JPH0424036B2 - - Google Patents
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Description
本発明は有機基質の微生物的変化に関し、特に
実質的に水と混和しない有機基質の変化を行わせ
るための固定化系における細胞の使用に関する。 微生物が、周囲温度および圧力においてまたは
その近くで高度に選択的なやり方において、種々
の商業的に有用な化学的変化を行わせることがで
きることが知られる。しかしながら、工業的に魅
惑的な供給原料の大多数のものは高度に非極性で
あり、これゆえに実質的に水と混和しないが、一
方、微生物自身は水性の環境を必要とし、そして
有機非極性媒体中において生残ることができな
い。混和しない２つの相に対するこの必要性は、
１つの相としての所望の有機基質と、適当な微生
物を含有する第２の水性相とを含むエマルジヨン
を使用することによりこれまで解決されてきた。
しかしながら、かかる２相のエマルジヨン系はエ
マルジヨンを保持するために必要とされるセン断
力による微生物細胞に対する物理的損傷のおよび
最小の物理的力によりエマルジヨンを安定化する
ために使用される表面活性剤による化学的損傷の
危険を含む多数の問題を導入する。さらに、かか
るエマルジヨンにおける混合は細胞を有機相との
直接の接触の有害な影響の下に置き、そして同時
に、エマルジヨンにおける有機および水性の細胞
含有相の混和物から所望の有機生成物を分離する
ことにおいて包含される実際的な問題を増大させ
る。この問題点は微生物が多孔の細かい支持体の
水で満たされた孔の中に位置する固定化微生物系
の使用によつて避けられまた和らげられることが
見出された。 この固定化系において、微生物は水と混和しな
い有機液体の潜在的に敵意のある媒質中に導入す
ることができるが、同時にそれは支持物質の孔中
に保持される水によりつくられた水性の微環境を
亨受し続ける。かくして微生物は非極性有機液体
との直接の接触の有害な結果から保護される。し
かしながら、２つの液体は完全に非混和性ではな
く、これゆえに有機相は限られた範囲内で水性相
に移行する。そこでそれは微生物の生化学的作用
の下に置かれ、そしてかくしてつくられた有機生
産物は、その相に対するそれらよりも大きい親和
力によつて有機相に送り返される。すなわちそれ
らの分配係数は有機相に有利であろう。かくして
この固定化系の潜在的な利点は反応生成物が、そ
れらが微生物の継続された生化学的活性を危うく
するのに充分に高い濃度をとる以前に、またそれ
らが他の望ましくない生成物へのもう１つの変化
を経る以前に、微生物の環境から有機相へ抽出さ
れることである。 この発明は、炭化水素基質である実質的に水非
混和性の有機基質の微生物的酸化方法であつて、
該基質の所望の酸化を行うことができるシユード
モナス・アエルギノサ微生物種が多孔質で水を保
持する粒子状不活性アルミナ支持体上に置かれ、
その孔サイズは該微生物の平均径よりも大きいも
のであり、それによつて該微生物が水性環境を有
する固定化系が形成され、そしてこの固定化系が
該基質および酸素源と接触される該方法におい
て、該酸素源が21容量％より多い酸素を含むガス
状混合物であることを特徴とする前記微生物的酸
化方法である。 この方法の１つの有用な応用は脂肪族炭化水素
の酸化にあり、そしてかかる酸化に適切な微生物
はアルカンを相当する１−アルカノールに、そし
て１−アルケンを相当する１，２−エポキシアル
カンに酸化することができる公知種のシユードモ
ナス・アエルギノサ473（Pseudomonas
aeruginosa473）である。 この微生物は1958年にThijsse and van der
Linden（Aut.v.Leeuwenhoek24，2981958）によ
つて最初に記述され、そして次の形態学的および
生化学的特性を有する。 細胞の形態 ：中程度の桿状 コロニーの形態 ：緑がかつた灰白色、平坦、
平滑、全体にうすい緑があ
る、円形、半透明、 生育℃ ：45℃＋ 50℃− カタラーゼ ：＋ オキシダーゼ、コバクス ：＋ Ｏ−Ｆグルコール ：酸化的 グラム染色 ：陰性 ピオシアニン ：＋ 螢光（フルオレセンス） ：＋ ペニシリンＧ ：− ストレプトマイシン ：＋ クロロフエニコール ：＋ テトラサイクリン ：＋ ノボビオチン ：− ポリミキシンＢ ：＋ ０／129 ：− レバン ：− 固定化された微生物細胞中の有効な活性の達成
は臨界的な最小量よりも上にある支持体粒子の孔
のサイズに依存し、また上述のように、これは微
生物の平均径よりも大きくあるべきであつて、通
常それは0.5ミクロンよりも大きい孔サイズを必
要とする。支持体粒子のサイズは固定化系の活性
に影響を及ぼし、粒子が大きくなるとより高活性
がえられる。最高の微生物の生化学的活性を達成
するために必要とされる孔サイズと粒子サイズの
正確な組合せは、本来、包含される微生物、支持
体の詳細な化学および形態学および基質の性質に
依存する。アルミナ上に担持されたシユードモナ
ス・アエルギノサであつて、メチルシクロヘキサ
ンの酸化に使用される場合、最も高いレベルの活
性および寿命は、粒子サイズが少なくとも１mmで
あり、そして特に６mmであるときに得られる。 多くの場合、支持体上に置かれた細胞の活性と
寿命は、支持体表面が親油性被膜を有するときに
増強されうる。支持体はポリスチレンのごときポ
リマーによつて含浸されうる。 支持体上への細胞の位置ずけは、種々の技法に
より行ないうるが、２つの手法が一般に適切であ
ることが見出された。１つの技法において微生物
の細胞は発酵槽内で所望の細胞のペーストが得ら
れるように確立された方法により培養される。支
持体粒子が減圧の下に置かれ、細胞のペーストが
減圧を維持しながら支持体に適用され、そしてそ
の後に大気圧が回復され、それによつてペースト
は孔の内に押込まれる。別法の技法はこの場にお
ける生育のそれであり、その技法において粉末状
の担体は適切な生育培地中にけん濁され、その後
に所望の微生物を接種する。接種され、支持体を
含む生育培地は、微生物の生育を行わせるために
適当な条件の下で培養され、そして適当な時間の
後に、細胞を含む固定化系を残すために、遊離の
細胞が洗浄によつて除去される。この技法の変法
において同化しうる炭素源および窒素源を含む新
鮮な生育培地が、付着のための適切な条件を与え
るために、固定化の間反応器に連続的に供給され
る。 所望の生成物の収量は、所望の段階を越える酸
化を進行させる微生物の能力を低減させる化合物
の有機相への添加により屡々高められる。かくし
て炭化水素のアルカノールへの酸化は異なるアル
コールの有機相への添加により改善されうる。特
別の機構によつて制限されることなく、アルコー
ルは微生物中に存在するデヒドロゲナーゼ酵素部
位を飽和する役目を果たし、それによつて、所望
の生成物のアルコールの酸化を最小にすると信じ
られる。この阻害機能のために適切なアルコール
はノナオールおよびメタノールを包含するが後者
の場合、濃度は微生物の阻害を導くように高くあ
つてはいけない。 酸素制限の条件（屡々適用されるであろうとこ
ろのもの）の下での基質の酸化は培養系が置かれ
ている周囲の大気中の酸素の濃度によつて影響を
受けること、および酸素分圧における増加は酸化
生成物の基質の増加した転化をもたらすが、この
効果には、これを越えた増加した酸素濃度は阻害
となるという制限があることがまた見出された。
好ましくは酸素の濃度は大気中に存在する21％を
超えるが、75％よりも大きくてはいけない。 この発明は次の例において説明される。 例 １ シユードモナス・アエルギノサがビオテツク発
酵器中で炭素源としてヘプタン蒸気によるASM
培地におけるバツチ式培養または消泡剤として
0.33g／Ｌのプロピレングリコール2000、炭素源
としてヘプタン蒸気および600rpmのかきまぜ速
度によるAM−２培地における連続式培養を使用
して生育された。この微生物は、次の手法を用い
て支持体の存在におけるもう一層の生育によつて
粒子状支持体上に固定化された。 培地の組成は次のとおりであつた。 培地ASMの組成 gl-1 NH4Cl 0.535 KH2PO4 0.531 Na2HPO4 0.866 K2SO4 0.174 MgSO47H2O 0.037 CaCl22H2O 0.00735 FeSO47H2O 0.006ｇ これとともに、次の鉱酸塩溶液のリツトル当り１
ml． ZnSO47H2O 1.44グラム／５リツトル MnSO44H2O 1.12 H3BO3 0.309 CuSO45H2O 0.624 Na2MoO42H2O 0.242 CoCl26H2O 0.238 Ki 0.415 IMH2SO4 ５ml 培地AM2の組成 gl-1 （NH4）2SO4 1.45 H3PO4（90％） 1.09 MgSO47H2O 0.099 CaCl22H2O 0.015 FeSO47H2O 0.02 これとともに、上記の鉱酸塩溶液のリツトル当り
２ml・ センター・ウエル・フラスコ（centre−well
flask）中に20ｇの選択された支持体を含有する
50mlのASM培地にシユードモナス・アエルギノ
サが接種され、そして分当り100ストロークにお
けるグラント振とう機中で、30℃において３日間
培養された。この生育期間後に支持体は0.1Mリ
ン酸塩緩衝液（PH：6.8）で洗浄され、支持体粒
子が除去され、そして過剰の外部水はテイツシユ
ペーパー上で乾燥することによつて除去された。 得られた固定化細胞系に存在する細胞の負荷は
細胞が負荷された粒子１ｇを0.1N水酸化ナトリ
ウム水溶液中の２％炭酸ナトリウム５ml中で２
１／２時間、80℃に加熱し、続いてフオーリン−チ
オカルテ（Methods in Enzymology Ed.
Colowick ＆ Kaplan、第巻、第447頁、
Acad.Press Inc.N.Y.1959）の手法によるタン白
質分析によつて測定された。 かくして得られた固定化細胞系10ｇが250ml栓
付きコニカルフラスコ中で水で飽和されたメチル
シクロヘキサン15mlに加えられた。このものは旋
回振とう機で105rpmおよび30℃においてかきま
ぜられ、そして0.1mlの試料が定められた間隔で
採取され、そして内部対照としてイソオクタン中
の１−（１−ヒドロキシ）−エチルシクロヘキサン
の0.3ｇ／Ｌ溶液0.5mlの添加の後に、キヤリアー
ガスとして30ml／分における窒素による30℃にお
ける６フイートの“クロモソルブ”
（ctromosorb）WHPガラスカラムおよび火災イ
オン化検出器（flame ionisation detector）を
使用して分析された。 支持体物質の選択により得られた結果は以下の
表に示される。
実質的に水と混和しない有機基質の変化を行わせ
るための固定化系における細胞の使用に関する。 微生物が、周囲温度および圧力においてまたは
その近くで高度に選択的なやり方において、種々
の商業的に有用な化学的変化を行わせることがで
きることが知られる。しかしながら、工業的に魅
惑的な供給原料の大多数のものは高度に非極性で
あり、これゆえに実質的に水と混和しないが、一
方、微生物自身は水性の環境を必要とし、そして
有機非極性媒体中において生残ることができな
い。混和しない２つの相に対するこの必要性は、
１つの相としての所望の有機基質と、適当な微生
物を含有する第２の水性相とを含むエマルジヨン
を使用することによりこれまで解決されてきた。
しかしながら、かかる２相のエマルジヨン系はエ
マルジヨンを保持するために必要とされるセン断
力による微生物細胞に対する物理的損傷のおよび
最小の物理的力によりエマルジヨンを安定化する
ために使用される表面活性剤による化学的損傷の
危険を含む多数の問題を導入する。さらに、かか
るエマルジヨンにおける混合は細胞を有機相との
直接の接触の有害な影響の下に置き、そして同時
に、エマルジヨンにおける有機および水性の細胞
含有相の混和物から所望の有機生成物を分離する
ことにおいて包含される実際的な問題を増大させ
る。この問題点は微生物が多孔の細かい支持体の
水で満たされた孔の中に位置する固定化微生物系
の使用によつて避けられまた和らげられることが
見出された。 この固定化系において、微生物は水と混和しな
い有機液体の潜在的に敵意のある媒質中に導入す
ることができるが、同時にそれは支持物質の孔中
に保持される水によりつくられた水性の微環境を
亨受し続ける。かくして微生物は非極性有機液体
との直接の接触の有害な結果から保護される。し
かしながら、２つの液体は完全に非混和性ではな
く、これゆえに有機相は限られた範囲内で水性相
に移行する。そこでそれは微生物の生化学的作用
の下に置かれ、そしてかくしてつくられた有機生
産物は、その相に対するそれらよりも大きい親和
力によつて有機相に送り返される。すなわちそれ
らの分配係数は有機相に有利であろう。かくして
この固定化系の潜在的な利点は反応生成物が、そ
れらが微生物の継続された生化学的活性を危うく
するのに充分に高い濃度をとる以前に、またそれ
らが他の望ましくない生成物へのもう１つの変化
を経る以前に、微生物の環境から有機相へ抽出さ
れることである。 この発明は、炭化水素基質である実質的に水非
混和性の有機基質の微生物的酸化方法であつて、
該基質の所望の酸化を行うことができるシユード
モナス・アエルギノサ微生物種が多孔質で水を保
持する粒子状不活性アルミナ支持体上に置かれ、
その孔サイズは該微生物の平均径よりも大きいも
のであり、それによつて該微生物が水性環境を有
する固定化系が形成され、そしてこの固定化系が
該基質および酸素源と接触される該方法におい
て、該酸素源が21容量％より多い酸素を含むガス
状混合物であることを特徴とする前記微生物的酸
化方法である。 この方法の１つの有用な応用は脂肪族炭化水素
の酸化にあり、そしてかかる酸化に適切な微生物
はアルカンを相当する１−アルカノールに、そし
て１−アルケンを相当する１，２−エポキシアル
カンに酸化することができる公知種のシユードモ
ナス・アエルギノサ473（Pseudomonas
aeruginosa473）である。 この微生物は1958年にThijsse and van der
Linden（Aut.v.Leeuwenhoek24，2981958）によ
つて最初に記述され、そして次の形態学的および
生化学的特性を有する。 細胞の形態 ：中程度の桿状 コロニーの形態 ：緑がかつた灰白色、平坦、
平滑、全体にうすい緑があ
る、円形、半透明、 生育℃ ：45℃＋ 50℃− カタラーゼ ：＋ オキシダーゼ、コバクス ：＋ Ｏ−Ｆグルコール ：酸化的 グラム染色 ：陰性 ピオシアニン ：＋ 螢光（フルオレセンス） ：＋ ペニシリンＧ ：− ストレプトマイシン ：＋ クロロフエニコール ：＋ テトラサイクリン ：＋ ノボビオチン ：− ポリミキシンＢ ：＋ ０／129 ：− レバン ：− 固定化された微生物細胞中の有効な活性の達成
は臨界的な最小量よりも上にある支持体粒子の孔
のサイズに依存し、また上述のように、これは微
生物の平均径よりも大きくあるべきであつて、通
常それは0.5ミクロンよりも大きい孔サイズを必
要とする。支持体粒子のサイズは固定化系の活性
に影響を及ぼし、粒子が大きくなるとより高活性
がえられる。最高の微生物の生化学的活性を達成
するために必要とされる孔サイズと粒子サイズの
正確な組合せは、本来、包含される微生物、支持
体の詳細な化学および形態学および基質の性質に
依存する。アルミナ上に担持されたシユードモナ
ス・アエルギノサであつて、メチルシクロヘキサ
ンの酸化に使用される場合、最も高いレベルの活
性および寿命は、粒子サイズが少なくとも１mmで
あり、そして特に６mmであるときに得られる。 多くの場合、支持体上に置かれた細胞の活性と
寿命は、支持体表面が親油性被膜を有するときに
増強されうる。支持体はポリスチレンのごときポ
リマーによつて含浸されうる。 支持体上への細胞の位置ずけは、種々の技法に
より行ないうるが、２つの手法が一般に適切であ
ることが見出された。１つの技法において微生物
の細胞は発酵槽内で所望の細胞のペーストが得ら
れるように確立された方法により培養される。支
持体粒子が減圧の下に置かれ、細胞のペーストが
減圧を維持しながら支持体に適用され、そしてそ
の後に大気圧が回復され、それによつてペースト
は孔の内に押込まれる。別法の技法はこの場にお
ける生育のそれであり、その技法において粉末状
の担体は適切な生育培地中にけん濁され、その後
に所望の微生物を接種する。接種され、支持体を
含む生育培地は、微生物の生育を行わせるために
適当な条件の下で培養され、そして適当な時間の
後に、細胞を含む固定化系を残すために、遊離の
細胞が洗浄によつて除去される。この技法の変法
において同化しうる炭素源および窒素源を含む新
鮮な生育培地が、付着のための適切な条件を与え
るために、固定化の間反応器に連続的に供給され
る。 所望の生成物の収量は、所望の段階を越える酸
化を進行させる微生物の能力を低減させる化合物
の有機相への添加により屡々高められる。かくし
て炭化水素のアルカノールへの酸化は異なるアル
コールの有機相への添加により改善されうる。特
別の機構によつて制限されることなく、アルコー
ルは微生物中に存在するデヒドロゲナーゼ酵素部
位を飽和する役目を果たし、それによつて、所望
の生成物のアルコールの酸化を最小にすると信じ
られる。この阻害機能のために適切なアルコール
はノナオールおよびメタノールを包含するが後者
の場合、濃度は微生物の阻害を導くように高くあ
つてはいけない。 酸素制限の条件（屡々適用されるであろうとこ
ろのもの）の下での基質の酸化は培養系が置かれ
ている周囲の大気中の酸素の濃度によつて影響を
受けること、および酸素分圧における増加は酸化
生成物の基質の増加した転化をもたらすが、この
効果には、これを越えた増加した酸素濃度は阻害
となるという制限があることがまた見出された。
好ましくは酸素の濃度は大気中に存在する21％を
超えるが、75％よりも大きくてはいけない。 この発明は次の例において説明される。 例 １ シユードモナス・アエルギノサがビオテツク発
酵器中で炭素源としてヘプタン蒸気によるASM
培地におけるバツチ式培養または消泡剤として
0.33g／Ｌのプロピレングリコール2000、炭素源
としてヘプタン蒸気および600rpmのかきまぜ速
度によるAM−２培地における連続式培養を使用
して生育された。この微生物は、次の手法を用い
て支持体の存在におけるもう一層の生育によつて
粒子状支持体上に固定化された。 培地の組成は次のとおりであつた。 培地ASMの組成 gl-1 NH4Cl 0.535 KH2PO4 0.531 Na2HPO4 0.866 K2SO4 0.174 MgSO47H2O 0.037 CaCl22H2O 0.00735 FeSO47H2O 0.006ｇ これとともに、次の鉱酸塩溶液のリツトル当り１
ml． ZnSO47H2O 1.44グラム／５リツトル MnSO44H2O 1.12 H3BO3 0.309 CuSO45H2O 0.624 Na2MoO42H2O 0.242 CoCl26H2O 0.238 Ki 0.415 IMH2SO4 ５ml 培地AM2の組成 gl-1 （NH4）2SO4 1.45 H3PO4（90％） 1.09 MgSO47H2O 0.099 CaCl22H2O 0.015 FeSO47H2O 0.02 これとともに、上記の鉱酸塩溶液のリツトル当り
２ml・ センター・ウエル・フラスコ（centre−well
flask）中に20ｇの選択された支持体を含有する
50mlのASM培地にシユードモナス・アエルギノ
サが接種され、そして分当り100ストロークにお
けるグラント振とう機中で、30℃において３日間
培養された。この生育期間後に支持体は0.1Mリ
ン酸塩緩衝液（PH：6.8）で洗浄され、支持体粒
子が除去され、そして過剰の外部水はテイツシユ
ペーパー上で乾燥することによつて除去された。 得られた固定化細胞系に存在する細胞の負荷は
細胞が負荷された粒子１ｇを0.1N水酸化ナトリ
ウム水溶液中の２％炭酸ナトリウム５ml中で２
１／２時間、80℃に加熱し、続いてフオーリン−チ
オカルテ（Methods in Enzymology Ed.
Colowick ＆ Kaplan、第巻、第447頁、
Acad.Press Inc.N.Y.1959）の手法によるタン白
質分析によつて測定された。 かくして得られた固定化細胞系10ｇが250ml栓
付きコニカルフラスコ中で水で飽和されたメチル
シクロヘキサン15mlに加えられた。このものは旋
回振とう機で105rpmおよび30℃においてかきま
ぜられ、そして0.1mlの試料が定められた間隔で
採取され、そして内部対照としてイソオクタン中
の１−（１−ヒドロキシ）−エチルシクロヘキサン
の0.3ｇ／Ｌ溶液0.5mlの添加の後に、キヤリアー
ガスとして30ml／分における窒素による30℃にお
ける６フイートの“クロモソルブ”
（ctromosorb）WHPガラスカラムおよび火災イ
オン化検出器（flame ionisation detector）を
使用して分析された。 支持体物質の選択により得られた結果は以下の
表に示される。
【表】
総べての支持体材料はノルトン社（Norton
Company）から得られ、そしてノルトン社によ
つてあてがわれた参照番号によつて同定される。 耐摩耗度はグラント振とう機中で水中における
分当り180ストロークで６日間振とうした後の重
量百分率損失として測定される。 細胞負荷は１ｇの支持体当りの乾燥細胞のグラ
ム数として表わされる。 生成物の生成は、時間当り乾燥細胞のグラム当
りにつくられたメチルシクロヘキサノールのグラ
ム数として表わされ、50時間の間にわたつて積算
される。 例 ２ 支持体物質の粒子サイズの影響が、粒子サイズ
の細かく定義され範囲を選択し、例１に記述され
たやり方を用いて得られた細胞の負荷および活性
を算定することによつて評価された。得られた結
果は以下の表２に示される。
Company）から得られ、そしてノルトン社によ
つてあてがわれた参照番号によつて同定される。 耐摩耗度はグラント振とう機中で水中における
分当り180ストロークで６日間振とうした後の重
量百分率損失として測定される。 細胞負荷は１ｇの支持体当りの乾燥細胞のグラ
ム数として表わされる。 生成物の生成は、時間当り乾燥細胞のグラム当
りにつくられたメチルシクロヘキサノールのグラ
ム数として表わされ、50時間の間にわたつて積算
される。 例 ２ 支持体物質の粒子サイズの影響が、粒子サイズ
の細かく定義され範囲を選択し、例１に記述され
たやり方を用いて得られた細胞の負荷および活性
を算定することによつて評価された。得られた結
果は以下の表２に示される。
【表】
例 ３
微生物細胞による支持体物質の負荷に対するや
り方の影響が例１に記述されたその場所における
やり方における生育を次の変法と比較することに
よつて評価された。総べての場合、支持体物質は
粒子サイズ６−７mmを有するノルトン社製アルミ
ナSA5221であり、微生物はシユードモナス・ア
エルギノサであつた。 (a) 濃縮された細胞ケン濁液からの吸収 ほぼ乾燥細胞10ｇ／Ｌを含む0.1Mリン酸塩緩
衝液50mlが支持体ビーズ20ｇとともに分当り100
ストロークにおけるグラント振とう機中で２−３
日間、振とうされた。 (b) 真空固定化 支持体ビーズ30−40ｇが300ml容の隔壁で封緘
されたブフナーフラスコ中でほぼ0.7kPa.まで減
圧にされた。支持体のｇ当り0.2mlの0.1Mリン酸
塩緩衝液中の微生物細胞の濃厚ケン濁液が隔壁を
通して注射器により導入された。混合物を完全に
振とうした後、真空が突如解放された。 各々の場合に、負荷された支持体粒子はテイツ
シユペーパーによつて表面的に乾燥され、例１に
記述されるように、メチルシクロヘキサンを相当
するアルコールへ酸化するためのそれらの能力が
評価された。 結果は以下の表３に示される。
り方の影響が例１に記述されたその場所における
やり方における生育を次の変法と比較することに
よつて評価された。総べての場合、支持体物質は
粒子サイズ６−７mmを有するノルトン社製アルミ
ナSA5221であり、微生物はシユードモナス・ア
エルギノサであつた。 (a) 濃縮された細胞ケン濁液からの吸収 ほぼ乾燥細胞10ｇ／Ｌを含む0.1Mリン酸塩緩
衝液50mlが支持体ビーズ20ｇとともに分当り100
ストロークにおけるグラント振とう機中で２−３
日間、振とうされた。 (b) 真空固定化 支持体ビーズ30−40ｇが300ml容の隔壁で封緘
されたブフナーフラスコ中でほぼ0.7kPa.まで減
圧にされた。支持体のｇ当り0.2mlの0.1Mリン酸
塩緩衝液中の微生物細胞の濃厚ケン濁液が隔壁を
通して注射器により導入された。混合物を完全に
振とうした後、真空が突如解放された。 各々の場合に、負荷された支持体粒子はテイツ
シユペーパーによつて表面的に乾燥され、例１に
記述されるように、メチルシクロヘキサンを相当
するアルコールへ酸化するためのそれらの能力が
評価された。 結果は以下の表３に示される。
【表】
例 ４
種々の水非混和性有機基質の変化における固定
化酵素の適用能力が例１のメチルシクロヘキサン
をｎ−ヘプタン、１−オクテン、DL−メンチル
アセテートによりまたはヘキサノール／ヘキサノ
イン酸と置き換えることによつて評価された。メ
ンチルアセテートの加水分解の場合に使用された
微生物はバチルス・ズブチリスT372（NCIB
11705）であり、他の場合はシユードモナス・ア
エルギノサ473であつた。これらの系の若干に対
して、比較実験が適切な有機相の５ml中におい
て、遊離の細胞をリン酸塩緩衝液（0.1M；PH
6.8）中の細胞ケン濁液の２mlとして使用して行
われた。有機基質がイソオクタン中の溶液として
使用される若干の実験が行われた。固定化系を使
用するそれらの場合に、支持物質は、エステル化
実験では「11.2ｇ×10-3ｇの乾燥細胞／ｇ支持
体」であることを除いて、「約７×10-3ｇ乾燥細
胞／ｇ支持体」の細胞負荷を与えるために、真空
固定化によつて負荷されたノルトン社製アルミナ
SA5221であつた。 実験の条件およびやり方は、その他の点で例１
に記述されたのと同様であつた。 得られた結果は以下の表３に示される。
化酵素の適用能力が例１のメチルシクロヘキサン
をｎ−ヘプタン、１−オクテン、DL−メンチル
アセテートによりまたはヘキサノール／ヘキサノ
イン酸と置き換えることによつて評価された。メ
ンチルアセテートの加水分解の場合に使用された
微生物はバチルス・ズブチリスT372（NCIB
11705）であり、他の場合はシユードモナス・ア
エルギノサ473であつた。これらの系の若干に対
して、比較実験が適切な有機相の５ml中におい
て、遊離の細胞をリン酸塩緩衝液（0.1M；PH
6.8）中の細胞ケン濁液の２mlとして使用して行
われた。有機基質がイソオクタン中の溶液として
使用される若干の実験が行われた。固定化系を使
用するそれらの場合に、支持物質は、エステル化
実験では「11.2ｇ×10-3ｇの乾燥細胞／ｇ支持
体」であることを除いて、「約７×10-3ｇ乾燥細
胞／ｇ支持体」の細胞負荷を与えるために、真空
固定化によつて負荷されたノルトン社製アルミナ
SA5221であつた。 実験の条件およびやり方は、その他の点で例１
に記述されたのと同様であつた。 得られた結果は以下の表３に示される。
【表】
＊＊ 反応は完結、基質は残らなかつた
。
例 ５ 脂肪族炭化水素の相当するアルコールへの酸化
において、有機相における異なつたアルコールの
生産性に対する影響が２つの実験により測定され
た。例３(b)に記述されたやり方と類似のやり方に
引続いてシユードモナス・アエルギノサがノルト
ン社製SA5221アルミナ（粒子サイズ１−２mm）
上に真空固定化されて、「0.86×10-3ｇ乾燥細
胞／ｇ支持体」の細胞負荷を有する固定化系を得
た。このものは例１に記された一般的なやり方に
引続いてそして基質として種々の量の１−ノナノ
ールを含むヘプタンを使用して評価された。同様
な実験が、基質として種々の量のメタノールを含
むメチルシクロヘキサンを使用して行われた。こ
れらの２つの実験の結果は表５および表６にそれ
ぞれ示される。
。
例 ５ 脂肪族炭化水素の相当するアルコールへの酸化
において、有機相における異なつたアルコールの
生産性に対する影響が２つの実験により測定され
た。例３(b)に記述されたやり方と類似のやり方に
引続いてシユードモナス・アエルギノサがノルト
ン社製SA5221アルミナ（粒子サイズ１−２mm）
上に真空固定化されて、「0.86×10-3ｇ乾燥細
胞／ｇ支持体」の細胞負荷を有する固定化系を得
た。このものは例１に記された一般的なやり方に
引続いてそして基質として種々の量の１−ノナノ
ールを含むヘプタンを使用して評価された。同様
な実験が、基質として種々の量のメタノールを含
むメチルシクロヘキサンを使用して行われた。こ
れらの２つの実験の結果は表５および表６にそれ
ぞれ示される。
【表】
【表】
例 ６
固定化系の生産性に対する周囲の酸素濃度の影
響がノルトン社製SA5221アルミナ上に真空固定
化されたシユードモナス・アエルギノサを使用し
て（細胞負荷：3.2×10-3ｇ乾燥細胞／ｇ支持体）
評価された。この系は、別の酸素レベルを採用す
ることを除いて例１に記述されたのと同様のやり
方を使用してメチルシクロヘキサンを相当するア
ルコールに酸化する能力について評価された。結
果は表７に示される。
響がノルトン社製SA5221アルミナ上に真空固定
化されたシユードモナス・アエルギノサを使用し
て（細胞負荷：3.2×10-3ｇ乾燥細胞／ｇ支持体）
評価された。この系は、別の酸素レベルを採用す
ることを除いて例１に記述されたのと同様のやり
方を使用してメチルシクロヘキサンを相当するア
ルコールに酸化する能力について評価された。結
果は表７に示される。
【表】
例 ７
親油性の支持体のコーテイングの効果が次のよ
うに評価された。 (a) シリカの酸処理 ビーズサイズ７−８mmを有するノルトン社製シ
リカ（SS5131）100ｇが0.6M硫酸150ml中で６時
間還流された。酸度を1.2まで増大させた後、混
合物はさらに３日間還流された。冷却後ビーズは
蛇口水で48時間洗浄され、引続いて100℃におい
て17時間乾燥された。このやり方は約３ヒドロキ
シル基／nm2（種々の熱分析により測定されたも
の）および0.7m2／ｇの表面積（BETにより測定
されたもの）を有する表面がヒドロキシル化され
たシリカをもたらした。 (b) 再水和されたシリカのシリル化 再水和されたシリカ30ｇが窒素雰囲気の下で19
時間トルエン30ml中で、一般式： を有する化合物3.55×10-2モルとともに還流され
た。引続いて支持体はソツクスレー装置において
24時間トルエンにより洗浄された。100℃におい
て24時間乾燥後、支持体の炭素含量が微量元素分
析により測定された。 (c) 支持体のポリスチレンコーテイング ノルトン社製シリカSS5131 40ｇが（膨脹可
能）ポリスチレン５ｇを含むトルエン100ml中で
１時間還流された。冷却し、そしてテイツシユペ
ーパーで表面乾燥の後、この材料は100℃におい
て24時間乾燥された。この材料の炭素含量（微量
元素分析によつて測定されたもの）はスチレン
nm-2について16分子に相当する。トルエン100ml
中の16ｇの膨脹可能なポリスチレンを用いる同一
の実験はスチレンnm-2について280分子を含む支
持体をもたらした。 (d) 上記のやり方によつてつくられた改変された
支持体粒子が例３(b)に記述されたような真空固定
化技術を使用してシユードモナス・アエルギノサ
により被覆され、そして得られた固定化系は、例
１に記載されたのと同様にメチルシクロヘキサン
を相当するアルコールへ酸化するためのそれらの
能力を評価した。結果は以下の表８に示される。
うに評価された。 (a) シリカの酸処理 ビーズサイズ７−８mmを有するノルトン社製シ
リカ（SS5131）100ｇが0.6M硫酸150ml中で６時
間還流された。酸度を1.2まで増大させた後、混
合物はさらに３日間還流された。冷却後ビーズは
蛇口水で48時間洗浄され、引続いて100℃におい
て17時間乾燥された。このやり方は約３ヒドロキ
シル基／nm2（種々の熱分析により測定されたも
の）および0.7m2／ｇの表面積（BETにより測定
されたもの）を有する表面がヒドロキシル化され
たシリカをもたらした。 (b) 再水和されたシリカのシリル化 再水和されたシリカ30ｇが窒素雰囲気の下で19
時間トルエン30ml中で、一般式： を有する化合物3.55×10-2モルとともに還流され
た。引続いて支持体はソツクスレー装置において
24時間トルエンにより洗浄された。100℃におい
て24時間乾燥後、支持体の炭素含量が微量元素分
析により測定された。 (c) 支持体のポリスチレンコーテイング ノルトン社製シリカSS5131 40ｇが（膨脹可
能）ポリスチレン５ｇを含むトルエン100ml中で
１時間還流された。冷却し、そしてテイツシユペ
ーパーで表面乾燥の後、この材料は100℃におい
て24時間乾燥された。この材料の炭素含量（微量
元素分析によつて測定されたもの）はスチレン
nm-2について16分子に相当する。トルエン100ml
中の16ｇの膨脹可能なポリスチレンを用いる同一
の実験はスチレンnm-2について280分子を含む支
持体をもたらした。 (d) 上記のやり方によつてつくられた改変された
支持体粒子が例３(b)に記述されたような真空固定
化技術を使用してシユードモナス・アエルギノサ
により被覆され、そして得られた固定化系は、例
１に記載されたのと同様にメチルシクロヘキサン
を相当するアルコールへ酸化するためのそれらの
能力を評価した。結果は以下の表８に示される。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 炭化水素基質である実質的に水非混和性の有
機基質の微生物的酸化方法であつて、該基質の所
望の酸化を行うことができるシユードモナス・ア
エルギノサ微生物種が多孔質で水を保持する粒子
状不活性アルミナ支持体上に置かれ、その孔サイ
ズは該微生物の平均径より大きいものであり、そ
れによつて該微生物が水性環境を有する固定化系
が形成され、そしてこの固定化系が該基質および
酸素源と接触される該方法において、該酸素源が
21容量％より多い酸素を含むガス状混合物である
ことを特徴とする前記微生物的酸化方法。 ２ 脂肪族炭化水素基質が、この基質を酸化する
ことのできるシユードモナス・アエルギノサ微生
物種を含む固定化系および酸素源との接触によつ
て酸化される、特許請求の範囲第１項に記載の方
法。 ３ 相当するアルカノールを超える酸化が、異な
つたアルコールの添加によつて阻害される、特許
請求の範囲第２項に記載の方法。 ４ 不活性支持体の粒子サイズが少なくとも１mm
である、特許請求の範囲第２項または第３項に記
載の方法。 ５ 不活性支持体の孔サイズが0.5ミクロンより
も大きい、特許請求の範囲第１〜４項のいずれか
一つの項に記載の方法。 ６ 支持体表面に親油性被膜が付与されている、
特許請求の範囲第１〜５項のいずれか一つの項に
記載の方法。 ７ 支持体上への微生物の位置ずけが、支持体粒
子を減圧の下に置くこと、減圧を維持しながら、
微生物のペーストを支持体に適用することおよび
引き続いて大気圧を回復することによつて行われ
る、特許請求の範囲第１〜６項のいずれか一つの
項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8039986 | 1980-12-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57132889A JPS57132889A (en) | 1982-08-17 |
| JPH0424036B2 true JPH0424036B2 (ja) | 1992-04-23 |
Family
ID=10517972
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19776781A Granted JPS57132889A (en) | 1980-12-12 | 1981-12-10 | Method and fixed cell system for microoranism change using fixed cell |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0054987B1 (ja) |
| JP (1) | JPS57132889A (ja) |
| DE (1) | DE3176978D1 (ja) |
| DK (1) | DK160566C (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3410650A1 (de) * | 1984-03-23 | 1985-10-03 | Kernforschungsanlage Jülich GmbH, 5170 Jülich | Mit mikroorganismen bewachsene poroese anorganische traeger, verfahren zur immobilisierung von mikroorganismen und dafuer geeignete traegerkoerper |
| FR2643647B1 (fr) * | 1989-02-27 | 1991-06-21 | Sanofi Sa | Procede microbiologique d'obtention de methylcetones |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| LU56634A1 (ja) * | 1968-08-02 | 1970-03-23 | ||
| GB1577933A (en) * | 1976-02-11 | 1980-10-29 | Unilever Ltd | Fat process and composition |
| GB2004300B (en) * | 1977-09-14 | 1982-08-04 | Corning Glass Works | High surface low volume biomass composites |
| US4268630A (en) * | 1978-04-14 | 1981-05-19 | Exxon Research & Engineering Co. | Microbiological production of ketones from C3 -C6 alkanes |
| CA1116543A (en) * | 1978-06-12 | 1982-01-19 | Saul L. Neidleman | Method for producing epoxides and glycols from alkenes |
| JPS5571797A (en) * | 1978-11-21 | 1980-05-30 | Fuji Oil Co Ltd | Manufacture of cacao butter substitute fat |
| AU540882B2 (en) * | 1980-03-08 | 1984-12-06 | Fuji Oil Company Limited | Enzymatic transesterification of lipid and enzyme used therein |
-
1981
- 1981-11-20 EP EP19810201290 patent/EP0054987B1/en not_active Expired
- 1981-11-20 DE DE8181201290T patent/DE3176978D1/de not_active Expired
- 1981-12-10 DK DK549281A patent/DK160566C/da not_active IP Right Cessation
- 1981-12-10 JP JP19776781A patent/JPS57132889A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK160566C (da) | 1991-09-09 |
| DK160566B (da) | 1991-03-25 |
| DK549281A (da) | 1982-06-13 |
| EP0054987A1 (en) | 1982-06-30 |
| DE3176978D1 (en) | 1989-03-02 |
| JPS57132889A (en) | 1982-08-17 |
| EP0054987B1 (en) | 1989-01-25 |
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