク（Ｃｏｍｐａ ｑ）３８６／２５コンピユーターを装備したオリンパス（Ｏｆ　ｙｍｐｕｓ）Ｑ ２画像アナライザーを使用して自動的に計数した。

圧電バイオセンサー装置およびシステム細胞の検出および同定、抗体応答の研究 、および成長速度の決定は、上に概説した条件下に単一の圧電発振器装置を使用 するか、あるいは温度に関連する不安定性を補償する第２水晶振動子に対して参 照した圧電発振器装置を使用して実施することができる。

さらに、操作の融通性のあるモードは、マルチウェル（ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ）の 分析プレート（２）中で発振器（３）、振動数カウンター（４〕、試薬供給シス テム（６）、バスボードコネクター（７）、およびコンピューター（５）を関連 させてアッセイを実施することであることができ、コンピューター（５）はデー タを記録しそして試薬供給システムをコントロールすることができる。第５図は このようなシステムの概略図であり、マルチウェルの分析プレート（２）の１つ の装置または反応チャンバー（２ａ）の拡大図を包含し、１つの装置または反応 チャンバ（２ａ）は圧電発振器（集合的にＱ、ＧＥ、およびＥＣ）、試料培地（ ＳＭ）　、および水晶振動子（Ｑ）の対向する面上の金電極（ＧＥ）に対する０ −リングまたはガスケット（Ｇ）を含有し、水晶振動子および電極はガスケット （Ｇ）により支持されている。分析プレート（２）のマルチウェルの列の各圧電 センサーは個々のコンピューター（５）に結合することができる。あるいは、各 々はそれ自身の参照センサーに対して参照することができるか、あるいは列のす べてのセンサーは集合的に共通のセンサーに参照することができる。試薬供給シ ステム（６）は必要な配管およびコントローラー（すなわち、ポンプ、サーボモ ーターなど）を組み込んでいるので、培養物の試料はマルチウェルの中に自動的 に導入することができる。試薬供給システム（６）は、また、必要に応じて異な る栄養培地または異なる抗体を添加することができるであろう。

多数の試料ウェルの応答パターンは、細胞の同定または抗体の応答についてのコ ンピューター分析により、既知の試薬の添加に関係づけるすることができる。精 巧なシステムを使用することができ、ここで異なる培地中の既知の培養からの応 答パターンの認識をコンピューターに「学習」させ、次いで分析に利用する。

ウェル中の特定の試薬の個々の配置を促進するために、例えば、米国特許第４． ５８８，５５５号に記載されているように、成長培地を分析の前に乾燥した混合 物として調製し、多孔質マトリックス、例えば、膜または吸収材料の上または内 部に含有させることができる。試験の間に、多孔質要素を各ウェルの上に配置す る。細胞を含有する試料の流体を要素の上部に添加するか、あるいは試薬の要素 を配置する前に添加することができる。

別の装置のフォーマットは有機体を膜または多孔質の構造体の上に固定化し、次 いでこの構造体を圧電発振器の表面に対向して、密接に近接させて配置する。代 謝産生物は生成し、次いで水晶振動子、膜、および限定Ｏ−リングにより定めら れた反応チャンバーの中に拡散する。溶液中でポリマー上のレセプター基との反 応後、ポリマーは沈澱し、そしてＱＣＭ表面上に吸着し、測定可能な振動数の変 化を生ずる。

期待されるように、この方法は病原性バクテリアおよび菌類の検出および同定に おいてことに価値があるであろう。この方法は、また、各異なる有機体に対して 特異的なポリマーまたはポリマーの接合体により、独特な代謝産生物の存在を直 接決定することによって、培養物中の哺乳動物の細胞を検出するために有用なで あることがある。さらに、この方法はすべての有機体が共通して生成する代謝物 、例えば、タンパク質に対して応答するポリマーを使用することができ、こうし て特定の栄養をすべきするその能力に基づいて有機体を検出および同定すること ができる。この方法の他の有意の使用は、成長阻害因子に対する細胞の応答を急 速に決定することである。抑制または毒性の化学物質および抗体に対するバクテ リアおよび菌類の応答性、および化学治療剤に対する癌細胞の応答性は、また、 本発明の有用性のすぐれた例である。本発明の融通性は、臨床的セット、食物に おける微生物の検出、および工業的方法における品質のコントロールにおける多 数の応用を示唆する。

実施例 次の非限定的実施例は、本発明の基本原理および独特の利点を例示する。

実施例１　化学的および電気化学的に誘発されたｐＨ変化のためのＱＣＭ振動数 の応答 この実施例は、培地のｐＨの変化をＱＣＭにより検出することができるという事 実を例示する。酸同等体はアニオン性ポリマーをその等電性組成物に転化し、こ れによりポリマーをＱＣＭの水晶振動子の表面上へ吸着させる。ポリマーの吸着 は、酸同等体の導入のときから測定された、ＱＣＭの共鳴振動数を減少させる。

酸同等体は直接添加によるか、あるいはＱＣＭの金電極において加水分解により 導入することができる。いずれの場合においても、ＱＣＭ表面におけるｐＨは変 更される。

（ａ）１：１：１のＡＡ−ＭＭＡ−ＤＭＡＥＭＡを０．０ＯＩＮのＨＣｌでＱＣ Ｍ中のｐＨ＝７．５からその等電点に酸性化すると、振動数の顕著な減少が直ち に観測される（第６ａ図）。これは、培地の粘度が感知し得るほどに変化しない ので、ポリマーの吸着のための水晶振動子上の質量の増加に主として起因する。

ポリマーの付着は石英／金型表面の写真において明らかであり、この写真はＱＣ Ｍ表面上の厚い凝着性ポリマーフィルムを示す。酸をさらに添加するか、あるい はＯ，０ＯＩＮのＨＣＩで逆滴定すると、共鳴振動数はもとの振動数に戻る。

（ｂ）ｐＨへのポリマーの吸着の依存性は、また、ｐＨの電気化学的操作により 実証することができる。全表面におけるポテンシャルが、１：　１　：　１．（ ７）ＡＡ−ＭＭＡ−ＤＭＡＥＭＡの存在下に、段階的１．：１．２Ｖ（Ａｇ／Ａ ｇＣ１に対して）となったとき、ここで０２が発生し、電極表面におけるｐＨは Ｈ１イオンの形成のために低下する（反応式２）。

これは、等電ポリマーが界面において発生するので、このポリマーの高度に効率 よい付着を生じ、同時に振動数は減少した（第６ｂ図）。段階的にポテンシャル を−０，５ｖに戻すと、表面におけるｐＨはＯＨ−イオンの発生のために増加し 、そして振動数はそのもとの値付近に戻る（反応式３）。

２Ｈ２０Ｍ　０２　＋４Ｈ◆＋４ｒ　島−１，２３Ｖ対１’Ｊ！（ＩＥ；ｐ）ｉ −ｏ）　（反応式２）２Ｈ２０＋　２ａ−Ｍ　Ｈ２＋　２０Ｈ−α−−ｏ、ｏｏ 　ｖ対ＮＨＥ；ｐＨ−０）　Ｃ反応式３）実施例２　活性細胞の存在およびそれ らの成長のためのＱＣＭの振動数の応答 この実施例は、Ｅ、ｃｏｌｉの存在を検出するためのＱＣＭの使用を例示する。

酸性代謝物は両性ポリマーをその等型組成物に転化して、ＱＣＭの表面上にポリ マーを吸着させた。ポリマーのａｄｓは、栄養培地にＥ、ｃｏｌｉを導入したと き測定したときのＱＣＭの共鳴振動数を減少させた。

本発明は、パープルブロス（Ｂａｃｔｃ））、炭水化物、ビーフェキスおよび１ ：１：１のＡＡ、−ＭＭＡ−ＤＭＡＥＭＡターポリマーを含有する栄養培地中の Ｅ、ｃｏｌｉの成長により実証された。また、ｐＨ指示体の色素をＱＣＭにより 観測される挙動を強固する助剤として添加した。

この方法は次の通りである。領　７５ｍ１の１％のマンニトール、０゜１％のビ ーフェキス（Ｂａｃｔｏ）、０．５％のＮａＣｌ、１．０％のペブト７（ＮＯ， ３、Ｐｒｏｔｅｏｓｅ）、および０．１％の１：１：１のＡＡ−ＭＭＡ−ＤＭＡ ＥＭＡターポリマーを含有するガラスセルを小さい体積のＥ、ｃｏｌｉ懸濁液と ともにインキュベーションして、その濃度を１０８細胞／ｍｌとした。この溶液 をｐＨ＝７．５に調節して、ポリマーの可溶化および成長培地のコンシスチンシ ーを保証した。振動数をモニターする間、５．４ｘｌＯ１ＯＥ、ｃｏｌｉ細胞／ 　ｃ　ｍを含有する試料の７５ｍ１を添加して、細胞の実際の開始濃度を５．４ Ｘ１０”細胞／ｍｌとした。次いで、油層をこの溶液の上部に添加して、培地か ら空気を排除した。各場合において、ＱＣＭチャンバーを実験の過程を通じて３ ７±１℃に維持した。

これらの条件下に、バクテリアは栄養を代謝すると同時に有機酸および二酸化炭 素が解放される。代謝活性はｐＨを減少させ、そしてプロトンをポリマーに供給 する。ポリマーの等電点に達成したとき、質量の生ずる増加は共鳴振動数の対応 する増加を与え、これは電気的に容易に測定される（第７図）。シフトは有意で あり、初期条件に依存して、２時間以内で１５００〜数千Ｈｚの範囲である。

実施例３　成長調節因子に対する細胞成長の応答の決定この実施例は、目的をも って抗体を添加することによって、Ｅ、ｃ。

１１の代謝を抑制できることを例示する。

１％のマンニトール、０．１％のビーフェキス（Ｂａｃ　ｔｏ）　、０゜５％の ＮａＣｌ、１．０％のペプトン（Ｎｏ、３、Ｐｒｏｔｅｏｓｅ）、および０．１ ％の１：１：１のＡＡ−ＭＭＡ−ＤＭＡＥＭＡターポリマーからなる０、７５ｍ １の滅菌の水溶液の中に、金で被覆した水晶振動子を浸漬した。この溶液をｐＨ ＝７．５に調節して、ポリマーの可溶化および成長培地のコンシスチンシーを保 証した。振動数をモニターする間、５．４Ｘ１０”Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉ細胞／　ｃ 　ｍを含有する試料の７５ｍ１を添加して、細胞の実際の開始濃度を５．４Ｘ１ ０°細胞／ｍｌとした。

次いで、１５μｌのカナマイシン溶液（２５μｇ／ｍｌ）を添加して、０．５μ ｇ／ｍｌのカナマイシンの実際の濃度を生成した。次いで、この培地を油フィル ムでカバーして空気を排除した。実験は、また、５゜４、Ｘ１０”細胞／ｍｌの 細胞濃度において実施した。各場合において、ＱＣＭチャンバーを実験の過程を 通じて３７±１℃に維持した。

表Ｂに要約するように、ＱＣＭの振動数は細胞の成長を促進すう条件下に、すな わち、抗体の存在下に、顕著に減少した。対照的に、共鳴振動数はカナマイシン の存在下に減少せず、細胞の成長の欠如を示した。

この結果は、また、第７図に示されている。

表　Ｂ　カナマイシン存在下のＥ、ｃｏｌｉに対するＱＣＭの応答５．４ｘ１０ ９　な　し　−１５００ ５，４ｘ１０８　な　し　−６００ ５，４ｘ１０９　あ　リ　０ ５．４ｘ１０９　あ　リ　０ 実施例４Ｅ、ｃｏｌｉの異なる濃度による応答のバクテリアの成長の変調の存在 によるＱＣＭ振動数の応答この実施例は、ＱＣＭの抵抗性が接種物中のＥ、ｃｏ ｌｉの出発濃度に依存することを例示する。

１％のマンニト−ル、０．１％のビーフェキス（Ｂａｃ　ｔｏ）、０゜５％のＮ ａＣｌ、１．０％のペプトン（Ｎｏ、３、Ｐｒｏｔｅｏｓｅ）、および０．１％ の１　：　１．　：　１のＡＡ−ＭＭＡ−ＤＭＡＥＭＡターポリマーからなる２ ｍｌの滅菌の水溶液の中に、金で被覆した水晶振動子を浸漬した。この溶液をｐ Ｈ＝７．５に調節してポリマーの可溶化を保証した。振動数をモニターする間、 ５．４ｘｌＯ’Ｅ、ｃａｌｆ細胞／ｃｍを含有する試料の２０μｌを添加して、 培地中の細胞の開始濃度を５゜４Ｘ１０’細胞／ｍｌとした。次いで、この培地 を油フィルムでカバーして空気を排除した。実験を通じてチャンバーを３７℃に 維持した。油フィルムの添加後の過程の間、バクテリアの代謝から酸が解放され 、ポリマーを等電性および不溶性とし、そして共鳴振動数はＱＣＭ表面上のポリ マ・−の付着のために減少した。共鳴振動数の減少速度、ｄ△ｆ／Δｔ１は、Ｅ 、ｃｏｌｉの集団の増加および酸同等体の発生の同時の増加のために、経時的に より太き（なった（第２図）。応答はウェルに添加したＥ、ｃｏｌＮの量にに依 存し、濃度が小さいほど減少する。表Ｃは、２時間後のシフトの減少における相 対的速度を示す。第８図は、細胞成長の間に得られたデータのグラフ的比較を示 す。

表　Ｃ真なる濃度に対するＱＣＭの応答５．４ＸＩＣｆｉ　≧−２０００ ５，４ｘ　１０５　−９５０ ５．４　ｘ　１０’　−２２５ ５，４ｘ　１０３　−５０ 実施例５　異なる炭水化物の栄養に対するＥ、ｃｏｌｉの応答この実施例は、代 謝物の形成およびＥ、ｃｏｌｔの成長がインキュベーション培地の中に存在する 炭水化物の栄養の型に依存するという事実を例示する。ＱＣＭの応答を使用して 、有機体の栄養の要件を特性決定し、そして未知の同一性の細胞を栄養の応答の ［フィンガープリント」により同定できることを示唆する。

２ｍｌの１％の炭水化物、０．１％のビーフェキス（Ｂａｃｔｏ）、０．５％の ＮａＣＬ　１．０％のペプトン（Ｎｏ、３、Ｐｒｏｔｅｏｓｅ）、および領　１ ％のに１：１のＡＡ−ＭＭＡ−ＤＭＡＥＭＡターポリマーからなる２ｒｎｌの滅 菌の水溶液の中に、金で被覆した水晶振動子を浸漬した。この溶液をｐＨ＝７． ５に調節してポリマーの可溶化を保証した。振動数をモニターする間、７．４ｘ ｌＯ’Ｅ、ｃｏｌｊ細胞／　ｃ　ｍを含有する試料の２０μｌを添加して、培地 中の細胞の最終濃度を７．４Ｘ１０’細胞／ｍｌとした。次いで、この培地を油 フィルムでカバーして空気を排除した。対照として、炭水化物を添加しない同一 の培地中の細胞の成長について、ＱＣＭの応答をまた決定した。

陽性のＱＣＭの応答（振動数の減少）は、マンニトール、マンノースおよびアラ ビノースの存在下の細胞の成長について観測された。マンニトールは最も活性な 応答を与えた。ラクトースまたはイノシトールの存在下に、あるいは炭水化物の 栄養の不存在下に実施した実験について、無視できる振動数の変化が観測される か、あるいは振動数の変化は観測されなかつた（第９図および表Ｄ）。

炭水化物　振動数の変化 （△Ｆ）（Ｈｚ） １％のマンニトール　−６５０ １％のマンノース　−１８０ １％のアラビノース　−１４０ １％のイノシトール　（ １％ラクトース　Ｏ 炭水化物なし　−２０ ＊　出発Ｅ、ｃｏｌｉ濃度＝７．４Ｘｌ′細胞／ｍ！実施例６　細胞の倍加速度 の間接的決定この実施例は、細胞濃度を倍加するために要求される時間により、 本発明が細胞の成長速度を決定することができる時点を例示する。

活性な細胞成長の存在下に、共鳴振動数の変化速度、ｄ△ｆ／△ｔ１は経時的に 細胞濃度の増加のために増加する。成長の応答は、下の方程式を使用して、モデ ル化することができる。幾何学的因子２′７′は細胞の増加を説明し、ここでｔ は経過時間であり、そしてνは細胞のコロニーがその濃度を倍にするために要求 される時間である。これらの方程式を使用して、ｄ△ｆ／△ｔの予測された挙動 は、Ｅ、ｃｏｌｉの倍加および代謝速度定数にの報告された値を使用して、異な る細胞濃度について第１０図に例示する［Ｇｅｒｈａｒｄ　Ｇｏｔｔｓｃｈａｌ ｋ、ｒバクテリアの代謝（Ｂａｃｔｅｒｔａｌ　Ｍｅｔｂｏｌｉｓｍ）Ｊ、ｐｐ 。

２３６−２４．３、Ｖｅｒｌａｇ−８ｐｒｆｎｇｅｒ、ニューヨーク：およびＦ ｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｃ，Ｎｅ１ｄｈａｒｄｔ、編、「大腸菌およびサルメネラ・ チフィヌリウム（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１１ａｎｄ　Ｓａｌｍｏｎｅｌ ｌａ　Ｔｙｐｈｉｍｕｒｔｕｍ）Ｊ、Ｖｏｌ。

２、ｐｐ、１５７８−１５８２および１５３７−１５４０　（１９８７）、Ａｍ ｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１ワシント ンＤ、　Ｃ，］。［Ｈ＋］の実際の予測される変化を、下に「Ｃ」で示す増加因 子により△ｆ値に変換する。この方法を実施例４の実際のデータと比較すること によって、すぐれた一致が実現する。５゜４Ｘ１０’細胞／ｍｌの細胞濃度から のデータを使用して、コロニーの倍加についての時間間隔をＩｏｇｄ△ｆ／△を 対ｔのプロットから決定することができ、これは（１ｏｇ２）／νの傾斜を与え る（第１１図）。

第１１図の傾斜から決定されたνの値は１９００秒であり、報告された値の１８ ００秒とほぼ同一である。有意に、細胞成長が起こらないとき、ｄ△ｆ／△１＝ ０゜したがって、ＱＣＭからのデータを使用して、代謝物のみが産生された場合 および代謝物の産生が細胞の成長を伴う場合を弁別することができる。

前述の詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すが、 例示を目的とするだけである。当業者は、ここに記載した発明の教示により、多 数の変化および変更を実施することができる。このような変更は次の請求の範囲 により包含されることを意図する。

ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、５ く く 〈 ■ く く ｔＩ！ｌ中の茹■ 平成４年１月２７０国

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、代謝物応答性ポリマーおよび成長調節因子を含有する培地に圧電発振器を接 触させることによって、圧電発振器の共鳴振動数を測定し、代謝物を産生するこ とができる有機体を前記培地の中に導入し、前記培地をインキュベーションして 、前記有機体が代謝物を産生することができるようにし、 前記代謝物を代謝物応答性ポリマーと反応させてポリマー一代謝物複合体を生成 し、 圧電発振器上へのポリマー一代謝物複合の付着により引き起こされる圧電発振器 の共鳴振動数の変化について前記培地をモニターし、こうして圧電発振器の共鳴 振動数の変化を使用して有機体の濃度、代謝速度または細胞の成長速度を決定す る、 ことからなる、圧電発振器により有機体を検出する方法。 ２、代謝物応答性ポリマーが水溶性のｐＨ感受性ポリマーである、上記第１項記 載の方法。 ３、代謝物応答性ポリマーが生理学的範囲の等電点をもつ水溶性の両性ポリマー である、上記第１項記載の方法。 ４、代謝物応答性ポリマーが、酸性モノマーから成る群より選択される第１単位 および塩基性モノマーから成る群より選択される第２単位からなる両性コポリマ ーである、上記第１項記載の方法。 ５、酸性モノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、およびリン酸基およびスルフ ィン酸基を含有するモノマーから成る群より選択される、上記第４項記載の方法 。 ６、塩基性モノマーが、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチ ルアミノエチルメタクリレート、ｔ−ブチルアミノエチルメタクリレート、モル ホリノエチルメタクリレート、ピペリジノエチルメタクリレートから成る群より 選択される、上記第４項記載の方法。 ７、代謝物応答性ポリマーが、酸性モノマーから成る群より選択される第１単位 、塩基性モノマーから成る群より選択される第２単位、および中性モノマーから 成る群より選択される第３群からなる両性ターポリマーである、上記第１項記載 の方法。 ８、酸性モノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、およびリン酸基およびスルフ ィン酸基を含有するモノマーから成る群より選択される、上記第７項記載の方法 。 ９、塩基性モノマーが、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチ ルアミノエチルメタクリレート、ｔ−ブチルアミノエチルメタクリレート、モル ホリノエチルメタクリレート、ピペリジノエチルメタクリレートから成る群より 選択される、上記第７項記載の方法。 １０、中性モノマーが、アルキルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレ ート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ビニルピロリドン、酢酸ビニル（加 水分解するとビニルアルコール）、アクリルアミド、ビニルエーテル、およびス チレンから成る群より選択される、上記第７項記載の方法。 １１、両性代謝物応答性ポリマーが、アクリル酸、メチルメタクリレート、およ びＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートの１：１：１のモル比からなる 、上記第３項記載の方法。 １２、代謝物応答性ポリマーが、抗体、抗原、ポリ核酸、レクチン、組織レセプ ター、キレート剤、配位子結合タンパク質、および細胞付着因子から成る群より 選択されるレセプターを組み込んでいる、上記第１項記載の方法。 １３、有機体が、バクテリア、菌類、および組織細胞から成る微生物の群より選 択される、上記第１項記載の方法。 １４、有機体に対して特異的な成長調節因子が、抗体、アミノ酸、炭水化物、ビ タミン、塩、および脂質から成る群より選択される、上記第１項記載の方法。 １５、有機体に対して特異的な成長調節因子が、マンニトール、マンノース、ア ラビノース、イノシトール、およびラクトースから成る群より選択される炭水化 物である、上記第１４項記載の方法。 １６、代謝物および代謝物応答性ポリマーの複合体がその上に付着する圧電発振 器、 圧電発振器に接続し、圧電発振器を活性化する電源、および圧電発振器に接続し 、圧電発振器上への代謝物および代謝物応答性ポリマーの複合体の付着により引 き起こされる圧電発振器の共鳴振動数の変化を測定する手段、 からなる、有機体を検出する装置。 １７、試料、有機体、代謝物応答性ポリマー、栄養、成長調節因子、および試薬 をシステムに自動的に供給する試薬供給システム、代謝物および代謝物応答性ポ リマーの複合体がその上に付着する圧電発振器、 圧電発振器に接続し、圧電発振器を活性化する電源、圧電発振器に接続し、圧電 発振器上への代謝物および代謝物応答性ポリマーの複合体の付着により引き起こ される圧電発振器の共鳴振動数の変化を測定する手段、および 試薬供給システムをコントロールし、そして圧電発振器の共鳴振動数の変化を集 め、記録し、そして分析するコンピューター、からなる、有機体を検出するシス テム。 １８、試薬供給システムが、圧電発振器に近接した関係で位置する膜または多孔 質のマトリックスからなり、前記マトリックスは、水性培地をシステムに添加し たとき、正確な測定した量の試料、有機体、代謝物応答性ポリマー、栄養、成長 調節因子、および試薬を圧電発振器と接触させることができる、上記第１７項記 載のシステム。