JPH0442050A - 薄層アガロースゲル電気泳動部材及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により
分離するための薄層アガロースゲル電気泳動部材、薄層
アガロースゲル電気泳動装置及びこの装置を用いたＤＮ
Ａ断片の分離方法に関する。

〔従来技術・発明が解決しようとする課題〕ゲル電気泳
動は、ＤＮＡ断片を分離、分析する手法として比較的簡
便で、かつ広い分子量の範囲で、その差に依存する高分
解能の結果が得られる特徴をもつため、頻繁に利用され
ている。

ゲル電気泳動に使用されるゲル素材としては、アガロー
ス及びポリアクリルアミドが挙げられるが、その中でも
アガロースゲルはポリアクリルアミドゲルと比較して調
製が容易であり、かつ毒性がないことから、特に頻繁に
利用されている。

アガロースゲルは、一般に水平型のスラブ式サブマリン
型電気泳動装置に付され、泳動中にゲルの表面が乾燥し
ないように、ゲルの表面が隠れる程度に泳動用緩衝液中
に浸漬されて、泳動が行われている（第３図参照）。

鮮明なりＮＡバンドを得るためには、アガロースゲルの
厚さを可能な限り薄（することが望まれるが、従来のア
ガロースゲル電気泳動部材では、アガロースゲルの厚さ
を３ｍ以下とすれば、泳動中にＤＮＡサンプルが泳動用
緩衝液中に浸出して、一部分画ができなくなる恐れがあ
る。

従って、アガロースゲル電気泳動は、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動と比較して、ＤＮＡバンドが不鮮明とな
る欠点を有していた。

また、電気泳動終了後のアガロースゲルを、ポリアクリ
ルアミドゲルに接続して、再び電気泳動を行うには、ア
ガロースゲルの厚さをポリアクリルアミドゲルの厚さ以
下にしなければならないが、ポリアクリルアミドゲルの
厚さは通常０．３〜２ａ程度であり、アガロースゲルを
ポリアクリルアミドゲルに接続することはできなかった
。

而して、本発明の目的は、鮮明なりＮＡバンドが得られ
、ポリアクリルアミドゲルに接続することが可能な程度
の厚さのアガロースゲル電気泳動部材、この電気泳動部
材を有する電気泳動装置及びこの電気泳動装置を用いた
ＤＮＡ断片の分離方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは上記実情に鑑み、各種検討を重ねた結果、
二枚の平板が、該平板の長手方向に列設されたスペーサ
ーを介して、積層され、該二枚の平板の間隙にアガロー
スゲルが充填されてなる薄層アガロースゲル電気泳動部
材、この電気泳動部材を有する電気泳動装置及びこの電
気泳動装置を用いたＤＮＡ断片の分離方法が、上記課題
を解決することを見出した。

本発明において使用される平板としては、特に限定され
ないが、泳動終了の確認が容品に行えるように、透明の
ものが望ましく、ガラス、プラスチック（アクリル樹脂
）等の通常、電気泳動に際して使用される平板でよい、
平板の大きさについても特に限定されず、実験目的に合
わせて適宜選択されるが、通常長手方向の長さ５０〜１
．０００　ｍ、幅方向の長さ３０〜２００　ｍ、厚さ０
．２〜５日程度である。

二枚の平板の長手方向の長さは異なっていてもよく、一
方の平板の長さを、他の一方の平板よりも３０〜６０閣
程度短（（または長く）することが望ましい。その理由
は、コーム（サンプル櫛）を突設させた別の平板を、ス
ペーサーを介して、より長い平板の延出した部分に積層
させた後、アガロース溶液をその間隙に充填・固化させ
て、アガロースゲルにウェルを形成させることが可能と
なるからである。尚、二枚の平板の長手方向の長さが同
一であっても、二枚の平板を互いにずらして積層させ、
どちらか一方の平板の延出した部分に、前記のコームを
有する平板を積層させて、前記と同様にアガロースゲル
にウェルを形成させることが可能である。平板上に突設
されたコームの高さは、アガロースゲルの厚さにより適
宜決定され、ゲルの厚さよりも０．１〜０．３閣程度短
くすることが望ましく、例えばゲルの厚さが１閣の場合
のコームの高さ（即ち、ゲルに形成されるウェルの深さ
）は０．７〜０．８　ｔｇｎ、ゲルの厚さが０．４　ｔ
ｍの場合のコームの高さは０．３ｍとすることが好まし
い。尚、複数の試料を同時に泳動できるように、平板上
に複数のコームを突設させてもよい。

スペーサーは、一般的にポリアクリルアミドゲル電気泳
動装置において使用されるスペーサーが用いられるが、
その厚さは、目的とするアガロースゲルの厚さに応じて
適宜決定され、３ａ以下、特に１〜０．２閣の厚さのも
のが使用されうる。このスペーサーを前記平板の長手方
向に列設させる。

本発明において、「平板の長手方向」とは、単に平板の
長辺のみを意味するのではなく、泳動の際の泳動方向を
意味する。スペーサーは、二枚の平板が一定間隔の間隙
を形成するために、少なくとも二本必要であり、平板の
略中央部に配設してもよいが、通常は平板の長手方向両
端縁にそれぞれ周設される。

二枚の前記平板は、前記スペーサーを介して積層され、
二枚の平板の間隙、即ち二枚の平板と二本のスペーサー
により形成された間隙に、アガロースゲルが充填される
。

本発明において使用されるアガロースは、一般的に電気
泳動用試薬として使用されているものが好適に使用され
る。アガロースゲルは、泳動用緩衝液を用いて溶解され
たアガロース溶液を固化させることにより調製される。

アガロース濃度は、分画するＤＮＡ断片の分子量により
適宜決定されるが、０．３〜２．０％、一般的には０．
７〜１％のゲル濃度が採用される。泳動用緩衝液として
は、トリス−ホウ酸緩衝液、トリス−酢酸緩衝液、トリ
ス−リン酸緩衝液等の通常の電気泳動用緩衝液、または
本発明者らが創出したトリス−酢酸−マグネシウム緩衝
液（以下ｒＴＡＭ緩衝液」という）（５０ｍＭ　　）リ
ス−酢酸（ｐＨ７，５）、０．７　ｍ　Ｍ酢酸マグネシ
ウム〕、トリス−酢酸−ホウ酸−マグネシウム緩衝液（
５０ｍＭ）リス−ホウ酸（ｐＨ８，３）、０．７ｍＭ　
　酢酸マグネシウム〕等が例示される。泳動後に紫外線
を照射してバンドを観察する場合、予め、臭化エチジウ
ムを終濃度０．５μｇ／ｄとなるように、アガロース溶
液に添加して混合してもよい。

アガロースゲルを二枚の平板の間隙に充填するには、ス
ペーサーの長手方向の一端部（底部とする）に、シリコ
ンチューブ等を当接させて二枚の平板により挟持させ、
アガロース溶液を平板の長手方向の他の一端部（頭部）
より注入すればよいが、アガロースゲルの幅（スペーサ
ー同士の間隙）が狭い場合（約８鵬程度）、アガロース
溶液を充填した注射器の注射針を、底部のシリコンチュ
ーブに貫通させ、平板の間隙に注入することが好ましい
。

上記の如くして調製された薄層アガロースゲル電気泳動
部材に、泳動用緩衝液槽及び架橋体を具備させることに
より、本発明の電気泳動装置が形成される。

泳動用緩衝液槽は、形状、大きさ、素材等について何ら
限定されず、定電圧電源装置の極板等の配設が可能なも
のであり、且つ泳動用緩衝液を変性させないものであれ
ば、何れも好適に用いられる。架橋体は、ゲル電気泳動
部材に泳動用緩衝液槽中の泳動用緩衝液を供給する媒体
であり、架橋体としては、前述のアガロースゲル、濾紙
、スポンジ等が例示される。架橋体として濾紙を用いる
場合、ベリスタルテイツクポンプを用いて、濾紙がゲル
に接続する付近を常に湿潤させておくことが好ましい。

試料としては全ての生物由来のＤＮＡ断片を対象とする
ことができる。試料の調製法は常法の手段が採用され、
対象とする試料により適宜選択して、ＤＮＡ断片を単離
、精製すればよい、試料には、酵素反応を停止させるた
めにＥＤＴＡ　（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
）（約２０ｍＭ）及びＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウ
ム＞　　（０，０５％）を添加し、さらに泳動の状況を
知るために泳動用マーカーとしてブロモフェノールブル
ーを０．０２％程度、シｇｔ１またはグリセロールを１
０％程度添加し混合してもよい、試料の量は、ゲルの厚
さやウェルの幅により適宜決定され、ゲルの厚さが０．
７ｍでウェルの幅が３ｍの場合は！、　５　ｕ　ｉ！、
ゲルの厚さが０．４　ｍでウェルの幅が３ＩＩ１１の場
合は１μ！程度とする。

本発明のＤＮＡ断片の分離方法は、本発明の電気泳動装
置を用いて、通常のゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片を
分画することにより行われる。

電圧、泳動時間は、使用するゲルの泳動距離、試料中の
ＤＮＡ９度により適宜調整すればよいが、通常１０〜１
５０Ｃ１１の泳動距離においては、１．０〜２０Ｖ／Ｃ
Ｉの電圧で５〜４８時間程度の泳動を行なう。

〔発明の効果〕

本発明の薄層アガロースゲル電気泳動部材、このゲル電
気泳動部材を具備する電気泳動装置及びこの装置を用い
たＤＮＡ断片の分離方法により、鮮明なりＮＡバンドが
得られ、さらに泳動後に他のゲル電気泳動部材、特にポ
リアクリルアミドゲルに接続して再び泳動を行うことが
可能となる。

以下に、本発明の実施例を図面に基づいて述べることに
より、本発明の効果をより一層明確なものとする。

〔実施例〕

アガロースゲル　′　　　　の 二枚のガラス平板〔ガラス平板Ａ（２）（５００Ｘ２０
０Ｘ５■〕、ガラス平板Ｂ（３）　（４７ｏ　ｘ２００
　ｘ５■）とする〕及びスペーサー〔スペーサーＡ（４
）（５００ｘｌＯｘ　１ｍ）二枚、スペーサーＢ（５）
（２００×１０×１■）−枚とする］のアガロースゲル
に接する面に、剥離剤としてのシリコーン（商品名：シ
グマコート、シグマ社製）を塗布した。ガラス平板Ａ（
２）上の幅方向両端部に、ゲルの幅が１８０　ｍとなる
ように、長手方向にスペーサーＡ（４）を列設させた。

また、両スペーサーＡ（４）の端部に接するようにスペ
ーサーＢ（５）を、ガラス平板Ａ（２）の幅方向に列設
し、ガラス平板Ｂ（３）を積層した。

さらに、ガラス平板Ｃ（６）　（１０ｘ３０ｘ　５　ｍ
）を、コーム（６１）　（Ｉ　Ｘ　３　ｘｏ、　７ｍ）
を突設させた面がアガロースゲルに接するように積層し
た。これらをクリップ（７）により固定した〔第１図（
ａ）参照〕。

ＴＡＭ緩衝液を用いて０．８％アガロース〔商品名：シ
ーケムＧＴＧ　（ＦＭＣバイオプロダクト社製）〕溶液
を調製し、電子レンジにより完全に溶解させ、５０℃程
度に冷却させた。

５０ｃｃのシリンジ（テルモ社製）を用いて、二枚のガ
ラス平板（ガラス平板Ａ及びガラス平板Ｂ）の間隙皿に
アガロース溶液を注入した。

室温にて冷却した後、クリップ（７）を外し、アガロー
スゲル（９）からガラス平板Ｃ（６）を剥離して、薄層
アガロースゲル電気泳動装置車を調製した〔第１図（ｂ
）参照〕。

試杢蔵号」製 キイロショウジョウバエ（ＤｒｏｓｏｐｈｉＬａ　Ｍｅ
Ｌａｎ。

ｇａｓｔｅｒ）の粉砕＠ＩＪＯ１５ｇにブロテイナーゼ
緩衝液〔５０Ｍｇ／ｄ　　ブロテイナーゼＫ、０．１〜
０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ、０．５％　ＳＤＳ、０．０５Ｍ
　　トリス−塩＃　　ｐＨａＯ）２ｍを添加して、６５
゛ｃで一晩保温した。さらに、１０■／Ｉ１１リボヌク
レアーゼＡＩＯμｉを添加して、３７℃で１時間以上保
温した。　３Ｂ、ＯＯＯｒｐｍ　、４８時間、１４°Ｃ
で超遠心分離した後、フェノール抽出を２回行い、エタ
ノール沈澱によりゲノｚ、　Ｄ　Ｎ　Ａを濃縮洗浄し、
５００μｇ／ｄになるようにＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　　
トリス−塩酸　ｐＨ１，５，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）に溶
解した。これに泳動用マーカーを添加、混合して、試料
とした。

−ル１ｉｉｉ　　による 薄層アガロースゲル電気泳動部材川、濾紙００）及び泳
動用緩衝液槽（Ｉｔ）を、第２図に示すように配設し、
ＴＡＭ緩衝液を泳動用緩衝液槽θ１）に注加した。

また、濾紙００）を支持するためのアクリル棒（φ１０
＋＋ｗ＋、長さ６０ＣＩＩ）、ペリスタルティックボン
ブ（ＩＷＡＫＩ社製）及び定電圧を源装置（ＡＴＴＯコ
ンスタパワー）（い、ずれも図示せず）を配設した。

ゲル電気泳動部材ｍのアガロースゲル（４７０×８１×
１ｍ）のウェル（９１）（１■×３閤×０．７ｍ）に、
試料０２１１μｇをマイクロピペットを用いて乗せた。

４．８Ｖ／ＣＩで１０分間泳動して、試料をゲル中に浸
透させた。第１図（Ｃ）に示すように、平板Ｃ（６）の
コームを突設させた面の反対の面がゲルに接触するよう
に積層した。

３、２６　Ｖ　／　ＣＩの電圧で１８時間泳動して、泳
動用マーカーのバンドがゲル下端付近に達したことを確
認し、泳動を停止した。

ゲル電気泳動部材組よりガラス平板Ｂ（３）及びガラス
平板Ｃ（６）を剥離し、染色液（臭化エチジウム終濃度
０．５μｇ／ｄＴＡＭ緩衝液）に４０分間浸漬して染色
した。

透過光型の紫外線照射装置上に、・ゲル電気泳動部材組
を積載して、鮮明なバンドを観察することができた。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）〜（Ｃ）は本発明の薄層アガロースゲル電
気泳動部材の調製工程を示す斜視図、第２図は本発明の
電気泳動装置の概略を示す断面図、第３図は従来のサブ
マリン型電気泳動装置の概略を示す断面図である。 ｍ・・・薄層アガロースゲル電気泳動部材（２）・・・
ガラス平板Ａ（３）・・・ガラス平板Ｂ（４）・・・ス
ペーサーＡ（５）・・・スペーサーＢ（６）・・・ガラ
ス平板Ｃ（３）・・・二枚の平板の間隙（９）・・・ア
ガロースゲル　０ＩＩｌ・・・濾紙（架橋体）０１ン・
・・泳動用緩衝液槽 特許出願人　　　　向　井　常　博 第３哩

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）二枚の平板が、該平板の長手方向に列設されたス
   ペーサーを介して、積層され、該二枚の平板の間隙にア
   ガロースゲルが充填されてなる薄層アガロースゲル電気
   泳動部材。
2. （２）請求項（１）記載の薄層アガロースゲル電気泳動
   部材、架橋体及び泳動用緩衝液槽から少なくとも構成さ
   れてなる電気泳動装置。
3. （３）請求項（２）記載の電気泳動装置を用いたＤＮＡ
   断片の分離方法。