JPH04335889A - カルバミルリン酸合成酵素ｉ遺伝子、その変異の検出方法およびそれに用いるｄｎａプローブ - Google Patents
カルバミルリン酸合成酵素ｉ遺伝子、その変異の検出方法およびそれに用いるｄｎａプローブInfo
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- JPH04335889A JPH04335889A JP3135902A JP13590291A JPH04335889A JP H04335889 A JPH04335889 A JP H04335889A JP 3135902 A JP3135902 A JP 3135902A JP 13590291 A JP13590291 A JP 13590291A JP H04335889 A JPH04335889 A JP H04335889A
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- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、カルバミルリン酸合成
酵素Ｉ遺伝子、その変異の検出方法およびそれに用いる
ＤＮＡプローブに関する。
酵素Ｉ遺伝子、その変異の検出方法およびそれに用いる
ＤＮＡプローブに関する。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】カルバミ
ルリン酸合成酵素Ｉ欠損症は尿素サイクルの初段酵素で
あるカルバミルリン酸合成酵素Ｉ（ＣＰＳＩ）の欠損に
より生ずる疾患である。本疾患は確定的ではないが、常
染色体性劣性遺伝型式をとることが知られている。
ルリン酸合成酵素Ｉ欠損症は尿素サイクルの初段酵素で
あるカルバミルリン酸合成酵素Ｉ（ＣＰＳＩ）の欠損に
より生ずる疾患である。本疾患は確定的ではないが、常
染色体性劣性遺伝型式をとることが知られている。
【０００３】ＣＰＳＩはヒトをはじめとする尿素排泄型
動物の肝ミトコンドリアに局在し、マトリックス蛋白質
の約２０％を占めている。また、ＣＰＳＩはヒト肝、ラ
ット肝などより精製されており、サブユニット分子量が
約１６万と大きく、単量体または単量体と２量体の平衡
状態で存在することが知られている ［Ｊ． Ｂｉｏｌ
． Ｃｈｅｍ．， ２５５， ７８９１ 〜７８９５，
（１９８０）； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
７， １１９〜１２７， （１９６８）； Ｅｕｒ．
Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ８５， ３７３〜３８３，
（１９７８）］。
動物の肝ミトコンドリアに局在し、マトリックス蛋白質
の約２０％を占めている。また、ＣＰＳＩはヒト肝、ラ
ット肝などより精製されており、サブユニット分子量が
約１６万と大きく、単量体または単量体と２量体の平衡
状態で存在することが知られている ［Ｊ． Ｂｉｏｌ
． Ｃｈｅｍ．， ２５５， ７８９１ 〜７８９５，
（１９８０）； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
７， １１９〜１２７， （１９６８）； Ｅｕｒ．
Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ８５， ３７３〜３８３，
（１９７８）］。
【０００４】ラットＣＰＳＩの全長ｃＤＮＡクローンが
Ｎｙｕｎｏｙａ らにより単離され、３８または３９ア
ミノ酸残基の延長ペプチドを含む１５００アミノ酸残基
におよぶラットＣＰＳＩ前駆体の全１次構造が決定され
ている［Ｊ． Ｂｉｏｌ． ｃｈｅｍ．， ２６０，
９３４６〜９３５６， （１９８５）］。さらに染色体
遺伝子の一部がクローン化され、その構造解析より、ラ
ットＣＰＳＩ遺伝子には偽遺伝子は存在せず、その大き
さは１００ｋｂ以上にもおよぶと推定されている。
Ｎｙｕｎｏｙａ らにより単離され、３８または３９ア
ミノ酸残基の延長ペプチドを含む１５００アミノ酸残基
におよぶラットＣＰＳＩ前駆体の全１次構造が決定され
ている［Ｊ． Ｂｉｏｌ． ｃｈｅｍ．， ２６０，
９３４６〜９３５６， （１９８５）］。さらに染色体
遺伝子の一部がクローン化され、その構造解析より、ラ
ットＣＰＳＩ遺伝子には偽遺伝子は存在せず、その大き
さは１００ｋｂ以上にもおよぶと推定されている。
【０００５】ヒトＣＰＳＩに関しては部分長ｃＤＮＡク
ローンが単離されており、ヒトとチャイニーズハムスタ
ーの雑種細胞クローンパネルおよび転座染色体の解析よ
り、ヒトＣＰＳＩ遺伝子は第２染色体短腕にマッピング
されていることが報告されている［Ｊ． Ｂｉｏｌ．
ｃｈｅｍ．， ２５９， １３４７１〜１３４７６，
（１９８４）］。即ち、ＡｄｃｏｃｋとＯ’Ｂｒｉｅｎ
はヒト肝ＣＰＳＩの部分ｃＤＮＡを初めて単離し（その
配列は示されていない）、彼らはこれらのｃＤＮＡの一
つをプローブとしてマッピングを行い、ヒトＣＰＳＩ遺
伝子が染色体２の短腕に位置することを見いだした。さ
らにｃＤＮＡをプローブとして７名のＣＰＳＩ欠損症患
者のＣＰＳＩ遺伝子のサザンブロット分析を行っている
が、遺伝子の欠失や転位は検出されていない。本症の病
因解析では、ＣＰＳＩ遺伝子の変異、転写の障害、ｍＲ
ＮＡのスプライシングを含む転写後修飾の障害または翻
訳の障害などが考えられているが、未だ明確なものとは
なっていない。
ローンが単離されており、ヒトとチャイニーズハムスタ
ーの雑種細胞クローンパネルおよび転座染色体の解析よ
り、ヒトＣＰＳＩ遺伝子は第２染色体短腕にマッピング
されていることが報告されている［Ｊ． Ｂｉｏｌ．
ｃｈｅｍ．， ２５９， １３４７１〜１３４７６，
（１９８４）］。即ち、ＡｄｃｏｃｋとＯ’Ｂｒｉｅｎ
はヒト肝ＣＰＳＩの部分ｃＤＮＡを初めて単離し（その
配列は示されていない）、彼らはこれらのｃＤＮＡの一
つをプローブとしてマッピングを行い、ヒトＣＰＳＩ遺
伝子が染色体２の短腕に位置することを見いだした。さ
らにｃＤＮＡをプローブとして７名のＣＰＳＩ欠損症患
者のＣＰＳＩ遺伝子のサザンブロット分析を行っている
が、遺伝子の欠失や転位は検出されていない。本症の病
因解析では、ＣＰＳＩ遺伝子の変異、転写の障害、ｍＲ
ＮＡのスプライシングを含む転写後修飾の障害または翻
訳の障害などが考えられているが、未だ明確なものとは
なっていない。
【０００６】本症の診断においては、一般に高アンモニ
ア血症がみられ、体液中にシトルリンなどの特異的アミ
ノ酸の上昇を認めず、尿中にオロット酸および各種有機
酸の異常排泄を見ない場合、本症を疑い診断確定のため
肝生検を行うことが必要であるのが実情である。また、
ＣＰＳＩの活性の発現にはアセチルグルタミン酸を必須
とし、ミトコンドリア内のアセチルグルタミン酸濃度の
変動によりＣＰＳＩ活性が制御されているので、アセチ
ルグルタミン酸合成酵素欠損症との鑑別は、現在のとこ
ろ、肝臓の酵素活性測定以外に方法がないのが実情であ
る。近年、多くの疾患で遺伝子を直接診断するＤＮＡ診
断が可能となってきているが、本症においても遺伝病の
一つであることから、ＤＮＡを用いた分子レベルでの分
析を行ない、ＣＰＳＩ変異遺伝子の検出によりＣＰＳＩ
を診断し、またキャリアーの発見、出生前診断を可能と
する方法の開発が望まれているが、未だ有用な方法は見
出されていない。
ア血症がみられ、体液中にシトルリンなどの特異的アミ
ノ酸の上昇を認めず、尿中にオロット酸および各種有機
酸の異常排泄を見ない場合、本症を疑い診断確定のため
肝生検を行うことが必要であるのが実情である。また、
ＣＰＳＩの活性の発現にはアセチルグルタミン酸を必須
とし、ミトコンドリア内のアセチルグルタミン酸濃度の
変動によりＣＰＳＩ活性が制御されているので、アセチ
ルグルタミン酸合成酵素欠損症との鑑別は、現在のとこ
ろ、肝臓の酵素活性測定以外に方法がないのが実情であ
る。近年、多くの疾患で遺伝子を直接診断するＤＮＡ診
断が可能となってきているが、本症においても遺伝病の
一つであることから、ＤＮＡを用いた分子レベルでの分
析を行ない、ＣＰＳＩ変異遺伝子の検出によりＣＰＳＩ
を診断し、またキャリアーの発見、出生前診断を可能と
する方法の開発が望まれているが、未だ有用な方法は見
出されていない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは前記課題を
解決するために、鋭意検討した結果、ヒト肝ＣＰＳＩを
コードするｃＤＮＡを調製してプローブとして用いるこ
とによりＣＰＳＩ変異遺伝子を検出する方法を見出し、
本発明に至った。
解決するために、鋭意検討した結果、ヒト肝ＣＰＳＩを
コードするｃＤＮＡを調製してプローブとして用いるこ
とによりＣＰＳＩ変異遺伝子を検出する方法を見出し、
本発明に至った。
【０００８】即ち、本発明の要旨は、（１）カルバミル
リン酸合成酵素Ｉ遺伝子、すなわち配列番号：１に記載
のＤＮＡの全部またはその一部からなるＤＮＡ、または
該ＤＮＡとハイブリダイズし得るＤＮＡ、（２）カルバ
ミルリン酸合成酵素Ｉ遺伝子の検出において、配列番号
：１に記載のＤＮＡの全部またはその一部からなるＤＮ
Ａ、または該ＤＮＡとハイブリダイズし得るＤＮＡをプ
ローブとして用いることを特徴とするカルバミルリン酸
合成酵素Ｉ変異遺伝子の検出方法、および（３）前記の
検出方法に用いるプローブに関する。
リン酸合成酵素Ｉ遺伝子、すなわち配列番号：１に記載
のＤＮＡの全部またはその一部からなるＤＮＡ、または
該ＤＮＡとハイブリダイズし得るＤＮＡ、（２）カルバ
ミルリン酸合成酵素Ｉ遺伝子の検出において、配列番号
：１に記載のＤＮＡの全部またはその一部からなるＤＮ
Ａ、または該ＤＮＡとハイブリダイズし得るＤＮＡをプ
ローブとして用いることを特徴とするカルバミルリン酸
合成酵素Ｉ変異遺伝子の検出方法、および（３）前記の
検出方法に用いるプローブに関する。
【０００９】本発明のＤＮＡプローブは、配列番号：１
に記載のＤＮＡの全部またはその一部からなるＤＮＡ、
または該ＤＮＡとハイブリダイズし得るＤＮＡである。 配列番号：１に記載のＤＮＡは、ヒト肝ＣＰＳＩをコー
ドするｃＤＮＡであり、ヒト肝ＣＰＳＩ遺伝子のクロー
ニングにより得られるｃＤＮＡ断片を常法によりつない
で全長ｃＤＮＡインサートを調製することができる。例
えば、後述の実施例で得られたｈＣＰＳＩ−１１、ｈＣ
ＰＳＩ−４、ｈＣＰＳＩ−２１、ｈＣＰＳＩ−０１１は
配列番号：１に記載のＤＮＡをオーバーラップするクロ
ーンであるので、これらを適宜制限酵素で切断し全長ｃ
ＤＮＡとなるようつないでいくことにより、容易に全長
ｃＤＮＡインサートを調製することができる。
に記載のＤＮＡの全部またはその一部からなるＤＮＡ、
または該ＤＮＡとハイブリダイズし得るＤＮＡである。 配列番号：１に記載のＤＮＡは、ヒト肝ＣＰＳＩをコー
ドするｃＤＮＡであり、ヒト肝ＣＰＳＩ遺伝子のクロー
ニングにより得られるｃＤＮＡ断片を常法によりつない
で全長ｃＤＮＡインサートを調製することができる。例
えば、後述の実施例で得られたｈＣＰＳＩ−１１、ｈＣ
ＰＳＩ−４、ｈＣＰＳＩ−２１、ｈＣＰＳＩ−０１１は
配列番号：１に記載のＤＮＡをオーバーラップするクロ
ーンであるので、これらを適宜制限酵素で切断し全長ｃ
ＤＮＡとなるようつないでいくことにより、容易に全長
ｃＤＮＡインサートを調製することができる。
【００１０】配列番号：１に記載のＤＮＡの一部からな
るＤＮＡとは、ヒト肝ＣＰＳＩ遺伝子の一部を構成する
ものであれば特に制限されるものではなく、単独でまた
は種々のｃＤＮＡ断片の混合物として用いてもよい。本
発明では、例えばヒト全長ＣＰＳＩｃＤＮＡを２分割し
５’端側の半分である５’ハーフおよび／または３’端
側の半分である３’ハーフをプローブとして用いること
ができる。５’ハーフまたは３’ハーフの調製は、前記
の全長ｃＤＮＡインサートの調製の場合と同様にオーバ
ーラップする種々のクローンを適宜制限酵素で切断しｃ
ＤＮＡハーフとなるようつないでいくことにより単独の
ｃＤＮＡハーフとし、あるいは種々のｃＤＮＡ断片の混
合物としてｃＤＮＡハーフとなるような組み合わせを調
製することにより容易に得ることができる。例えば、５
’ハーフプローブとしてはヌクレオチド１−１１８４の
ｃＤＮＡ断片とヌクレオチド１１８５−２５５０の断片
の混合物を用いることができ、３’ハーフプローブとし
てはヌクレオチド２５５１−３６３６のｃＤＮＡ断片と
ヌクレオチド３６３７−５０９２の断片の混合物を用い
ることができる。
るＤＮＡとは、ヒト肝ＣＰＳＩ遺伝子の一部を構成する
ものであれば特に制限されるものではなく、単独でまた
は種々のｃＤＮＡ断片の混合物として用いてもよい。本
発明では、例えばヒト全長ＣＰＳＩｃＤＮＡを２分割し
５’端側の半分である５’ハーフおよび／または３’端
側の半分である３’ハーフをプローブとして用いること
ができる。５’ハーフまたは３’ハーフの調製は、前記
の全長ｃＤＮＡインサートの調製の場合と同様にオーバ
ーラップする種々のクローンを適宜制限酵素で切断しｃ
ＤＮＡハーフとなるようつないでいくことにより単独の
ｃＤＮＡハーフとし、あるいは種々のｃＤＮＡ断片の混
合物としてｃＤＮＡハーフとなるような組み合わせを調
製することにより容易に得ることができる。例えば、５
’ハーフプローブとしてはヌクレオチド１−１１８４の
ｃＤＮＡ断片とヌクレオチド１１８５−２５５０の断片
の混合物を用いることができ、３’ハーフプローブとし
てはヌクレオチド２５５１−３６３６のｃＤＮＡ断片と
ヌクレオチド３６３７−５０９２の断片の混合物を用い
ることができる。
【００１１】また、該ＤＮＡとハイブリダイズし得るＤ
ＮＡとは、配列番号：１に記載のＤＮＡの一部に塩基の
置換、欠失、挿入等の変異のあるものであっても、前記
のような全長のカルバミルリン酸合成酵素Ｉ遺伝子ある
いはその断片とハイブリダイズし得るものは、本発明の
方法において使用することができ得るので本発明の範囲
に入るものである。
ＮＡとは、配列番号：１に記載のＤＮＡの一部に塩基の
置換、欠失、挿入等の変異のあるものであっても、前記
のような全長のカルバミルリン酸合成酵素Ｉ遺伝子ある
いはその断片とハイブリダイズし得るものは、本発明の
方法において使用することができ得るので本発明の範囲
に入るものである。
【００１２】本発明における配列番号：１に記載のＤＮ
Ａクローンを得るには、公知の方法を用いて行うことが
できる。例えばプラークハイブリダイゼーション法によ
って、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて調製されたλ
ｇｔ１１中のヒト肝ｃＤＮＡライブラリーおよびランダ
ムプライマーを用いて調製されたλｇｔ１１中のライブ
ラリーを常法によりスクリーニングする。ここで、プラ
ークハイブリダイゼーションに用いるプローブは、ラッ
ト肝ＣＰＳＩｃＤＮＡの３’断片を放射標識して用い、
λｇｔ１１中のオリゴ（ｄＴ）プライムヒト肝ｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングして、陽性クローンを単
離することができる。また、同様にラットｃＤＮＡの５
’断片、中間断片および３’断片を放射標識してプロー
ブとして用い、λｇｔ１１中のランダムプライマーヒト
肝ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによ
り、陽性クローンを単離することができる。
Ａクローンを得るには、公知の方法を用いて行うことが
できる。例えばプラークハイブリダイゼーション法によ
って、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて調製されたλ
ｇｔ１１中のヒト肝ｃＤＮＡライブラリーおよびランダ
ムプライマーを用いて調製されたλｇｔ１１中のライブ
ラリーを常法によりスクリーニングする。ここで、プラ
ークハイブリダイゼーションに用いるプローブは、ラッ
ト肝ＣＰＳＩｃＤＮＡの３’断片を放射標識して用い、
λｇｔ１１中のオリゴ（ｄＴ）プライムヒト肝ｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングして、陽性クローンを単
離することができる。また、同様にラットｃＤＮＡの５
’断片、中間断片および３’断片を放射標識してプロー
ブとして用い、λｇｔ１１中のランダムプライマーヒト
肝ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによ
り、陽性クローンを単離することができる。
【００１３】このようにして得られる種々のｃＤＮＡ挿
入断片は、ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡのコード領域がラット
のＣＰＳＩｃＤＮＡと相同性が高いのでヒトＣＰＳＩｃ
ＤＮＡ配列全体を包含したものが得られる。また、得ら
れた各種のクローンのｃＤＮＡ挿入断片は、常法により
ｐＵＣ１８などにサブクローンして用いられる。本発明
のＣＰＳＩ変異遺伝子の検出方法は、前記のようなＤＮ
Ａをプローブとして用いることを特徴とする。具体的に
はＣＰＳＩ異常症の診断において、分子レベルでの分析
を行う際に使用される。検出方法としては、プローブを
必要とする分子レベルでの分析方法であれば特に制限さ
れるものではないが、通常サザンブロッティングによる
分析において利用される。
入断片は、ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡのコード領域がラット
のＣＰＳＩｃＤＮＡと相同性が高いのでヒトＣＰＳＩｃ
ＤＮＡ配列全体を包含したものが得られる。また、得ら
れた各種のクローンのｃＤＮＡ挿入断片は、常法により
ｐＵＣ１８などにサブクローンして用いられる。本発明
のＣＰＳＩ変異遺伝子の検出方法は、前記のようなＤＮ
Ａをプローブとして用いることを特徴とする。具体的に
はＣＰＳＩ異常症の診断において、分子レベルでの分析
を行う際に使用される。検出方法としては、プローブを
必要とする分子レベルでの分析方法であれば特に制限さ
れるものではないが、通常サザンブロッティングによる
分析において利用される。
【００１４】サザンブロッティングを行う場合、試料は
通常患者のゲノムＤＮＡを末梢血リンパ球から常法によ
り調製するか、生検により得られた肝組織からＤＮＡを
常法により調製して用いる。試料のＤＮＡを適当な制限
酵素例えばＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩで消化した後、
アガロースゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロ
ースフィルターに移し、３２Ｐで標識した前記のプロー
ブ例えば、ヒト肝ＣＰＳＩｃＤＮＡ５’ハーフおよび／
または３’ハーフを用い、常法に従ってハイブリダイゼ
ーションを行う。得られるバンドから、正常な試料のＤ
ＮＡの場合、ＥｃｏＲＩ消化によって少なくとも１９個
の断片が見られ、同様に、ＢａｍＨＩ消化では少なくと
も１０個の断片が見られる。ここで、対照となる正常な
試料とは異なるバンドを発見することによりＣＰＳＩ変
異遺伝子を検出することができる。
通常患者のゲノムＤＮＡを末梢血リンパ球から常法によ
り調製するか、生検により得られた肝組織からＤＮＡを
常法により調製して用いる。試料のＤＮＡを適当な制限
酵素例えばＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩで消化した後、
アガロースゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロ
ースフィルターに移し、３２Ｐで標識した前記のプロー
ブ例えば、ヒト肝ＣＰＳＩｃＤＮＡ５’ハーフおよび／
または３’ハーフを用い、常法に従ってハイブリダイゼ
ーションを行う。得られるバンドから、正常な試料のＤ
ＮＡの場合、ＥｃｏＲＩ消化によって少なくとも１９個
の断片が見られ、同様に、ＢａｍＨＩ消化では少なくと
も１０個の断片が見られる。ここで、対照となる正常な
試料とは異なるバンドを発見することによりＣＰＳＩ変
異遺伝子を検出することができる。
【００１５】ところでＣＰＳＩ欠損症は新生児期に発症
することが多く、高アンモニア血症は重とくでありしば
しば死の転機をとる。新生児期を乗り切れば、経過は他
の尿素サイクル異常症と大差はない。従って、生直後ま
たは胎児期に本症の診断がつくことは大切であり、予後
を左右するものと思われる。また、本症は１９８９年の
永田らの報告（日本先天代謝異常学会雑誌、５；１３０
１９８９）では我国で１９例が知られているが、その
後さらに症例数が増えている。両親に血縁関係のない症
例も多くあり、変異ＣＰＳＩ遺伝子のキャリアは希では
ない可能性もある。これらのことからみて、本症の早期
診断とキャリアの検索のためには遺伝子診断が有用であ
る。例えば、本発明のプローブを用いて、前記に示した
挿入または再配列の変異の検索以外にも、制限酵素切断
多型（ＲＦＬＰｓ）を利用した遺伝子診断が考えられる
。Ｆｅａｒｏｎらは部分長ｃＤＮＡを使用してＢｇｌＩ
のＲＦＬＰを報告（Ｆｅａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．； Ｈ
ｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７０；２０７−２１０ １９８５）
しているが、全長ｃＤＮＡを用いれば他の制限酵素で
もＲＦＬＰｓの見つかる可能性がある。
することが多く、高アンモニア血症は重とくでありしば
しば死の転機をとる。新生児期を乗り切れば、経過は他
の尿素サイクル異常症と大差はない。従って、生直後ま
たは胎児期に本症の診断がつくことは大切であり、予後
を左右するものと思われる。また、本症は１９８９年の
永田らの報告（日本先天代謝異常学会雑誌、５；１３０
１９８９）では我国で１９例が知られているが、その
後さらに症例数が増えている。両親に血縁関係のない症
例も多くあり、変異ＣＰＳＩ遺伝子のキャリアは希では
ない可能性もある。これらのことからみて、本症の早期
診断とキャリアの検索のためには遺伝子診断が有用であ
る。例えば、本発明のプローブを用いて、前記に示した
挿入または再配列の変異の検索以外にも、制限酵素切断
多型（ＲＦＬＰｓ）を利用した遺伝子診断が考えられる
。Ｆｅａｒｏｎらは部分長ｃＤＮＡを使用してＢｇｌＩ
のＲＦＬＰを報告（Ｆｅａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．； Ｈ
ｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７０；２０７−２１０ １９８５）
しているが、全長ｃＤＮＡを用いれば他の制限酵素で
もＲＦＬＰｓの見つかる可能性がある。
【００１６】
【実施例】以下、実施例により本発明についてさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら
限定されるものではない。 実施例１ ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡクローンの単離と塩基配列の決定
しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら
限定されるものではない。 実施例１ ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡクローンの単離と塩基配列の決定
【００１７】（１）ラットＣＰＳＩｃＤＮＡプローブの
作成 本実験ではラットＣＰＳＩｃＤＮＡのタンパク質コード
領域由来の３個の断片を以下のようにして増幅し、プロ
ーブとして用いた。即ち、ラット肝ｃＤＮＡ配列を有す
るλファージＤＮＡをランダムプライマーｃＤＮＡライ
ブラリーから調製した。得られた１〜２μｇのλファー
ジＤＮＡを用い、公知の方法に従いＰＣＲによる増幅を
行った。プライマーのセット（センス／アンチセンス）
としては、■５’断片（５９７ｂｐ、ラットｃＤＮＡの
ヌクレオチド４−６００）を得る場合は５’−ＡＣＧＡ
ＧＧＡＴＴＴＴＧＡＣＡＧＣＡＴＧＣＡＡＡ−３’／５
’−ＣＡＡＡＴＴＣＴＧＣＴＴＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＡ
Ｃ−３’、■中間断片（４０２ｂｐ、ヌクレオチド１８
４３−２２４４）を得る場合は５’−ＧＣＴＡＴＧＡＣ
ＣＡＡＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧ−３’／５’−ＴＧ
ＧＧＡＴＴＣＣＴＡＧＡＧＣＧＡＴＣＴＴＴＧＣ−３’
、■３’断片（７３１ｂｐ、ヌクレオチド３４５１−４
１８１）を得る場合は５’−ＴＴＣＣＴＴＧＡＧＧＡＧ
ＧＣＣＡＣＴＣＧＡＧＴＣ−３’／５’−ＧＴＧＧＣＴ
ＴＣＴＧＴＧＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴＧ−３’を用いた
。また、ランダムプライマー標識化キット（宝酒造社製
）を用いてλｇｔ１１中のランダムプライマーライブラ
リーのＰＣＲ増幅断片を［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識
し、公知の方法に従い、プレハイブリダイゼーション、
ハイブリダイゼーション、および洗浄を行った。
作成 本実験ではラットＣＰＳＩｃＤＮＡのタンパク質コード
領域由来の３個の断片を以下のようにして増幅し、プロ
ーブとして用いた。即ち、ラット肝ｃＤＮＡ配列を有す
るλファージＤＮＡをランダムプライマーｃＤＮＡライ
ブラリーから調製した。得られた１〜２μｇのλファー
ジＤＮＡを用い、公知の方法に従いＰＣＲによる増幅を
行った。プライマーのセット（センス／アンチセンス）
としては、■５’断片（５９７ｂｐ、ラットｃＤＮＡの
ヌクレオチド４−６００）を得る場合は５’−ＡＣＧＡ
ＧＧＡＴＴＴＴＧＡＣＡＧＣＡＴＧＣＡＡＡ−３’／５
’−ＣＡＡＡＴＴＣＴＧＣＴＴＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＡ
Ｃ−３’、■中間断片（４０２ｂｐ、ヌクレオチド１８
４３−２２４４）を得る場合は５’−ＧＣＴＡＴＧＡＣ
ＣＡＡＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧ−３’／５’−ＴＧ
ＧＧＡＴＴＣＣＴＡＧＡＧＣＧＡＴＣＴＴＴＧＣ−３’
、■３’断片（７３１ｂｐ、ヌクレオチド３４５１−４
１８１）を得る場合は５’−ＴＴＣＣＴＴＧＡＧＧＡＧ
ＧＣＣＡＣＴＣＧＡＧＴＣ−３’／５’−ＧＴＧＧＣＴ
ＴＣＴＧＴＧＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴＧ−３’を用いた
。また、ランダムプライマー標識化キット（宝酒造社製
）を用いてλｇｔ１１中のランダムプライマーライブラ
リーのＰＣＲ増幅断片を［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識
し、公知の方法に従い、プレハイブリダイゼーション、
ハイブリダイゼーション、および洗浄を行った。
【００１８】（２）ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡクローンの単
離 プラークハイブリダイゼーションによって、λｇｔ１１
中のオリゴ（ｄＴ）プライムヒト肝ｃＤＮＡライブラリ
ーおよびλｇｔ１１中のランダムプライマーライブラリ
ーを常法によりスクリーニングした。これらのｃＤＮＡ
ライブラリーは、それぞれＧ．Ｃ．Ｒｉｃｃａ氏（Ｍｅ
ｌｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バージニア州
スプリングフィールド）、Ｙ．Ｅｂｉｎａ氏（徳島大学
）およびＪ．Ｏｕ氏（サンフランシスコ大学、カリフォ
ルニア州）より提供を受けたものである。
離 プラークハイブリダイゼーションによって、λｇｔ１１
中のオリゴ（ｄＴ）プライムヒト肝ｃＤＮＡライブラリ
ーおよびλｇｔ１１中のランダムプライマーライブラリ
ーを常法によりスクリーニングした。これらのｃＤＮＡ
ライブラリーは、それぞれＧ．Ｃ．Ｒｉｃｃａ氏（Ｍｅ
ｌｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バージニア州
スプリングフィールド）、Ｙ．Ｅｂｉｎａ氏（徳島大学
）およびＪ．Ｏｕ氏（サンフランシスコ大学、カリフォ
ルニア州）より提供を受けたものである。
【００１９】プローブは前記で得られたラット肝ＣＰＳ
ＩｃＤＮＡの３’断片を用い、λｇｔ１１中のオリゴ（
ｄＴ）プライムヒト肝ｃＤＮＡライブラリーからクロー
ン約３ｘ１０５ 個をスクリーニングした。その結果、
１個の陽性クローンを単離し、このファージクローンの
ｃＤＮＡ挿入断片をｈＣＰＳＩ０１１と名付けた（図１
参照）。プローブとして同様に前記で得られたラットｃ
ＤＮＡの５’断片、中間断片および３’断片を用い、λ
ｇｔ１１中のランダムプライマーヒト肝ｃＤＮＡライブ
ラリーからクローン約６ｘ１０５ 個をスクリーニング
した。
ＩｃＤＮＡの３’断片を用い、λｇｔ１１中のオリゴ（
ｄＴ）プライムヒト肝ｃＤＮＡライブラリーからクロー
ン約３ｘ１０５ 個をスクリーニングした。その結果、
１個の陽性クローンを単離し、このファージクローンの
ｃＤＮＡ挿入断片をｈＣＰＳＩ０１１と名付けた（図１
参照）。プローブとして同様に前記で得られたラットｃ
ＤＮＡの５’断片、中間断片および３’断片を用い、λ
ｇｔ１１中のランダムプライマーヒト肝ｃＤＮＡライブ
ラリーからクローン約６ｘ１０５ 個をスクリーニング
した。
【００２０】ラット肝ＣＰＳＩｃＤＮＡは約５．６ｋｂ
の長さを有し、ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡは同様の長さを有
すると推定された。そこで、ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡ配列
全体を包含するｃＤＮＡを得るために前記３個のラット
ｃＤＮＡ断片をプローブとして用いてスクリーニングを
し、合計６個の陽性クローンを単離した。得られたｃＤ
ＮＡ挿入断片（ｈＣＰＳＩ２、３、４、１１、１３、お
よび２０）を図１に示す。１個のクローン（ｈＣＰＳＩ
４）は５’プローブと中間プローブの両方に対して陽性
であった。もう一つのクローン（ｈＣＰＳＩ２）は中間
プローブと３’プローブの両方に対して陽性であった。 ｈＣＰＳＩ４クローンの挿入断片ｃＤＮＡは長さが２．
２ｋｂであり、ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡの５’部分から中
間部分までを占めていた。一方、ｈＣＰＳＩ２クローン
の挿入断片ｃＤＮＡは長さが２．４ｋｂで、中間部分か
ら３’部分までを占めていた。次いで、これら７個のク
ローンのｃＤＮＡ挿入断片をｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部
位にサブクローンし、更に詳しい検討を行った。
の長さを有し、ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡは同様の長さを有
すると推定された。そこで、ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡ配列
全体を包含するｃＤＮＡを得るために前記３個のラット
ｃＤＮＡ断片をプローブとして用いてスクリーニングを
し、合計６個の陽性クローンを単離した。得られたｃＤ
ＮＡ挿入断片（ｈＣＰＳＩ２、３、４、１１、１３、お
よび２０）を図１に示す。１個のクローン（ｈＣＰＳＩ
４）は５’プローブと中間プローブの両方に対して陽性
であった。もう一つのクローン（ｈＣＰＳＩ２）は中間
プローブと３’プローブの両方に対して陽性であった。 ｈＣＰＳＩ４クローンの挿入断片ｃＤＮＡは長さが２．
２ｋｂであり、ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡの５’部分から中
間部分までを占めていた。一方、ｈＣＰＳＩ２クローン
の挿入断片ｃＤＮＡは長さが２．４ｋｂで、中間部分か
ら３’部分までを占めていた。次いで、これら７個のク
ローンのｃＤＮＡ挿入断片をｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部
位にサブクローンし、更に詳しい検討を行った。
【００２１】（３）塩基配列の決定
ｐＵＣ１８サブクローンは、アルカリ変性プラスミドを
鋳型とし合成オリゴヌクレオチドをプライマーとするジ
デオキシ鎖終止法によって、直接ヌクレオチド配列の決
定を行った。オリゴヌクレオチドプライマーはＤＮＡシ
ンセサイザー３８１Ａ型（アプライド・バイオシステム
ズ社製）を用いて合成した。７個のクローンから得たｃ
ＤＮＡ挿入断片の制限酵素地図と挿入断片の配列決定の
手順を図１に示す。ｃＤＮＡ挿入断片は、１１８ｂｐの
５’非翻訳配列、４５００ｂｐ（アミノ酸残基１５００
個）のタンパク質コード化配列および５９７ｂｐの３’
非翻訳配列を含んでいた。また、図２〜図１０に全長ヒ
トＣＰＳＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配列を示
す。
鋳型とし合成オリゴヌクレオチドをプライマーとするジ
デオキシ鎖終止法によって、直接ヌクレオチド配列の決
定を行った。オリゴヌクレオチドプライマーはＤＮＡシ
ンセサイザー３８１Ａ型（アプライド・バイオシステム
ズ社製）を用いて合成した。７個のクローンから得たｃ
ＤＮＡ挿入断片の制限酵素地図と挿入断片の配列決定の
手順を図１に示す。ｃＤＮＡ挿入断片は、１１８ｂｐの
５’非翻訳配列、４５００ｂｐ（アミノ酸残基１５００
個）のタンパク質コード化配列および５９７ｂｐの３’
非翻訳配列を含んでいた。また、図２〜図１０に全長ヒ
トＣＰＳＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配列を示
す。
【００２２】３’ｃＤＮＡクローン（ｈＣＰＳＩ０１１
）はオリゴ（ｄＴ）プライムｃＤＮＡライブラリーから
単離されたが、ポリアデニル化のシグナルとポリ（Ａ）
トラクトを欠いていた。大部分の真核生物遺伝子に見ら
れるように、ヌクレオチド＋１の位置にある開始コドン
ＡＴＧの前には、−３の位置にプリン（Ａ）が、−４の
位置にＣが存在した。ヌクレオチド−３７の位置には読
み取り枠外のＡＴＧが存在し、このＡＴＧは不完全な逆
向き反復配列中に位置していた。
）はオリゴ（ｄＴ）プライムｃＤＮＡライブラリーから
単離されたが、ポリアデニル化のシグナルとポリ（Ａ）
トラクトを欠いていた。大部分の真核生物遺伝子に見ら
れるように、ヌクレオチド＋１の位置にある開始コドン
ＡＴＧの前には、−３の位置にプリン（Ａ）が、−４の
位置にＣが存在した。ヌクレオチド−３７の位置には読
み取り枠外のＡＴＧが存在し、このＡＴＧは不完全な逆
向き反復配列中に位置していた。
【００２３】ヒト肝ＣＰＳＩの前駆体の予想されるＭｒ
は１６４８２８であり、プロセシングを完了した成熟体
では１６０４３８または１６０３２４であったが、これ
らの値は精製ヒト肝ＣＰＳＩについて報告されている数
字（１６５０００）とよく一致していた。
は１６４８２８であり、プロセシングを完了した成熟体
では１６０４３８または１６０３２４であったが、これ
らの値は精製ヒト肝ＣＰＳＩについて報告されている数
字（１６５０００）とよく一致していた。
【００２４】ヒト肝ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、タ
ンパク質コード領域では８８．９％がラットｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列と相同性があり、推定アミノ酸配列は
９４．４％の相同性がある。ヒトｃＤＮＡおよびラット
ｃＤＮＡの５’非翻訳配列と３’非翻訳配列のホモロジ
ーはタンパク質コード配列のホモロジーよりはるかに低
かった。
ンパク質コード領域では８８．９％がラットｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列と相同性があり、推定アミノ酸配列は
９４．４％の相同性がある。ヒトｃＤＮＡおよびラット
ｃＤＮＡの５’非翻訳配列と３’非翻訳配列のホモロジ
ーはタンパク質コード配列のホモロジーよりはるかに低
かった。
【００２５】ラット肝ＣＰＳＩのプレ配列に対応するＮ
末端３８位または３９位のアミノ酸配列は塩基性が高く
（９個の塩基性アミノ酸残基と２個の酸性アミノ酸残基
から成る）、水酸化された残基（８残基）を多く含有し
、疎水性アミノ酸部分を含んでいなかった。これらの特
徴はプレ配列に共通のものである。推定アミノ酸配列は
、ラットの酵素で見られたのと同様、Ｎ末端ハーフ（残
基４２５−８１３）とＣ末端ハーフ（残基９７５−１３
４９）の間に顕著なホモロジー（２４．３％が共通）を
示し、各ハーフはヌクレオチド結合にコンセンサス配列
（Ｎ末端ハーフでは残基７１８−７６８、Ｃ末端ハーフ
では残基１２５９−１３０２）を含んでいた。
末端３８位または３９位のアミノ酸配列は塩基性が高く
（９個の塩基性アミノ酸残基と２個の酸性アミノ酸残基
から成る）、水酸化された残基（８残基）を多く含有し
、疎水性アミノ酸部分を含んでいなかった。これらの特
徴はプレ配列に共通のものである。推定アミノ酸配列は
、ラットの酵素で見られたのと同様、Ｎ末端ハーフ（残
基４２５−８１３）とＣ末端ハーフ（残基９７５−１３
４９）の間に顕著なホモロジー（２４．３％が共通）を
示し、各ハーフはヌクレオチド結合にコンセンサス配列
（Ｎ末端ハーフでは残基７１８−７６８、Ｃ末端ハーフ
では残基１２５９−１３０２）を含んでいた。
【００２６】（４）全長ｃＤＮＡインサートの取得全長
ｃＤＮＡインサートを取得するには、公知の方法を用い
て容易に行うことができる。例えば本実施例で得られた
クローンのうち、ｈＣＰＳＩ−１１，ｈＣＰＳＩ−４，
ｈＣＰＳＩ−２，ｈＣＰＳＩ−０１１は全長ｃＤＮＡを
オーバーラップする配列を有しているので、これらを制
限酵素で適宜切断し、結合することにより全長ｃＤＮＡ
を構築することができる。
ｃＤＮＡインサートを取得するには、公知の方法を用い
て容易に行うことができる。例えば本実施例で得られた
クローンのうち、ｈＣＰＳＩ−１１，ｈＣＰＳＩ−４，
ｈＣＰＳＩ−２，ｈＣＰＳＩ−０１１は全長ｃＤＮＡを
オーバーラップする配列を有しているので、これらを制
限酵素で適宜切断し、結合することにより全長ｃＤＮＡ
を構築することができる。
【００２７】例えば、まずｈＣＰＳＩ−１１をＨｉｎｃ
ＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ で消化し、またｈＣＰＳＩ
−４も同様にＨｉｎｃＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ で消
化した後、両者を結合したものを調製する（ｈＣＰＳＩ
■）。次に、ｈＣＰＳＩ−２をＡｖａＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩ で消化し、またｈＣＰＳＩ−０１１も同様にＡ
ｖａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ で消化した後、両者を結
合したものを調製する（ｈＣＰＳＩ■）。次いで、これ
らｈＣＰＳＩ■およびｈＣＰＳＩ■をつなぐことにより
全長ｃＤＮＡを構築することができる。
ＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ で消化し、またｈＣＰＳＩ
−４も同様にＨｉｎｃＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ で消
化した後、両者を結合したものを調製する（ｈＣＰＳＩ
■）。次に、ｈＣＰＳＩ−２をＡｖａＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩ で消化し、またｈＣＰＳＩ−０１１も同様にＡ
ｖａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ で消化した後、両者を結
合したものを調製する（ｈＣＰＳＩ■）。次いで、これ
らｈＣＰＳＩ■およびｈＣＰＳＩ■をつなぐことにより
全長ｃＤＮＡを構築することができる。
【００２８】また、全長ｃＤＮＡインサートのみを取り
出せるようにするためには、常法によりリンカーを合成
して用いればよい。例えば、５’ＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣ
ＴＴＧＡＡＴＴＣ３’の１８マーを合成し、その１８マ
ーをセルフアニーリングさせた後、ＥｃｏＲＩで切断す
る。ｈＣＰＳＩ■をＥｃｏＲＩで切断し、アルカリフォ
スファターゼ処理した後、前記のリンカーを結合し、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ で消化する。これを、ｈＣＰＳＩ■をＨ
ｉｎｄＩＩＩ で切断しアルカリフォスファターゼ処理
後のプラスミドと結合して得られるもののうち順方向に
入ったものを選択する。全長ｃＤＮＡインサートは、Ｅ
ｃｏＲＩで切り出すことにより取出すことができる。
出せるようにするためには、常法によりリンカーを合成
して用いればよい。例えば、５’ＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣ
ＴＴＧＡＡＴＴＣ３’の１８マーを合成し、その１８マ
ーをセルフアニーリングさせた後、ＥｃｏＲＩで切断す
る。ｈＣＰＳＩ■をＥｃｏＲＩで切断し、アルカリフォ
スファターゼ処理した後、前記のリンカーを結合し、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ で消化する。これを、ｈＣＰＳＩ■をＨ
ｉｎｄＩＩＩ で切断しアルカリフォスファターゼ処理
後のプラスミドと結合して得られるもののうち順方向に
入ったものを選択する。全長ｃＤＮＡインサートは、Ｅ
ｃｏＲＩで切り出すことにより取出すことができる。
【００２９】実施例２
ＣＰＳＩ欠損症の分子レベルでの分析
（１）被験者
ＣＰＳＩ欠損症を分子レベルで分析するために、３名の
患者から採取したタンパク質、ゲノムＤＮＡおよびｍＲ
ＮＡを分析した。公知の方法に従い肝臓の尿素サイクル
酵素の活性を測定することによって、３名の日本人患者
がＣＰＳＩ欠損症であると診断した。３名はいずれも高
アンモニア血症と血漿シトルリン濃度低下の症状を示し
、尿中オロット酸塩の量は正常であった。一人の女児患
者（症例１）（両親は近親婚でない）は遅延発病型であ
った。別の女児患者（症例２）は新生児期に死亡した兄
弟があり、両親は近親婚であった。残りの一人は男児で
（症例３）、同じ病気の兄弟があるが両親は近親婚でな
かった。これら２症例は新生児期発病型であった。これ
ら３名の患者の肝ＣＰＳＩ活性は対照に対してそれぞれ
９％、１１％、０％であった。
患者から採取したタンパク質、ゲノムＤＮＡおよびｍＲ
ＮＡを分析した。公知の方法に従い肝臓の尿素サイクル
酵素の活性を測定することによって、３名の日本人患者
がＣＰＳＩ欠損症であると診断した。３名はいずれも高
アンモニア血症と血漿シトルリン濃度低下の症状を示し
、尿中オロット酸塩の量は正常であった。一人の女児患
者（症例１）（両親は近親婚でない）は遅延発病型であ
った。別の女児患者（症例２）は新生児期に死亡した兄
弟があり、両親は近親婚であった。残りの一人は男児で
（症例３）、同じ病気の兄弟があるが両親は近親婚でな
かった。これら２症例は新生児期発病型であった。これ
ら３名の患者の肝ＣＰＳＩ活性は対照に対してそれぞれ
９％、１１％、０％であった。
【００３０】（２）ヒト肝ホモジネートのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ ヒト肝ホモジネートのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、次いで
タンパク質を染色することによってＣＰＳＩポリペプチ
ドの検出を行った。まず、肝生検によって対照および症
例１から肝臓試料を採取し、症例２と症例３からは死後
数時間以内の剖検肝から試料を採取した。試料はいずれ
も試験開始時まで−７０℃で保存した。０．５％（ｗ／
ｖ）のトリトンＸ−１００、２０％（ｗ／ｖ）のグリセ
リンおよび１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．４）を含有する５
０ｍＭのＨｅｐｅｓカリウム（ｐＨ７．４）９倍量中で
肝臓をホモジネートし、得られたホモジネートをマイク
ロ遠心分離機で遠心分離した。次いで７０μｇのタンパ
ク質を含有する上清を、公知の方法に従ってＳＤＳ−６
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。その結果
、ＣＰＳＩポリペプチドは対照の肝臓からは検出された
が、３名の患者の肝臓にはまったくあるいはほとんど検
出されなかった（図１１）。これらの結果から、上記３
名の患者の肝ＣＰＳＩ活性の低下はＣＰＳＩ酵素タンパ
ク質量の減少によるものであると思われる。
ＧＥ ヒト肝ホモジネートのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、次いで
タンパク質を染色することによってＣＰＳＩポリペプチ
ドの検出を行った。まず、肝生検によって対照および症
例１から肝臓試料を採取し、症例２と症例３からは死後
数時間以内の剖検肝から試料を採取した。試料はいずれ
も試験開始時まで−７０℃で保存した。０．５％（ｗ／
ｖ）のトリトンＸ−１００、２０％（ｗ／ｖ）のグリセ
リンおよび１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．４）を含有する５
０ｍＭのＨｅｐｅｓカリウム（ｐＨ７．４）９倍量中で
肝臓をホモジネートし、得られたホモジネートをマイク
ロ遠心分離機で遠心分離した。次いで７０μｇのタンパ
ク質を含有する上清を、公知の方法に従ってＳＤＳ−６
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。その結果
、ＣＰＳＩポリペプチドは対照の肝臓からは検出された
が、３名の患者の肝臓にはまったくあるいはほとんど検
出されなかった（図１１）。これらの結果から、上記３
名の患者の肝ＣＰＳＩ活性の低下はＣＰＳＩ酵素タンパ
ク質量の減少によるものであると思われる。
【００３１】（３）サザンブロッティングによる分析ラ
ットＣＰＳＩ遺伝子は１００ｋｂ以上の長さがあると推
定され、１３５９ｂｐ（コード領域の約３０％に相当）
からなるコード領域の３’部分は１３個の独立したエク
ソンに分かれていることが知られている。ヒトＣＰＳＩ
遺伝子についても非常に大型で多くのエクソンに分かれ
ていると思われることから以下に示すように、ヒトＣＰ
ＳＩｃＤＮＡの５’ハーフまたは３’ハーフをプローブ
として用いるハイブリダイゼーションを行った。まず、
常法に従い対照および症例１からゲノムＤＮＡを末梢血
リンパ球から調製した。ＤＮＡ（７〜１０μｇ）を制限
酵素ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩで消化した後、０．７
％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ニトロセル
ロースフィルターに移した。次いで３２Ｐで標識したヒ
ト肝ＣＰＳＩｃＤＮＡの５’または３’ハーフをプロー
ブとして用い、マニアティスらの方法に従ってハイブリ
ダイゼーションを行い、フィルターを洗浄し、−７０℃
でＸ線フィルム（ニューＲＸ、富士写真フィルム社製）
に１日露光した。
ットＣＰＳＩ遺伝子は１００ｋｂ以上の長さがあると推
定され、１３５９ｂｐ（コード領域の約３０％に相当）
からなるコード領域の３’部分は１３個の独立したエク
ソンに分かれていることが知られている。ヒトＣＰＳＩ
遺伝子についても非常に大型で多くのエクソンに分かれ
ていると思われることから以下に示すように、ヒトＣＰ
ＳＩｃＤＮＡの５’ハーフまたは３’ハーフをプローブ
として用いるハイブリダイゼーションを行った。まず、
常法に従い対照および症例１からゲノムＤＮＡを末梢血
リンパ球から調製した。ＤＮＡ（７〜１０μｇ）を制限
酵素ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩで消化した後、０．７
％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ニトロセル
ロースフィルターに移した。次いで３２Ｐで標識したヒ
ト肝ＣＰＳＩｃＤＮＡの５’または３’ハーフをプロー
ブとして用い、マニアティスらの方法に従ってハイブリ
ダイゼーションを行い、フィルターを洗浄し、−７０℃
でＸ線フィルム（ニューＲＸ、富士写真フィルム社製）
に１日露光した。
【００３２】用いた５’ハーフプローブはヌクレオチド
１−１１８４のｃＤＮＡ断片とヌクレオチド１１８５−
２５５０の断片の混合物であり、３’ハーフプローブは
ヌクレオチド２５５１−３６３６のｃＤＮＡ断片とヌク
レオチド３６３７−５０９２の断片の混合物である。こ
の５’ハーフプローブはｈＣＰＳＩ−１１をＥｃｏＲＩ
およびＨｉｎｃＩＩで消化したｃＤＮＡ断片とｐＣＰＳ
Ｉ−４をＨｉｎｃＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ で消化し
たｃＤＮＡ断片の混合物により、また３’ハーフプロー
ブはｈＣＰＳＩ−２をＡｖａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
で消化したｃＤＮＡ断片とｐＣＰＳＩ−０１１をＡｖａ
ＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｃＤＮＡ断片の混合物に
よって調製した。
１−１１８４のｃＤＮＡ断片とヌクレオチド１１８５−
２５５０の断片の混合物であり、３’ハーフプローブは
ヌクレオチド２５５１−３６３６のｃＤＮＡ断片とヌク
レオチド３６３７−５０９２の断片の混合物である。こ
の５’ハーフプローブはｈＣＰＳＩ−１１をＥｃｏＲＩ
およびＨｉｎｃＩＩで消化したｃＤＮＡ断片とｐＣＰＳ
Ｉ−４をＨｉｎｃＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ で消化し
たｃＤＮＡ断片の混合物により、また３’ハーフプロー
ブはｈＣＰＳＩ−２をＡｖａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
で消化したｃＤＮＡ断片とｐＣＰＳＩ−０１１をＡｖａ
ＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｃＤＮＡ断片の混合物に
よって調製した。
【００３３】このようにして、サザンブロッティングに
よる分析を行った結果、明瞭なバンドを得たが、対照Ｄ
ＮＡの場合、ＥｃｏＲＩ消化によって少なくとも１９個
の断片が見られ、これらの断片の合計長さは９２ｋｂで
あった（図１２）。同様に、ＢａｍＨＩ消化では少なく
とも１０個の断片が見られ、これらの断片の合計長さは
７７ｋｂであった。これらのデータから、ヒト肝ＣＰＳ
Ｉ遺伝子の長さは９２ｋｂを越えること、およびｃＤＮ
Ａ中にはＥｃｏＲＩ部位は存在しないことから、この遺
伝子は少なくとも１９個のエクソンに分かれていること
がうかがわれる。一方、症例１では、オートラジオグラ
ムパターンに余分のバンドが見られた（図１２、図中Ａ
のレーン２および４を参照）。すなわち、５’ハーフプ
ローブを用いてＥｃｏＲＩ消化による３．９ｋｂのバン
ド１本とＢａｍＨＩ消化による２本のバンド（４．１ｋ
ｂと２．９ｋｂ）が見られた。したがって、症例１の場
合、ＣＰＳＩ遺伝子の挿入または再配列などの変異が起
きたものと判断された。この挿入または再配列が病気の
原因であるかどうかはさらに検討を要するが、病因とな
る変異ＣＰＳＩ遺伝子はこの挿入または再配列と連鎖し
ていることはまちがいない。
よる分析を行った結果、明瞭なバンドを得たが、対照Ｄ
ＮＡの場合、ＥｃｏＲＩ消化によって少なくとも１９個
の断片が見られ、これらの断片の合計長さは９２ｋｂで
あった（図１２）。同様に、ＢａｍＨＩ消化では少なく
とも１０個の断片が見られ、これらの断片の合計長さは
７７ｋｂであった。これらのデータから、ヒト肝ＣＰＳ
Ｉ遺伝子の長さは９２ｋｂを越えること、およびｃＤＮ
Ａ中にはＥｃｏＲＩ部位は存在しないことから、この遺
伝子は少なくとも１９個のエクソンに分かれていること
がうかがわれる。一方、症例１では、オートラジオグラ
ムパターンに余分のバンドが見られた（図１２、図中Ａ
のレーン２および４を参照）。すなわち、５’ハーフプ
ローブを用いてＥｃｏＲＩ消化による３．９ｋｂのバン
ド１本とＢａｍＨＩ消化による２本のバンド（４．１ｋ
ｂと２．９ｋｂ）が見られた。したがって、症例１の場
合、ＣＰＳＩ遺伝子の挿入または再配列などの変異が起
きたものと判断された。この挿入または再配列が病気の
原因であるかどうかはさらに検討を要するが、病因とな
る変異ＣＰＳＩ遺伝子はこの挿入または再配列と連鎖し
ていることはまちがいない。
【００３４】
【発明の効果】本発明によれば、ヒトＣＰＳＩの全長ｃ
ＤＮＡ配列を包含するオーバーラップするｃＤＮＡをプ
ローブとして用いることにより、ＣＰＳＩ遺伝子の挿入
または再配列等に起因すると思われるＣＰＳＩ欠損症を
検出することができる。したがって、このようにして検
出された患者の家族ではキャリヤの発見と出生前診断も
可能となる。
ＤＮＡ配列を包含するオーバーラップするｃＤＮＡをプ
ローブとして用いることにより、ＣＰＳＩ遺伝子の挿入
または再配列等に起因すると思われるＣＰＳＩ欠損症を
検出することができる。したがって、このようにして検
出された患者の家族ではキャリヤの発見と出生前診断も
可能となる。
【００３５】
【配列表】配列番号：１
配列の長さ：５２１５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
起源
生物名：ヒト
組織の種類：肝臓
配列
ＡＡＧＣＡＡＣＣＴＴ ＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧ ＣＡ
ＣＣＣＴＣＣＣＡ ＧＡＴＴＴＣＴＴＴＴ ＡＣＡＴＴ
ＡＡＣＴＡ ＡＡＡＡＧＴＣＴＴＡ ６０ ＴＣ
ＡＣＡＣＡＡＴＣ ＴＣＡＴＡＡＡＡＴＴ ＴＡＴＧＴ
ＡＡＴＴＴ ＣＡＴＴＴＡＡＴＴＴ ＴＡＧＣＣＡＣＡ
ＡＡ ＴＣＡＴＣＡＡＡＡＴ １２０ ＧＡＣＧＡ
ＧＧＡＴＴ ＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴ ＴＣＡＡＡＧＴＧ
ＧＴ ＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧ ＡＡＧＡＣＴＧＧＴＴ
ＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣ １８０ ＣＡＡＴＧＴＧＡ
ＣＴ ＧＣＡＣＡＣＣＡＡＡ ＡＡＴＧＧＡＡＡＴＴ
ＴＴＣＡＡＧＡＣＣＴ ＧＧＣＡＴＣＡＧＧＣ ＴＣＣ
ＴＴＴＣＴＧＴ ２４０ ＣＡＡＧＧＣＡＣＡＧ
ＡＣＡＧＣＡＣＡＣＡ ＴＴＧＴＣＣＴＧＧＡ ＡＧＡ
ＴＧＧＡＡＣＴ ＡＡＧＡＴＧＡＡＡＧ ＧＴＴＡＣＴ
ＣＣＴＴ ３００ ＴＧＧＣＣＡＴＣＣＡ ＴＣＣ
ＴＣＴＧＴＴＧ ＣＴＧＧＴＧＡＡＧＴ ＧＧＴＴＴＴ
ＴＡＡＴ ＡＣＴＧＧＣＣＴＧＧ ＧＡＧＧＧＴＡＣＣ
Ｃ ３６０ ＡＧＡＡＧＣＴＡＴＴ ＡＣＴＧＡＣ
ＣＣＴＧ ＣＣＴＡＣＡＡＡＧＧ ＡＣＡＧＡＴＴＣＴ
Ｃ ＡＣＡＡＴＧＧＣＣＡ ＡＣＣＣＴＡＴＴＡＴ
４２０ ＴＧＧＧＡＡＴＧＧＴ ＧＧＡＧＣＴＣＣＴ
Ｇ ＡＴＡＣＴＡＣＴＴＣ ＴＣＴＧＧＡＴＧＡＡ Ｃ
ＴＧＧＧＡＣＴＴＡ ＧＣＡＡＡＴＡＴＴＴ ４８
０ ＧＧＡＧＴＣＴＡＡＴ ＧＧＡＡＴＣＡＡＧＧ Ｔ
ＴＴＣＡＧＧＴＴＴ ＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧ ＧＡＴＴ
ＡＴＡＧＴＡ ＡＡＧＡＣＴＡＣＡＡ ５４０ Ｃ
ＣＡＣＴＧＧＣＴＧ ＧＣＴＡＣＣＡＡＧＡ ＧＴＴＴ
ＡＧＧＧＣＡ ＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧ ＧＡＡＧＡＡＡ
ＡＧＧ ＴＴＣＣＴＧＣＡＡＴ ６００ ＴＴＡＴ
ＧＧＡＧＴＧ ＧＡＣＡＣＡＡＧＡＡ ＴＧＣＴＧＡＣ
ＴＡＡ ＡＡＴＡＡＴＴＣＧＧ ＧＡＴＡＡＧＧＧＴＡ
ＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧ ６６０ ＧＡＡＧＡＴＴ
ＧＡＡ ＴＴＴＧＡＡＧＧＴＣ ＡＧＣＣＴＧＴＧＧＡ
ＴＴＴＴＧＴＧＧＡＴ ＣＣＡＡＡＴＡＡＡＣ ＡＧ
ＡＡＴＴＴＧＡＴ ７２０ ＴＧＣＴＧＡＧＧＴＴ
ＴＣＡＡＣＣＡＡＧＧ ＡＴＧＴＣＡＡＡＧＴ ＧＴ
ＡＣＧＧＣＡＡＡ ＧＧＡＡＡＣＣＣＣＡ ＣＡＡＡＡ
ＧＴＧＧＴ ７８０ ＡＧＣＴＧＴＡＧＡＣ ＴＧ
ＴＧＧＧＡＴＴＡ ＡＡＡＡＣＡＡＴＧＴ ＡＡＴＣＣ
ＧＣＣＴＧ ＣＴＡＧＴＡＡＡＧＣ ＧＡＧＧＡＧＣＴ
ＧＡ ８４０ ＡＧＴＧＣＡＣＴＴＡ ＧＴＴＣＣ
ＣＴＧＧＡ ＡＣＣＡＴＧＡＴＴＴ ＣＡＣＣＡＡＧＡ
ＴＧ ＧＡＧＴＡＴＧＡＴＧ ＧＧＡＴＴＴＴＧＡＴ
９００ ＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡ ＣＣＧＧＧＧＡＡ
ＣＣ ＣＡＧＣＴＣＴＴＧＣ ＡＧＡＡＣＣＡＣＴＡ
ＡＴＴＣＡＧＡＡＴＧ ＴＴＣＡＧＡＡＧＡＴ ９
６０ ＴＴＴＧＧＡＧＡＧＴ ＧＡＴＣＧＣＡＡＧＧ
ＡＧＣＣＡＴＴＧＴＴ ＴＧＧＡＡＴＣＡＧＴ ＡＣＡ
ＧＧＡＡＡＣＴ ＴＡＡＴＡＡＣＡＧＧ １０２０
ＡＴＴＧＧＣＴＧＣＴ ＧＧＴＧＣＣＡＡＡＡ ＣＣＴ
ＡＣＡＡＧＡＴ ＧＴＣＣＡＴＧＧＣＣ ＡＡＣＡＧＡ
ＧＧＧＣ ＡＧＡＡＴＣＡＧＣＣ １０８０ ＴＧＴ
ＴＴＴＧＡＡＴ ＡＴＣＡＣＡＡＡＣＡ ＡＡＣＡＧＧ
ＣＴＴＴ ＣＡＴＴＡＣＴＧＣＴ ＣＡＧＡＡＴＣＡＴ
Ｔ ＧＣＴＡＴＧＣＣＴＴ １１４０ ＧＧＡＣＡＡ
ＣＡＣＣ ＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧ ＧＣＴＧＧＡＡＡＣ
Ｃ ＡＣＴＴＴＴＴＧＴＧ ＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ Ａ
ＴＣＡＡＡＣＡＡＡ １２００ ＴＧＡＧＧＧＧＡＴ
Ｔ ＡＴＧＣＡＴＧＡＧＡ ＧＣＡＡＡＣＣＣＴＴ Ｃ
ＴＴＣＧＣＴＧＴＧ ＣＡＧＴＴＣＣＡＣＣ ＣＡＧＡ
ＧＧＴＣＡＣ １２６０ ＣＣＣＧＧＧＧＣＣＡ Ａ
ＴＡＧＡＣＡＣＴＧ ＡＧＴＡＣＣＴＧＴＴ ＴＧＡＴ
ＴＣＣＴＴＴ ＴＴＣＴＣＡＣＴＧＡ ＴＡＡＡＧＡＡ
ＡＧＧ １３２０ ＡＡＡＡＧＣＴＡＣＣ ＡＣＣＡ
ＴＴＡＣＡＴ ＣＡＧＴＣＴＴＡＣＣ ＧＡＡＧＣＣＡ
ＧＣＡ ＣＴＡＧＴＴＧＣＡＴ ＣＴＣＧＧＧＴＴＧＡ
１３８０ ＧＧＴＴＴＣＣＡＡＡ ＧＴＣＣＴＴＡ
ＴＴＣ ＴＡＧＧＡＴＣＡＧＧ ＡＧＧＴＣＴＧＴＣＣ
ＡＴＴＧＧＴＣＡＧＧ ＣＴＧＧＡＧＡＡＴＴ １
４４０ ＴＧＡＴＴＡＣＴＣＡ ＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧ
ＣＴＧＴＡＡＡＡＧＣ ＣＡＴＧＡＡＧＧＡＡ ＧＡ
ＡＡＡＴＧＴＣＡ ＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴ １５００
ＧＡＴＧＡＡＣＣＣＡ ＡＡＣＡＴＴＧＣＡＴ ＣＡ
ＧＴＣＣＡＧＡＣ ＣＡＡＴＧＡＧＧＴＧ ＧＧＣＴＴ
ＡＡＡＧＣ ＡＡＧＣＧＧＡＴＡＣ １５６０ ＴＧ
ＴＣＴＡＣＴＴＴ ＣＴＴＣＣＣＡＴＣＡ ＣＣＣＣＴ
ＣＡＧＴＴ ＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧ ＧＴＣＡＴＣＡＡ
ＧＧ ＣＡＧＡＡＣＡＧＣＣ １６２０ ＡＧＡＴＧ
ＧＧＴＴＡ ＡＴＴＣＴＧＧＧＣＡ ＴＧＧＧＴＧＧＣ
ＣＡ ＧＡＣＡＧＣＴＣＴＧ ＡＡＣＴＧＴＧＧＡＧ
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ＡＣＡＡ ＡＧＡＡＴＧＧＣＣＡ ＴＣＧＡＡＴＴＴＡ
Ｇ ＡＴＣＴＴＡＧＡＡＡ ２６４０ ＡＧＡＧＴＴ
ＧＴＣＴ ＧＡＡＣＣＡＡＧＣＡ ＧＣＡＣＧＣＧＴＡ
Ｔ ＣＴＡＴＧＣＣＡＴＴ ＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡ Ｔ
ＴＧＡＴＧＡＣＡＡ ２７００ ＣＡＴＧＴＣＣＣＴ
Ｔ ＧＡＴＧＡＧＡＴＴＧ ＡＧＡＡＧＣＴＣＡＣ Ａ
ＴＡＣＡＴＴＧＡＣ ＡＡＧＴＧＧＴＴＴＴ ＴＧＴＡ
ＴＡＡＧＡＴ ２７６０ ＧＣＧＴＧＡＴＡＴＴ Ｔ
ＴＡＡＡＣＡＴＧＧ ＡＡＡＡＧＡＣＡＣＴ ＧＡＡＡ
ＧＧＣＣＴＣ ＡＡＣＡＧＴＧＡＧＴ ＣＣＡＴＧＡＣ
ＡＧＡ ２８２０ ＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧ ＡＡＡＡ
ＧＧＧＣＡＡ ＡＧＧＡＧＡＴＴＧＧ ＧＴＴＣＴＣＡ
ＧＡＴ ＡＡＧＣＡＧＡＴＴＴ ＣＡＡＡＡＴＧＣＣＴ
２８８０ ＴＧＧＧＣＴＣＡＣＴ ＧＡＧＧＣＣＣ
ＡＧＡ ＣＡＡＧＧＧＡＧＣＴ ＧＡＧＧＴＴＡＡＡＧ
ＡＡＡＡＡＣＡＴＣＣ ＡＣＣＣＴＴＧＧＧＴ ２
９４０ ＴＡＡＡＣＡＧＡＴＴ ＧＡＴＡＣＡＣＴＧＧ
ＣＴＧＣＡＧＡＡＴＡ ＣＣＣＡＴＣＡＧＴＡ ＡＣ
ＡＡＡＣＴＡＴＣ ＴＣＴＡＴＧＴＴＡＣ ３０００
ＣＴＡＣＡＡＴＧＧＴ ＣＡＧＧＡＧＣＡＴＧ ＡＴ
ＧＴＣＡＡＴＴＴ ＴＧＡＴＧＡＣＣＡＴ ＧＧＡＡＴ
ＧＡＴＧＧ ＴＧＣＴＡＧＧＣＴＧ ３０６０ ＴＧ
ＧＴＣＣＡＴＡＴ ＣＡＣＡＴＴＧＧＣＡ ＧＣＡＧＴ
ＧＴＧＧＡ ＡＴＴＴＧＡＴＴＧＧ ＴＧＴＧＣＴＧＴ
ＣＴ ＣＴＡＧＴＡＴＣＣＧ ３１２０ ＣＡＣＡＣ
ＴＧＣＧＴ ＣＡＡＣＴＴＧＧＣＡ ＡＧＡＡＧＡＣＧ
ＧＴ ＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴ ＴＧＣＡＡＴＣＣＴＧ
ＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧ ３１８０ ＣＡＣＡＧＡＣＴ
ＴＴ ＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧ ＡＣＡＡＡＣＴＧＴＡ
ＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧ ＴＴＧＴＣＣＴＴＧＧ ＡＧＡ
ＧＡＡＴＣＣＴ ３２４０ ＡＧＡＣＡＴＣＴＡＣ
ＣＡＴＣＡＧＧＡＧＧ ＣＡＴＧＴＧＧＴＧＧ ＣＴＧ
ＣＡＴＣＡＴＡ ＴＣＡＧＴＴＧＧＡＧ ＧＣＣＡＧＡ
ＴＴＣＣ ３３００ ＡＡＡＣＡＡＣＣＴＧ ＧＣＡ
ＧＴＴＣＣＴＣ ＴＡＴＡＣＡＡＧＡＡ ＴＧＧＴＧＴ
ＣＡＡＧ ＡＴＣＡＴＧＧＧＣＡ ＣＡＡＧＣＣＣＣＣ
Ｔ ３３６０ ＧＣＡＧＡＴＣＧＡＣ ＡＧＧＧＣＴ
ＧＡＧＧ ＡＴＣＧＣＴＣＣＡＴ ＣＴＴＣＴＣＡＧＣ
Ｔ ＧＴＣＴＴＧＧＡＴＧ ＡＧＣＴＧＡＡＧＧＴ
３４２０ ＧＧＣＴＣＡＧＧＣＡ ＣＣＴＴＧＧＡＡＡ
Ｇ ＣＴＧＴＴＡＡＴＡＣ ＴＴＴＧＡＡＴＧＡＡ Ｇ
ＣＡＣＴＧＧＡＡＴ ＴＴＧＣＡＡＡＧＴＣ ３４８
０ ＴＧＴＧＧＡＣＴＡＣ ＣＣＣＴＧＣＴＴＧＴ Ｔ
ＧＡＧＧＣＣＴＴＣ ＣＴＡＴＧＴＴＴＴＧ ＡＧＴＧ
ＧＧＴＣＴＧ ＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴ ３５４０ Ｇ
ＧＴＡＴＴＣＴＣＴ ＧＡＧＧＡＴＧＡＧＡ ＴＧＡＡ
ＡＡＡＡＴＴ ＣＣＴＡＧＡＡＧＡＧ ＧＣＧＡＣＴＡ
ＧＡＧ ＴＴＴＣＴＣＡＧＧＣ ３６００ ＣＡＣＧ
ＣＣＡＧＴＧ ＧＴＧＣＴＧＡＣＡＡ ＡＡＴＴＴＧＴ
ＴＧＡ ＡＧＧＧＧＣＣＣＧＡ ＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡ
ＴＧＧＡＣＧＣＴＧＴ ３６６０ ＴＧＧＣＡＡＡ
ＧＡＴ ＧＧＡＡＧＧＧＴＴＡ ＴＣＴＣＴＣＡＴＧＣ
ＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡ ＣＡＴＧＴＴＧＡＡＧ ＡＴ
ＧＣＡＧＧＴＧＴ ３７２０ ＣＣＡＣＴＣＧＧＡＧ
ＡＡＴＧＣＣＡＣＴＣ ＴＧＡＴＧＣＴＧＣＣ ＣＡ
ＣＡＣＡＡＡＣＣ ＡＴＣＡＧＣＣＡＡＧ ＧＧＧＣＣ
ＡＴＴＧＡ ３７８０ ＡＡＡＧＧＴＧＡＡＧ ＧＡ
ＴＧＣＴＡＣＣＣ ＧＧＡＡＧＡＴＴＧＣ ＡＡＡＧＧ
ＣＴＴＴＴ ＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧ ＧＴＣＣＡＴＴＣ
ＡＡ ３８４０ ＣＧＴＣＣＡＡＴＴＴ ＣＴＴＧＴ
ＣＡＡＡＧ ＧＡＡＡＴＧＡＴＧＴ ＣＴＴＧＧＴＧＡ
ＡＴ ＧＡＧＴＧＴＡＡＣＴ ＴＧＡＧＡＧＣＴＴＣ
３９００ ＴＣＧＡＴＣＣＴＴＣ ＣＣＣＴＣＴＧＴ
ＴＴ ＣＣＡＡＧＡＣＴＣＴ ＴＧＧＧＧＴＴＧＡＣ
ＴＴＣＡＴＴＧＡＴＧ ＴＧＧＣＣＡＣＣＡＡ ３９
６０ ＧＧＴＧＴＴＧＡＴＴ ＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧ
ＴＴＧＡＴＧＡＧＡＡ ＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡ ＡＣＡ
ＴＴＧＧＡＣＣ ＡＴＣＣＣＡＴＡＡＴ ４０２０
ＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣ ＴＡＴＧＴＴＧＣＡＡ ＴＴＡ
ＡＧＧＣＴＣＣ ＣＡＴＧＴＴＴＴＣＣ ＴＧＧＣＣＣ
ＣＧＧＴ ＴＧＡＧＧＧＡＴＧＣ ４０８０ ＴＧＡ
ＣＣＣＣＡＴＴ ＣＴＧＡＧＡＴＧＴＧ ＡＧＡＴＧＧ
ＣＴＴＣ ＣＡＣＴＧＧＡＧＡＧ ＧＴＧＧＣＴＴＧＣ
Ｔ ＴＴＧＧＴＧＡＡＧＧ ４１４０ ＴＡＴＴＣＡ
ＴＡＣＡ ＧＣＣＴＴＣＣＴＡＡ ＡＧＧＣＡＡＴＧＣ
Ｔ ＴＴＣＣＡＣＡＧＧＡ ＴＴＴＡＡＧＡＴＡＣ Ｃ
ＣＣＡＧＡＡＡＧＧ ４２００ ＣＡＴＣＣＴＧＡＴ
Ａ ＧＧＣＡＴＣＣＡＧＣ ＡＡＴＣＡＴＴＣＣＧ Ｇ
ＣＣＡＡＧＡＴＴＣ ＣＴＴＧＧＴＧＴＧＧ ＣＴＧＡ
ＡＣＡＡＴＴ ４２６０ ＡＣＡＣＡＡＴＧＡＡ Ｇ
ＧＴＴＴＣＡＡＧＣ ＴＧＴＴＴＧＣＣＡＣ ＧＧＡＡ
ＧＣＣＡＣＡ ＴＣＡＧＡＣＴＧＧＣ ＴＣＡＡＣＧＣ
ＣＡＡ ４３２０ ＣＡＡＴＧＴＣＣＣＴ ＧＣＣＡ
ＡＣＣＣＡＧ ＴＧＧＣＡＴＧＧＣＣ ＧＴＣＴＣＡＡ
ＧＡＡ ＧＧＡＣＡＧＡＡＴＣ ＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣ
４３８０ ＴＴＣＣＡＴＣＡＧＡ ＡＡＡＴＴＧＡ
ＴＴＡ ＧＡＧＡＴＧＧＣＡＧ ＣＡＴＴＧＡＣＣＴＡ
ＧＴＧＡＴＴＡＡＣＣ ＴＴＣＣＣＡＡＣＡＡ ４
４４０ ＣＡＡＣＡＣＴＡＡＡ ＴＴＴＧＴＣＣＡＴＧ
ＡＴＡＡＴＴＡＴＧＴ ＧＡＴＴＣＧＧＡＧＧ ＡＣ
ＡＧＣＴＧＴＴＧ ＡＴＡＧＴＧＧＡＡＴ ４５００
ＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣ ＡＣＴＡＡＴＴＴＴＣ ＡＧ
ＧＴＧＡＣＣＡＡ ＡＣＴＴＴＴＴＧＣＴ ＧＡＡＧＣ
ＴＧＴＧＣ ＡＧＡＡＡＴＣＴＣＧ ４５６０ ＣＡ
ＡＧＧＴＧＧＡＣ ＴＣＣＡＡＧＡＧＴＣ ＴＴＴＴＣ
ＣＡＣＴＡ ＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣ ＡＧＴＧＣＴＧＧ
ＡＡ ＡＡＧＣＡＧＣＡＴＡ ４６２０ ＧＡＧＡＴ
ＧＣＡＧＡ ＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣ ＣＣＡＴＴＡＴＴ
ＡＡ ＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡ ＧＣＣＡＣＡＴＧＴＴ
ＡＴＡＴＡＡＡＧＧＡ ４６８０ ＡＣＴＧＡＴＴＣ
ＡＣ ＡＡＣＴＴＴＣＴＣＡ ＧＡＧＡＴＧＡＡＴＡ
ＴＴＧＡＴＡＡＣＴＡ ＡＡＣＴＴＣＡＴＴＴ ＣＡＧ
ＴＴＴＡＣＴＴ ４７４０ ＴＧＴＴＡＴＧＣＣＴ
ＴＡＡＴＡＴＴＣＴＧ ＴＧＴＣＴＴＴＴＧＣ ＡＡＴ
ＴＡＡＡＴＴＧ ＴＣＡＧＴＣＡＣＴＴ ＣＴＴＣＡＡ
ＡＡＣＣ ４８００ ＴＴＡＣＡＧＴＣＣＴ ＴＣＣ
ＴＡＡＧＧＴＴ ＡＣＴＣＴＴＣＡＴＧ ＡＧＡＴＴＣ
ＡＴＣＣ ＡＴＴＴＡＣＴＡＡＴ ＡＣＴＧＴＡＴＴＴ
Ｔ ４８６０ ＴＧＧＴＧＧＡＣＴＡ ＧＧＣＴＴＧ
ＣＣＴＡ ＴＧＴＧＣＴＴＡＴＧ ＴＧＴＡＧＣＴＴＴ
Ｔ ＴＡＣＴＴＴＴＴＡＴ ＧＧＴＧＴＧＡＴＴＡ
４９２０ ＡＴＧＧＴＧＡＴＣＡ ＡＧＧＴＡＧＧＡＡ
Ａ ＡＧＴＴＧＴＧＴＴＣ ＴＡＴＴＴＴＣＴＴＧ Ａ
ＡＣＴＣＣＴＴＣＴ ＡＴＡＣＴＴＴＡＡＧ ４９８
０ ＡＴＡＣＴＣＴＡＴＴ ＴＴＴＡＡＡＡＣＡＣ Ｔ
ＡＴＣＴＧＣＡＡＡ ＣＴＣＡＧＧＡＣＡＣ ＴＴＴＡ
ＡＣＡＧＧＧ ＣＡＧＡＡＴＡＣＴＣ ５０４０ Ｔ
ＡＡＡＡＡＣＴＴＧ ＡＴＡＡＡＡＴＴＡＡ ＡＴＡＴ
ＡＧＡＴＴＴ ＡＡＴＴＴＡＴＧＡＡ ＣＣＴＴＣＣＡ
ＴＣＡ ＴＧＴＧＴＴＴＧＴＧ ５１００ ＴＡＴＴ
ＧＣＴＴＣＴ ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣ ＴＣＡＴＴＣＴ
ＣＡＣ ＣＣＡＴＴＴＧＧＣＴ ＡＡＴＣＣＡＧＧＡＡ
ＴＡＴＴＧＴＴＡＴＣ ５１６０ ＣＣＴＴＣＣＣ
ＡＴＴ ＡＴＡＴＴＧＡＡＧＴ ＴＧＡＧＡＡＡＴＧＴ
ＧＡＣＡＧＡＧＣＡＴ ＴＴＡＧＡＧＴＡＴＧ ＡＡ
ＴＴＣ ５２１５
【図１】図１はヒト肝ＣＰＳＩｃＤＮＡの制限酵素地図
および得られた各種のクローンの位置を示した図である
。図中のオープンボックスはコード領域を示し、線の部
分は非コード領域を示す。矢印は配列決定の方向と領域
を示す。
および得られた各種のクローンの位置を示した図である
。図中のオープンボックスはコード領域を示し、線の部
分は非コード領域を示す。矢印は配列決定の方向と領域
を示す。
【図２】図２は図３〜図１０とともに全長ヒトＣＰＳＩ
ｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配列を示す。
ｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は図２および図４〜図１０とともに全長ヒ
トＣＰＳＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配列を示
す。
トＣＰＳＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配列を示
す。
【図４】図４は図２、図３および図５〜図１０とともに
全長ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配
列を示す。
全長ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配
列を示す。
【図５】図５は図２〜図４および図６〜図１０とともに
全長ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配
列を示す。
全長ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配
列を示す。
【図６】図６は図２〜図５および図７〜図１０とともに
全長ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配
列を示す。
全長ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配
列を示す。
【図７】図７は図２〜図６および図８〜図１０とともに
全長ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配
列を示す。
全長ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配
列を示す。
【図８】図８は図２〜図７および図９、図１０とともに
全長ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配
列を示す。
全長ヒトＣＰＳＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配
列を示す。
【図９】図９は図２〜図８および図１０とともに全長ヒ
トＣＰＳＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配列を示
す。
トＣＰＳＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配列を示
す。
【図１０】図１０は図２〜図９とともに全長ヒトＣＰＳ
ＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配列を示す。
ＩｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配列を示す。
【図１１】図１１は肝ホモジネートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
の結果を示した図である。レーン１とレーン４はコント
ロール、レーン２は症例１、レーン３は症例２、レーン
５は症例３の結果を示す。分子量のサイズマーカーはウ
サギミオシン（２００ｋＤ）、ウサギホスフォリラーゼ
ｂ（９７．４ｋＤ）、ウシ血清アルブミン（６９ｋＤ）
、およびニワトリオブアルブミン（４６ｋＤ）を用いた
。
の結果を示した図である。レーン１とレーン４はコント
ロール、レーン２は症例１、レーン３は症例２、レーン
５は症例３の結果を示す。分子量のサイズマーカーはウ
サギミオシン（２００ｋＤ）、ウサギホスフォリラーゼ
ｂ（９７．４ｋＤ）、ウシ血清アルブミン（６９ｋＤ）
、およびニワトリオブアルブミン（４６ｋＤ）を用いた
。
【図１２】図１２はサザンブロッティングによる分析の
結果を示した図である。Ａは５’ハーフプローブを用い
た場合の結果であり、Ｂは３’ハーフプローブを用いた
場合の結果である。図中のＡ、Ｂともレーン１、２はＤ
ＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、レーン３、４はＢａｍＨＩ
で消化した結果の図である。またレーン１と３は対照、
レーン２と４は症例１である。
結果を示した図である。Ａは５’ハーフプローブを用い
た場合の結果であり、Ｂは３’ハーフプローブを用いた
場合の結果である。図中のＡ、Ｂともレーン１、２はＤ
ＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、レーン３、４はＢａｍＨＩ
で消化した結果の図である。またレーン１と３は対照、
レーン２と４は症例１である。
Claims (3)
- 【請求項１】 配列番号：１に記載のＤＮＡの全部ま
たはその一部からなるＤＮＡ、または該ＤＮＡとハイブ
リダイズし得るＤＮＡ。 - 【請求項２】 カルバミルリン酸合成酵素Ｉ遺伝子の
検出において、配列番号：１に記載のＤＮＡの全部また
はその一部からなるＤＮＡ、または該ＤＮＡとハイブリ
ダイズし得るＤＮＡをプローブとして用いることを特徴
とするカルバミルリン酸合成酵素Ｉ変異遺伝子の検出方
法。 - 【請求項３】 配列番号：１に記載のＤＮＡの全部ま
たはその一部からなるＤＮＡ、または該ＤＮＡとハイブ
リダイズし得るＤＮＡからなるＤＮＡプローブ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13590291A JP3298901B2 (ja) | 1991-05-09 | 1991-05-09 | カルバミルリン酸合成酵素ｉ変異遺伝子の検出方法およびそれに用いるｄｎａプローブ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13590291A JP3298901B2 (ja) | 1991-05-09 | 1991-05-09 | カルバミルリン酸合成酵素ｉ変異遺伝子の検出方法およびそれに用いるｄｎａプローブ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04335889A true JPH04335889A (ja) | 1992-11-24 |
| JP3298901B2 JP3298901B2 (ja) | 2002-07-08 |
Family
ID=15162498
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13590291A Expired - Fee Related JP3298901B2 (ja) | 1991-05-09 | 1991-05-09 | カルバミルリン酸合成酵素ｉ変異遺伝子の検出方法およびそれに用いるｄｎａプローブ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3298901B2 (ja) |
-
1991
- 1991-05-09 JP JP13590291A patent/JP3298901B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3298901B2 (ja) | 2002-07-08 |
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