JPH04254752A - 電気泳動キャピラリ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、一般に、キャピラリ・
ゾーン電気泳動に関し、特にその場で（ｉｎｓｉｔｕ）
試料前処理を行なうための電気泳動分離に有用なキャピ
ラリ管に関するものである。

【０００２】

【従来技術とその問題点】口径の小さいキャピラリ中で
のキャピラリ・ゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は、次の文献
で最初に示され、ある特定の小さな溶質を分離するため
の効率的な方法として有用であることが実証されている
。Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，２１８（１９８１）２０
９；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（１９８１）１２９８
参照．ＣＺＥでは、溶質を含む電解質が導入されるキャ
ピラリ管の両端部間に電界を印加する。電界によって電
界質は管の中を流れる。ある溶質は他の溶質よりも高い
界面動電移動度（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ　　ｍ
ｏｂｉｌｉｌｔｉｅｓ）を有するので、試料成分は電界
質がキャピラリ管中を流れる間にキャピラリ管内のゾー
ンに分解する。

【０００３】ＣＺＥの魅力的な要因は小さい試料サイズ
、高分離能、自動化および生物学的活性試料の定量化と
回収（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）の可能性を含んでいる。例え
ば、米国特許第４，６７５，３００号では、レーザー励
起蛍光検出器を使用した界面動電的分離プロセスの理論
および装置が開示されている。ここで開示されているシ
ステムは、７５μｍの内径を有するフェーズド・シリカ
・キャピラリを備えている。ＣＺＥは、例えばアミノ酸
、タンパク質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、薬剤等の
広範囲な物質についての多くの分析に使用されている。

【０００４】以下の文献では、タンパク質の分離に関す
る問題が報告されている。ほとんどのタンパク質は、フ
ェーズド・シリカ・キャピラリおよびホウケイ酸ガラス
・キャピラリのどちらの表面にも著しい吸着を示すこと
が明らかにされている。このような吸着は、二つの望ま
しくない点でエレクトロフェログラムに影響を及ぼすと
結論を出している。第１に、このような吸着はブロード
で非対称の「テーリング」ゾーンを導く。第２に、キャ
ピラリ表面を変える吸着タンパク質は、通常、電気浸透
流を著しく減少させ、そして、注入を繰り返し行なうこ
とにより、全ての試料ゾーンについて予期しない移動を
導く。Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２（１９８３）、２６６参
照。

【０００５】Ａｎａ１．Ｃｈｅｍ．，５８（１９８６）
１６６では、タンパク質とシリカ・キャピラリのキャピ
ラリ壁におけるクーロン反発力によってキャピラリ壁へ
のタンパク質の吸着傾向を克服する可能性があると報告
されている。タンパク質の等電点（ｐＩ）に対して溶液
のｐＨを変化させてそれらの実効電荷を変えるモデル・
タンパク質（分子量が１３，０００〜７７，０００の範
囲）の分離が実証されている。管璧とタンパク質の吸着
を回避するための他の幾つかのアプローチは、極めて低
いｐＨ値を与えていることにより、シラノール基の大部
分はプロトン化され、壁上の電荷が小さい結果となるこ
と；シラノール基をシールドするために中性の親水性部
分で壁を化学処理することである。Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，１８５（１９９０）５１；Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒ．，４８０（１９８９），３３９；Ｊ．Ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒ．，４７１（１９８９），４２９；Ａｎ
ａｌ．Ｃｈｅｍ．，６０（１９８８），２３２２；Ｊ．
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，３４７（１９８５），１９１
参照。

【０００６】ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）からの
陰イオン性ミセルの使用によってキャピラリ電気泳動の
選択性制御の増加が実現されている。このアプローチは
ｐＨ７の緩衡液中で塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオ
チドを分離するために用いられている。操作におけるｐ
Ｈでは、塩基およびヌクレオシドは変化しないので、分
離はミセル内部における異なる分配の結果である。そし
て、化学種がより疎水性であれば、分配係数がより大き
く保持力（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）がより大きい。オリゴ
ヌクレオチドは負に荷電しており、ＳＤＳミセルなしに
分離することができるが、時間ウインドウが狭くて錯体
混合物の分離が制限されてしまう。低濃度の２価金属お
よびＳＤＳミセルの組合せは、時間ウインドウの著しい
向上とオリゴヌクレオチドの良好な分離をもたらす。金
属イオンはミセルの表面に静電気的に引きつけられ、ミ
セルの表面と共にオリゴヌクレオチドの異なる金属錯体
は錯体混合物の分離を導く。Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，５
９（１９８７），１０２１参照。

【０００７】複雑なマトリクス中の化学種の従来からの
分析では、試料を部分的に清浄し、妨害物を取除くため
の抽出または沈殿などの前処理ステップが要求される。 Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，４２６（１９８８），１
２９参照。しかしながら、前処理は、分析時間を長くし
、分析における汚染と溶質の不注意な損失の可能性が大
きくなる。

【０００８】

【発明の目的】本発明の目的は、溶質の電気泳動分離に
有用なポリマー・ゲル・フィルターをキャピラリに設け
て、分析の前に溶質から妨害物をフィルターによって除
去することを可能にすることである。本発明の他の目的
は、巨大分子の流れを連続的に分析、すなわち小さな溶
質の分析に続いて大きな溶質の分析が可能となるように
遅らせる重合架橋結合が調節可能なポリマー・ゲル・フ
ィルターをキャピラリに設けることにある。本発明のさ
らに他の目的は、少なくとも部分的に電荷の差異に基づ
く迅速な電気泳動分離に有用であり、実質的に定量結果
を得ることができるキャピラリを提供することにある。 本発明の他の目的および利点は、以下の詳細な説明によ
り当業者にとって自明のことである。

【０００９】

【発明の概要】本発明では、溶質の電気泳動分離に有用
なキャピラリは、試料が注入される管の端部付近に設け
られたポリアクリルアミド・ゲル・フィルターを有する
。フィルターの長さ、ゲル濃度およびその架橋度合によ
ってフィルターのふるい分け特性が決定される。ゲル濃
度と架橋度合が高いほど、フィルターの透過性はより低
くなる。例えば、フィルターは妨害物をすべて除去する
ために使用される。代わりに、ある特定の溶質を遅らせ
るためにのみ使用することも可能である。よって巨大分
子の分析以前に小さな溶質の連続分析を可能とする。 本実施例においては、キャピラリのフリー・ゾーン（ｆ
ｒｅｅ　　ｚｏｎｅ）はポリスチレン・フリットによっ
てゲル・フィルターから分離される。

【００１０】本発明に用いられるキャピラリ管は、最初
にキャピラリ管内でポリスチレンを溶融し、溶融物を冷
却し、そして多孔性のフリットを生成することによって
調整することが好ましい。次に、３−アクリロキシプロ
ピルメトキシシランなどのシリル化剤をフリットの一方
の側の内側管にコーティングする。次にキャピラリ管を
ヘリウムで洗浄し、シリル化剤をキャピラリ管の壁上に
硬化させる。最後に、シリル化剤がコーティングされた
管の同じ側にポリアクリルアミドを設置し、このポリマ
ーをゲル化する。

【００１１】

【発明の実施例】キャピラリ・ゾーン電気泳動（ＣＺＥ
）に有益な小口径のキャピラリ管は、通常、約５００μ
ｍ以下であり、しばしば２００μｍ以下の口径を有して
いる。本発明に用いられる典型的な口径は、約７５μｍ
から約５００μｍまでのもので、さらに一般的には約７
５μｍから２００μｍの範囲のものである。本発明にお
いては、キャピラリ管は第１と第２の部分に画定され、
第２部分を通る小さい口径が備えられている。第１部分
は、分子量によって分子をふるい分ける（ｓｉｅｖｉｎ
ｇ）手段を含むと同時に第２部分は、電荷による分子の
分離（従来よりＣＺＥで実施されている）を可能にする
のに十分な構造をしている。第１および第２部分は隣接
しているので、分離中に試料を伴う流体は第１の部分か
ら第２の部分に容易に流れる。

【００１２】以下に詳述するように、本発明は分析対象
の試料の電気泳動キャピラリ内で行なわれる（その場で
行なわれる）前処理（ｉｎｓｉｔｕ　　ｐｒｅｔｒｅａ
ｔｍｅｎｔ）を提供し、これにより、分析誤差をしばし
ば増大させる面倒なオフライン（ｏｆｆ−ｌｉｎｅ）前
処理の必要を除去する。さらに、試料から妨害物をろ過
することは別として、本発明では巨大分子の流れを遅ら
せるためにも使用することができる。これにより、小さ
い溶質がまず導入（そして分析し）、次に大きな溶質が
続いて導入される連続的に行なわれる分析のため、第２
部分に溶質を導入する手段が備えられる。

【００１３】好適な一実施例において、中空のキャピラ
リ管（ｏｐｅｎ−ｃａｐｉｌｌａｒｙ）の前端部に設け
られたポリアミド・ゲル・プラグは第１部分のふるい分
け手段として機能し、そしてフィルターとして作用して
ある特定の（選択された）分子量範囲の巨大分子を排除
するか遅らせる。巨大分子はゲル中での進行が遅れ、小
さい溶質が第２の部分の「フリーゾーン（ｆｒｅｅ　　
ｚｏｎｅ）」に浸透し、こうして優先的に分析される。 第１部分のゲルの架橋度合（ｄｅｇｒｅｅ　　ｏｆｃｒ
ｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）は、タンパク質などの大きい
分子が小さい溶質の後で分析可能となるように限定され
るものとして考えられている。しかしながら、架橋度合
を増加させることも可能なので、分析工程中で巨大分子
がゲルに完全に浸透することは決してない。この事につ
いて、ゲルはその場で（ｉｎ　　ｓｉｔｕ）分子量フィ
ルターとして作用する。

【００１４】図１に示すように、本発明に係るキャピラ
リ管の調整はキャピラリ管１０中にポリスチレンをディ
ポジットさせることから始めることが好ましい。（異な
る分子量のポリスチレンを使用することができるが、粉
末状の分子量２０３０（ＭＷ２０３０）の市販のポリス
チレンを使用した。）通常、ポリスチレンを管の一方の
端部から約２ｃｍの所に配置する。それから、ポリスチ
レンを加熱し、溶融物を冷却してキャピラリ管を二つの
部分（すなわち、第２および第１部分の先駆体（ｐｒｅ
ｃｕｒｓｏｒｓ））に効果的に分割するフリット１２を
生成する。その結果得られた多孔性のポリスチレン・フ
リットは所定の位置で十分に焼なましされている。すな
わち、フリットの構造的完全性（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ
　　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）に悪影響を及ぼすことなく、
溶液は高い流量でフリットを容易に通過する。キャピラ
リ管１０の一部分の内側表面に、３−アクリロキシプロ
ピルメトキシシランなどのシリル化剤をコーティングす
る。このシリル化剤はキャピラリ管の内側表面へのポリ
マーゲルの接着性を助ける。それから、ヘリウムをキャ
ピラリ管へ通過させ、キャピラリ管の内壁上にシリル化
剤が硬化される。最後にポリアクリルアミドなどのゲル
生成材料が硬化されたシリル化剤を含むキャピラリ管の
部分に設けられる。ポリアクリルアミドがいったんゲル
化されると管は使用できる状態になる。図２に示される
本発明に係るキャピラリ管には、ゲル・スタック１６、
ポリスチレン・フリット１２、フリー・ゾーン１８を有
する。

【００１５】他の実施例では、ポリスチレン・フリット
の代りにシリカ・プラグを用いる。この場合には、キャ
ピラリ管中にシリカ・プラグを配置した後、加熱して焼
結されたプラグを生成する。さらに、ポリアクリルアミ
ドの他に本発明のゲルスタックを生成するのに適した他
の物質としてアガロースを含む。

【００１６】分析対象の試料はゲルを含む管の端部に充
填される。上述のようにゲルの物質とその架橋の度合に
応じて、ゲルは分析からある特定の分子量範囲の巨大分
子を効果的に除外する（高度に架橋されている場合）か
、あるいは巨大分子を効果的に遅らせ、予じめ分離させ
て、大きな溶質の分析の前に小さい溶質を連続的に分析
を行なう手段を提供する。実際の溶質の分析は、本発明
に係るキャピラリ管のフリー・ゾーン部分において行わ
れる。本発明は現在用いられている従来からのキャピラ
リ電気泳動システムに容易に組込むことができる。これ
により、検出器は検出器を通移動する試料ゾーンの通過
を感知する。

【００１７】本発明は好適な実施例と関連させて詳述し
てきたが、この説明および実施例は例示するためのもの
であって本発明の範囲を限定するものではないは明らか
である。

【００１８】

【発明の効果】以上説明したように、本発明ではＣＺＥ
で用いられるキャピラリ内部にゲル・フィルタを設け、
試料注入後その場で巨大分子の遅延または除去等の試料
の前処理を行ない、続いて電気泳動にする分析を行なう
ことを可能とする。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例である電気泳動キャピラリの
中間製造物の断面図。

【図２】本発明の一実施例である電気泳動キャピラリの
断面図。

【符号の説明】

１０：キャピラリ管 １２：ポリスチレン・フリット １６：ゲル・スタック １８：フリー・ゾーン

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】第１と第２部分に画定される円筒状の口径
   を有する管から成り、前記第１部分は分子量に基づいて
   試料分子をろ過する手段を含み、前記第１部分と前記第
   ２部分は連続的に流体連結することを特徴とする電気泳
   動キャピラリ。
2. 【請求項２】前記ろ過手段は巨大分子の前記第１部分か
   ら前記第２部分への流れを遅延させ、または阻止すると
   同時に他の分子の前記第２部分への流れを可能にする請
   求項第１項記載の電気泳動キャピラリ。