JPH04271786A - ヌクレオシド二リン酸キナーゼをコードする組換えｄｎａ構造体及びその産物 - Google Patents
ヌクレオシド二リン酸キナーゼをコードする組換えｄｎａ構造体及びその産物Info
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】〔発明の背景〕
産業上の利用分野
本発明はヌクレオシド二リン酸キナーゼ遺伝子のク
ローニング、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＰ）
活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、そ
の酵素の過剰産生及びＮＤＰ活性を有するポリペプチド
に関する。
ローニング、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＰ）
活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、そ
の酵素の過剰産生及びＮＤＰ活性を有するポリペプチド
に関する。
【０００２】発明の背景
ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＡＴＰ：ヌクレオ
シド二リン酸ホスホトランスフェラーゼ，ＥＣ２．７．
４．６）は下記一般メカニズムによりヌクレオシド三リ
ン酸（ＮＴＰ）からヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）へ
のγ‐リン酸基の転移を触媒する。 ヌクレオシド１三リン酸＋ヌクレオシド２二リン酸←→
ヌクレオシド１二リン酸＋ヌクレオシド２三リン酸その
酵素はヌクレオシド１及びヌクレオシド２がプリン又は
ピリミジンリボ‐又はデオキシリボヌクレオシドである
場合に比較的非特異的である。ＮＤＰキナーゼは酵母（
１）及びハト胸筋肉（２）から最初単離された。その時
以来、その酵素は自然界に遍在して、植物、動物及び微
生物中に広く分布することが示された（３）。ＮＤＰキ
ナーゼはヌクレオシド三リン酸、多数の補酵素、ＲＮＡ
及びＤＮＡの生合成経路における主成分として細胞中で
機能している。ＮＤＰキナーゼで観察される活性は多く
の組織において比較的高い。例えば約７６単位／ｍｌ
パック化細胞のヒト赤血球でのＮＤＰキナーゼ活性は、
この細胞における最大酵素活性の１つである（４）。
シド二リン酸ホスホトランスフェラーゼ，ＥＣ２．７．
４．６）は下記一般メカニズムによりヌクレオシド三リ
ン酸（ＮＴＰ）からヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）へ
のγ‐リン酸基の転移を触媒する。 ヌクレオシド１三リン酸＋ヌクレオシド２二リン酸←→
ヌクレオシド１二リン酸＋ヌクレオシド２三リン酸その
酵素はヌクレオシド１及びヌクレオシド２がプリン又は
ピリミジンリボ‐又はデオキシリボヌクレオシドである
場合に比較的非特異的である。ＮＤＰキナーゼは酵母（
１）及びハト胸筋肉（２）から最初単離された。その時
以来、その酵素は自然界に遍在して、植物、動物及び微
生物中に広く分布することが示された（３）。ＮＤＰキ
ナーゼはヌクレオシド三リン酸、多数の補酵素、ＲＮＡ
及びＤＮＡの生合成経路における主成分として細胞中で
機能している。ＮＤＰキナーゼで観察される活性は多く
の組織において比較的高い。例えば約７６単位／ｍｌ
パック化細胞のヒト赤血球でのＮＤＰキナーゼ活性は、
この細胞における最大酵素活性の１つである（４）。
【０００３】いくつかのＮＤＰキナーゼが見掛け上均一
に精製された（５、６）。ビール酵母からの酵素が結晶
化された（７）。サブユニット構造、物理化学的性質、
アミノ酸末端基及びアミノ酸組成に関する研究は酵母か
らの結晶品で行われた（９）。研究されたほとんどのＮ
ＤＰキナーゼ品は８０，０００〜１１０，０００の範囲
内の分子量を示す（３）。その酵素は多量体であるらし
い（６、９）。現在まで試験されたすべてのＮＤＰキナ
ーゼ品は必須スルフヒドリル基を含み（３）、このため
最大酵素活性にとりこれらのシステイン残基をそれらの
還元状態に保つことが必要である。すべての酵素品は二
価陽イオンに関する絶対的必要性も有し、Ｍｇ２＋及び
Ｍｎ２＋が同様の活性を有することが観察された（３）
。本酵素の本来の基質はＭｇ２＋ヌクレオチド錯体であ
る（１０）。様々な供給源からのＮＤＰキナーゼはコン
ホメーション変化を受け易いが、水銀剤による不活性化
に対してはヌクレオチド基質の添加で顕著に保護される
（３）。多数の精製操作が異なる供給源のＮＤＰキナー
ゼに関して開発された。均一品はパン酵母（１１）、子
ウシ肝臓ミトコンドリア（１２）、ヒト赤血球（１３）
及びバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ） （５）から得られた。その酵素は市販さ
れている。ウシ肝臓、ヒト赤血球又はパン酵母からの製
品は、各々１，０００、１００および２，０００〔ビウ
レット（Ｂｉｕｒｅｔ）又はローリー（Ｌｏｕｒｙ）
〕単位／ｍｇ タンパク質までの特異的活性で入手しう
る（１４）。
に精製された（５、６）。ビール酵母からの酵素が結晶
化された（７）。サブユニット構造、物理化学的性質、
アミノ酸末端基及びアミノ酸組成に関する研究は酵母か
らの結晶品で行われた（９）。研究されたほとんどのＮ
ＤＰキナーゼ品は８０，０００〜１１０，０００の範囲
内の分子量を示す（３）。その酵素は多量体であるらし
い（６、９）。現在まで試験されたすべてのＮＤＰキナ
ーゼ品は必須スルフヒドリル基を含み（３）、このため
最大酵素活性にとりこれらのシステイン残基をそれらの
還元状態に保つことが必要である。すべての酵素品は二
価陽イオンに関する絶対的必要性も有し、Ｍｇ２＋及び
Ｍｎ２＋が同様の活性を有することが観察された（３）
。本酵素の本来の基質はＭｇ２＋ヌクレオチド錯体であ
る（１０）。様々な供給源からのＮＤＰキナーゼはコン
ホメーション変化を受け易いが、水銀剤による不活性化
に対してはヌクレオチド基質の添加で顕著に保護される
（３）。多数の精製操作が異なる供給源のＮＤＰキナー
ゼに関して開発された。均一品はパン酵母（１１）、子
ウシ肝臓ミトコンドリア（１２）、ヒト赤血球（１３）
及びバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ） （５）から得られた。その酵素は市販さ
れている。ウシ肝臓、ヒト赤血球又はパン酵母からの製
品は、各々１，０００、１００および２，０００〔ビウ
レット（Ｂｉｕｒｅｔ）又はローリー（Ｌｏｕｒｙ）
〕単位／ｍｇ タンパク質までの特異的活性で入手しう
る（１４）。
【０００４】〔発明の概要〕本発明はミキソコッカス・
キサンタス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕ
ｓ）由来のヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ｎｄｋ）遺
伝子をコードする組換えＤＮＡ構造体を提供する。本発
明は大腸菌〔エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）〕におけるこの酵素の過剰産生方法も
提供する。その遺伝子のＤＮＡ配列は決定され、アミノ
酸配列が導き出された。本発明は更にＮＤＰキナーゼ活
性を有するポリペプチド及び対応リン酸化ＮＤＰキナー
ゼを提供する。
キサンタス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕ
ｓ）由来のヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ｎｄｋ）遺
伝子をコードする組換えＤＮＡ構造体を提供する。本発
明は大腸菌〔エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）〕におけるこの酵素の過剰産生方法も
提供する。その遺伝子のＤＮＡ配列は決定され、アミノ
酸配列が導き出された。本発明は更にＮＤＰキナーゼ活
性を有するポリペプチド及び対応リン酸化ＮＤＰキナー
ゼを提供する。
【０００５】〔発明の具体的な説明〕本発明はミキソコ
ッカス・キサンタス由来のＮＤＰキナーゼのクローニン
グ及び発現に関する。その遺伝子のＤＮＡ配列は決定さ
れ、遺伝子産物が大腸菌で発現された。本酵素は大腸菌
から精製され、８２４μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク
質の特異的活性を示した。５種のＧＴＰ結合タンパク質
がアジド‐ＧＴＰでのフォトアフィニティ標識によりＭ
．キサンタスから見つけられた。それらのうち２種は膜
分画中に存在し、３種は可溶性分画中に存在している。 最小１６ｋＤａ 細胞質タンパク質の産生量は発生中極
端に減少した。 このタンパク質をコードする遺伝子はクローニングされ
、そのＤＮＡ配列が決定された。遺伝子産物の生化学研
究では、それがヌクレオシド二リン酸キナーゼであるこ
とを示した。原核細胞（１５、１６）及び真核細胞（７
、１７）においてこの酵素は徹底的に研究されたが、そ
のタンパク質のアミノ酸配列のみならずその遺伝子のＤ
ＮＡ配列についても報告されたことがなかった。 他の生物からのＮＤＰキナーゼ種も本発明の範囲内に属
し、これらもアジド‐ＧＴＰでのフォトアフィニティ標
識による等の適切な操作で単離しうる。ＮＤＰキナーゼ
に関するこのような供給源としては、参考として本明細
書に組み込まれるヌクレオシドジホスホキナーゼの分布
（３）の表１で開示されるように、酵母（ビール酵母）
〔サッカロミセス・カールスバーゲネシス（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ）
〕、ヒト赤血球、大腸菌、サルモネラ・チフィムリウ
ム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）
及び他の供給源がある。
ッカス・キサンタス由来のＮＤＰキナーゼのクローニン
グ及び発現に関する。その遺伝子のＤＮＡ配列は決定さ
れ、遺伝子産物が大腸菌で発現された。本酵素は大腸菌
から精製され、８２４μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク
質の特異的活性を示した。５種のＧＴＰ結合タンパク質
がアジド‐ＧＴＰでのフォトアフィニティ標識によりＭ
．キサンタスから見つけられた。それらのうち２種は膜
分画中に存在し、３種は可溶性分画中に存在している。 最小１６ｋＤａ 細胞質タンパク質の産生量は発生中極
端に減少した。 このタンパク質をコードする遺伝子はクローニングされ
、そのＤＮＡ配列が決定された。遺伝子産物の生化学研
究では、それがヌクレオシド二リン酸キナーゼであるこ
とを示した。原核細胞（１５、１６）及び真核細胞（７
、１７）においてこの酵素は徹底的に研究されたが、そ
のタンパク質のアミノ酸配列のみならずその遺伝子のＤ
ＮＡ配列についても報告されたことがなかった。 他の生物からのＮＤＰキナーゼ種も本発明の範囲内に属
し、これらもアジド‐ＧＴＰでのフォトアフィニティ標
識による等の適切な操作で単離しうる。ＮＤＰキナーゼ
に関するこのような供給源としては、参考として本明細
書に組み込まれるヌクレオシドジホスホキナーゼの分布
（３）の表１で開示されるように、酵母（ビール酵母）
〔サッカロミセス・カールスバーゲネシス（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ）
〕、ヒト赤血球、大腸菌、サルモネラ・チフィムリウ
ム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）
及び他の供給源がある。
【０００６】本発明の遺伝子産物の生化学的特徴に基づ
き、そのタンパク質はＧＴＰのみならず他のすべてのＮ
ＴＰ及びｄＮＴＰとも結合する。しかもそれはＮＤＰ及
びｄＮＤＰと結合することができる。それにもかかわら
ず、そのタンパク質はＧＴＰ結合タンパク質中に存在す
ることが知られたＧＸＸＧＫ（残基１８〜２２）及びＤ
ＸＸＧ（残基８８〜９１）のようなある配列を含んでい
る（１８）。２配列の間隔は６５残基であって、ＧＴＰ
結合タンパク質中にみられるものともよく一致する（１
９）。しかしながら、グアニン塩基認識に関与すること
が知られたＮＫＸＤ配列はこのタンパク質で欠失してい
る。この酵素は、すべてのヌクレオシド三リン酸（ＮＴ
Ｐ）の細胞内濃度を調節しかつそれらの機能レベルを維
持する上で重要な役割を果たすと考えられている。この
ため、その遺伝子は細胞増殖に必須であるらしい。ｎｄ
ｋ遺伝子の分裂変異体は単離不能であることがわかった
。サルモネラ・チフィムリウムにおいて低温感受性ｎｄ
ｋ変異体が単離されたが（２０）、これは２０℃で増殖
しえず、温度が３７℃になった場合に増殖を再開する。 これは細胞増殖に関するｎｄｋ遺伝子の必須の役割も支
持している。
き、そのタンパク質はＧＴＰのみならず他のすべてのＮ
ＴＰ及びｄＮＴＰとも結合する。しかもそれはＮＤＰ及
びｄＮＤＰと結合することができる。それにもかかわら
ず、そのタンパク質はＧＴＰ結合タンパク質中に存在す
ることが知られたＧＸＸＧＫ（残基１８〜２２）及びＤ
ＸＸＧ（残基８８〜９１）のようなある配列を含んでい
る（１８）。２配列の間隔は６５残基であって、ＧＴＰ
結合タンパク質中にみられるものともよく一致する（１
９）。しかしながら、グアニン塩基認識に関与すること
が知られたＮＫＸＤ配列はこのタンパク質で欠失してい
る。この酵素は、すべてのヌクレオシド三リン酸（ＮＴ
Ｐ）の細胞内濃度を調節しかつそれらの機能レベルを維
持する上で重要な役割を果たすと考えられている。この
ため、その遺伝子は細胞増殖に必須であるらしい。ｎｄ
ｋ遺伝子の分裂変異体は単離不能であることがわかった
。サルモネラ・チフィムリウムにおいて低温感受性ｎｄ
ｋ変異体が単離されたが（２０）、これは２０℃で増殖
しえず、温度が３７℃になった場合に増殖を再開する。 これは細胞増殖に関するｎｄｋ遺伝子の必須の役割も支
持している。
【０００７】Ｍ．キサンタスの１６ｋＤａ ＧＴＰ結合
タンパク質が均一に精製され、生化学的に特徴付けられ
、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＰキナーゼ）で
あることが同定された。それは真核（７、１７）及び原
核（１５、１６）細胞の双方において報告された他のＮ
ＤＰキナーゼといくつかの特徴を共有している。それは
下記反応を触媒する。 Ｎ１ＴＰ＋Ｎ２ＤＰ←→Ｎ１ＤＰ＋Ｎ２ＴＰ本反応は可
逆的であって、リンタンパク質中間体と２ステップで起
きる。多量のこの中間体はＥＤＴＡ存在下でそのタンパ
ク質をＮＴＰのみとインキュベートすることにより単離
しうる。反応を完了させるためには、Ｍｇ２＋が必要で
ある。ＥＤＴＡと一緒の反応は、Ｍｇ２＋との場合より
も約２００，０００倍遅く進行する。タンパク質がＮＴ
Ｐ及びＭｇ２＋のみとインキュベートされた場合、ＮＴ
ＰはＮＤＰ及びＰｉに加水分解するが、しかしながら双
方の産物を分析することで計算された活性によれば、タ
ンパク質はＰｉよりもＮＤＰを多く放出する。これは一
部のＰｉがタンパク質に結合して留まるものの、ＮＤＰ
はすべて放出されることで説明しうる。この加水分解活
性はＥＤＴＡの存在下でも遅延化される。これらの結果
によれば、ＥＤＴＡはこのタンパク質で触媒される反応
を極端に遅延化し、リン酸化酵素の単離を可能にする。 リンタンパク質はその酵素をＮＴＰ及びＥＤＴＡと混合
した後ゲル濾過で単離することができる。
タンパク質が均一に精製され、生化学的に特徴付けられ
、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＰキナーゼ）で
あることが同定された。それは真核（７、１７）及び原
核（１５、１６）細胞の双方において報告された他のＮ
ＤＰキナーゼといくつかの特徴を共有している。それは
下記反応を触媒する。 Ｎ１ＴＰ＋Ｎ２ＤＰ←→Ｎ１ＤＰ＋Ｎ２ＴＰ本反応は可
逆的であって、リンタンパク質中間体と２ステップで起
きる。多量のこの中間体はＥＤＴＡ存在下でそのタンパ
ク質をＮＴＰのみとインキュベートすることにより単離
しうる。反応を完了させるためには、Ｍｇ２＋が必要で
ある。ＥＤＴＡと一緒の反応は、Ｍｇ２＋との場合より
も約２００，０００倍遅く進行する。タンパク質がＮＴ
Ｐ及びＭｇ２＋のみとインキュベートされた場合、ＮＴ
ＰはＮＤＰ及びＰｉに加水分解するが、しかしながら双
方の産物を分析することで計算された活性によれば、タ
ンパク質はＰｉよりもＮＤＰを多く放出する。これは一
部のＰｉがタンパク質に結合して留まるものの、ＮＤＰ
はすべて放出されることで説明しうる。この加水分解活
性はＥＤＴＡの存在下でも遅延化される。これらの結果
によれば、ＥＤＴＡはこのタンパク質で触媒される反応
を極端に遅延化し、リン酸化酵素の単離を可能にする。 リンタンパク質はその酵素をＮＴＰ及びＥＤＴＡと混合
した後ゲル濾過で単離することができる。
【０００８】精製された本発明のリン酸化ＮＤＰキナー
ゼは非常に安定である。精製されたリン酸化酵素が４５
℃、酸性ｐＨ下で約２時間インキュベートされた実験に
おいて、酵素活性は約２０％しか低下しなかった。本発
明の酵素のこれらの性質は〔γ‐３２Ｐ〕ＡＴＰがリン
酸ドナーであるγ‐３２Ｐ標識ヌクレオチドの効率的大
規模産生にとって有用であると考えられる。ＡＤＰから
３２Ｐリン酸化酵素を分離し、しかる後Ｍｇ２＋存在下
におけるリン酸化酵素とＮＤＰとを反応させると、〔γ
‐３２Ｐ〕ＮＴＰのみを産生し、汚染〔γ‐３２Ｐ〕Ａ
ＴＰは産生されない。Ｍｇ２＋存在下において中間体の
半減期は非常に短く、極少量でだけリンタンパク質が得
られる。他のＮＤＰキナーゼにおいては、リンタンパク
質がＭｇ２＋存在下でのみ単離されうることが報告され
た（３３）。
ゼは非常に安定である。精製されたリン酸化酵素が４５
℃、酸性ｐＨ下で約２時間インキュベートされた実験に
おいて、酵素活性は約２０％しか低下しなかった。本発
明の酵素のこれらの性質は〔γ‐３２Ｐ〕ＡＴＰがリン
酸ドナーであるγ‐３２Ｐ標識ヌクレオチドの効率的大
規模産生にとって有用であると考えられる。ＡＤＰから
３２Ｐリン酸化酵素を分離し、しかる後Ｍｇ２＋存在下
におけるリン酸化酵素とＮＤＰとを反応させると、〔γ
‐３２Ｐ〕ＮＴＰのみを産生し、汚染〔γ‐３２Ｐ〕Ａ
ＴＰは産生されない。Ｍｇ２＋存在下において中間体の
半減期は非常に短く、極少量でだけリンタンパク質が得
られる。他のＮＤＰキナーゼにおいては、リンタンパク
質がＭｇ２＋存在下でのみ単離されうることが報告され
た（３３）。
【０００９】このため本発明のＭ．キサンタスＮＤＰキ
ナーゼのＭｇ２＋必要性は、報告されたＮＤＰキナーゼ
の場合よりも明らかに高い。Ｍ．キサンタスＮＤＰキナ
ーゼと他のＮＤＰキナーゼとのもう１つの差異は、Ｍ．
キサンタスタンパク質が活性のの面でＤＴＴの存在を必
要としないことである。したがって、本発明のＮＤＰキ
ナーゼのアミノ酸組成はタンパク質中においてシステイ
ンの欠失を示した。このため、還元剤は従来の酵素と異
なり酵素活性にとり不必要である。このように、本発明
のＮＤＰキナーゼは独特な構造的及び生化学的特徴を有
している。
ナーゼのＭｇ２＋必要性は、報告されたＮＤＰキナーゼ
の場合よりも明らかに高い。Ｍ．キサンタスＮＤＰキナ
ーゼと他のＮＤＰキナーゼとのもう１つの差異は、Ｍ．
キサンタスタンパク質が活性のの面でＤＴＴの存在を必
要としないことである。したがって、本発明のＮＤＰキ
ナーゼのアミノ酸組成はタンパク質中においてシステイ
ンの欠失を示した。このため、還元剤は従来の酵素と異
なり酵素活性にとり不必要である。このように、本発明
のＮＤＰキナーゼは独特な構造的及び生化学的特徴を有
している。
【００１０】ヌクレオシド二リン酸キナーゼは非常に大
きなタンパク質群のようであり、それらのすべてが同様
の反応を同様の様式で触媒しうる能力を有しているが、
但しこれまでに報告されたタンパク質は互いに非常に異
なる。それらの多くは多量体であると報告されたが、サ
ブユニットの数は非常に様々である。酵母におけるタン
パク質は、各々見掛け分子量１７，３００の６サブユニ
ットからなる（３４）。ＨｅＬａ Ｓ３細胞において
それは２つの異なるサブユニットからなり、その一方は
分子量２１，０００、他方は１９，０００であるが（３
５）、腎臓における酵素は分子量２１，０００のモノマ
ー、分子量９２，０００のテトラマー又は分子量１３８
，０００のヘキサマーとして単離された（３６）。細菌
中のＮＤＰキナーゼに関して、それらはＢ．ズブチリス
（５）、サルモネラ・チフィムリウム（３７）及び大腸
菌（３３、１６、３８）のような数種の微生物で報告さ
れた。大腸菌の場合には、異なるＮＤＰキナーゼが異な
る株から発見される。大腸菌ＮＩＨ‐Ｊの場合、酵素は
各々分子量１６，０００の４サブユニットからなる（３
３）。大腸菌Ｂにおけるサブユニット分子量は５５，０
００であり（３８）、大腸菌Ｋ１０８では１１５，００
０である（１６）。Ｍ．キサンタスの場合、天然タンパ
ク質は各々分子量１６，０００の３サブユニットからな
る。これらサブユニットのアミノ酸組成は大腸菌ＮＩＨ
‐Ｊ（３３）、酵母（３４）及び哺乳動物細胞（３９）
でみられるキナーゼとは異なる。ヌクレオシド二リン酸
キナーゼ活性も大腸菌ＪＭ８３で検出されたが、そのタ
ンパク質はＭ．キサンタスでみられる場合と非常に異な
るらしい。アジド‐ＧＴＰでのフォトアフィニティ標識
により、我々は本発明のＮＤＰキナーゼの分子量１６，
０００に近い分子量のＧＴＰ結合タンパク質を大腸菌Ｊ
Ｍ８３で検出できなかった。Ｍ．キサンタスＮＤＰキナ
ーゼに対する抗血清を用いたウェスタンブロット分析で
も、これらの抗体と特異的に反応するタンパク質を大腸
菌で検出することができなかった。更に、プローブとし
てＭ．キサンタスｎｄｋ遺伝子を用いたサザンブロット
ハイブリダイゼイションにおいても、そのプローブとハ
イブリッドダイズする断片が検出できなかった。
きなタンパク質群のようであり、それらのすべてが同様
の反応を同様の様式で触媒しうる能力を有しているが、
但しこれまでに報告されたタンパク質は互いに非常に異
なる。それらの多くは多量体であると報告されたが、サ
ブユニットの数は非常に様々である。酵母におけるタン
パク質は、各々見掛け分子量１７，３００の６サブユニ
ットからなる（３４）。ＨｅＬａ Ｓ３細胞において
それは２つの異なるサブユニットからなり、その一方は
分子量２１，０００、他方は１９，０００であるが（３
５）、腎臓における酵素は分子量２１，０００のモノマ
ー、分子量９２，０００のテトラマー又は分子量１３８
，０００のヘキサマーとして単離された（３６）。細菌
中のＮＤＰキナーゼに関して、それらはＢ．ズブチリス
（５）、サルモネラ・チフィムリウム（３７）及び大腸
菌（３３、１６、３８）のような数種の微生物で報告さ
れた。大腸菌の場合には、異なるＮＤＰキナーゼが異な
る株から発見される。大腸菌ＮＩＨ‐Ｊの場合、酵素は
各々分子量１６，０００の４サブユニットからなる（３
３）。大腸菌Ｂにおけるサブユニット分子量は５５，０
００であり（３８）、大腸菌Ｋ１０８では１１５，００
０である（１６）。Ｍ．キサンタスの場合、天然タンパ
ク質は各々分子量１６，０００の３サブユニットからな
る。これらサブユニットのアミノ酸組成は大腸菌ＮＩＨ
‐Ｊ（３３）、酵母（３４）及び哺乳動物細胞（３９）
でみられるキナーゼとは異なる。ヌクレオシド二リン酸
キナーゼ活性も大腸菌ＪＭ８３で検出されたが、そのタ
ンパク質はＭ．キサンタスでみられる場合と非常に異な
るらしい。アジド‐ＧＴＰでのフォトアフィニティ標識
により、我々は本発明のＮＤＰキナーゼの分子量１６，
０００に近い分子量のＧＴＰ結合タンパク質を大腸菌Ｊ
Ｍ８３で検出できなかった。Ｍ．キサンタスＮＤＰキナ
ーゼに対する抗血清を用いたウェスタンブロット分析で
も、これらの抗体と特異的に反応するタンパク質を大腸
菌で検出することができなかった。更に、プローブとし
てＭ．キサンタスｎｄｋ遺伝子を用いたサザンブロット
ハイブリダイゼイションにおいても、そのプローブとハ
イブリッドダイズする断片が検出できなかった。
【００１１】ＮＤＰキナーゼは、それらの活性に関与す
るある保存配列をおそらく有しているのであろう。しか
しながら、他のタンパク質配列が入手しえないため、配
列の比較は行えない。ＧＴＰ結合タンパク質と類似性を
示すドメインがＭ．キサンタスＮＤＰキナーゼ中に存在
するが、それらはタンパク質の活性に関して役割を果た
しているらしい。本発明によれば、高度に精製されたＮ
ＤＰキナーゼが結晶形であっても得られることは注目す
べきである。
るある保存配列をおそらく有しているのであろう。しか
しながら、他のタンパク質配列が入手しえないため、配
列の比較は行えない。ＧＴＰ結合タンパク質と類似性を
示すドメインがＭ．キサンタスＮＤＰキナーゼ中に存在
するが、それらはタンパク質の活性に関して役割を果た
しているらしい。本発明によれば、高度に精製されたＮ
ＤＰキナーゼが結晶形であっても得られることは注目す
べきである。
【００１２】本明細書で記載されるように、本発明のリ
ン酸化ＮＤＰキナーゼは著しく安定である。したがって
、それは後の適切なリン酸アクセプターへの転移のため
に高エネルギーリン酸を“貯蔵”する中間体として役立
ちうる魅力的分子を提供する。更に詳しくは、その操作
では酵素、ここではＮＤＰキナーゼをＮＴＰとマグネシ
ウムをキレート化するＥＤＴＡ存在下（好ましくは、約
０〜２０℃のような低温）で混合し、こうしてγ‐３２
ＰをＮＴＰからキナーゼに転移させることで、その酵素
をリン酸化させる。このリン酸化生成物は高度に安定で
あって、簡単な濾過（例えば、セファデックスカラム）
のような慣用的操作で残留ＮＴＰから分離される。この
生成物は貯蔵してもよく、ホスホリル基をいずれか他の
適切なＮＤＰに転移させるための供給源として有用であ
る。例えば、リン酸化される新鮮ＮＤＰはマグネシウム
存在下でリン酸化キナーゼと混合してもよく、ホスホリ
ル基はＮＤＰに転移されてＮＴＰを生じる。このため、
ＣＤＰからＣＴＰのようにいかなる選択ＮＤＰであって
もリン酸化しうる。勿論、特異的ＮＤＰキナーゼに必要
であることが知られているＭｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２
＋又はＺｎ２＋のような他の二価陽イオンもＭｇ２＋に
代わり用いてよい。前記操作は従来の操作よりも著しく
簡単である。下記例は説明のみの目的であって、本発明
の範囲の制限として示されているのではない。
ン酸化ＮＤＰキナーゼは著しく安定である。したがって
、それは後の適切なリン酸アクセプターへの転移のため
に高エネルギーリン酸を“貯蔵”する中間体として役立
ちうる魅力的分子を提供する。更に詳しくは、その操作
では酵素、ここではＮＤＰキナーゼをＮＴＰとマグネシ
ウムをキレート化するＥＤＴＡ存在下（好ましくは、約
０〜２０℃のような低温）で混合し、こうしてγ‐３２
ＰをＮＴＰからキナーゼに転移させることで、その酵素
をリン酸化させる。このリン酸化生成物は高度に安定で
あって、簡単な濾過（例えば、セファデックスカラム）
のような慣用的操作で残留ＮＴＰから分離される。この
生成物は貯蔵してもよく、ホスホリル基をいずれか他の
適切なＮＤＰに転移させるための供給源として有用であ
る。例えば、リン酸化される新鮮ＮＤＰはマグネシウム
存在下でリン酸化キナーゼと混合してもよく、ホスホリ
ル基はＮＤＰに転移されてＮＴＰを生じる。このため、
ＣＤＰからＣＴＰのようにいかなる選択ＮＤＰであって
もリン酸化しうる。勿論、特異的ＮＤＰキナーゼに必要
であることが知られているＭｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２
＋又はＺｎ２＋のような他の二価陽イオンもＭｇ２＋に
代わり用いてよい。前記操作は従来の操作よりも著しく
簡単である。下記例は説明のみの目的であって、本発明
の範囲の制限として示されているのではない。
【００１３】例１
Ｍ．キサンタスにおけるＧＴＰ結合タンパク質の決定〔
γ‐３２Ｐ〕８‐Ｎ３ＧＴＰ（８‐アジド‐ＧＴＰ）で
のフォトアフィニティ標識をＮｏｒｔｈｒｕｐ ｅｔ
ａｌ． （２１）に記載された方法の修正法により行っ
た。音波処理で得た全膜及び可溶性分画（タンパク質４
０μｇ）をｐＨ８の２０ｍＭヘペス（Ｈｅｐｅｓ） 緩
衝液、１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌ及び０．１
％ルブロールＰＸ（Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ） 含有緩衝液
中で〔γ‐３２Ｐ〕８‐Ｎ３ＧＴＰ（１５Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ ）２μＣｉと混合し、４℃で１０分間インキュベー
トしてタンパク質を８‐Ｎ３ＧＴＰに結合させた。次い
でサンプルに距離１ｃｍで５分間短波ＵＶ光を照射した
。ｐＨ６．８の８０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）ＨＣｌ、２
％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．２Ｍ２‐メルカプ
トエタノール及び０．０２５％ブロモフェノールブルー
含有溶液１０μＬを加えて反応を停止させた。沸騰水浴
中で３分間インキュベート後、サンプルを１７．５％Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル上にのせた（２２）。ゲル
を乾燥し、コダック（Ｋｏｄａｋ） ＸＡＲ５フィルム
に−７０℃で１６時間露出させた。一部のケースではゲ
ルを乾燥前にクマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルーで
染色した。このアナログの使用で、Ｍ．キサンタスはＧ
ＴＰと結合する少なくとも５種のタンパク質を有するこ
とが判明した（図１）。それらのうち見掛け分子量５９
，０００及び５０，０００の２種は膜分画（列１）に位
置し、一方他の３種（Ｍｒ４２，０００、４０，０００
及び１５，５００）は可溶性分画（列２）でみられる。 最小可溶性ＧＴＰ結合タンパク質は１６ｋＤａ ＧＴＰ
結合タンパク質と称される。オートラジオグラムの列２
でみられる他の弱いバンドは遊離光分解８‐アジド‐Ｇ
ＴＰとタンパク質との非特異的反応により生じているの
であろう。このパターンは大腸菌で観察される場合と著
しく異なり、大腸菌の場合では弱いバンドが膜分画（列
３）で検出され、約７つのバンドが可溶性分画（列４）
でみられる。
γ‐３２Ｐ〕８‐Ｎ３ＧＴＰ（８‐アジド‐ＧＴＰ）で
のフォトアフィニティ標識をＮｏｒｔｈｒｕｐ ｅｔ
ａｌ． （２１）に記載された方法の修正法により行っ
た。音波処理で得た全膜及び可溶性分画（タンパク質４
０μｇ）をｐＨ８の２０ｍＭヘペス（Ｈｅｐｅｓ） 緩
衝液、１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌ及び０．１
％ルブロールＰＸ（Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ） 含有緩衝液
中で〔γ‐３２Ｐ〕８‐Ｎ３ＧＴＰ（１５Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ ）２μＣｉと混合し、４℃で１０分間インキュベー
トしてタンパク質を８‐Ｎ３ＧＴＰに結合させた。次い
でサンプルに距離１ｃｍで５分間短波ＵＶ光を照射した
。ｐＨ６．８の８０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）ＨＣｌ、２
％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．２Ｍ２‐メルカプ
トエタノール及び０．０２５％ブロモフェノールブルー
含有溶液１０μＬを加えて反応を停止させた。沸騰水浴
中で３分間インキュベート後、サンプルを１７．５％Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル上にのせた（２２）。ゲル
を乾燥し、コダック（Ｋｏｄａｋ） ＸＡＲ５フィルム
に−７０℃で１６時間露出させた。一部のケースではゲ
ルを乾燥前にクマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルーで
染色した。このアナログの使用で、Ｍ．キサンタスはＧ
ＴＰと結合する少なくとも５種のタンパク質を有するこ
とが判明した（図１）。それらのうち見掛け分子量５９
，０００及び５０，０００の２種は膜分画（列１）に位
置し、一方他の３種（Ｍｒ４２，０００、４０，０００
及び１５，５００）は可溶性分画（列２）でみられる。 最小可溶性ＧＴＰ結合タンパク質は１６ｋＤａ ＧＴＰ
結合タンパク質と称される。オートラジオグラムの列２
でみられる他の弱いバンドは遊離光分解８‐アジド‐Ｇ
ＴＰとタンパク質との非特異的反応により生じているの
であろう。このパターンは大腸菌で観察される場合と著
しく異なり、大腸菌の場合では弱いバンドが膜分画（列
３）で検出され、約７つのバンドが可溶性分画（列４）
でみられる。
【００１４】例２
ＮＤＰキナーゼ（１６ｋＤａ ＧＴＰ結合タンパク質）
をコードする遺伝子のクローニング及び配列決定１６ｋ
Ｄａ ＧＴＰ結合タンパク質をコードする遺伝子をクロ
ーニングするため、タンパク質を最初に精製し、そのア
ミノ末端配列を決定した。細胞をＣＹＥ培地で増殖され
たミキソコッカス・キサンタスＤＺＦ１の１Ｌ培養物か
ら回収し（２３）、ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．７の１０ｍＭ
トリスＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）１０ｍｌに再懸濁した
。音波処理後、サンプルを１００，０００×ｇで４０分
間遠心し、上澄を同緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥセル
ロース〔ＤＥ５２，ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ） 〕
カラムにのせた。流動分画は１６ｋＤａ タンパク質を
含有していたが、これを８‐アジド‐ＧＴＰと架橋させ
るフォトアフィニティで検出した。これら分画の一部を
１７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上におき、分
離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜〔ミリポア（Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ） 〕にブロットした。クマシーブルーで染
色後、そのタンパク質に相当するバンドを切出し、約３
００ｐｍｏｌを配列決定に用いた。 配列は１２０オンラインＰＴＨアミノ酸アナライザー及
び９００Ａコントロール／データ分析モジュール装備ア
プライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．） ４７０Ａタンパク質シー
クエンサーで得た。クロマトグラムを記録し、ＡＢＩ４
７５Ａレポート作成機を用いてサンプル結果を計算した
。
をコードする遺伝子のクローニング及び配列決定１６ｋ
Ｄａ ＧＴＰ結合タンパク質をコードする遺伝子をクロ
ーニングするため、タンパク質を最初に精製し、そのア
ミノ末端配列を決定した。細胞をＣＹＥ培地で増殖され
たミキソコッカス・キサンタスＤＺＦ１の１Ｌ培養物か
ら回収し（２３）、ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．７の１０ｍＭ
トリスＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）１０ｍｌに再懸濁した
。音波処理後、サンプルを１００，０００×ｇで４０分
間遠心し、上澄を同緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥセル
ロース〔ＤＥ５２，ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ） 〕
カラムにのせた。流動分画は１６ｋＤａ タンパク質を
含有していたが、これを８‐アジド‐ＧＴＰと架橋させ
るフォトアフィニティで検出した。これら分画の一部を
１７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上におき、分
離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜〔ミリポア（Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ） 〕にブロットした。クマシーブルーで染
色後、そのタンパク質に相当するバンドを切出し、約３
００ｐｍｏｌを配列決定に用いた。 配列は１２０オンラインＰＴＨアミノ酸アナライザー及
び９００Ａコントロール／データ分析モジュール装備ア
プライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．） ４７０Ａタンパク質シー
クエンサーで得た。クロマトグラムを記録し、ＡＢＩ４
７５Ａレポート作成機を用いてサンプル結果を計算した
。
【００１５】こうして得られた配列はＡ‐Ｉ‐Ｅ‐Ｘ‐
Ｔ‐Ｌ‐Ｓ‐Ｉ‐Ｉ‐Ｋ‐Ｐ‐Ｄ‐Ｇ‐Ｌ‐Ｅ‐Ｋ‐Ｇ
‐Ｖ‐Ｉ‐Ｇ（Ｘは未同定アミノ酸である）である（更
に下記参照）。この配列に従い、配列ＡＴＣＡＴＣＡＡ
ＧＣＣＸＧＡＣＧＧＸＣＴＸＧＡＹＡＡＧ（ＸはＣ又は
Ｇのいずれかを表し、ＹはＡ又はＧを表す）を有する２
７−ｍｅｒ縮重オリゴヌクレオチドを合成した。これら
のオリゴヌクレオチドは８位のイソロイシンから１６位
のリジン残基までの９残基配列に相当する。Ｍ．キサン
タス染色体ＤＮＡ及びバクテリオファージλで製造され
たＭ．キサンタスゲノムライブラリーの制限切断をスク
リーニングするためにそのオリゴヌクレオチドプローブ
を用いた。
Ｔ‐Ｌ‐Ｓ‐Ｉ‐Ｉ‐Ｋ‐Ｐ‐Ｄ‐Ｇ‐Ｌ‐Ｅ‐Ｋ‐Ｇ
‐Ｖ‐Ｉ‐Ｇ（Ｘは未同定アミノ酸である）である（更
に下記参照）。この配列に従い、配列ＡＴＣＡＴＣＡＡ
ＧＣＣＸＧＡＣＧＧＸＣＴＸＧＡＹＡＡＧ（ＸはＣ又は
Ｇのいずれかを表し、ＹはＡ又はＧを表す）を有する２
７−ｍｅｒ縮重オリゴヌクレオチドを合成した。これら
のオリゴヌクレオチドは８位のイソロイシンから１６位
のリジン残基までの９残基配列に相当する。Ｍ．キサン
タス染色体ＤＮＡ及びバクテリオファージλで製造され
たＭ．キサンタスゲノムライブラリーの制限切断をスク
リーニングするためにそのオリゴヌクレオチドプローブ
を用いた。
【００１６】Ｍ．キサンタスの染色体ＤＮＡ及びλファ
ージＤＮＡを前記方法で製造した（２４、２５）。数種
の制限酵素で切断後、断片を０．７％アガロースゲルに
溶解し、サザンブロット分析のためニトロセルロースフ
ィルターに移した。ファージプラークを接触によりニト
ロセルロースフィルターにブロットした。Ｍ．キサンタ
スコロニーを３ＭＭワットマン紙上で増殖させ、フィル
ターを前記のように処理した（２６）。
ージＤＮＡを前記方法で製造した（２４、２５）。数種
の制限酵素で切断後、断片を０．７％アガロースゲルに
溶解し、サザンブロット分析のためニトロセルロースフ
ィルターに移した。ファージプラークを接触によりニト
ロセルロースフィルターにブロットした。Ｍ．キサンタ
スコロニーを３ＭＭワットマン紙上で増殖させ、フィル
ターを前記のように処理した（２６）。
【００１７】オリゴヌクレオチドプローブをニックトラ
ンスレーションによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（
２６）及び二本鎖ＤＮＡで標識した（２５）。オリゴヌ
クレオチドとのハイブリッド形成を前記条件下５０％ホ
ルミアミド中５５℃及び４２℃でニックトランスレート
化ＤＮＡと行った（２５、２６）。図２で示されるよう
に、単一断片のみがプローブとして２７−ｍｅｒオリゴ
ヌクレオチドを用いたサザンブロット分析で染色体ＤＮ
Ａの各切断毎に検出された。各列は下記サンプルを含ん
でいた：列１，ＢａｍＨＩで切断；列２，ＢａｍＨＩ及
びＥｃｏＲＩで切断；列３，ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ
ＩＩ で切断；列４，ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断；
列５，ＰｓｔＩで切断；列６，ＳａｌＩで切断；列７，
ＸｈｏＩで切断。約３μｇのＤＮＡを各列においた。
ンスレーションによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（
２６）及び二本鎖ＤＮＡで標識した（２５）。オリゴヌ
クレオチドとのハイブリッド形成を前記条件下５０％ホ
ルミアミド中５５℃及び４２℃でニックトランスレート
化ＤＮＡと行った（２５、２６）。図２で示されるよう
に、単一断片のみがプローブとして２７−ｍｅｒオリゴ
ヌクレオチドを用いたサザンブロット分析で染色体ＤＮ
Ａの各切断毎に検出された。各列は下記サンプルを含ん
でいた：列１，ＢａｍＨＩで切断；列２，ＢａｍＨＩ及
びＥｃｏＲＩで切断；列３，ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ
ＩＩ で切断；列４，ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断；
列５，ＰｓｔＩで切断；列６，ＳａｌＩで切断；列７，
ＸｈｏＩで切断。約３μｇのＤＮＡを各列においた。
【００１８】λファージで作成されたＭ．キサンタスゲ
ノムライブラリー（２７）を遺伝子の存在についてスク
リーニングするために用いた。試験された９６０プラー
クのうち、５つがオリゴヌクレオチドプローブとハイブ
リッド形成することがわかった。陽性クローンのうち１
つを更に用いて、ＤＮＡを単離した。ＸｈｏＩ切断で得
られた３．７ｋｂ断片を精製し、ポリリンカー領域に唯
一のＸｈｏＩ部位を含むｐＵＣ８の誘導体ｐＵＸに組込
んでサブクローニングした（２８）。こうして得られた
プラスミドはｐＪＭ５Ｃ２と命名した。プローブとして
クローン化ＤＮＡ断片を用い、Ｍ．キサンタスＮＤＰキ
ナーゼ（ｎｄｋ）遺伝子を含む９．６ｋｂ断片の制限地
図を図３で示されるように確立した。２７−ｍｅｒオリ
ゴヌクレオチドプローブは６５０ｂｐＰｓｔＩ（ｂ）‐
ＰｓｔＩ（ｃ）断片とハイブリッド形成した。次いで、
７８９ｂｐＡｌｕＩ断片をｐＵＣ９に組込んでクローニ
ングし、７‐デアザＧＴＰを用いたチェインターミネー
ション法（２０）で配列決定した。オープン読取り枠（
ＯＲＦ）は図４で示されるようにこの断片でみつかった
。ＯＲＦは８８位の開始コドンから始まる１４５アミノ
酸残基のポリペプチドをコードする。２位のアラニンか
ら２１位のグリシン残基までのアミノ末端配列は、現在
アルギニンと同定されている未同定残基Ｘを除き精製さ
れたタンパク質の場合と同一である。
ノムライブラリー（２７）を遺伝子の存在についてスク
リーニングするために用いた。試験された９６０プラー
クのうち、５つがオリゴヌクレオチドプローブとハイブ
リッド形成することがわかった。陽性クローンのうち１
つを更に用いて、ＤＮＡを単離した。ＸｈｏＩ切断で得
られた３．７ｋｂ断片を精製し、ポリリンカー領域に唯
一のＸｈｏＩ部位を含むｐＵＣ８の誘導体ｐＵＸに組込
んでサブクローニングした（２８）。こうして得られた
プラスミドはｐＪＭ５Ｃ２と命名した。プローブとして
クローン化ＤＮＡ断片を用い、Ｍ．キサンタスＮＤＰキ
ナーゼ（ｎｄｋ）遺伝子を含む９．６ｋｂ断片の制限地
図を図３で示されるように確立した。２７−ｍｅｒオリ
ゴヌクレオチドプローブは６５０ｂｐＰｓｔＩ（ｂ）‐
ＰｓｔＩ（ｃ）断片とハイブリッド形成した。次いで、
７８９ｂｐＡｌｕＩ断片をｐＵＣ９に組込んでクローニ
ングし、７‐デアザＧＴＰを用いたチェインターミネー
ション法（２０）で配列決定した。オープン読取り枠（
ＯＲＦ）は図４で示されるようにこの断片でみつかった
。ＯＲＦは８８位の開始コドンから始まる１４５アミノ
酸残基のポリペプチドをコードする。２位のアラニンか
ら２１位のグリシン残基までのアミノ末端配列は、現在
アルギニンと同定されている未同定残基Ｘを除き精製さ
れたタンパク質の場合と同一である。
【００１９】開始コドンより８塩基上流の配列ＧＧＡＧ
はリボソーム結合部位であるらしい。塩基６１２〜６３
１の安定的二次構造は、サルサー（Ｓａｌｓｅｒ）（３
０）に従い計算される−６．０ｋｃａｌのΔＧで形成す
ることができる。この配列の後にＴＴＴ（６６０‐６６
２）が続くが、それはターミネーターとして機能するの
であろう。 ｎｄｋ遺伝子の終結コドン後に３つの異なる開始コドン
が存在し、それらはいずれも新しいオープン読取り枠を
開始しないようであるが、これは終結コドンが非常に近
いか（ＡＴＧ５４０‐５４２はコドンＴＡＧ６２４‐６
２６で終わる）又はコドン用法が他のＭ．キサンタス遺
伝子で観察される場合と非常に異なるためのいずれかで
ある（３１）。
はリボソーム結合部位であるらしい。塩基６１２〜６３
１の安定的二次構造は、サルサー（Ｓａｌｓｅｒ）（３
０）に従い計算される−６．０ｋｃａｌのΔＧで形成す
ることができる。この配列の後にＴＴＴ（６６０‐６６
２）が続くが、それはターミネーターとして機能するの
であろう。 ｎｄｋ遺伝子の終結コドン後に３つの異なる開始コドン
が存在し、それらはいずれも新しいオープン読取り枠を
開始しないようであるが、これは終結コドンが非常に近
いか（ＡＴＧ５４０‐５４２はコドンＴＡＧ６２４‐６
２６で終わる）又はコドン用法が他のＭ．キサンタス遺
伝子で観察される場合と非常に異なるためのいずれかで
ある（３１）。
【００２０】例３
大腸菌内における遺伝子の発現
完全遺伝子を含む７８９ｂｐＡｌｕＩ断片を唯一のＳｍ
ａＩ部位でｐＵＣ９に組込みクローニングして、その遺
伝子をｌａｃＺプロモーターの下流に挿入した。ｐＪＭ
５Ｃ２Ａと命名されるこのプラスミドで形質転換された
大腸菌ＪＭ８３をアンピシリン含有ＬＢ培地で増殖させ
た。その細胞を音波処理で破壊し、膜及び可溶性分画を
遠心で分離した。約３０μｇの可溶性分画を８‐アジド
‐ＧＴＰでのフォトアフィニティ標識後にＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動で分析した。ゲルをクマシー
ブルーで染色し（Ａ部）、しかる後乾燥し、−７０℃で
１６時間Ｘ線フィルムに露出させた（Ｂ部）。各列は下
記サンプルを含んでいた：列１，Ｍ．キサンタスＤＺＦ
１；列２，プラスミドｐＪＭ５Ｃ２Ａ含有大腸菌ＪＭ８
３；列３，大腸菌ＪＭ８３。新しいバンドは図５の列２
で示されるように分子量１５，５００でＳＤＳポリアク
リルアミドゲル中に出現したが、これは未形質転換細胞
で観察されなかった（列３）。新しいタンパク質の見掛
け分子量は図４におけるＯＲＦの計算分子量（１６，０
０２）とよく一致する。多量の遺伝子産物はｐＪＭ５Ｃ
２Ａ保有大腸菌ＪＭ８３がＬＢ培地で増殖された場合に
産生されたが、これは可溶性分画中における全タンパク
質の１３％に当たる（図５の列２参照）。大腸菌内にお
けるこのタンパク質の過剰産生は、Ｌブロス寒天プレー
ト上での細胞増殖及びコロニー形態にいかなる影響も示
さなかった。
ａＩ部位でｐＵＣ９に組込みクローニングして、その遺
伝子をｌａｃＺプロモーターの下流に挿入した。ｐＪＭ
５Ｃ２Ａと命名されるこのプラスミドで形質転換された
大腸菌ＪＭ８３をアンピシリン含有ＬＢ培地で増殖させ
た。その細胞を音波処理で破壊し、膜及び可溶性分画を
遠心で分離した。約３０μｇの可溶性分画を８‐アジド
‐ＧＴＰでのフォトアフィニティ標識後にＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動で分析した。ゲルをクマシー
ブルーで染色し（Ａ部）、しかる後乾燥し、−７０℃で
１６時間Ｘ線フィルムに露出させた（Ｂ部）。各列は下
記サンプルを含んでいた：列１，Ｍ．キサンタスＤＺＦ
１；列２，プラスミドｐＪＭ５Ｃ２Ａ含有大腸菌ＪＭ８
３；列３，大腸菌ＪＭ８３。新しいバンドは図５の列２
で示されるように分子量１５，５００でＳＤＳポリアク
リルアミドゲル中に出現したが、これは未形質転換細胞
で観察されなかった（列３）。新しいタンパク質の見掛
け分子量は図４におけるＯＲＦの計算分子量（１６，０
０２）とよく一致する。多量の遺伝子産物はｐＪＭ５Ｃ
２Ａ保有大腸菌ＪＭ８３がＬＢ培地で増殖された場合に
産生されたが、これは可溶性分画中における全タンパク
質の１３％に当たる（図５の列２参照）。大腸菌内にお
けるこのタンパク質の過剰産生は、Ｌブロス寒天プレー
ト上での細胞増殖及びコロニー形態にいかなる影響も示
さなかった。
【００２１】アジド‐ＧＴＰと架橋させるフォトアフィ
ニティをｐＪＭ５Ｃ２Ａ保有大腸菌ＪＭ８３の可溶性分
画で行った場合、図６の列２で示されるように別個の放
射性バンドが図５の列２で確認された新しいバンドと同
様の位置に出現した。このバンドはプラスミドｐＪＭ５
Ｃ２Ａのないコントロール細胞で観察されなかった（図
６の列３）。これらの結果は、プラスミドｐＪＭ５Ｃ２
Ａ中の７８９ｂｐＡｌｕＩ断片からの遺伝子産物がＧＴ
Ｐと結合しうることを明らかに証明している。図６の列
１で示されるようにＭ．キサンタス抽出物中の放射性バ
ンドがｐＪＭ５Ｃ２Ａ保有大腸菌ＪＭ８３で検出される
バンド（図６の列２）と同様の位置で観察されることに
着目すべきである。このバンドに相当する主バンドは図
５の列１で示されるクマシーブルー染色ゲル中に観察さ
れるが、これはＧＴＰ結合タンパク質がＭ．キサンタス
中の主可溶性タンパク質であることを示し、全細胞タン
パク質の約２％に当る。これは約３００，０００分子／
細胞に相当する。Ｍ．キサンタス細胞が栄養に枯渇した
場合にこのタンパク質の量が有意に減少したことは注目
に値する。
ニティをｐＪＭ５Ｃ２Ａ保有大腸菌ＪＭ８３の可溶性分
画で行った場合、図６の列２で示されるように別個の放
射性バンドが図５の列２で確認された新しいバンドと同
様の位置に出現した。このバンドはプラスミドｐＪＭ５
Ｃ２Ａのないコントロール細胞で観察されなかった（図
６の列３）。これらの結果は、プラスミドｐＪＭ５Ｃ２
Ａ中の７８９ｂｐＡｌｕＩ断片からの遺伝子産物がＧＴ
Ｐと結合しうることを明らかに証明している。図６の列
１で示されるようにＭ．キサンタス抽出物中の放射性バ
ンドがｐＪＭ５Ｃ２Ａ保有大腸菌ＪＭ８３で検出される
バンド（図６の列２）と同様の位置で観察されることに
着目すべきである。このバンドに相当する主バンドは図
５の列１で示されるクマシーブルー染色ゲル中に観察さ
れるが、これはＧＴＰ結合タンパク質がＭ．キサンタス
中の主可溶性タンパク質であることを示し、全細胞タン
パク質の約２％に当る。これは約３００，０００分子／
細胞に相当する。Ｍ．キサンタス細胞が栄養に枯渇した
場合にこのタンパク質の量が有意に減少したことは注目
に値する。
【００２２】例４
ｎｄｋ遺伝子産物の精製
タンパク質を４ステップで均一に精製した。第一ステッ
プは可溶性分画の調製であった。プラスミドｐＪＭ５Ｃ
２Ａ保有大腸菌ＪＭ８３の３リットル培養物を５０μｇ
／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地（３２）で中間対数相
まで増殖させた。細胞を４℃、４，０００×ｇで２０分
間の遠心により回収し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．７の１０
ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）３０ｍｌに再懸濁
し、音波処理で破壊した。細胞砕片を４℃、４，０００
×ｇｒｐｍで５分間遠心除去し、膜分画を１００，００
０×ｇで４０分間の遠心により可溶性分画から分離した
。第二ステップでは、上澄をＤＥＡＥセルロースクロマ
トグラフィーに付した。ＤＥＡＥセルロース（ＤＥ５２
，ワットマン）カラム（２．５×１４ｃｍ）をＴＥ緩衝
液で平衡化し、可溶性分画２３ｍｌをのせた。次いでカ
ラムをＴＥ緩衝液１００ｍｌで洗浄した。１６ｋＤａ
タンパク質を洗液で溶出させた。流動相中の分画をＳＤ
Ｓ‐ＰＡＧＥで分析し（２２）、１６ｋＤａ ＧＴＰ結
合タンパク質含有分画をプールした。
プは可溶性分画の調製であった。プラスミドｐＪＭ５Ｃ
２Ａ保有大腸菌ＪＭ８３の３リットル培養物を５０μｇ
／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地（３２）で中間対数相
まで増殖させた。細胞を４℃、４，０００×ｇで２０分
間の遠心により回収し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．７の１０
ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）３０ｍｌに再懸濁
し、音波処理で破壊した。細胞砕片を４℃、４，０００
×ｇｒｐｍで５分間遠心除去し、膜分画を１００，００
０×ｇで４０分間の遠心により可溶性分画から分離した
。第二ステップでは、上澄をＤＥＡＥセルロースクロマ
トグラフィーに付した。ＤＥＡＥセルロース（ＤＥ５２
，ワットマン）カラム（２．５×１４ｃｍ）をＴＥ緩衝
液で平衡化し、可溶性分画２３ｍｌをのせた。次いでカ
ラムをＴＥ緩衝液１００ｍｌで洗浄した。１６ｋＤａ
タンパク質を洗液で溶出させた。流動相中の分画をＳＤ
Ｓ‐ＰＡＧＥで分析し（２２）、１６ｋＤａ ＧＴＰ結
合タンパク質含有分画をプールした。
【００２３】第三ステップでは、硫酸アンモニウムをタ
ンパク質含有分画に４５％飽和まで加えた。混合液を氷
上で２時間保ち、沈降物を４℃、２１，０００×ｇで１
０分間の遠心により回収し、ＴＥ緩衝液２００μＬに溶
解した。上澄に硫酸アンモニウムを６５％飽和まで加え
た。混合液を４℃で一夜保った。沈降物を遠心回収し、
ＴＥ緩衝液１ｍｌに溶解した。溶液を遠心して不溶性物
質を除去し、しかる後上澄をｐＨ７．７の１０ｍＭトリ
スＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌ（ＴＥ
Ｎ緩衝液）２リットルに対して一夜透析した。緩衝液を
２回交換した。最終ステップでは、透析された溶液（１
．４ｍｌ）をＴＥＮ緩衝液で平衡化されたセファデック
スＧ‐１００含有カラム（１．５×７２ｃｍ）にのせた
。サンプルを同一緩衝液で溶出させた。分画をＳＤＳ‐
ＰＡＧＥで分析し、１６ｋＤａ タンパク質含有分画を
プールし、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）濃縮器で３．４ｍ
ｌまで濃縮した。天然タンパク質の分子量を評価するた
め、セファデックスＧ‐１００カラムを標準としてブル
ーデキストラン（Ｍｒ＝２，０００，０００）、ウシ血
清アルブミン（Ｍｒ＝６６，０００）、オボアルブミン
（Ｍｒ＝４５，０００）、炭酸脱水酵素（Ｍｒ＝３１，
０００）及びチトクロームｃ（Ｍｒ＝１２，４００）に
より較正した。
ンパク質含有分画に４５％飽和まで加えた。混合液を氷
上で２時間保ち、沈降物を４℃、２１，０００×ｇで１
０分間の遠心により回収し、ＴＥ緩衝液２００μＬに溶
解した。上澄に硫酸アンモニウムを６５％飽和まで加え
た。混合液を４℃で一夜保った。沈降物を遠心回収し、
ＴＥ緩衝液１ｍｌに溶解した。溶液を遠心して不溶性物
質を除去し、しかる後上澄をｐＨ７．７の１０ｍＭトリ
スＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌ（ＴＥ
Ｎ緩衝液）２リットルに対して一夜透析した。緩衝液を
２回交換した。最終ステップでは、透析された溶液（１
．４ｍｌ）をＴＥＮ緩衝液で平衡化されたセファデック
スＧ‐１００含有カラム（１．５×７２ｃｍ）にのせた
。サンプルを同一緩衝液で溶出させた。分画をＳＤＳ‐
ＰＡＧＥで分析し、１６ｋＤａ タンパク質含有分画を
プールし、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）濃縮器で３．４ｍ
ｌまで濃縮した。天然タンパク質の分子量を評価するた
め、セファデックスＧ‐１００カラムを標準としてブル
ーデキストラン（Ｍｒ＝２，０００，０００）、ウシ血
清アルブミン（Ｍｒ＝６６，０００）、オボアルブミン
（Ｍｒ＝４５，０００）、炭酸脱水酵素（Ｍｒ＝３１，
０００）及びチトクロームｃ（Ｍｒ＝１２，４００）に
より較正した。
【００２４】図７の結果はタンパク質の精製について示
している。各列は下記サンプルを含んでいた：列１，大
腸菌音波処理物の可溶性分画；列２，ＤＥＡＥ‐セルロ
ースカラム流動物；列３，硫酸アンモニウム沈降物；列
４，プールされた濃縮Ｇ‐１００カラム溶出物。イオン
交換クロマトグラフィー後、１６ｋＤａタンパク質が主
タンパク質になり、純度約７０％である（図７，列２）
。 硫酸アンモニウムで分別後、タンパク質は純度約９８％
であった（図７，列３）。次いで副汚染タンパク質を図
７の列４で示されるようにセファデックスＧ‐１００に
よるゲル濾過でほぼ完全に除去した。最終回収率は約３
０％であった（表１）。
している。各列は下記サンプルを含んでいた：列１，大
腸菌音波処理物の可溶性分画；列２，ＤＥＡＥ‐セルロ
ースカラム流動物；列３，硫酸アンモニウム沈降物；列
４，プールされた濃縮Ｇ‐１００カラム溶出物。イオン
交換クロマトグラフィー後、１６ｋＤａタンパク質が主
タンパク質になり、純度約７０％である（図７，列２）
。 硫酸アンモニウムで分別後、タンパク質は純度約９８％
であった（図７，列３）。次いで副汚染タンパク質を図
７の列４で示されるようにセファデックスＧ‐１００に
よるゲル濾過でほぼ完全に除去した。最終回収率は約３
０％であった（表１）。
【００２５】
表１
大腸菌で過
剰産生されるＭ．キサンタスヌクレオシド二リン酸キナ
ーゼの精製
タンパク質 全活性＊ 容量 特
異的活性＊ 精製 サンプル
ｍｇ／ｍｌ μｍｏｌ／ｍｉ
ｎ ｍｌ μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ 倍率
タンパク質 粗抽出物
１１．５
１５３４１ ２３ ５８
１ ＤＥＡＥセルロース
０．５２ １３２９８
３８ ６７３ １１
．６ ６５％ 硫酸アンモニウム ５．
２ ５６０６ １．４
７７０ １３ セファデックス
Ｇ−１００ １．６５ ４
６２３ ３．４ ８２４
１４ ＊〔γ‐３２Ｐ〕ＡＴＰをリン酸ド
ナーとして用い、ＧＤＰをアクセプターとして用いた。
表１
大腸菌で過
剰産生されるＭ．キサンタスヌクレオシド二リン酸キナ
ーゼの精製
タンパク質 全活性＊ 容量 特
異的活性＊ 精製 サンプル
ｍｇ／ｍｌ μｍｏｌ／ｍｉ
ｎ ｍｌ μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ 倍率
タンパク質 粗抽出物
１１．５
１５３４１ ２３ ５８
１ ＤＥＡＥセルロース
０．５２ １３２９８
３８ ６７３ １１
．６ ６５％ 硫酸アンモニウム ５．
２ ５６０６ １．４
７７０ １３ セファデックス
Ｇ−１００ １．６５ ４
６２３ ３．４ ８２４
１４ ＊〔γ‐３２Ｐ〕ＡＴＰをリン酸ド
ナーとして用い、ＧＤＰをアクセプターとして用いた。
【００２６】１．６５ｍｇ／ｍｌタンパク質を含有した
このサンプルから、２‐メチル‐２，４‐ペンタンジオ
ールを最終濃度６０％（ｖ／ｖ） まで加えて結晶を得
ることができる。結晶化はタンパク質と有機溶媒との一
夜インキュベート後に室温で起きた。天然タンパク質の
分子量をセファデックスＧ‐１００でサイズ排除により
評価したところ、このタンパク質は分子量５０，０００
のタンパク質に相当する溶出容量で溶出することがわか
ったが、これはタンパク質が複合体を形成していること
を示している。タンパク質の分子量はＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲルから約１５，５００と評価されたため、こ
れらのデータはこのタンパク質が細胞内でトリマーとし
て存在することを示している。精製操作をＥＤＴＡなし
で繰返したが、これは本発明で必須ではない。このため
、その操作は結晶タンパク質の高収率のためには本質的
に４ステップ操作からなる。
このサンプルから、２‐メチル‐２，４‐ペンタンジオ
ールを最終濃度６０％（ｖ／ｖ） まで加えて結晶を得
ることができる。結晶化はタンパク質と有機溶媒との一
夜インキュベート後に室温で起きた。天然タンパク質の
分子量をセファデックスＧ‐１００でサイズ排除により
評価したところ、このタンパク質は分子量５０，０００
のタンパク質に相当する溶出容量で溶出することがわか
ったが、これはタンパク質が複合体を形成していること
を示している。タンパク質の分子量はＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲルから約１５，５００と評価されたため、こ
れらのデータはこのタンパク質が細胞内でトリマーとし
て存在することを示している。精製操作をＥＤＴＡなし
で繰返したが、これは本発明で必須ではない。このため
、その操作は結晶タンパク質の高収率のためには本質的
に４ステップ操作からなる。
【００２７】例５
ヌクレオシド二リン酸キナーゼ活性の証明ＮＤＰキナー
ゼ活性は、タンパク質が１つのヌクレオシド三リン酸か
ら他のヌクレオシド二リン酸にγ‐リン酸を転移させう
ることを証明することで確認した。この目的のため、〔
γ‐３２Ｐ〕ＡＴＰをリン酸ドナーとして用い、数種の
ヌクレオシド二リン酸をアクセプターとして用いた。活
性は緩衝液（ｐＨ８の１００ｍＭヘペスＮａ、２００ｍ
ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＭｇＣｌ２）５μｌを２０ｍＭＡ
ＴＰ１μｌ、〔γ‐３２Ｐ〕ＡＴＰ１μｌ（１０μＣｉ
，＞５，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ ）、１０ｍＭＮＤＰ２
μｌ及び酵素製剤１μｌ（純粋タンパク質が用いられた
場合１．６ｎｇ）と混合することで測定した。３０℃で
１０分間インキュベート後、反応混合液１μｌを５ｍＭ
ＥＤＴＡ１０μｌと混合し、この最終混合液１μｌをＰ
ＥＩ‐セルロースプレート上にのせた。薄層クロマトグ
ラフィーをｐＨ３．６５の０．７５ＭＫＨ２ＰＯ４で行
った。乾燥後、プレートをコダックＸＡＲ‐５フィルム
に２時間露出させ、ヌクレオシド二リン酸及び三リン酸
に相当するスポットを切出し、各スポットの放射能を定
量した。結果は図８で示されている。下記ヌクレオシド
二リン酸を用いた：列１，ＧＤＰ；列２，ｄＧＤＰ；列
３，ＣＤＰ；列４，ｄＣＤＰ；列５，ＵＤＰ；列６，Ｔ
ＤＰ。列Ｃのコントロールは〔γ‐３２Ｐ〕ＡＴＰ、Ｇ
ＤＰを含有していたが、タンパク質は含有されていない
。その結果によれば、そのタンパク質はＮＴＰを生成し
うるかについて試験されるすべてのＮＤＰにＡＴＰから
γ‐リン酸を転移させることができた。Ｐｉは放出され
なかったことは注目されるべきである。計算された特異
的活性は用いられたすべてのヌクレオシドと同様であっ
た（８９０±９０μｍｏｌ ＮＴＰ／ｍｉｎ／ｍｇ タ
ンパク質）。
ゼ活性は、タンパク質が１つのヌクレオシド三リン酸か
ら他のヌクレオシド二リン酸にγ‐リン酸を転移させう
ることを証明することで確認した。この目的のため、〔
γ‐３２Ｐ〕ＡＴＰをリン酸ドナーとして用い、数種の
ヌクレオシド二リン酸をアクセプターとして用いた。活
性は緩衝液（ｐＨ８の１００ｍＭヘペスＮａ、２００ｍ
ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＭｇＣｌ２）５μｌを２０ｍＭＡ
ＴＰ１μｌ、〔γ‐３２Ｐ〕ＡＴＰ１μｌ（１０μＣｉ
，＞５，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ ）、１０ｍＭＮＤＰ２
μｌ及び酵素製剤１μｌ（純粋タンパク質が用いられた
場合１．６ｎｇ）と混合することで測定した。３０℃で
１０分間インキュベート後、反応混合液１μｌを５ｍＭ
ＥＤＴＡ１０μｌと混合し、この最終混合液１μｌをＰ
ＥＩ‐セルロースプレート上にのせた。薄層クロマトグ
ラフィーをｐＨ３．６５の０．７５ＭＫＨ２ＰＯ４で行
った。乾燥後、プレートをコダックＸＡＲ‐５フィルム
に２時間露出させ、ヌクレオシド二リン酸及び三リン酸
に相当するスポットを切出し、各スポットの放射能を定
量した。結果は図８で示されている。下記ヌクレオシド
二リン酸を用いた：列１，ＧＤＰ；列２，ｄＧＤＰ；列
３，ＣＤＰ；列４，ｄＣＤＰ；列５，ＵＤＰ；列６，Ｔ
ＤＰ。列Ｃのコントロールは〔γ‐３２Ｐ〕ＡＴＰ、Ｇ
ＤＰを含有していたが、タンパク質は含有されていない
。その結果によれば、そのタンパク質はＮＴＰを生成し
うるかについて試験されるすべてのＮＤＰにＡＴＰから
γ‐リン酸を転移させることができた。Ｐｉは放出され
なかったことは注目されるべきである。計算された特異
的活性は用いられたすべてのヌクレオシドと同様であっ
た（８９０±９０μｍｏｌ ＮＴＰ／ｍｉｎ／ｍｇ タ
ンパク質）。
【００２８】他のヌクレオシド二リン酸キナーゼの２つ
の特徴は、それらが触媒する反応が可逆的であること及
び反応がリン酸化タンパク質中間体の形成に関して２ス
テップのピンポンメカニズムであることである（４０、
４１、３７、３９）。Ｍ．キサンタスヌクレオシド二リ
ン酸キナーゼの反応の可逆性は、ドナーとしてＡＴＰ及
びアクセプターとしてＧＤＰを用いた経時的実験で確認
した。反応混合液は前記緩衝液中に１．６ｎｇタンパク
質、２０ｍＭ〔γ‐３２Ｐ〕ＡＴＰ（０．５Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌ ）及び２０ｍＭＧＤＰを含有していた。０、１０
、２０、３０、４０、５０及び６０分間のインキュベー
ト後、反応混合液１μｌを５ｍＭＥＤＴＡ１０μｌに移
し、１μｌをＰＥＩ‐セルロースプレート上にのせた。 プレートをｐＨ３．６５の０．７５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４
でクロマトグラフィーに付した。プレートをＸ線フィル
ムに−７０℃で２時間露出させ、ＡＴＰ及びＧＴＰに相
当するスポットを切出し、放射能を測定した。
の特徴は、それらが触媒する反応が可逆的であること及
び反応がリン酸化タンパク質中間体の形成に関して２ス
テップのピンポンメカニズムであることである（４０、
４１、３７、３９）。Ｍ．キサンタスヌクレオシド二リ
ン酸キナーゼの反応の可逆性は、ドナーとしてＡＴＰ及
びアクセプターとしてＧＤＰを用いた経時的実験で確認
した。反応混合液は前記緩衝液中に１．６ｎｇタンパク
質、２０ｍＭ〔γ‐３２Ｐ〕ＡＴＰ（０．５Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌ ）及び２０ｍＭＧＤＰを含有していた。０、１０
、２０、３０、４０、５０及び６０分間のインキュベー
ト後、反応混合液１μｌを５ｍＭＥＤＴＡ１０μｌに移
し、１μｌをＰＥＩ‐セルロースプレート上にのせた。 プレートをｐＨ３．６５の０．７５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４
でクロマトグラフィーに付した。プレートをＸ線フィル
ムに−７０℃で２時間露出させ、ＡＴＰ及びＧＴＰに相
当するスポットを切出し、放射能を測定した。
【００２９】結果（図９）は、ＡＴＰ及びＧＤＰのモル
比が１：１である場合に、双方のヌクレオシド三リン酸
の濃度がほぼ等しくなるまでＧＴＰの合成量が時間と共
に増加することを示している。しかる後、ＡＴＰ及びＧ
ＴＰ双方の量に関する変化は観察されなかった。同様の
結果は、他のヌクレオシド三リン酸がリン酸ドナーとし
て用いられた場合に得られた。酵素で触媒されるリン酸
転移は２ステップで起きる。その結果は図１０で示され
ている。タンパク質（１．６μｇ）を全容量２０μｌの
１ｍＭＥＤＴＡ含有緩衝液中〔γ‐３２Ｐ〕ＡＴＰ２０
μＣｉと共に氷上で１０分間インキュベートして、タン
パク質をリン酸化した（図９の列１参照）。サンプルを
同一緩衝液に対し３０分間透析して遊離ＡＴＰを除去し
（図９の列２参照）、リン酸化タンパク質（１０μｌ）
を２０ｍＭＭｇＣｌ２１０μｌに移し、３０℃で１０分
間インキュベートした。各ステップにおいて、１μｌを
５ｍＭＥＤＴＡ１０μｌに移し、１μｌをＰＥＩ‐セル
ロースプレート上にのせた。クロマトグラフィー後、プ
レートをＸ線フィルムに−７０℃で２時間露出させた。
比が１：１である場合に、双方のヌクレオシド三リン酸
の濃度がほぼ等しくなるまでＧＴＰの合成量が時間と共
に増加することを示している。しかる後、ＡＴＰ及びＧ
ＴＰ双方の量に関する変化は観察されなかった。同様の
結果は、他のヌクレオシド三リン酸がリン酸ドナーとし
て用いられた場合に得られた。酵素で触媒されるリン酸
転移は２ステップで起きる。その結果は図１０で示され
ている。タンパク質（１．６μｇ）を全容量２０μｌの
１ｍＭＥＤＴＡ含有緩衝液中〔γ‐３２Ｐ〕ＡＴＰ２０
μＣｉと共に氷上で１０分間インキュベートして、タン
パク質をリン酸化した（図９の列１参照）。サンプルを
同一緩衝液に対し３０分間透析して遊離ＡＴＰを除去し
（図９の列２参照）、リン酸化タンパク質（１０μｌ）
を２０ｍＭＭｇＣｌ２１０μｌに移し、３０℃で１０分
間インキュベートした。各ステップにおいて、１μｌを
５ｍＭＥＤＴＡ１０μｌに移し、１μｌをＰＥＩ‐セル
ロースプレート上にのせた。クロマトグラフィー後、プ
レートをＸ線フィルムに−７０℃で２時間露出させた。
【００３０】第一ステップでは、タンパク質はヌクレオ
シド三リン酸と結合し、そのタンパク質は自動リン酸化
する（図１０の列１）。第二ステップでは、リン酸化タ
ンパク質は他のヌクレオシド二リン酸と結合し、しかる
後リン酸基はタンパク質から結合ヌクレオシド二リン酸
に移り、新しいヌクレオシド三リン酸を生じる（図１０
の列３）。図１０の列１で示されるように、リンタンパ
ク質はＥＤＴＡ存在下でそのタンパク質をＡＴＰとイン
キュベートすることにより安定的に得られる。リンタン
パク質は透析によって遊離ＡＴＰから分離できる（図１
０の列２）。次いでリンタンパク質がＣＤＰ及びＭｇ２
＋と混合された場合には、〔γ‐３２Ｐ〕ＧＴＰが合成
される（図１０の列３）。これらの結果は、本発明のタ
ンパク質がヌクレオシド二リン酸キナーゼであることを
証明している。
シド三リン酸と結合し、そのタンパク質は自動リン酸化
する（図１０の列１）。第二ステップでは、リン酸化タ
ンパク質は他のヌクレオシド二リン酸と結合し、しかる
後リン酸基はタンパク質から結合ヌクレオシド二リン酸
に移り、新しいヌクレオシド三リン酸を生じる（図１０
の列３）。図１０の列１で示されるように、リンタンパ
ク質はＥＤＴＡ存在下でそのタンパク質をＡＴＰとイン
キュベートすることにより安定的に得られる。リンタン
パク質は透析によって遊離ＡＴＰから分離できる（図１
０の列２）。次いでリンタンパク質がＣＤＰ及びＭｇ２
＋と混合された場合には、〔γ‐３２Ｐ〕ＧＴＰが合成
される（図１０の列３）。これらの結果は、本発明のタ
ンパク質がヌクレオシド二リン酸キナーゼであることを
証明している。
【００３１】本発明のＮＤＰキナーゼは形質転換された
大腸菌内で発現されることがここでは示されているが、
これはそれで研究することが非常に好都合だからである
。ＮＤＰキナーゼが他の適切な形質転換宿主で発現可能
であることも本発明の範囲内に属し、それは形質転換し
やすい細菌のような他の微生物であってもよい。このよ
うな細菌としては腸内細菌科、例えば大腸菌株、サルモ
ネラ属、バチルス科、例えばバチルス・ズブチリス、ニ
ューモコッカス属、ストレプトコッカス属及びヘモフィ
ラス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）がある。酵母及び哺乳動物細胞の
ような真核細胞も使用可能である。適切な微生物（及び
ベクター）はメリーランド州ロックビル２０８５２のア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション〔Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）〕を含めた公共機関から入手しう
る。
大腸菌内で発現されることがここでは示されているが、
これはそれで研究することが非常に好都合だからである
。ＮＤＰキナーゼが他の適切な形質転換宿主で発現可能
であることも本発明の範囲内に属し、それは形質転換し
やすい細菌のような他の微生物であってもよい。このよ
うな細菌としては腸内細菌科、例えば大腸菌株、サルモ
ネラ属、バチルス科、例えばバチルス・ズブチリス、ニ
ューモコッカス属、ストレプトコッカス属及びヘモフィ
ラス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）がある。酵母及び哺乳動物細胞の
ような真核細胞も使用可能である。適切な微生物（及び
ベクター）はメリーランド州ロックビル２０８５２のア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション〔Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）〕を含めた公共機関から入手しう
る。
【００３２】〔参考文献〕１．Ｂｅｒｇ，Ｐ．ａｎｄ
Ｊｏｋｌｉｋ，Ｗ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，１７２，１０
０８（１９５３）．２．Ｋｒｅｂｓ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ
Ｈｅｍｓ，Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ，１２，１７２（１９５３）． ３．Ｐａｒｋｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｊｒ．ａｎｄ Ａｇａｒｗ
ａｌ，Ｒ．Ｐ．，ｉｎ ”Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ”，
Ｖｏｌｕｍｅ ＶＩＩＩ，３ ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ
Ｂｏｙｅｒ，Ｐ．Ｄ．，ｐｐ．３０８−３１２，Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７３
．４．Ａｇａｒｗａｌ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０，１３４１（１
９７１）． ５．Ｓｅｄｍａｋ，Ｊ．ａｎｄ Ｒａｍａｌｅｙ，Ｒ．
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６，５３６５（１９
７１）． ６．Ｅｄｌｕｎｄ，Ｂ．，Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａ
ｎｄ．，２５，１３７０（１９７１）．７．Ｒａｔｌｉ
ｆｆ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，２３９，３０１（１９６４）．８．Ｙｕｅ，Ｒ．Ｈ
．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６，２９
２３（１９６７）．９．Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｒ．ｅｔ
ａｌ．，Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．Ｆｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ
．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，２９，Ａ９１４（１９７０）．
１０．Ｃｏｌｏｍｂ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，８，１９２６（１９６９）．１１．
Ｅｄｌｕｎｄ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，９，４５１（１９６９）．１２．Ｇｌａ
ｚｅ，Ｒ．Ｐ．ａｎｄ Ｗａｄｋｉｎｓ，Ｃ．Ｌ．，Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２，２１３９（１９６７
）． １３．Ａｇａｒｗａｌ，Ｒ．Ｐ．ａｎｄ Ｐａｒｋｓ，
Ｒ．Ｅ．，Ｊｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６
，２２５６（１９７１）． １４．Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ
Ｃａｔａｌｏｇ，ｐ．１０７３（１９８８）．１５．
Ｇｉｎｔｈｅｒ，Ｃ．Ｌ． ａｎｄ Ｉｎｇｒａｈａｍ
，Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４９，３４
０６（１９７４）． １６．Ｒｏｉｓｉｎ，Ｍ．Ｐ．ａｎｄ Ｋｅｐｅｓ，Ａ
．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５２
６，４１８（１９７８）． １７．Ｍｏｕｒａｄ，Ｎ． ａｎｄ Ｐａｒｋ，Ｒ．Ｅ
．Ｊｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４１，２７１
（１９６６）． １８．ＭｃＣｏｒｗｉｃｋ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２３０，７８（１９８５）．１９．Ｄｅｖｅ
ｒ，Ｔ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１８１４（１９８７）． ２０．Ｇｉｎｔｈｅｒ，Ｃ．Ｌ． ａｎｄ Ｉｎｇｒａ
ｈａｍ，Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１８
，１０２０（１９７４）． ２１．Ｎｏｒｔｈｒｕｐ，Ｊ．Ｋ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，２５７，１１４１６（１９８２）．２２．Ｉ
ｎｏｕｙｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，
６８，５７９（１９７９）．２３．Ｃａｍｐｏｓ，Ｊ．
Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１９，
１６７（１９７８）．２４．Ａｖｅｒｙ，Ｌ． ａｎｄ
Ｋａｉｓｅｒ，Ｄ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．
，１９１，９９（１９８３）． ２５．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，”Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１
９８２） ２６．Ｉｎｏｕｙｅ，Ｓ．ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ，Ｍ．
，”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ”，Ｎａｒａｎｇ
，Ｓ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒ
ｌａｎｄｏ，ＦＬ（１９８７）． ２７．Ｈｓｕ，Ｍ．−Ｙ．ｅｔ ａｌ．，ｕｎｐｕｂｌ
ｉｓｈｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ．２８．Ｉｎｏｕｙｅ，Ｓ
．，ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ．２９．
Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７
７）． ３０．Ｓａｌｓｅｒ，Ｗ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，１
３，９８５（１９７７）． ３１．Ｉｎｏｕｙｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５
６，７０９（１９８９）．３２．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ
．ｅｔ ａｌ．，”Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７２） ３３．Ｏｈｔｓｕｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｉｎｔ．，８，７１５（１９８４）．３４．Ｐａ
ｌｍｉｅｒｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，２４８，４４８６（１９７３）．３５．Ｏｈｔ
ｓｕｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１
９６，１４５（１９８６）．３６．Ｈｏｓｓｌｅｒ，Ｆ
．Ｅ．ａｎｄ Ｒｅｎｄｉ，Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，４３，５３０（
１９７１）．３７．Ｇｉｎｔｈｅｒ，Ｃ．Ｌ． ａｎｄ
Ｉｎｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２４９，３４０６（１９７４）． ３８．Ｓａｅｋｉ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．，７６，６２３（１９７４）．３９．Ｒｏｂｉｎ
ｓｏｎ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２５６，１０７６９（１９８１）． ４０．Ｍｏｕｒａｄ．Ｎ．ａｎｄ Ｐａｒｋｓ，Ｒ．Ｅ
．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍｕｎ，１９，３１２（１９６５）．４１．Ｗａｌｉｎ
ｄｅｒ，Ｏ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３，３
９４７（１９６８）．
Ｊｏｋｌｉｋ，Ｗ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，１７２，１０
０８（１９５３）．２．Ｋｒｅｂｓ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ
Ｈｅｍｓ，Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ，１２，１７２（１９５３）． ３．Ｐａｒｋｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｊｒ．ａｎｄ Ａｇａｒｗ
ａｌ，Ｒ．Ｐ．，ｉｎ ”Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ”，
Ｖｏｌｕｍｅ ＶＩＩＩ，３ ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ
Ｂｏｙｅｒ，Ｐ．Ｄ．，ｐｐ．３０８−３１２，Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７３
．４．Ａｇａｒｗａｌ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０，１３４１（１
９７１）． ５．Ｓｅｄｍａｋ，Ｊ．ａｎｄ Ｒａｍａｌｅｙ，Ｒ．
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６，５３６５（１９
７１）． ６．Ｅｄｌｕｎｄ，Ｂ．，Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａ
ｎｄ．，２５，１３７０（１９７１）．７．Ｒａｔｌｉ
ｆｆ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，２３９，３０１（１９６４）．８．Ｙｕｅ，Ｒ．Ｈ
．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６，２９
２３（１９６７）．９．Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｒ．ｅｔ
ａｌ．，Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．Ｆｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ
．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，２９，Ａ９１４（１９７０）．
１０．Ｃｏｌｏｍｂ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，８，１９２６（１９６９）．１１．
Ｅｄｌｕｎｄ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，９，４５１（１９６９）．１２．Ｇｌａ
ｚｅ，Ｒ．Ｐ．ａｎｄ Ｗａｄｋｉｎｓ，Ｃ．Ｌ．，Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２，２１３９（１９６７
）． １３．Ａｇａｒｗａｌ，Ｒ．Ｐ．ａｎｄ Ｐａｒｋｓ，
Ｒ．Ｅ．，Ｊｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６
，２２５６（１９７１）． １４．Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ
Ｃａｔａｌｏｇ，ｐ．１０７３（１９８８）．１５．
Ｇｉｎｔｈｅｒ，Ｃ．Ｌ． ａｎｄ Ｉｎｇｒａｈａｍ
，Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４９，３４
０６（１９７４）． １６．Ｒｏｉｓｉｎ，Ｍ．Ｐ．ａｎｄ Ｋｅｐｅｓ，Ａ
．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５２
６，４１８（１９７８）． １７．Ｍｏｕｒａｄ，Ｎ． ａｎｄ Ｐａｒｋ，Ｒ．Ｅ
．Ｊｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４１，２７１
（１９６６）． １８．ＭｃＣｏｒｗｉｃｋ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２３０，７８（１９８５）．１９．Ｄｅｖｅ
ｒ，Ｔ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１８１４（１９８７）． ２０．Ｇｉｎｔｈｅｒ，Ｃ．Ｌ． ａｎｄ Ｉｎｇｒａ
ｈａｍ，Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１８
，１０２０（１９７４）． ２１．Ｎｏｒｔｈｒｕｐ，Ｊ．Ｋ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，２５７，１１４１６（１９８２）．２２．Ｉ
ｎｏｕｙｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，
６８，５７９（１９７９）．２３．Ｃａｍｐｏｓ，Ｊ．
Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１９，
１６７（１９７８）．２４．Ａｖｅｒｙ，Ｌ． ａｎｄ
Ｋａｉｓｅｒ，Ｄ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．
，１９１，９９（１９８３）． ２５．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，”Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１
９８２） ２６．Ｉｎｏｕｙｅ，Ｓ．ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ，Ｍ．
，”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ”，Ｎａｒａｎｇ
，Ｓ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒ
ｌａｎｄｏ，ＦＬ（１９８７）． ２７．Ｈｓｕ，Ｍ．−Ｙ．ｅｔ ａｌ．，ｕｎｐｕｂｌ
ｉｓｈｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ．２８．Ｉｎｏｕｙｅ，Ｓ
．，ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ．２９．
Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７
７）． ３０．Ｓａｌｓｅｒ，Ｗ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，１
３，９８５（１９７７）． ３１．Ｉｎｏｕｙｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５
６，７０９（１９８９）．３２．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ
．ｅｔ ａｌ．，”Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７２） ３３．Ｏｈｔｓｕｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｉｎｔ．，８，７１５（１９８４）．３４．Ｐａ
ｌｍｉｅｒｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，２４８，４４８６（１９７３）．３５．Ｏｈｔ
ｓｕｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１
９６，１４５（１９８６）．３６．Ｈｏｓｓｌｅｒ，Ｆ
．Ｅ．ａｎｄ Ｒｅｎｄｉ，Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，４３，５３０（
１９７１）．３７．Ｇｉｎｔｈｅｒ，Ｃ．Ｌ． ａｎｄ
Ｉｎｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２４９，３４０６（１９７４）． ３８．Ｓａｅｋｉ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．，７６，６２３（１９７４）．３９．Ｒｏｂｉｎ
ｓｏｎ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２５６，１０７６９（１９８１）． ４０．Ｍｏｕｒａｄ．Ｎ．ａｎｄ Ｐａｒｋｓ，Ｒ．Ｅ
．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍｕｎ，１９，３１２（１９６５）．４１．Ｗａｌｉｎ
ｄｅｒ，Ｏ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３，３
９４７（１９６８）．
【図１】Ｍ．キサンタスにおけるＧＴＰ結合タンパク質
の検出について示す。
の検出について示す。
【図２】Ｍ．キサンタス染色体ＤＮＡと２７−ｍｅｒオ
リゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼイション
について示す。
リゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼイション
について示す。
【図３】ヌクレオシド二リン酸キナーゼ遺伝子を含んだ
Ｍ．キサンタス断片の制限地図について示す。
Ｍ．キサンタス断片の制限地図について示す。
【図４】Ｍ．キサンタスヌクレオシド二リン酸キナーゼ
遺伝子のヌクレオチド配列及びその導き出されたアミノ
酸配列について示す。
遺伝子のヌクレオチド配列及びその導き出されたアミノ
酸配列について示す。
【図５】大腸菌ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
（染色）におけるＭ．キサンタスｎｄｋ遺伝子の発現に
ついて示す。
（染色）におけるＭ．キサンタスｎｄｋ遺伝子の発現に
ついて示す。
【図６】乾燥されかつＸ線フィルムに露出された図５を
同じのゲルについて示している。
同じのゲルについて示している。
【図７】Ｍ．キサンタスヌクレオシド二リン酸キナーゼ
の精製について示す。
の精製について示す。
【図８】その酵素のヌクレオシド二リン酸キナーゼ活性
について示す。
について示す。
【図９】その酵素で触媒されるγ‐リン酸転移の可逆性
について示す。
について示す。
【図１０】ＡＴＰ及びＧＤＰからＧＴＰの２ステップ合
成について示す。
成について示す。
Claims (16)
- 【請求項１】ポリペプチドがシステイン残基を含んでい
ない、ＮＤＰキナーゼ活性を有するポリペプチド。 - 【請求項２】活性が少なくとも８００μｍｏｌ／ｍｉｎ
／ｍｇタンパク質である、請求項１に記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項３】ポリペプチドが１６，０００のサブユニッ
ト分子量を有し、ＧＴＰと結合する、請求項２に記載の
ポリペプチド。 - 【請求項４】ポリペプチドが１６，０００のサブユニッ
ト分子量を有する、請求項３に記載のポリペプチド。 - 【請求項５】下記アミノ酸配列： 【化１】及びその機能同等配列を有する、請求項１に記
載のポリペプチド。 - 【請求項６】ポリペプチドがリン酸化されている、ＮＤ
Ｐキナーゼ活性を有するポリペプチド。 - 【請求項７】少なくとも８００μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ
タンパク質のＮＤＰキナーゼ活性及び１６，０００のサ
ブユニット分子量を有する、請求項６に記載のリン酸化
ポリペプチド。 - 【請求項８】４５℃、酸性ｐＨで２時間インキュベート
された場合に酵素活性の約８０％を維持している、請求
項７に記載のリン酸化ポリペプチド。 - 【請求項９】マグネシウムのキレート化剤の存在下でＮ
ＤＰキナーゼをＮＴＰと反応させてそれにより安定的リ
ン酸化ＮＴＰキナーゼを得、いかなる残留ＮＴＰも分離
し、マグネシウムの存在下で上記リン酸化酵素をＮＤＰ
と混合してそれによりＮＴＰを産生することを特徴とす
る、ＮＤＰのリン酸化方法。 - 【請求項１０】ＮＤＰがＣＤＰであり、生成物がＣＴＰ
である、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】ヌクレオシド二リン酸キナーゼに関する
遺伝子をコードする、組換えＤＮＡ構造体。 - 【請求項１２】原核細胞ヌクレオシド二リン酸キナーゼ
をコードする、請求項１１に記載の構造体。 - 【請求項１３】ミキソコッカス・キサンタスのヌクレオ
シド二リン酸キナーゼをコードする、請求項１２に記載
の構造体。 - 【請求項１４】請求項１１記載の構造体を含む、形質転
換宿主。 - 【請求項１５】宿主が大腸菌である、請求項１４に記載
の形質転換宿主。 - 【請求項１６】ヌクレオシド二リン酸キナーゼ活性を発
現しうるポリペプチドをコードする下記ヌクレオチド配
列及びその機能同等ヌクレオチド配列を有する、単離Ｄ
ＮＡ配列。 【化２】
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US45860689A | 1989-12-29 | 1989-12-29 | |
| US458606 | 1999-12-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04271786A true JPH04271786A (ja) | 1992-09-28 |
Family
ID=23821432
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP41597490A Pending JPH04271786A (ja) | 1989-12-29 | 1990-12-28 | ヌクレオシド二リン酸キナーゼをコードする組換えｄｎａ構造体及びその産物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04271786A (ja) |
-
1990
- 1990-12-28 JP JP41597490A patent/JPH04271786A/ja active Pending
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