JPH04235199A - フェンシクリジンの蛍光偏光イムノアッセイ - Google Patents

フェンシクリジンの蛍光偏光イムノアッセイ

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JPH04235199A
JPH04235199A JP3125955A JP12595591A JPH04235199A JP H04235199 A JPH04235199 A JP H04235199A JP 3125955 A JP3125955 A JP 3125955A JP 12595591 A JP12595591 A JP 12595591A JP H04235199 A JPH04235199 A JP H04235199A
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ロバート・エドワード・ダブラー
Mary P Frintner
メアリー・パット・フリントナー
Jonathan Grote
ジョナサン・グロウト
Gregg A Hadley
グレッグ・アレン・ハドリー
David J Hawksworth
デイビッド・ジェイムズ・ホークスワース
Hal D Hopkins
ハル・デイトン・ホプキンズ
Daniel S Nam
ダニエル・エス・ナム
Frank S Ungemach
フランク・エス・アンゲマック
Larry K Wray
ラリー・ケイ・レイ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、試料、とりわけ尿、血
清または血漿などの生物学的試料中のフェンシクリジン
およびフェンシクリジン代謝物の存在または量を決定す
るための蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）を行うた
めの方法および試薬、該試薬の調製法、該試薬を含むア
ッセイキットに関する。さらに詳しくは、本発明は、（
１）試料中のフェンシクリジンおよびフェンシクリジン
代謝物の存在または量を決定するための試薬（トレーサ
ーおよび抗体、並びに該トレーサーおよび抗体を含むア
ッセイキット）；（２）モノクローナルまたはポリクロ
ーナル抗体を産生させるのに使用する免疫原化合物；（
３）該トレーサーおよび免疫原化合物の合成法；および
（４）該アッセイを行うための分析法に関する。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】フェ
ンシクリジンは、強力な鎮静作用および麻酔作用を有す
る合成薬である。この薬は、麻酔後に重篤で長期にわた
る錯乱および譫妄状態を生じることが示されている。こ
の薬は幻覚、陶酔感、知覚の歪み、および解離感を生じ
る傾向があるため、不法に使用され乱用されてきた。乱
用が繰り返されるので、この薬の製造および分布を防ぐ
努力が絶えず払われてきた。これら努力と一貫して、フ
ェンシクリジンおよびフェンシクリジン代謝物の検出の
ための迅速で信用性が高く選択的な方法に対する必要性
が存在する。 【０００３】フェンシクリジンは代謝されて４−フェニ
ル−４−ピペリジノシクロヘキサノールおよび１−（１
−フェニルシクロヘキシル）−４−ヒドロキシピペリジ
ンの２つの主要な代謝物となり、これら代謝物はそれぞ
れ対応するグルクロニド結合体とともに尿中に排泄され
る。フェンシクリジンかまたはフェンシクリジン代謝物
のいずれかが検出されると、フェンシクリジンの使用が
示される。 【０００４】最もしばしば試験される生物学的試料は尿
である。尿試料は体内非侵入性であり、一般に血液試料
よりも利用しやすい。しかしながら、他の生物学的試料
も試験することが可能である。 【０００５】過去においては、フェンシクリジンおよび
フェンシクリジン代謝物の存在についての尿試料の試験
は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ガスクロマト
グラフィー（ＧＣ）または高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）アッセイにより行われてきた。これら各方
法に顕著な欠点は、これら方法に要するアッセイ時間が
一般に長すぎることである。 【０００６】フェンシクリジン、フェンシクリジン代謝
物または他の物質のアッセイでは、競合結合イムノアッ
セイ法が一層満足のいく代替法であった。一般に、競合
結合イムノアッセイは、試料中のリガンドを測定するた
めに用いられる（本発明の開示の目的のためには、「リ
ガンド」とは競合結合イムノアッセイ法により定量すべ
き生物学的に興味のもたれる物質をいう）。リガンドと
標識試薬（「リガンド類似体」または「トレーサー」）
とは、該リガンドおよびリガンド類似体とに特異的な抗
体上の限られた数のリガンド結合部位に対して競合する
。リガンドおよびリガンド類似体はそれぞれの濃度に比
例して抗体に結合するので、試料中のリガンドの濃度は
抗体に結合するリガンド類似体の量を決定し、抗体に結
合するリガンド類似体の量は試料中のリガンドの濃度に
反比例する。 【０００７】ＦＰＩＡ法は、競合結合イムノアッセイに
おいて生成したトレーサー−抗体結合体の量の測定のた
めの定量手段を提供する。この方法は、蛍光標識化合物
を平面偏光で励起したときに、その回転速度と逆の相関
の程度の偏光を有する蛍光を放出するという原理に基づ
いている。従って、蛍光標識を有するトレーサー−抗体
結合体を平面偏光で励起すると、放出される光は高度に
偏光されている。というのは、光の吸収時と放出時との
間に蛍光団は回転が束縛されるからである。これとは対
照的に、未結合トレーサーを平面偏光で励起させると、
その回転速度は対応するトレーサー−抗体結合体のもの
よりも遥かに大きく、それゆえ分子は一層ランダムに配
向することになる。その結果、未結合トレーサー分子か
ら放出される光は脱分極される。 【０００８】これまでＦＰＩＡ法による尿中のフェンシ
クリジンおよび他の「乱用薬物」の正確な測定を妨げて
きた問題は、リボフラビンによる妨害であった。リボフ
ラビン、すなわちビタミンＢ２は、多くの食品および市
販のビタミン補給剤に共通に含まれる成分である。リボ
フラビンは主として尿中に排泄され、フルオレセインと
極めて類似した蛍光スペクトルを有する。その結果、た
とえ尿試料中に含まれる量がそれ程多くなくとも、リボ
フラビンは妨害を引き起こし、そのため間違ったデータ
が得られる。通常のリボフラビン摂取では尿中に痕跡量
以上のリボフラビンを生じることはないが、フェンシク
リジンの検出を妨害しようと意図する被験者が過剰量の
ビタミン補給剤を摂取することにより試験結果が容易に
歪められる。 【０００９】本発明は、当該技術分野において利点を提
供するものであり、リボフラビンによる妨害を受けるこ
となく、フェンシクリジンおよびフェンシクリジン代謝
物を決定することのできるトレーサー、該トレーサーの
製造法、および該トレーサーおよびモノクローナル抗体
またはポリクローナル抗体を利用したアッセイを提供す
る。 【００１０】 【課題を解決するための手段】本発明は、フェンシクリ
ジンおよびフェンシクリジン代謝物のための蛍光偏光イ
ムノアッセイ法；トレーサー、免疫原および抗体；該イ
ムノアッセイに用いるトレーサーおよび抗体を含む試薬
キット；および該トレーサー、免疫原および抗体の製造
法に関する。 【００１１】本発明の第一の側面は、新規な構造を有す
る独特のトレーサーおよび免疫原の発見にある。本発明
の第一の側面によれば、トレーサーおよび免疫原はとも
に、下記式： 【化５】 または 【化６】 ［式中、ＷはＣＨまたはＮ；Ｒは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐまた
はＦから選ばれた４個までのヘテロ原子を含み、合計０
〜８個のヘテロ原子および炭素原子が直鎖状または分枝
鎖状に配列しており、１個までの脂肪族または芳香族環
構造を含む、連結基；ＺはＮＨ、ＣＯ、ＣＮＨまたはＯ
ＣＯ；ｎはＷがＮである場合に０または１、ＷがＣＨで
ある場合に１；Ｑはポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸
）誘導体、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体
である］で示される。 【００１２】Ｑがポリ（アミノ酸）またはその誘導体で
ある場合は、該化合物は免疫原として用いることができ
る。Ｑがフルオレセインまたはその誘導体である場合は
、該化合物はトレーサーとして用いることができる。 【００１３】本発明の第二の側面は、モノクローナル抗
体またはポリクローナル抗体、好ましくは本発明の新規
免疫原に対して産生させたモノクローナル抗体に関する
。本発明の第二の側面によれば、モノクローナル抗体ま
たはポリクローナル抗体は、上記「化１」または「化２
」においてＱがポリ（アミノ酸）またはその誘導体であ
る化合物に対して応答させて調製する。 【００１４】本発明の第三の側面では、免疫原は下記式
： 【化７】 または 【化８】 ［式中、ＷはＣＨまたはＮ；Ｒは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐまた
はＦから選ばれた４個までのヘテロ原子を含み、合計０
〜８個のヘテロ原子および炭素原子が直鎖状または分枝
鎖状に配列しており、１個までの脂肪族または芳香族環
構造を含む、連結基；ＺはＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＮ、Ｃ
ＨＯまたはＯＨ；ｎはＷがＮである場合に０または１、
ＷがＣＨである場合に１である］のいずれかで示される
化合物をポリ（アミノ酸）またはポリ（アミノ酸）の誘
導体とカップリングさせる方法により製造する。 【００１５】本発明の第四の側面では、下記式：【化９
】 または 【化１０】 ［式中、ＷはＣＨまたはＮ；Ｒは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐまた
はＦから選ばれた４個までのヘテロ原子を含み、合計０
〜８個のヘテロ原子および炭素原子が直鎖状または分枝
鎖状に配列しており、１個までの脂肪族または芳香族環
構造を含む、連結基；ＺはＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＮ、Ｃ
ＨＯまたはＯＨ；ｎはＷがＮである場合に０または１、
ＷがＣＨである場合に１である］のいずれかで示される
化合物をフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体と
カップリングすることによりトレーサーを製造する方法
が提供される。 【００１６】本発明の第五の側面は、リボフラビンによ
る潜在的な蛍光妨害の回避に関する。リボフラビン結合
タンパク質（ＲＢＰ）を各試料に直接加えるか、または
アッセイに使用した１種または２種以上の試薬に加え、
試料中に存在する全てのリボフラビンと結合させてＲＢ
Ｐ−リボフラビン複合体を生成させ、かくして蛍光妨害
を除去する。この目的のために他の蛍光停止物質を用い
ることもできる。 【００１７】本発明の第六の側面では、フェンシクリジ
ンおよびフェンシクリジン代謝物の濃度の測定法または
検出法が提供される。試料を、フェンシクリジン誘導体
抗血清、およびフェンシクリジン誘導体抗血清の存在に
対して検出可能な蛍光偏光を生成し得るフルオレセイン
含有フェンシクリジン誘導体と接触させる。ついで、こ
の溶液に平面偏光を通して蛍光偏光応答を得、この応答
を検出して試料中のフェンシクリジンおよびフェンシク
リジン代謝物の量を測定する。 【００１８】本発明の第七の側面は、試料中のフェンシ
クリジンおよびフェンシクリジン代謝物の存在または量
を決定するのに有用な安定化試薬キットに関する。本発
明の試薬キットは、本発明の方法において試薬として有
用に用いられるトレーサーおよびその塩を含んでいる。 本発明の試薬キットの他の成分としては、（１）リボフ
ラビンによる蛍光妨害を減少させるのに有効な所定量の
リボフラビン結合タンパク質を含有する溶液；（２）免
疫原に対して産生され、フェンシクリジンおよびフェン
シクリジン誘導体および本発明のトレーサー試薬を特異
的に認識し得るモノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体；および（３）充分な量のジメチルホルムアミド
および充分な量のブタノールを含有し、アッセイを行う
のに使用する自動または半自動装置のプローブを洗浄す
るための洗浄溶液（これにより、一つの試料からつぎの
試料へのフェンシクリジンの持ち越しが減少する）が挙
げられる。 【００１９】本発明は、フルオレセインおよびフルオレ
セイン誘導体の使用を含む。特に、フルオレセインおよ
びフルオレセイン誘導体を本発明のトレーサー化合物と
して使用するのに必要な性質は、フルオレセインの蛍光
性である。フルオレセインは、環境の酸濃度（ｐＨ）に
依存して、下記に示すように２つの互変体として存在す
る。 【化１１】 【００２０】開環形（酸形）では多数の共役二重結合が
存在し、これにより、この形態のフルオレセイン（およ
びフルオレセイン残基を含有する化合物）は青色の光を
吸収し、約４ナノ秒間の励起状態の後に緑色の蛍光を放
出することができる。開環形と閉環形とが共存する場合
は、上記ｐＨレベルを調節することにより開環形と閉環
形との分子の相対濃度を容易に変えることができる。一
般に、本発明のトレーサー化合物は生物学的に許容し得
る塩（たとえば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニ
ウム塩など）として溶液中に存在するので、本発明の分
析法に用いた場合に開環形、すなわち蛍光形で存在する
ことができる。その際の特定の塩は、ｐＨレベルを調節
するのに使用した緩衝液に依存する。たとえば、リン酸
ナトリウム緩衝液を用いた場合は、本発明の化合物は一
般に開環形でナトリウム塩として存在するであろう。 【００２１】本明細書において「フルオレセイン」とい
う場合は、それが特定の分子として存在する場合は、蛍
光に関連して使用するとき以外は開環形および閉環形の
両方を包含する。蛍光を生じるには開環形であることが
必要である。 【００２２】フルオレセイン分子の炭素原子の番号付け
は、該分子の開環形および閉環形のいずれを考慮するか
により異なる。従って、フルオレセインおよびその複合
体に関する文献は炭素原子の番号付けが統一されていな
い。閉環形では、ラクトンのカルボニルのパラ位にある
炭素原子は６の番号が付されている（この形態の分子は
しばしば「異性体ＩＩ」と命名される）。開環形では、
カルボン酸基のパラ位にある炭素原子は５の番号が付さ
れている（この形態の分子はしばしば「異性体Ｉ」と命
名される）。上記「化１１」は、これら異性体を示して
いる。 本発明の開示の目的のためには、閉環形の番号付けを採
用することにする。というのは、本発明の合成に用いる
出発物質は該系によって番号付けされているのが一般で
あるからである。それゆえ、フルオレセインおよびその
複合体のカルボキシル基の反対に位置する炭素原子は、
本発明の開示の目的のためには６の番号が付される。 【００２３】抗体と複合体を形成していないトレーサー
は、吸収および蛍光の再放出に必要な時間よりも短い時
間の間、自由に回転できる。その結果、再放出される光
は比較的ランダムに配向しており、抗体と複合体を形成
していないトレーサーの蛍光偏光は低く、０に近付く。 特定の抗体と複合体を形成すると、かくして形成された
トレーサー−抗体複合体は抗体分子の回転（比較的小さ
な分子であるトレーサー分子の回転よりも遅い）を引き
受けるため、観察される偏光は増加する。それゆえ、リ
ガンドが抗体部位に対してトレーサーと競合すると、観
察されるトレーサー−抗体複合体の蛍光の偏光は、トレ
ーサーの蛍光の偏光とトレーサー−抗体複合体の蛍光の
偏光との間の値となる。もしも試料が高濃度のリガンド
を含有しておれば、観察される偏光値は遊離のトレーサ
ーの偏光値に近付く、すなわち低くなる。試料が低濃度
のリガンドを含有しておれば、偏光値は結合トレーサー
の偏光値に近付く、すなわち高くなる。 【００２４】イムノアッセイの反応混合物を垂直偏光つ
いで平面偏光で順番に励起させ、放出光の垂直成分のみ
を分析することにより、反応混合物の蛍光の偏光を正確
に決定することができる。測定すべきリガンドの濃度と
偏光との正確な相関関係は、既知濃度のカリブレーター
の偏光値を測定することにより確立される。リガンドの
濃度は、このようにして作成した標準曲線から外挿する
ことができる。本発明に従って製造した特定のトレーサ
ー、免疫原および抗体からは、下記に示すように驚くべ
き良好なアッセイが得られることがわかった。 【００２５】試薬および試薬キット 　　本発明の免疫原およびトレーサーは、ともに上記「
化５」および「化６」で示される一般的な構造を有する
。式中、Ｑがポリ（アミノ酸）である場合は該化合物は
免疫原であり、Ｑがフルオレセイン誘導体である場合は
該化合物はトレーサーである。 【００２６】本発明のアッセイの目的は、抗体の認識部
位に対してフェンシクリジンおよびフェンシクリジン誘
導体とトレーサーとの間で競合させることにある。この
目的を達成するために、該ハプテンおよびトレーサーの
構造を種々変化させることが可能である。本発明の目的
のためには、「ハプテン」とは、一般に置換フェンクリ
ジン誘導体とポリ（アミノ酸）担体に対する連結基から
なる免疫原の前駆体をいう。 【００２７】免疫原の構造 　　使用できるモノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体は、種々のフェンシクリジン誘導体から製造する
ことができる。そのような抗体は、適当なトレーサーと
組み合わせたときに本発明によるフェンシクリジンおよ
びフェンシクリジン代謝物のアッセイに有用である。 【００２８】本発明の免疫原はまた、下記式：【化１２
】 【化１３】 【化１４】 で示される一般的構造を有する。本発明の好ましい態様
において、免疫原は上記「化１４」で示される構造を有
する。最も好ましい免疫原は、下記式： 【化１５】 で示される構造を有するものである。 【００２９】本発明の免疫原の最も好ましい形態のポリ
（アミノ酸）はチログロブリンであるが、アルブミン、
血清タンパク質（たとえば、グロブリンなど）、眼の水
晶体タンパク質、リポタンパク質などの種々のタンパク
質担体を用いることもできる。タンパク質担体の例とし
ては、チログロブリンの他に、ウシ血清アルブミン、キ
ーホールリンペットヘモシアニン、卵アルブミン、ウシ
ガンマグロブリン、チロキシン結合グロブリンなどが挙
げられる。別のやり方として、充分に多数の利用できる
アミノ基を有する（たとえば、リジンなど）、または充
分に多数の利用できるカルボン酸基を有する（たとえば
、グルタミン酸塩など）合成ポリ（アミノ酸）を調整す
ることもできる。ハプテンのカップリング基がアミノ基
である場合は、上記ポリ（アミノ酸）担体の対応グルタ
ルアルデヒド誘導体を用いることもできる。 【００３０】下記合成法および実施例で記載するように
、免疫原は、上記「化７」、「化８」または「化１０」
で示される化合物をポリ（アミノ酸）またはポリ（アミ
ノ酸）の誘導体とカップリングすることにより調製する
ことができる。 【００３１】トレーサーの構造 　　本発明のトレーサーの構造において取り得る変更は
、本発明のハプテンの構造において取り得る変更よりも
大きい。本発明のトレーサーは、上記「化５」および「
化６」においてＱがフルオレセイン残基またはフルオレ
セイン誘導体を表す一般構造を有する。フェンシクリジ
ンおよびフェンシクリジン誘導体は、フルオレセイン分
子またはその誘導体が蛍光特性を保持する限り、フルオ
レセイン分子またはその誘導体上のいかなる位置にも結
合することができ、たとえば、上記「化１１」における
フルオレセインの酸の形態の番号付けに従えば４位、５
位および３ａ位に結合させることができる。本発明の好
ましい態様において、トレーサーは下記式： 【化１６】 で示される構造を有する化合物である。最も好ましい態
様においては、トレーサーは下記式： 【化１７】 で示される構造を有する化合物である。 【００３２】トレーサーは、下記に示すように、たとえ
ばアミド、アミジノ、トリアジニルアミノ、カルバミド
、チオカルバミド、カルバモイル、チオカルバモイル、
またはスルホニルカルバモイル基によりフルオレセイン
誘導体に結合したフェンシクリジン誘導体である。 【化１８】 【化１９】 【化２０】 【００３３】トレーサーは、下記合成法および実施例で
記載するように、アミノ基、カルボン酸基、水酸基、イ
ミデート基、ヒドラジド基、クロロホルメート基、クロ
ロチオホルメート基、クロロスルホニルカルバモイル基
、イソシアネート基、チオイソシアネート基、または同
様の基を含むフェンシクリジン誘導体に適当なフルオレ
セイン誘導体を結合させることにより調製する。 【００３４】例として、下記フルオレセイン誘導体のい
ずれをも用いることができる。 Ｆｌ−ＮＨ２　　　　　　　　　　　　フルオレセイン
アミンＦｌ−ＣＯ２Ｈ　　　　　　　　　　カルボキシ
フルオレセインＦｌ−ＮＨＣＯＣＨ２Ｉ　　ａ−ヨード
アセトアミドフルオレセイン 【化２１】 Ｆｌ−ＮＣＳ　　　　　　　　　　　フルオレセインチ
オイソシアネート 【００３５】抗体 　　好ましい抗体は、上記「化１４」で示される免疫原
に対して産生されたものであるが、最も好ましい抗体は
、上記「化１５」で示される免疫原に対して産生された
ものである。 【００３６】ポリクローナル抗体およびモノクローナル
抗体のいずれも免疫原上の特異的エピトープを認識する
。ポリクローナル抗体はそれぞれ特異的エピトープを認
識する複数の抗体の混合物からなるがモノクローナル抗
体は特異的のエピトープを認識する単一の抗体を分泌す
る細胞により産生されるものであること、およびモノク
ローナル抗体はインビトロおよびインビボの両方で産生
させることができることから、本発明の方法および本発
明の試薬キットに使用するにはモノクローナル抗体が好
ましい抗体である。 【００３７】ポリクローナル抗体を用いた本発明のアッ
セイと比較してモノクローナル抗体を用いた本発明のア
ッセイが有利である点は、（１）より選択的なアッセイ
を行うことができること；（２）試料中に存在するかも
しれない他の化合物であって、抗体と交差反応する結果
、実際には試料中に何も存在しない場合にフェンシクリ
ジンまたはフェンシクリジン代謝物の偽陽性の読み取り
を与える他の化合物による妨害が減ること；（３）引き
続き動物を再免疫する必要がなく、またそのような動物
の再免疫に付随する労力のかかる手順が省かれること；
および（４）同一の抗血清の非再現性の可能性がなくな
ること（なぜなら、抗体産生動物の交差反応プロフィル
は変化するためアッセイの再構築が必要なこと、いかに
注意深く動物を扱っても動物は必ず死ぬこと、および新
たに動物を免疫すると最初に得られたのと同じ交差反応
性プロフィルが得られないかもしれないことのためであ
る）である。 【００３８】一般に、モノクローナル抗体を調製するに
は、マウスやラットなどの動物に腹腔内注射、皮下注射
、静脈内注射、または他の仕方で抗原（免疫原、たとえ
ば上記「化１５」で示される構造を有する免疫原など）
を注射して該動物において免疫応答（該抗原に特異的な
抗体の産生）を引き起こさせる。ついで、動物から血清
を取り出し、該血清を試験して該血清中の抗体力価を決
定する（動物が所望の免疫応答を引き起こしたかどうか
、またどの程度に免疫応答を引き起こしかを決定するた
め）。所望の免疫応答を引き起こした動物は、約２〜３
カ月休息させる。この２〜３カ月の後、Ｂリンパ球（抗
原で刺激すると抗体を合成する形質細胞に成熟する細胞
；Ｂ細胞とも呼ばれる）とミエローマ細胞（腫瘍細胞）
との融合の約３日前に、これら動物に抗原のブースター
注射を投与する。 【００３９】ついで、標準法によりこれら動物の脾臓か
らＢリンパ球を取り出し、標準法、たとえばコーラーお
よびミルシュテインの「コンティニュアス・カルチャー
・オブ・ヒューズド・セルズ・シークリーティング・ア
ンチボディー・オブ・プリディファインド・スペシフィ
シティー（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　
ｏｆ　Ｆｕｓｅｄ　Ｃｅｌｌｓ　Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　
Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　Ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ　Ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９
５（１９７５）に記載の方法に従って、Ｂリンパ球をミ
エローマ融合細胞と融合させる。ついで、ＨＡＴ培地ま
たは他の適当な培地を入れたマルチウエル組織培養プレ
ート中にＢリンパ球−ミエローマ融合細胞をプレーティ
ングする。得られた培養液にＨＴ培地または他の適当な
培地を与え、細胞融合の約５〜７日またはその前後にウ
シ胎仔血清または仔ウシ血清を与え、融合から約１０日
またはその前後に目的抗原に特異的な抗体の存在につい
て試験する。ついで、所望の特別のハイブリッド細胞を
限界希釈法によりクローニングする（ハイブリッド細胞
を異なる量のＨＴ培地または他の適当な培地中に希釈し
、単一の所望のクローンを単離するために組織培養プレ
ート中にプレーティングする）。ついで、確立されたク
ローンを広範囲の交差反応物のパネルに対する特異性を
再試験する。 【００４０】ついで、所望のクローンにより得られたモ
ノクローナル抗体の量はスケールアップして（１）組織
培養（組織培養液またはＨＴ培地中の細胞数を拡大する
ことにより）かまたは（２）マウス腹水のいずれかで精
製するために充分な量の抗体を製造することができる。 モノクローナル抗体のスケールアップは、ハイブリッド
細胞をマウスの腹腔内に注射し、細胞を増殖させる（通
常、約７日間）ことにより行うことができる。マウスを
屠殺し、腹水を回収し、腹水を精製することにより腹水
をマウスから集める（実施例ＸＶＩＩＩ）。この目的の
ために用いられる実験室マウスの最も普通の株はＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスであり、このマウスは、ジャクソン・ラボ
ラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）（バーハーバー、メイン）やチャールズ・リバー（
Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ）（ウイルミントン、マサ
チューセッツ）などのあらゆるマウス販売者から入手す
ることができる。 【００４１】Ｂ細胞およびＴ細胞を産生する免疫系を刺
激するため、プリスタン（アルドリッチ・ケミカル、ミ
ルウオーキー、ＷＩから得ることができる）をマウスに
注射すべきであり（ハイブリッド細胞をマウスに注射す
る約２〜３週間前）、このことによりマウスに注射する
クローン細胞のフィーダー層が得られる。このことは、
ハイブリッド細胞が増殖することのできる適当な環境を
提供するために行う。本発明のポリクローナル抗体は、
上記免疫原に対する応答を動物において起こさせること
により調製する。当業者によく知られた方法で一連の注
射によりウサギやヒツジなどの動物に免疫原を投与する
。 【００４２】試薬キット 　　試料中のフェンシクリジンおよびフェンシクリジン
誘導体の存在または量を決定するための本発明の試薬キ
ットは、上記「化５」または「化６」（式中、Ｗ、Ｒ、
Ｚ、ｎおよびＱは前記と同じ）のいずれかの式で示され
る第一トレーサー、および上記「化５」または「化６」
（式中、Ｗ、Ｒ、Ｚ、ｎおよびＱは前記と同じ）のいず
れかの式で示される免疫原に対して産生させたモノクロ
ーナルまたはポリクローナル（好ましくはモノクローナ
ル）抗体からなる。好ましくは、本発明の試薬キットは
また、リボフラビンによる蛍光妨害を減少させるのに有
効な所定量のリボフラビン結合タンパク質、およびアッ
セイを行うための自動または半自動装置のプローブを洗
浄するためのジメチルホルムアミドおよびブタノールを
含有する洗浄溶液をも含んでいる。 【００４３】本発明の試薬キットに用いるのに最も好ま
しいトレーサーは上記「化１７」で示される構造を有す
るトレーサーであるが、該キットに用いるのに最も好ま
しい抗体は上記「化１５」で示される構造を有する免疫
原に対して産生させたモノクローナル抗体である。本発
明のキットに使用するのに最も好ましいトレーサーと抗
血清の組み合わせは、上記「化１７」で示される構造を
有するトレーサーと上記「化１５」で示される構造を有
する免疫原に対して産生させたモノクローナル抗体であ
る。 【００４４】合成法 　　本発明の免疫原およびトレーサーの両方とも、上記
「化９」、「化７」、「化８」または「化１０」［式中
、ＷはＣＨまたはＮ；Ｒは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、ＰまたはＦか
ら選ばれた４個までのヘテロ原子を含み、合計０〜８個
のヘテロ原子および炭素原子が直鎖状または分枝鎖状に
配列しており、１個までの脂肪族または芳香族環構造を
含む、連結基；Ｚは免疫原を調製する場合はＮＨ２、Ｃ
ＯＯＨ、ＣＮ、ＣＨＯまたはＯＨ、トレーサーを調製す
る場合はＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＮ、ＣＨＯまたはＯＨ；
ｎはＷがＮである場合に０または１、ＷがＣＨである場
合に１である］で示される前駆体から製造することがで
きる。 【００４５】免疫原の合成 　　本発明の免疫原は、上記「化７」、「化８」、「化
９」または「化１０」においてＺがＮＨ２、ＣＯＯＨ、
ＣＮ、ＣＨＯまたはＯＨである一般式の構造を有するハ
プテンをポリ（アミノ酸）にカップリングさせることに
より製造する。ポリ（アミノ酸）のハプテンへの結合は
、アミド結合、アミジン結合、アルキル結合、尿素結合
、チオ尿素結合、カルバメート結合、またはチオカルバ
メート結合などにより行うことができる。ハプテンはカ
ルバメート結合を生成するのに通常使用する条件下でカ
ップリングさせるのが好ましく、そのような条件は当業
者にはよく知られている。所望のカルバメート結合を生
成するには約８．０のｐＨ条件を用いるのが最も好まし
いが、それは該目的のために該結合を生成させるには該
条件が最も有効であるからである。 【００４６】免疫原の調製は、−ＮＨ２、−ＣＯ２Ｈ、
−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＣＮＯＲ、−ＣＨＯ、−ＮＣＯ、
−ＮＣＳ、−ＯＣＯＣｌまたは−ＯＣＳＣｌ基を含有す
るハプテンをポリ（アミノ酸）にカップリングさせるこ
とにより行う。−ＮＨ２の場合は、−ＮＨ２基の存在下
でポリ（アミノ酸）上のカルボン酸基を活性化すること
によりカップリングする。ポリ（アミノ酸）上のカルボ
ン酸基の活性化は、ハプテンおよびポリ（アミノ酸）を
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（ＤＣＣ）、１−シクロヘキシル−３−（
２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トル
エンスルホネートなどと混合することにより行う。−Ｃ
Ｏ２Ｈの場合は、活性法（ＥＤＣ）または活性エステル
法によりカップリングする。−ＣＯＮＨＮＨ２の場合は
、非芳香族アミノ基の場合と同様の方法でカップリング
する。 【００４７】−ＣＮＯＲ（対応シアノ化合物から調製さ
れる）の場合は、直接ポリ（アミノ酸）にカップリング
させる。−ＣＨＯの場合は、還元的アミノ化によりポリ
（アミノ酸）にカップリングさせる。ポリ（アミノ酸）
を−ＣＨＯハプテンと混合し、得られるイミンを水素化
シアノホウ素ナトリウムで還元してポリ（アミノ酸）上
にアルキル化アミンを生成させる。イソシアネート（−
ＮＣＯ）およびイソチオシアネート（−ＮＳＣ）の場合
（対応アミノ化合物から調製される）、およびクロロホ
ルメート（−ＯＣＯＣｌ）およびクロロチオホルメート
（−ＯＣＳＣｌ）の場合（対応アルコール化合物から調
製される）は、それぞれ尿素結合、チオ尿素結合、カル
バメート結合およびチオカルバメート結合が生成する。 これは、ハプテンをポリ（アミノ酸）に直接カップリン
グさせることにより行う。 【００４８】上記ハプテン（免疫原前駆体）の合成も非
常によく似た方法で行うことができる。上記「化８」ま
たは「化１０」は、本発明の方法の好ましい態様におい
て使用する免疫原前駆体を示す。 【００４９】一般に、ハプテンの調製は、シアン化物の
存在下で適当なピペリジン誘導体をシクロヘキサノンと
反応させることにより行う。ついで、カップリング生成
物をフェニルマグネシウムブロマイドと反応させてハプ
テン前駆体を得る。ついで、このハプテン前駆体をハプ
テンに変換する。 【化２２】 【００５０】ＷがＮである場合は、ベンジルを保護基と
して用いることができる。ベンジル基はフェンシクリジ
ン誘導体を生成させた後で除去する。この第二級アミン
は適当なハプテンである。このアミンをアルキルハライ
ド（Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）、たとえばブロモアセトニト
リル、３−ブロモプロパノール、４−ブロモ酪酸などで
アルキル化して適当なハプテンを調製することもできる
。 担体タンパク質にカップリングさせるのに有用な適当な
基を含有する活性エステル（たとえば、無水コハク酸、
シアノアセチルクロライドなど）でクロロホルムアミド
誘導体（適当なハプテンを製造することができた）を生
成したりアミド誘導体を生成したりすることもできる。 【００５１】ＷがＣＨでありＸがＣＨＯＨである場合は
、フェンシクリジン誘導体を生成後に広範囲の種々のハ
プテンを調製することができる。エーテル誘導体を生成
するための標準法により、担体タンパク質にカップリン
グさせるのに有用な適当な基を含有するアルキルハライ
ド（Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）で上記アルコール化合物をア
ルキル化することができる。このアルコール化合物を対
応するハロゲン誘導体（ブロモ、クロロまたはヨードな
ど）に変換することができ、該誘導体を担体タンパク質
にカップリングさせるのに有用な適当な基を含有する化
合物のカルバニオン、アルコールまたはアミン誘導体と
反応させる。このアルコール化合物を対応ケトンに酸化
することができ、該ケトンは、知られた方法により誘導
体化して、担体タンパク質にカップリングさせるのに有
用な適当な基を含有する種々の化合物、たとえばウイテ
ィッヒ試薬、アルコキシアミン化合物とすることができ
、アミノ化合物を用いて還元的アミノ化することもでき
る。上記ケトン化合物を酢酸アンモニウムを用いて還元
的アミノ化に供すると、アミノ誘導体が得られる。この
アミノ化合物はハプテンとして適しており、ＷがＮでｎ
が０の場合と同様にして公知方法により種々のハプテン
化合物に誘導体化することもできる。 【００５２】ニトリル誘導体（Ｚ＝ＣＮ）は、無水アル
コールおよび塩化水素ガスで処理することによりアルコ
キシイミデート（Ｚ＝ＣＮＯＲ）に変換することができ
る。 ヒドラジド誘導体（Ｚ＝ＣＯＮＨＮＨ２）は、ヒドラジ
ンと活性エステルカップリングすることにより対応カル
ボン酸誘導体から調製するか、またはヒドラジンを対応
カルボン酸エステル誘導体と反応させて調製する。ホス
ゲンまたはチオホスゲンと反応させることにより、アミ
ン（Ｚ＝ＮＨ２）はイソシアネートまたはチオイソシア
ネート誘導体に変換することができ、アルコール（Ｚ＝
ＯＨ）はクロロホルメートおよびクロロチオホルメート
誘導体に変換することができる。 【００５３】アルデヒドおよびケトンは、（アミノヒド
ロキシ）アルキルカルボン酸、たとえばＮＨ２ＯＣＨ２
ＣＯ２Ｈと縮合して置換オキシム誘導体を生成すること
ができる。このオキシムアルキルカルボン酸誘導体は部
分的に還元して対応する（アミノヒドロキシ）アルキル
カルボン酸誘導体に変換することができる。同じタイプ
の縮合および還元は、ヒドラジンおよびヒドラジン誘導
体を用いても行うことができる。 【００５４】トレーサーの合成 　　本発明のトレーサーは、フルオレセイン残基または
フルオレセイン誘導体を上記「化７」、「化８」、「化
９」または「化１０」においてＺがＮＨ２、ＣＯＯＨ、
ＣＮまたはＯＨである一般構造を有する化合物にカップ
リングすることにより製造する。フルオレセイン残基は
、上記「化１８」、「化１９」または「化２０」に示す
ように、アミド結合、アミジン結合、尿素結合、チオ尿
素結合、カルバメート結合、チオカルバメート結合、ト
リアジニルアミノ結合またはスルホニルカルバメート結
合によりアミノ、カルボキシ、イミデートまたはアルコ
キシ官能基に結合させることができる。現在のところ好
ましい態様においては、フルオレセイン誘導体は、６−
カルボキシフルオレセインであり、これを４−アミノフ
ェンシクリジンの前駆体にカップリングさせる。この反
応はピリジン中で行うのが好ましいが、共溶媒中、たと
えば塩基（たとえば、トリエチルアミンなど）の存在下
、メタノール、ジメチルスルホキシドなど中で行うこと
もできる。 最も好ましいトレーサーの構造は、上記「化１７」に示
すものである。使用可能なトレーサーは、種々のフェン
シクリジン誘導体から調製することができる。 【００５５】アミノ、ヒドラジニル、ヒドラジドなどの
末端アミノ基を有するすべてのフェンシクリジン誘導体
は、活性エステル法または混合無水物法、好ましくは活
性エステル法によりカルボキシフルオレセインにカップ
リングすることができ、また溶液中で単に混合すること
によりフルオレセインイソチオシアネート、ＤＴＡＦま
たはアルコキシＤＴＡＦにカップリングすることができ
る。アミノ基はホスゲンまたはチオホスゲンと反応させ
ることにより、それぞれイソシアネートまたはチオイソ
シアネート基に変換することができる。ついで、これら
化合物をアミノフルオレセインと縮合してトレーサーを
生成する。 【００５６】カルボン酸、（アミノヒドロキシ）カルボ
ン酸などの末端カルボン酸基を有するすべてのフェンシ
クリジン誘導体は、活性エステル法によりアミノフルオ
レセインにカップリングさせることができる。 【００５７】末端水酸基を有するすべてのフェンシクリ
ジン誘導体は、ＤＴＡＦ、ヨードアセトアミドフルオレ
セインまたはフルオレセインイソチオシアネートと溶液
中で反応させることによりフルオレセインにカップリン
グすることができる。ヒドロキシ基は、クロロスルホニ
ルイソシアネート、ホスゲンまたはチオホスゲンと反応
させることにより、それぞれクロロスルホニルカルバモ
イル、クロロホルメートおよびクロロスルホニルイソシ
アネートに変換することができる。ついで、これら誘導
体を溶液中でアミノフルオレセインまたはアミノメチル
フルオレセインとカップリングしてトレーサーを調製す
る。 【００５８】末端ニトリル基を有するすべてのフェンシ
クリジン誘導体は、塩化水素ガスの存在下、無水アルコ
ール中でイミデートに変換することができる。ついで、
このイミデートを溶液中でフルオレセインアミンまたは
アミンメチルフルオレセインとカップリングしてトレー
サーを調製する。アニリド誘導体の種々のアミノ誘導体
、カルボン酸誘導体、ヒドロキシ誘導体およびニトリル
誘導体は、上記免疫原の調製のところで記載した。 【００５９】アッセイ 　　本発明の特定のトレーサーおよび抗体は、フェンシ
クリジンおよびフェンシクリジン代謝物のための蛍光偏
光アッセイにおいて驚くほど良好な結果が得られること
がわかった。本発明のアッセイ法は、分析前に試料を処
理する必要が全くないので、従来の方法に比べて迅速な
フェンシクリジンおよびフェンシクリジン代謝物のアッ
セイ法である。本発明のアッセイ系は、抗体の特異性に
よってフェンシクリジン様化合物以外の化合物の検出を
排除することができるので、試料中のフェンシクリジン
およびフェンシクリジン代謝物の存在または量を正確に
測定することができる。 【００６０】試料中のフェンシクリジンおよびフェンシ
クリジン代謝物の存在または量を決定するための本発明
の方法は、下記手順からなる。 （ａ）試料を （１）上記「化５」または「化６」（式中、Ｗ、Ｒ、Ｚ
、ｎおよびＱは前記と同じ）のいずれかで示される構造
を有する免疫原に対して産生させたモノクローナルまた
はポリクローナル（好ましくはモノクローナル）抗体を
含有するフェンシクリジン抗血清；および （２）上記「化５」または「化６」（式中、Ｗ、Ｒ、Ｚ
、ｎおよびＱは前記と同じ）のいずれかで示される構造
を有するトレーサー化合物であって、該フェンシクリジ
ン抗血清の存在に対する検出可能な蛍光偏光応答を生成
し得るトレーサー化合物と接触させ、 （ｂ）上記工程（ａ）で得た溶液に平面偏光を通して蛍
光偏光応答を生じさせ、ついで （ｃ）上記工程（ｂ）の溶液の蛍光偏光応答を検出して
試料中のフェンシクリジンまたはフェンシクリジン誘導
体の存在または量を測定する。 【００６１】本発明の最も好ましい方法は、上記「化１
５」で示される構造を有する免疫原に対して産生させた
モノクローナル抗体および上記「化１７」で示される構
造を有するトレーサーを用いるものである。 【００６２】本発明のトレーサーおよび免疫原化合物を
用いて蛍光偏光イムノアッセイにより試料中のフェンシ
クリジンおよびフェンシクリジン代謝物の存在または量
を決定するための本発明の方法に従い、フェンシクリジ
ンおよび／またはフェンシクリジン代謝物を含有する、
または含有していると思われる試料を、（１）トレーサ
ーの生物学的に許容し得る塩、および（２）フェンシク
リジンおよびフェンシクリジン代謝物および該トレーサ
ーに特異的なモノクローナルまたはポリクローナル（好
ましくはモノクローナル）抗体と混合する。この抗体は
、上記免疫原を用いて産生させる。フェンシクリジンお
よびフェンシクリジン代謝物およびトレーサーは、限ら
れた抗体部位に対して競合し、その結果、複合体を生成
する。 【００６３】トレーサーおよび抗体の濃度を一定に保つ
ことにより、生成するトレーサー−抗体複合体に対する
フェンシクリジン−抗体複合体およびフェンシクリジン
代謝物−抗体複合体の比は、試料中のフェンシクリジン
およびフェンシクリジン代謝物の量に正比例する。この
混合物を直線（ｌｉｎｅａｒｌｙ）偏光で励起し、トレ
ーサーおよびトレーサー−抗体複合体から放出される蛍
光の偏光（ミリ偏光の単位）を測定することにより、試
料中のフェンシクリジンおよびフェンシクリジン代謝物
の定量または存在の定性的決定を行うことができる。 【００６４】得られた結果は、正味のミリ偏光単位およ
びスパン（ミリ偏光の単位）により定量することができ
る。正味のミリ偏光単位の測定は、フェンシクリジンま
たはフェンシクリジン代謝物の不在下で最大量のトレー
サーが抗体に結合した場合の最大偏光を示す。正味のミ
リ偏光単位が高ければ高いほど、トレーサーの抗体への
結合が良くなる。アッセイスパンとは、フェンシクリジ
ンの不在下で最大量のトレーサーが結合した場合に得ら
れる正味のミリ偏光値と、所定量のフェンシクリジンま
たはフェンシクリジン代謝物が試料中に存在する場合に
得られる正味のミリ偏光値との差異である。大きなスパ
ンほど、アッセイのために作成した標準曲線の各カリブ
レーターの間に多くのミリ偏光単位を置くことができ、
そのためアッセイの精度が一層良くなり、このことから
逆に得られたデータの一層良好な数値分析を可能になる
。最も好ましい抗体−トレーサーの組み合わせからは少
なくとも９０ミリ偏光単位のスパンが得られるが、許容
し得るアッセイとするためには一層小さなスパンを用い
ることもできる。スパンは使用した試料サイズに依存し
て変わること、および、このことにより好ましい組み合
わせが変わるかもしれないことを認識するのが重要であ
る。 【００６５】表１は、試料が７５ｎｇ／ｍｌのフェンシ
クリジンを含有する場合に２μＬの試料サイズを用い、
本発明の種々の態様のトレーサー、抗体およびアッセイ
を用いて得られた結果をスパンおよび正味のミリ偏光単
位にて表したものである。表１中、抗体産生用免疫原に
用いるハプテンは下記式で示される構造を有するもので
あった。 【化２３】 【化２４】 【化２５】 またトレーサーは下記式で示される構造を有するもので
あった。 【化２６】 【化２７】 【化２８】 【化２９】 【００６６】表１に示すデータからわかるように、「化
２３」のハプテンから調製した免疫原を「化２７」のト
レーサーと組み合わせて２μＬの試料サイズで用いたア
ッセイから良好な結果が得られる。したがって、この抗
体およびトレーサーの組み合わせは試料サイズが２μＬ
である場合に本発明の好ましい態様である。しかしなが
ら、本発明のアッセイの最も好ましい形態は、上記「化
１５」で示される構造を有する免疫原に対して産生させ
たモノクローナル抗体を上記「化１７」で示される構造
を有するトレーサーとともに用いるものである。「化２
３」と「化２６」、「化２３」と「化１７」、「化２３
」と「化２８」、および「化２３」と「化２９」の組み
合わせによる抗体／トレーサーの組み合わせからもまた
許容し得る結果が得られ、別の好ましい組み合わせを示
すものである。 【００６７】 【表１】 　　　　　　表１ 抗体産生用免疫原　　　　トレーサー　　　　正味の偏
光＊　　　　スパン＊＊に用いるハプテン 　　「化２３」　　　　　　　　　　　　「化２６」　
　　　　　１７６　　　　　　　　　　１６　　「化２
３」　　　　　　　　　　　　「化２７」　　　　　　
１７２　　　　　　　　　　１８　　「化２３」　　　
　　　　　　　　　「化１７」　　　　　　１６４　　
　　　　　　　　１６　　「化２３」　　　　　　　　
　　　　「化２８」　　　　　　１５９　　　　　　　
　　　１５　　「化２３」　　　　　　　　　　　　「
化２９」　　　　　　１８７　　　　　　　　　　１２
　　「化２４」　　　　　　　　　　　　「化２６」　
　　　　　１２９　　　　　　　　　　　　５　　「化
２４」　　　　　　　　　　　　「化２７」　　　　　
　１２５　　　　　　　　　　　　５　　「化２４」　
　　　　　　　　　　　「化１７」　　　　　　１０２
　　　　　　　　　　　　４　　「化２４」　　　　　
　　　　　　　「化２８」　　　　　　１１０　　　　
　　　　　　　　６　　「化２４」　　　　　　　　　
　　　「化２９」　　　　　　１１９　　　　　　　　
　　　　４　　「化２５」　　　　　　　　　　　　「
化２６」　　　　　　１３７　　　　　　　　　　　　
４　　「化２５」　　　　　　　　　　　　「化２７」
　　　　　　１４２　　　　　　　　　　　　２　　「
化２５」　　　　　　　　　　　　「化１７」　　　　
　　１５５　　　　　　　　　　　　６　　「化２５」
　　　　　　　　　　　　「化２８」　　　　　　１４
０　　　　　　　　　　　　５　　「化２５」　　　　
　　　　　　　　「化２９」　　　　　　１４１　　　
　　　　　　　　　４（注）＊：ミリ偏光単位で示す。 ＊＊：７５ｎｇ／ｍＬのフェンシクリジン濃度、２μＬ
の試料サイズにおいてミリ偏光単位で示す。 【００６８】本発明のトレーサーおよび免疫原の最も好
ましい組み合わせ、すなわち、それぞれ上記「化１７」
および「化１５」で示される化合物の組み合わせから得
られる顕著な特徴は、（１）該免疫原に対して産生した
フェンシクリジン、フェンシクリジン代謝物およびフェ
ンシクリジン類似体に対するモノクローナル抗体の特異
性が非常に高いこと、および（２）他の薬物および他の
天然化合物に対する該抗体の交差反応性が最小であるこ
とである。 【００６９】下記表２は、上記「化１５」で示される構
造を有する免疫原に対して産生させたモノクローナル抗
体の特異性を、同じ免疫原に対して産生させたヒツジお
よびウサギのポリクローナル抗体の特異性と比較したも
のである。ヒツジおよびウサギからの抗血清およびマウ
スモノクローナル抗体を用い、１０種の異なる化合物の
パネルに対する交差反応性を調べた（抗体はすべて「化
１５」で示される構造を有する免疫原に対して産生した
ものであり、「化１７」で示されるトレーサーを用いて
試験した）。 【００７０】 【表２】 　　　　　　表２ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　濃度（ｎｇ／ｍＬ）添加し
た化合物　　　　　　　　　　ヒツジ　　　　　　　ウ
サギ　　　　　　　　　　　　　マウス（１００μｇ／
ｍＬ）　　　　　　　　　　　　　　６３０　６３１　
　　２２６３　２２６４　２２６５　２２６６　　　モ
ノクローナルアミトリプチリン　　　　　　　　６９　
　２１　　　　　２９　　　４８　　　１６　　　２６
　　　　　　　　４ノルチプチリン　　　　　　　　　
　２３　　１９　　　　　１９　　　４２　　　　９　
　　１９　　　　　　　低いイミプラミン　　　　　　
　　　　　　３７　　２５　　　　　２６　　　４９　
　　１９　　　２８　　　　　　　　３デシプラミン　
　　　　　　　　　　　３２　　２２　　　　　１９　
　　３４　　　１５　　　１９　　　　　　　　２デキ
ストロメトルファン　　６０　　１８　　　　　３３　
　　４０　　　３２　　低い　　　　　　３１ケタミン
　　　　　　　　　　　　　　　　２３　　３６　　　
　　２５　　　５１　　　　８　　　１３　　　　　　
　　３プロマジン　　　　　　　　　　　　　　２８　
　７２　　　　　３５　　　４６　　　１６　　　２５
　　　　　　　　４レバロルファン　　　　　　　　　
　３１　　４９　　　　　６２　　　７３　　　２７　
　　２７　　　　　　　１６シクリジン　　　　　　　
　　　　　　　４８　　３６　　　　　４８　　　３２
　　　５１　　　３５　　　　　　　　４ジフェンヒド
ラミン　　　　　　３０　　２４　　　　　３１　　　
３９　　　２５　　　２５　　　　　　　　１スパン１
（ｍＰ）　　　　　　　　　　　　　１９　　２６　　
　　　１９　　　１４　　　３３　　　３１　　　　　
　　１２スパン２（ｍＰ）　　　　　　　　　　　　　
８０　１０１　　　　　７８　　１００　　１４９　　
　９０　　　　　　　７８ 【００７１】（注）スパン１：２５ｎｇ／ｍＬのフェン
シクリジンを含有する試料とフェンシクリジンを含有し
ないコントロール試料とで得られた正味のミリ偏光読み
取り値の差異。 スパン２：フェンシクリジンを含有しない試料と５００
ｎｇ／ｍＬのフェンシクリジンを含有する最も高いカリ
ブレーターとで得られた正味のミリ偏光読み取り値の差
異。 低い：みかけの濃度が０のカリブレーター未満である場
合にアボットＴＤｘＲクリニカルアナライザーによりプ
リントされた結果。 【００７２】本発明の方法を行う際のｐＨは、トレーサ
ーのフルオレセイン残基が開環形で存在するのに充分な
ものでなければならない。ｐＨは約３〜１２、通常は約
５〜１０、最も好ましくは約６〜９の範囲である。アッ
セイ手順の間に上記ｐＨを達成および維持するために種
々の緩衝液を用いることができる。代表的な緩衝液とし
ては、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタ
ールなどが挙げられる。どの特定の緩衝液を使用するか
は本発明にとって重要ではないが、トリスおよびリン酸
緩衝液が好ましい。一般に、使用した緩衝液のカチオン
部分が溶液中のトレーサー塩のカチオン部分を決定する
。 【００７３】試料中に存在するリボフラビンと結合させ
て潜在的な蛍光妨害を除くため、試料または１種または
２種以上のアッセイ試薬にリボフラビン結合タンパク質
（ＲＢＰ）を加える。ＲＢＰは、卵の白身から単離され
る分子量が約３２，０００のタンパク質である。卵から
単離すると、ＲＢＰの各分子は１個のリボフラビン分子
を含有している。このハロタンパク質の形態のＲＢＰは
、酸性条件下で透析して結合リボフラビンを除くことに
よりアポタンパク質の形態に変換しなければならない。 本発明で使用するＲＢＰアポタンパク質は、シグマ・ケ
ミカル・カンパニー（セントルイス、ミズーリ）から市
販されている。試料中のすべての遊離のリボフラビンを
結合するのに充分な量であれば、使用量は重要ではない
。 【００７４】非常に高濃度の場合は、フェンシクリジン
およびフェンシクリジン代謝物は装置プローブのプラス
チック成分に付着する傾向がある。この結果、一つの試
料から他の試料へフェンシクリジンおよびフェンシクリ
ジン代謝物が持ち越されることになる。標準希釈緩衝液
（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．０１％ウシガンマグ
ロブリンおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有、ｐＨ
７．５）は、プローブからフェンシクリジンおよびフェ
ンシクリジン代謝物を除去するのに充分ではない。それ
ゆえ、約４０〜６０％（ｖ／ｖ）ジメチルホルムアミド
（好ましくは５０％）、約８〜１２％（ｖ／ｖ）ｎ−ブ
タノール（好ましくは１０％）、および約３〜５％塩化
ナトリウム（好ましくは４％）の水溶液を洗浄溶液とし
てキットに加える。 【００７５】本発明のアッセイの好ましい方法を以下に
さらに詳しく説明する。本発明のアッセイは「均一アッ
セイ」であり、このアッセイは、最終の偏光の読み取り
を結合トレーサーを未結合トレーサーから分離していな
い溶液中で行うことを意味する。この点は、読み取りを
行う前に結合トレーサーを未結合トレーサーから分離し
なければならない不均一イムノアッセイ法に比べて顕著
な利点である。 【００７６】本発明の蛍光偏光アッセイの試薬は、（１
）フェンシクリジンおよびフェンシクリジン代謝物に対
するモノクローナルまたはポリクローナル抗体；および
（２）トレーサー試薬からなる。モノクローナル抗体が
本発明のアッセイに使用する好ましい抗体である。本発
明のアッセイに使用するのに最も好ましい抗体は、上記
「化１５」で示される免疫原に対して産生させたモノク
ローナル抗体である。 【００７７】さらに、前処理溶液、希釈緩衝液、フェン
シクリジンカリブレーターおよびフェンシクリジンコン
トロールを含む通常の溶液を調製するのが望ましい。こ
れら試薬の典型的な溶液（その幾つかは以下に記載する
）は、アボット・ラボラトリーズ（アボットパーク、イ
リノイ）からのアッセイ「キッツ」中にて市販されてい
る。 【００７８】本明細書中に記載するパーセントは、特に
断らない限りすべてｗ／ｖである。現在のところ好まし
いトレーサー調製物は、［０．１モルのトリス緩衝液（
ｐＨ７．９）、１０％コール酸ナトリウム、０．１％ア
ジ化ナトリウムおよび０．０１％ウシガンマグロブリン
］中の１６４ナノモルのトレーサーである。抗血清調製
物は、［０．０５モルのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５
）、０．１％アジ化ナトリウム、１．０％卵アルブミン
および１０％グリセロール（ｖ／ｖ）］で希釈したマウ
スモノクローナル抗体からなる。希釈緩衝液は、０．１
モルリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、０．１％アジ化
ナトリウム、および０．０１％ウシガンマグロブリンか
らなる。前処理溶液は、０．０１％ウシガンマグロブリ
ン、０．１モルのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１
％アジ化ナトリウム、および１０ｍｇ／ｍＬのリボフラ
ビン結合タンパク質からなる。 【００７９】アッセイを行うのに使用する自動または半
自動装置のプローブを洗浄するのに用いる水性洗浄溶液
は、５０％（ｖ／ｖ）ジメチルホルムアミド、１０％（
ｖ／ｖ）ｎ−ブタノールおよび４％塩化ナトリウムを含
有する。正常ヒト尿中に０．０、２５．０、６０．０、
１２０．０、２５０．０および５００．０ｎｇ／ｍＬの
濃度でフェンシクリジンを含有するフェンシクリジンカ
リブレーター（保存剤として０．１％アジ化ナトリウム
を含有）が有用である。正常ヒト尿中に３５．０、１０
０．０および２５０．０ｎｇ／ｍＬの濃度でフェンシク
リジンを含有するフェンシクリジンコントロール（保存
剤として０．１％アジ化ナトリウムを含有）もまた有用
である。 【００８０】好ましい手順は、アボットＴＤｘＲクリニ
カルアナライザーまたはアボットＡＤｘＲドラッグズオ
ブアビューズシステム（両者ともアボット・ラボラトリ
ーズ、アボットパーク、イリノイから市販）とともに用
いるように設計したものである。５０μｌの尿が必要で
ある。カリブレーター、コントロールまたは未知試料を
ＴＤｘＲ試料カートリッジの試料ウエルに直接ピペット
で加える。この方法の利点の一つは、試料を特に調製す
る必要がないことである。この観点からアッセイ手順を
完全に自動化することができる。 【００８１】手動アッセイを行う場合は、試料を希釈緩
衝液中の前処理溶液と混合し、バックグラウンドの読み
取りを行う。ついで、トレーサーを上記アッセイと混合
する。ついで、最後に抗体を試験溶液中に混合する。イ
ンキュベーション後、蛍光偏光を読み取る。 【００８２】各カリブレーター、コントロールまたは試
料の蛍光偏光値を測定し、アボットＴＤｘＲアナライザ
ーやＡＤｘＲシステムなどの装置の出力テープ上にプリ
ントする。非線形回帰分析を用い、各カリブレーターの
濃度に対して偏光をプロットすることにより標準曲線を
装置中に作成する。各コントロールまたは試料の濃度を
貯蔵検量曲線から読み取り、出力テープ上にプリントす
る。 【００８３】上記手順に関し、トレーサー、抗体、前処
理溶液、洗浄溶液、カリブレーターおよびコントロール
は約２℃〜約８℃の間で貯蔵しなければならないが、希
釈溶液は周囲温度で貯蔵しなければならないことに注意
すべきである。標準曲線およびコントロールは２週間毎
に行い、各カリブレーターおよびコントロールは２つず
つで行う。試料はすべて２つずつで行う。 【００８４】本発明の最も好ましいアッセイ（上記「化
１５」で示される構造を有する免疫原に対して産生させ
たモノクローナル抗体、および上記「化１７」で示され
る構造を有するトレーサーを用いたもの）の顕著な特徴
は、フェンシクリジン、フェンシクリジン代謝物および
フェンシクリジン類似体に対する特異性が高いのに対し
て、多数の他の合成化合物や天然化合物に対する交差反
応性が高度に最小化されていることである。本発明のア
ッセイ（トレーサーは「化１７」で示される構造を有す
るものであり、抗体は「化１５」で示される免疫原に対
して産生させたものである）を用いたフェンシクリジン
代謝物およびフェンシクリジン類似体についての代表的
な交差反応性データを、下記表３に示す。表３において
４つのコラムはそれぞれ下記情報を示す。 【００８５】（１）コラム１：アッセイを行った特定の
化合物 （２）コラム２：薬剤不含尿に加えた被験化合物の量（
３）コラム３：試験後の尿中に認められた被験化合物の
量 （４）コラム４：交差反応性 コラム４の交差反応性（％）値は、下記数式に基づいて
得た。交差反応性％＝１００×（試験後のヒト尿中に検
出した被験化合物の濃度）／（正常薬剤不含ヒト尿に加
えた被験化合物の濃度） 【００８６】 【表３】 　　　　　　表３ 　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　２　　　　　　　　　　
３　　　　　　　　　　４４−ＯＨピプ（ｐｉｐ）フェ
ン　　　　　　　　　　　　　　１００，０００　　　
　　　　　ＨＩ　　　　　　　　　　ＮＲシクリジン（
ＰＣＰ代謝物）　　　　　　　　　　　　　　１０，０
００　　　　　　　　ＨＩ　　　　　　　　　　ＮＲ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１，０００　　　　　　１
４８．３３　　　　　　　１４．８　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１００　　　　　　　１６．６８　　　
　　　　１６．７　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
５０　　　　　　　　７．８０　　　　　　　１５．６
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　
　　５．５９　　　　　　　２２．４１−フェニルシク
ロヘキシル　　　　　　　　　　　１００，０００　　
　　　　　　ＮＤ　　　　　　　　　　　−アミン（Ｐ
ＣＰ代謝物）　　　　　　　　　　　　　　　Ｎ−エチ
ル−１−フェニルシクロ　　　　　　　１００，０００
　　　　　　１３９．７７　　　　　　　　０．１ヘキ
シルアミン（ＰＣＰ類似体）　　　　　　　　　　１０
，０００　　　　　　　１９．７５　　　　　　　　０
．２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１，０００　　　　
　　　　ＮＤ　　　　　　　　　　　−　　　　　　 【００８７】 １−（１−フェニルシクロヘキシル）　　　　　　　１
，０００　　　　　　　　ＨＩ　　　　　　　　　　Ｎ
Ｒピロリジン（ＰＣＰｙ）　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１００　　　　　　　８４．９８　　
　　　　　８５．０（ＰＣＰ類似体）　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０　　　
　　　　４３．７２　　　　　　　８７．４　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　２１．３
７　　　　　　　８５．５１−［１−（２−チエニル）
シクロ　　　　　　　　　　１，０００　　　　　　１
８５．５５　　　　　　　１８．６ヘキシル］モルホリ
ン（ＴＣＭ）　　　　　　　　　　　　　　１００　　
　　　　　２５．３３　　　　　　　２５．３（ＰＣＰ
類似体）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　５０　　　　　　　１３．２３　　　　
　　　２６．５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
５　　　　　　　　７．１１　　　　　　　２８．４１
−［１−（２−チエニル）シクロ　　　　　　　　　　
１，０００　　　　　　４６７．１７　　　　　　　４
６．７ヘキシル］ピペリジン（ＴＣＰ）　　　　　　　
　　　　　　　１００　　　　　　　５５．５７　　　
　　　　５５．６（ＰＣＰ類似体）　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０　　　　
　　　３０．２５　　　　　　　６０．５　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　１４．７４
　　　　　　　５９．０　　　　　　 【００８８】 １−［１−（２−チエニル）シクロ　　　　　　　　　
　１，０００　　　　　　３７７．６３　　　　　　　
３７．８ヘキシル］ピロリジン（ＴＣＰｙ）　　　　　
　　　　　　　１００　　　　　　　４６．２６　　　
　　　　４６．３（ＰＣＰ類似体）　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０　　　　
　　　２３．４６　　　　　　　４６．９　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　１２．６６
　　　　　　　５０．６　　　 （注）ＮＲ＝報告せず ＮＤ＊＝何も検出されず：アッセイ感度（５．００ｎｇ
／ｍＬ）未満の濃度ＨＩ＝濃度が最高のカリブレーター
よりも大きい場合にアボットＴＤｘＲク リニカルアナライザーによりプリントされた結果【００
８９】本発明のアッセイの他の利点は、非フェンシクリ
ジン化合物とのアッセイの交差反応性が低いことである
。フェンシクリジンと化学構造が類似している化合物に
ついてのアッセイの交差反応性が低いことを示す代表的
交差反応性データを下記表４に示す（「化１７」で示さ
れる構造を有するトレーサーおよび「化１５」で示され
る構造を有する免疫原に対して産生されたモノクローナ
ル抗体に対して）。表４中の４つのコラムは上記表３に
示したのと同じ情報を示す。 【００９０】 【表４】 　　　　　　表４ 　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　２　　　　　　　　　　　　３　
　　　　　　　　　４　　　　デキストロメトルファン
　　　　　　１００，０００　　　　２０．７９　　　
　＜０．１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１０，０００　　　　　　ＮＤ＊
　　　　　　　　−フェンカムファミン　　　　　　　
１，０００，０００　　　　２０．５８　　　　＜０．
１（Ｆｅｎｃａｍｆａｍｉｎｅ）　　　　　　　　　　
　　　　１００，０００　　　　　　ＮＤ＊　　　　　
　　　−レバロルファン　　　　　　　　　　　　　　
１００，０００　　　　　　６．０２　　　　＜０．１
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５０，０００　　　　　　ＮＤ＊　　　　　
　　　−フェニルトロキサミン　　　　　１，０００，
０００　　　　　　７．７２　　　　＜０．１　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
００，０００　　　　　　ＮＤ＊　　　　　　　　−　
　　　　　 【００９１】 ピセナドール　　　　　　　　　　　　　１，０００，
０００　　　　１５．０４　　　　＜０．１（Ｐｉｃｅ
ｎａｄｏｌ）　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
０，０００　　　　　　ＮＤ＊　　　　　　　　−プロ
リンタン　　　　　　　　　　　　　　　　１００，０
００　　　　１５．６６　　　　＜０．１　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
０，０００　　　　　　ＮＤ＊　　　　　　　　−チオ
リダジン　　　　　　　　　　　　　１，０００，００
０　　　　３４．２３　　　　＜０．１　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００，
０００　　　　　　ＮＤ　　　　　　　　　　−　　　
　　 （注）ＮＤ＊＝何も検出されず：アッセイ感度（５．０
０ｎｇ／ｍＬ）未満の濃度 【００９２】加えて、下記に掲げる化合物は１００ｎｇ
／ｍＬで試験した場合に５．０ｎｇ／ｍＬ未満の交差反
応性を示した。 アセトアミノフェン アセトプロマジン Ｎ−アセチル−１−システイン アセチルサリチル酸 アロバルビタール α−メチル−１−ＤＯＰＡ アルファプロジン アルフェナール アルプラゾラム 【００９３】アルプレノロール アマンタジン アミノグルテチミド アミノピリン ＊アミトリプチリン シス−１０−ＯＨ−アミトリプチリン トランス−１０−ＯＨ−アミトリプチリンアモバルビタ
ール アモキシシリン ｄ，ｌ−アンフェタミン ｐ−ＯＨ−アンフェタミン 【００９４】アンフォテリシン アンピリシン アニレリジン アンタビュース ＊アポモルヒネ アプロバルビタール アスパルテーム アテノロール アトロピン ＊アザタジン バルビタール 【００９５】バルビツール酸 ベルコメタゾン ベナクチジン ベンゾカイン 安息香酸 ベンゾイルエクゴニン ベンズトロピン ベンジルペニシリン ブラロバルビタール ブロモクリプチン ブロムフェニラミン ブピバカイン 【００９６】ブプレノルフィン ブスピロン ブタバルビタール ブテタール ブトルファノール ブチロフェノン カフェイン 次亜塩素酸カルシウム カルバマゼピン カルバマゼピン−１０，１１−エポキシドカリソプロド
ール カルフェナジン 【００９７】セファレキシン セファロリジン ＊抱水クロラール クロラムフェニコール クロルジアゼポキシド クロロキン クロロチアジド ＊クロルフェニラミン クロルプロマジン クロルプロマジド クロルゾキサゾン コレステロール 【００９８】シメチジン シプロフロキサシン クレマスタチン クリンダマイシン クロミプラミン クロニジン コカイン コデイン コーチゾン β−コルトール シクリジン シクロバルビタール 【００９９】シクロベンザプリン シクロヘプタジン デオキシコルチコステロン デシプラミン ジアセチルモルヒネ ジアゼパム ジベンゼピン ジブカイン ジエチルプロピオン ジフルニサール ジギトキシン ジゴキシン 【０１００】ジヒドロコデイン ジヒドロモルヒネ １０，１１−ジヒドロキシカルバマゼピンジルチアゼム １，３−ジメチルバルビツール酸 ＊ジフェンヒドラミン ジフェノキシレート ジフェニルヒダントイン ドーパミン ドチエピン ＊ドキセピン ＊ドキシラミン エクゴニン 【０１０１】エフェドリン エピネフリン エリスロマイシン エストラジオール エストリオール エストロン−３−サルフェート エタンブトール エチナメート ４−エチル−２，５−ジメトキシアンフェタミン（ＤＯ
ＥＴ） エチルモルヒネ フェンカムファミン ＊フェンフルラミン 【０１０２】フェノプロフェン フェンタニル フルフェナミン酸 ＊フルオキセチン フルフェナジン＊フルラゼパム フルルビプロフェン フロセミド ゲンチシン酸 グルテチミド グリコピロレート ＊グアイアコールグリセリルエーテル 【０１０３】ハロペリドール ヘキソバルビタール 馬尿酸 ヒスタミン ヒドララジン ヒドロクロロチアジド ヒドロコドン ヒドロコルチゾン ヒドロモルホン ５−ヒドロキシ−３−酢酸 ５−ヒドロキシ−２−カルボン酸 【０１０４】５−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−５−フ
ェニルヒダントイン（ＨＰＰＨ） ヒドロキシジン ＊イブプロフェン ＊ＣＯＯＨ−イブプロフェン ＊ＯＨ−イブプロフェン イミノスチルベン イミプラミン インドール−３−酢酸 インドール−３−酪酸 インドメタシン イプロニアジド イソプロテレノール 【０１０５】イソキシスプリン ＊ケタミン ケトプロフェン ラベタロール レボルファノール レボチロキシン リドカイン ＊ロペラミド ロラタジン ＊ロラゼパム ロキサピン ＬＳＤ 【０１０６】マプロチリン マジンドール メフェナミン酸 メラニン メペリジン メフェニトイン メピバカイン メプロバメート メスカリン メサドン メサドン主代謝物 【０１０７】ｄ−メタンフェタミン ｄ，ｌ−メタンフェタミン メタピリレン メタクアロン メタルビタール メトカルバモール メトトリメプラジン メトキシフェナミン メトキシプロマジン メトスクシミド ４−メチル−２，５−ジメトキシアンフェタミン（ＤＯ
Ｍ） ３，４−メチレンジオキシ−Ｎ−エチルアンフェタミン
（ＭＤＡ） 【０１０８】３，４−メチレンジオキシメタンフェタミ
ン（ＭＤＭＡ） ＊メチルフェニデート メチプリロン ＊メトクロプラミド メトプロロール メトロニダゾール ミダゾラム ６−モノアセチルモルヒネ モノエチルグリシンキシリジド（ＭＥＧＸ）＊モルヒネ モルヒネ−３β−Ｄ−グルクロニド ナフシリン 【０１０９】ナルブフィン ナロルフィン ナロキソン ナルトレキソン ナプロキセン ナイアシンアミド ニコチン ニコチン酸 ニフェジピン ｐ−ニトロフェノール ノミフェンシン 【０１１０】ノルクロリアゼポキシド ＊Ｎ−ノルコデイン ノルドキセピン ノルエチンドロン ＊Ｎ−ノルモルヒネ Ｎ−ノルオキシモルヒネ Ｎ−ノルプロポキシフェン ノルトリプチリン シス−１０−ＯＨ−ノルトリプチリン トランス−１０−ＯＨ−ノルトリプチリンニリドリン 【０１１１】オクトパミン オピプラモール オロチン酸 ＊オルフェナドリン オキサゼパム ＊オキシコデイン オキシメタゾリン ＊オキシモルホン オキフェンブタゾン ペモリン ペニシリンＧ 【０１１２】ペンタゾシン ペントバルビタール ペルフェパジン フェナセチン ＊フェンジメトラジン フェネルジン フェネチルアミン フェンホルミン フェニラミン フェンメトラジン フェノバルビタール 【０１１３】フェノチアジン ＊フェンテルミン フェニルブタゾン フェニルプロパノールアミン フェニトイン ピペラセタジン １−ピペリジノシクロヘキサンカルボニトリルピロキシ
カム 塩化カリウム プラゾシン プレドニゾロン プレドニゾン 【０１１４】プレグネノロン プリロカイン プリミドン プロベネシド プロカインアミド プロカイン プロクロルペラジン プロゲステロン プロマジン プロメタジン プロポキシフェン 【０１１５】プロプラノロール ＊プロピルヘキセドリン プロトリプチリン 偽エフェドリン ＊ピリラミン キニジン キニン ＊ラニチジン サリチル酸 スコポラミン セコバルビタール セロトニン ストリキニン 【０１１６】スドキシカム スルファメタジン スルファメトキサゾール スルファチアゾール スリンダク テルブタリン テルフェナジン テストステロン テトラカイン テトラサイクリン ＊＊１１−ノル−デルタ−９−テトラヒドロカンナビノ
ール−９−カルボン酸 テトラヒドロコルチゾン 【０１１７】テトラヒドロゾリン テバイン ＊テニルジアミン テオフィリン チオプロバゼート チオチキセン トルブタミド トラニルシプロミン トラゾドン トリアムテレン トリフルオペラジン トリヘキシフェニジル 【０１１８】トリメトプリム トリミプラミン ＊トリペレナミン トリプロリジン トロープ酸（Ｔｒｏｐｉｃ　ａｃｉｄ）トロピン トリプタミン チラミン 尿酸 ワーファリン ゾメピラク アモキサピン ニアラミド ナファゾリン ＊：１，０００μｇ／ｍＬで試験 ＊＊：１０μｇ／ｍＬで試験 【０１１９】薬剤不含尿試料およびフェンシクリジンお
よびフェンシクリジン代謝物を含有する尿試料をフェン
シクリジンを検出するための他の方法、たとえばガスク
ロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、ラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）および酵素多重イムノアッセイ
法（ｅｎｚｙｍｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ　ｉｍｍｕｎ
ｏａｓｓａｙ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ＥＭＩＴ）によ
り試験することにより、本発明のアッセイ法をこれら方
法と比較した。本発明の最も好ましいアッセイ（「化１
７」で示される構造を有するトレーサーおよび「化１５
」で示される構造を有する免疫原に対して産生させたモ
ノクローナル抗体を使用）をＥＭＩＴおよびＧＣ／ＭＳ
と比較した代表的データを下記表５に、本発明のアッセ
イをＲＩＡおよびＧＣ／ＭＳと比較した代表的データを
下記表６に示す。 【０１２０】 【表５】 　　　　　　表５ 　　　　　　　　　　　　　　　　Ｎ　　　　　ＴＤｘ
　　　　　　　ＡＤｘ　　　　　　ＥＭＩＴ　　　　Ｇ
Ｃ／ＭＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　陽性／陰性　　　　陽性／陰性　　　　陽性／陰性　
　　陽性／陰性ＴＤｘにより　　１０１　　０／１０１
　　　　０／１０１　　　　０／１０１　　　　０／２
＜２５ｎｇ／ｍＬ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　９９ＮＴＴＤｘにより　　　　９８　
　９８／０　　　　　　９８／０　　　　　　９５／３
＊　　　　９８／０≧２５ｎｇ／ｍＬ （注）＊：下記表参照 【０１２１】 　　試料＃　　　　　　ＴＤｘ　　　　　　ＡＤｘ　　
　　　　ＥＭＩＴ　　　　　　　ＧＣ／ＭＳ　　　　　
　　　　　　　　　（ｎｇ／ｍＬ）　　　　（ｎｇ／ｍ
Ｌ）　　　　　　陽性／陰性　　　　　　　　（ｎｇ／
ｍＬ）　　１１　　　　　　　４０．２５　　　４０．
４　　　　　　　　陰性　　　　　　　　　　　　３９
　　６０　　　　　　　５９．０７　　　５９．４　　
　　　　　　陰性　　　　　　　　　　　　４１　　７
９　　　　　　　４５．９９　　　４７．６　　　　　
　　　陰性　　　　　　　　　　　　３９【０１２２】 【表６】 　　　　　　表６ 　　　　　　　　　　　　　　　　Ｎ　　　　　ＴＤｘ
　　　　　　　ＡＤｘ　　　　　　　ＲＩＡ　　　　　
ＧＣ／ＭＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　陽性／陰性　　　　陽性／陰性　　　　陽性／陰性
　　　陽性／陰性ＴＤｘにより　　１００　　０／１０
０　　　　０／１００　　　　０／１００　　１００Ｎ
Ｔ＜２５ｎｇ／ｍＬ ＴＤｘにより　　１０１　　１０１／０　　　　１００
／１＊　　１０１／０　　１０１／０≧２５ｎｇ／ｍＬ （注）＊：下記表参照 【０１２３】 　　試料＃　　　　　　ＴＤｘ　　　　　　ＡＤｘ　　
　　　　　ＲＩＡ　　　　　　　　ＧＣ／ＭＳ　　　　
　　　　　　　　　　（ｎｇ／ｍＬ）　　　　（ｎｇ／
ｍＬ）　　　　　　陽性／陰性　　　　　　　（ｎｇ／
ｍＬ）　　１５２　　　　　２６．３２　　　２４．９
　　　　　　　　陽性　　　　　　　　　　　２６（注
）ＮＴ＝試験せず 　　　　ＴＤｘおよびＡＤｘにより「陽性」＝閾値（２
５ｎｇ／ｍＬフェンシクリジン）以上の濃度 　　　　ＲＩＡにより「陽性」＝閾値（２５ｎｇ／ｍＬ
フェンシクリジン）以上の毎分放射能数 　　　　ＥＭＩＴにより「陽性」＝ＥＭＩＴローカリブ
レーター（７５ｎｇ／ｍＬ）以上の吸光度 　　　　ＧＣ／ＭＳにより「陽性」＝２５ｎｇ／ｍＬフ
ェンシクリジン以上の濃度【０１２４】つぎに、本発明
を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明は
これらに限られるものではない。実施例Ｉ〜ＩＩＩおよ
びＸＶＩＩは抗体の産生に有用な免疫原の調製に関する
ものであり、実施例ＩＶ〜ＩＸ、ＸＩおよびＸＩＩは免
疫原およびトレーサーの前駆体の合成に関するものであ
り、実施例ＸおよびＸＩＩＩ〜ＸＶＩはトレーサーの調
製に関するものであり、実施例ＸＶＩＩＩは「化１５」
で示される構造を有する免疫原に対するモノクローナル
抗体を調製する実験に関する。 【０１２５】実施例Ｉ １−（１−フェニルシクロヘキシル）ピペラジン免疫原
：５０％メタノール／水（２ｍｌ）中の１−（１−フェ
ニルシクロヘキシル）ピペラジン（２５ｍｇ）を撹拌下
に蒸留水（２ｍｌ）中のウシ血清アルブミン（３０ｍｇ
）に加えた。０．１Ｎ　ＨＣｌを用いてｐＨを５．５に
調節した。 蒸留水（２ｍｌ）中の１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド（１ｇ）を４回に分け
て加え、各添加後に０．１Ｎ　ＨＣｌを用いてｐＨを５
．５に調節した。ついで、この混合物を室温で１８時間
撹拌した。この混合物をセルロース透析チューブ（スペ
クトラ／ポルＲ，分子量１２，０００〜１４，０００）
中で蒸留水に対して４日間透析した。透析チューブから
の溶液は、ビウレットタンパク質濃度決定法により２．
７ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含有していることが認めら
れた。 【０１２６】実施例ＩＩ ４−（１−（１−フェニルシクロヘキシル））ピペリジ
ニルクロロホルメート免疫原： ジメチルホルムアミド（０．２５ｍｌ）中の４−（１−
（１−フェニルシクロヘキシル））ピペリジニルクロロ
ホルメート（５７ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）中のウシ血清アルブミン（５０ｍｇ）に加え、
室温で１時間撹拌した。この混合物をセルロース透析チ
ューブ（スペクトラ／ポルＲ、分子量１２，０００〜１
４，０００）中で蒸留水に対して２日間、０．９０％食
塩水に対して１日透析した。透析チューブからの溶液は
、ビウレットタンパク質濃度決定法により１５．４ｍｇ
／ｍｌのタンパク質を含有していることが認められた。 【０１２７】実施例ＩＩＩ ４−アミノ−１−（１−フェニルシクロヘキシル）ピペ
リジン免疫原： ジメチルホルムアミド（２．５ｍｌ）および蒸留水（７
．５ｍｌ）中の４−アミノ−１−（１−フェニルシクロ
ヘキシル）ピペリジン（４０ｍｇ）を撹拌下に蒸留水（
２．０ｍｌ）中のウシ血清アルブミン（６９．５ｍｇ）
に加え、０．１Ｎ　ＨＣｌを用いてｐＨを５．０〜５．
５に調節した。０．１Ｎ　ＨＣｌでｐＨを５．０〜５．
５に保持しながら、１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド（６０ｍｇ）を加えた。 この混合物を室温で２時間撹拌した。この混合物をセル
ロース透析チューブ（スペクトラ／ポルＲ、分子量１２
，０００〜１４，０００）中で蒸留水に対して３日間透
析した。透析チューブからの溶液は、ビウレットタンパ
ク質濃度決定法により４．１９ｍｇ／ｍｌのタンパク質
を含有していることが認められた。 【０１２８】実施例ＩＶ １−ベンジル−４−（１−シアノシクロヘキシル）ピペ
ラジン： １−ベンジルピペラジン（アルドリッチ・ケミカル）（
６．１２ｇ）を脱イオン水（１０ｍｌ）中に溶解し、０
℃に冷却した。濃塩酸（３．６ｍｌ）を加えてｐＨを５
に調節した。室温に温めた後、シクロヘキサノン（３．
６ｍｌ）を加え、ついで脱イオン水（６ｍｌ）中のシア
ン化カリウム（２．４ｇ）を加えた。この溶液はゆっく
りと濁った。１８時間後、固体を濾過した。この固体を
クロロホルム中に溶解し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過
し、溶媒を減圧除去して純粋な１−ベンジル−４−（１
−シアノシクロヘキシル）ピペラジンを得た。 【０１２９】実施例Ｖ １−ベンジル−４−（１−フェニルシクロヘキシル）ピ
ペラジン： 乾燥テトラヒドロフラン（３０ｍｌ）中のブロモベンゼ
ン（０．６ｇ）およびマグネシウム末（０．２ｇ）に窒
素雰囲気下、小結晶のヨウ素および１０滴の１，２−ジ
ブロモエタンを加えた。小さな泡が生成し始めた後、反
応液を撹拌し、４時間加熱還流した。室温に冷却後、１
−ベンジル−４−（１−シアノシクロヘキシル）ピペラ
ジン（１ｇ）を加えた。２３時間後、反応液を濾過し、
飽和水性塩化アンモニウム（２０ｍｌ）を加え、混合物
をジエチルエーテルで抽出した。このエーテルを乾燥し
、減圧除去した。残渣をシリカゲル上のクロマトグラフ
ィーに付し、クロロホルムで溶離して純粋な１−ベンジ
ル−４−（１−フェニルシクロヘキシル）ピペラジンを
得た。 【０１３０】実施例ＶＩ １−（１−フェニルシクロヘキシル）ピペラジン：１−
ベンジル−４−（１−フェニルシクロヘキシル）ピペラ
ジン（０．４７ｇ）をメタノール（８６ｍｌ）および０
．２ＮＨＣｌ／メタノール（１４ｍｌ）中に溶解した。 この混合物を室温にて１時間、パラジウムブラック（０
．１１７５ｇ）および３気圧の水素で水素化した。反応
液を濾過し、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲル上
のクロマトグラフィーに付し、メタノールとクロロホル
ムの適当な混合物で溶離して純粋な１−（１−フェニル
シクロヘキシル）ピペラジンを得た。 【０１３１】実施例ＶＩＩ １−（１−シアノシクロヘキシル）−４−ヒドロキシピ
ペリジン： ４−ヒドロキシピペリジン（アルドリッチ・ケミカル）
（５ｇ）を蒸留水（１４ｍｌ）中に溶解し、０℃に冷却
し、濃塩酸および４−ヒドロキシピペリジンを加えてｐ
Ｈを４〜５に調節した。室温に温めた後、シクロヘキサ
ノン（５．２ｍｌ）および水（９ｍｌ）中のシアン化カ
リウム（３．３ｇ）を順番に加えた。室温で１８時間撹
拌した後、固体を濾過した。この固体を塩化メチレン（
１００ｍｌ）中に溶解し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過
し、溶媒を減圧除去して純粋な１−（１−シアノシクロ
ヘキシル）−４−ヒドロキシピペリジンを得た。 【０１３２】実施例ＶＩＩＩ １−（１−フェニルシクロヘキシル）−４−ヒドロキシ
ピペリジン： 乾燥テトラヒドロフラン（２００ｍｌ）中のブロモベン
ゼン（４．１ｍｌ）およびマグネシウム末（４ｇ）に、
窒素雰囲気下、ヨウ素の結晶および１０滴の１，２−ジ
ブロモエタンを加えた。小さな泡が生成し始めた後、反
応液を撹拌し、４時間加熱還流した。室温に冷却した後
、１−（１−シアノシクロヘキシル）−４−ヒドロキシ
ピペリジン（２ｇ）を加えた。１７時間後、反応液を濾
過し、飽和塩化アンモニウム（１２０ｍｌ）を加え、混
合物をエチルエーテルで抽出した。このエーテル層を乾
燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲル上のクロ
マトグラフィーに付し、メタノールとクロロホルムの適
当な混合物で溶離して純粋な１−（１−フェニルシクロ
ヘキシル）−４−ヒドロキシピペリジンを得た。 【０１３３】実施例ＩＸ ４−（１−（１−フェニルシクロヘキシル））ピペリジ
ニルクロロホルメート： １−（１−フェニルシクロヘキシル）−４−ヒドロキシ
ピペリジン（０．２６１ｍｇ）を乾燥ベンゼン（５ｍｌ
）中に懸濁し、１０％ホスゲン／ベンゼン（２ｍｌ）を
加えた。 撹拌後、室温で３時間栓をし（ｓｔｏｐｐｅｒｉｎｇ）
、クロロホルム（１ｍｌ）を加えた。３０分後、溶媒を
減圧除去した。 四塩化炭素（乾燥）（１ｍｌ）を加え、減圧除去して４
−（１−（１−フェニルシクロヘキシル））ピペリジニ
ルクロロホルメートを白色固体として得た。 【０１３４】実施例Ｘ ４−（５−フルオレセイニルカルバモイル）−１−（フ
ェニルシクロヘキシル）ピペリジン： ４−（１−（１−フェニルシクロヘキシル））ピペリジ
ニルクロロホルメート（１０ｍｇ）および５−アミノフ
ルオレセイン（１０ｍｇ）を乾燥ピリジン（２ｍｌ）中
に溶解し、室温で約１８時間撹拌した。反応液をシリカ
ゲルプレパラティブプレート上のクロマトグラフィーに
付し、適当な比のメタノール、クロロホルムおよび酢酸
で溶離して所望のトレーサーを得た。 【０１３５】実施例ＸＩ １−（１−フェニルシクロヘキシル）−４−ピペリドン
：１−（１−フェニルシクロヘキシル）−４−ヒドロキ
シピペリジンを氷酢酸（１５ｍｌ）および濃硫酸（０．
３ｍｌ）中に溶解し、ジョーンズ試薬（１．９ｍｌ）（
Ｈ２ＣｒＯ４（２６．７２ｇ）およびＨ２ＳＯ４（２３
ｍｌ）を水で１００ｍｌに希釈して調製）を滴下した。 室温で２０分間撹拌した後、２−プロパノール（２ｍｌ
）、Ｚｎ（Ｈｇ）（古い（ｍｏｓｓｙ）亜鉛（１．５ｇ
）および塩化第二水銀（０．２ｇ）を水（２０ｍｌ）お
よび濃塩酸（０．２５ｍｌ）中、室温にて３分間入れて
調製）、クエン酸ナトリウム二水和物（３．６ｇ）およ
び脱イオン水（３５ｍｌ）を順番に加えた。この溶液を
室温にて３０分間撹拌した後、反応液をクロロホルムで
抽出した。溶媒を減圧除去した。蒸留水を加え、減圧除
去した。残渣をシリカゲル上のクロマトグラフィーにか
け、メタノールとクロロホルムの適当な混合物で溶離し
て純粋な１−（１−フェニルシクロヘキシル）−４−ピ
ペリドンを得た。 【０１３６】実施例ＸＩＩ ４−アミノ−１−（１−フェニルシクロヘキシル）ピペ
リジン： １−（１−フェニルシクロヘキシル）−４−ピペリドン
（０．２４５ｇ）および酢酸アンモニウム（１ｇ）を乾
燥メタノール（３．５ｍｌ）中に溶解した。室温で１０
分間撹拌した後、水素化シアノホウ素ナトリウム（０．
１ｇ）を加え、栓をした。２０時間後、濃塩酸（０．１
ｍｌ）を加え、ついで水（１０ｍｌ）を加え、混合物を
１．５時間撹拌した。この溶液を炭酸カリウムでｐＨ９
の塩基性にし、塩化メチレンで抽出した。この塩化メチ
レンをＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧除去した。生成物を
減圧下（約５ｍｍＨｇ）、９０〜１３０℃にて無色透明
の油状物として蒸留した。 【０１３７】実施例ＸＩＩＩ ４−（４−クロロ−６−（５−フルオレセイニルアミノ
）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ−１−
（１−フェニルシクロヘキシル）ピペリジン：４−アミ
ノ−１−（１−フェニルシクロヘキシル）ピペリジン（
９ｍｇ）および５−（（４，６−ジクロロ−１，３，５
−トリアジン−２−イル）アミノ）フルオレセイン（１
７ｍｇ）を、メタノール（１ｍｌ）およびトリエチルア
ミン（０．１ｍｌ）中に溶解した。室温にて３０時間撹
拌した後、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲル上の
クロマトグラフィーにかけ、メタノールとクロロホルム
の適当な混合物で溶離してトレーサーを得た。 【０１３８】実施例ＸＩＶ ４−（４−クロロ−６−（６−フルオレセイニルアミノ
）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ−１−
（１−フェニルシクロヘキシル）ピペリジン：５−（（
４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル
）アミノ）フルオレセインの代わりに６−（（４，６−
ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ
）フルオレセインを用いる他は実施例ＸＩＩＩと同様に
して目的化合物を得た。 【０１３９】実施例ＸＶ ４−（フルオレセイン−６−イルカルボニル）アミノ−
１−（１−フェニルシクロヘキシル）ピペリジン：６−
カルボキシフルオレセイン［カルバイオケム（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ）、ラジョラ、ＣＡ］（１４ｍｇ）、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミド（６ｍｇ）およびＮ，Ｎ’−
ジシクロヘキシルカルボジイミド（１４ｍｇ）を乾燥ピ
リジン（０．５ｍｌ）中に溶解し、室温で撹拌し、つい
で栓をした。１時間後、４−アミノ−１−（１−フェニ
ルシクロヘキシル）ピペリジン（９ｍｇ）を加え、つい
で乾燥ピリジン（０．５ｍｌ）を加えた。１５時間後、
反応液をシリカゲルプレパラティブプレート上のクロマ
トグラフィーにかけ、メタノール、クロロホルムおよび
酢酸の適当な混合物で溶離した。 【０１４０】実施例ＸＶＩ ４−（フルオレセイン−５−イルカルボニル）アミノ−
１−（１−フェニルシクロヘキシル）ピペリジン：６−
カルボキシフルオレセインの代わりに５−カルボキシフ
ルオレセイン（カルバイオケム、上記）を用いる他は実
施例ＸＶと同様にして目的化合物を得た。 【０１４１】実施例ＸＶＩＩ Ｎ−［３−ヒドロキシメチルピペリジノ］シクロヘキシ
ルカルボニトリル（最も好ましい免疫原−「化１５」−
の調製）： 無水エタノール（８ｍｌ）と水（８ｍｌ）の混合物中の
３−ヒドロキシメチルピペリジン（１．００ｇ、８．６
８ミリモル）の溶液を０℃に冷却し、濃塩酸でｐＨ３〜
４の酸性にした。ついで、シクロヘキサノン（０．８３
ｍｌ、８．０４ミリモル）およびシアン化カリウム（５
５０ｍｇ、８．４３ミリモル）を加え、きつく栓をし、
周囲温度で一夜撹拌した。この反応混合物をロートバプ
（ｒｏｔｏｖａｐ）上で濃縮し、水酸化ナトリウムでｐ
Ｈ８〜９の塩基性にし、クロロホルム（３×３０ｍｌ）
で抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し
た。シリカゲルカラム上のクロマトグラフィー（溶離液
として５％メタノール／クロロホルム）により淡黄色の
油状物（１．２６８ｇ）を得た。 【０１４２】１−［Ｎ−［３−ヒドロキシメチルピペリ
ジノ］］−１−フェニルシクロヘキサン：上記工程で調
製した油状物（５６３ｍｇ、２．５４ミリモル）のテト
ラヒドロフラン（１５ｍｌ）中の溶液（０℃に冷却）に
、フェニルマグネシウムブロマイド（５．０８ｍｌ、３
．０Ｍ、１５．２ミリモル）を加えた。この溶液を５分
間撹拌し、５５℃に２．５時間温めた。冷却させた後、
周囲温度で１２時間撹拌した。水および塩化アンモニウ
ムで反応停止させ、酢酸エチル（３×３０ｍｌ）で抽出
した。コンバインした抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し
、濃縮した。シリカゲルカラム上のクロマトグラフィー
にかけ、１０％メタノール／クロロホルムで溶離して無
色透明な油状物（３６５ｍｇ）を得た。 【０１４３】１−［Ｎ−（３−カルボキシピペリジノ）
］−１−フェニルシクロヘキサン： 上記工程で調製したアルコール化合物（１５０ｍｇ、０
．５５ミリモル）の氷酢酸（５．５ｍｌ）中の溶液（０
℃に冷却）に、氷酢酸（１．５ｍｌ）と水（１．０ｍｌ
）の混合物中の三酸化クロム（１３７ｍｇ、１．３８ミ
リモル）の溶液を加えた。反応液を周囲温度に温め、５
時間撹拌した。 回転蒸発してほとんどの酢酸を除去し、残渣を水中に希
釈し、１Ｍ　ＮａＯＨでｐＨ７〜８の塩基性にし、クロ
ロホルム（５×１５ｍｌ）で抽出した。コンバインした
抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。シリカゲ
ル上のクロマトグラフィー（８％メタノール／クロロホ
ルムで溶離）にかけて、幾らかの不順な生成物とともに
無色透明の油状物（６６ｍｇ）を得た。 【０１４４】タンパク質担体へのハプテンの結合：１−
［Ｎ−（カルボキシピペリジノ）］−１−フェニルシク
ロヘキサン（６０ｍｇ、１．０５×１０−４モル）をジ
メチルスルホキシド（２．０ｍｌ）中に溶解した。この
溶液に各１．７４×１０−４モルのＮ−ヒドロキシスク
シンイミドおよびジシクロヘキシルカルボジイミドを加
えた。この混合物を室温にて２時間撹拌した。ついで、
この活性エステルを含有する溶液を、ＤＭＳＯ：０．０
５Ｎリン酸ナトリウム（１：１）（３７ｍｌ；最終ｐＨ
８．５）中に溶解したウシチログロブリン（１００ｍｇ
）の溶液（すばやく撹拌）に加えた。この混合物を室温
にて一夜撹拌し、ついで６０％ＤＭＳＯに対して８時間
透析した。つぎの透析の間にＤＭＳＯは２５％に減少し
た。最後の３回の透析変更は、０．０５Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．５）であった。得られた綿毛状の
白色沈殿を透析バッグから除き、遠心分離により回収し
た。沈殿を含有するペレットを最小量の緩衝液中に再懸
濁し、実施例ＸＶＩＩＩにおいて免疫原として用いた。 【０１４５】実施例ＸＶＩＩＩ 「化１５」で示される構造を有する免疫原に対するモノ
クローナル抗体（最も好ましい抗体）の調製：ＲＩＢＩ
アジュバント（ＲＩＢＩイムノケム、ハミルトン、モン
タナ）中に１：１に混合した「化１５」で示される構造
を有する免疫原（１００μｇ）を用い、６週齢の雌ＢＡ
ＬＢ／ｃマウスの後部腹部の腹腔内の２つの異なる部位
に１週目、５週目、９週目および１６週目に腹腔内免疫
した。 【０１４６】上記免疫マウスにより産生される抗体がフ
ェンシクリジンおよびフェンシクリジン代謝物に対して
特異的かどうかを決定するため、試料に遊離のフェンシ
クリジンを加えて競合イムノアッセイを行う。遊離のフ
ェンシクリジンは、抗体上の結合部位に対してトレーサ
ーと競合するであろう。遊離のフェンシクリジンが上記
抗体と結合すれば、このことは該抗体がフェンシクリジ
ンに特異的であることを示しており、このためトレーサ
ーが該抗体に結合するのが妨げられるであろう。それゆ
え、試料中に存在するトレーサー−抗体複合体は少なく
なり、その結果、全体のシグナル（アボットＴＤｘＲア
ナライザーなどの装置による蛍光読み取りの量）は少な
くなるであろう。 【０１４７】各免疫から２週間後に血清試料を取り、つ
いでアボット・ラボラトリーズ（アボットパーク、イリ
ノイ）から入手したアボット・ラボラトリーズのＴＤｘ
Ｒクリニカルアナライザー、およびパンデックススクリ
ーンマシーン［バックスター・ヘルスケア・コーポレー
ション（Ｂａｘｔｅｒ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ）、マンデレイン、イリノイ］上で分
析した。４回目の免疫およびその血清試料の分析後、ミ
エローマ細胞とのＢリンパ球の融合に用いるため４匹の
マウスを選択した。これら各マウスは、「化１７」の構
造を有するトレーサー化合物を用いた競合結合イムノア
ッセイにおいて５００ｎｇ／ｍｌの遊離フェンシクリジ
ンを用い、全シグナルの５０％置換に基づいてフェンシ
クリジンおよびフェンシクリジン代謝物に特異的な抗体
を産生していることがわかった。 【０１４８】マウスＢリンパ球をミエローマ細胞と融合
させる４日前に、上記４匹の応答マウスの１匹の上記２
つの腹部腹腔のそれぞれに同じ免疫原（２５０μｇ、合
計５００μｇ）を再注射した。 【０１４９】ついで、標準法によりＢリンパ球をマウス
から採取した。一般に、マウスを屠殺し、７０％ＥｔＯ
Ｈに浸け、ついで滅菌装置を用いて脾臓を無菌的に取り
出した。脾臓を１％ペンストレップ（ｐｅｎ−ｓｔｒｅ
ｐ）および１％Ｌ−グルタミンを添加したＩＭＤＭ［イ
スコーブ修正ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）
］中で洗浄し、ペトリ皿に移した。１２ｍｌ容注射器上
の２３ｇ針を用い、脾臓に２０の穴をあけた。さらに、
この注射器を用い、１％ペンストレップおよび１％Ｌ−
グルタミンを添加したＩＭＤＭ（１０ｍｌ）の２回の注
射により脾臓からＢリンパ球を絞り出した。セルスクレ
ーパーを用い、脾臓を穏やかに圧迫し、脾臓が半透明に
みえるまでＢリンパ球を連続して絞り出した。ついで、
得られたＢリンパ球細胞の懸濁液をニテックス（Ｎｉｔ
ｅｘ）フィルター［テトコ（Ｔｅｔｋｏ）、エルムスフ
ォード、ニューヨーク］で５０ｍｌ容遠心管中に濾過し
た。ついで、このＢリンパ球細胞の懸濁液を１０００ｒ
ｐｍで５分間遠心分離にかけた。遠心分離後、上澄み液
を吸引除去し、Ｂリンパ球細胞の懸濁液を１％ペンスト
レップおよび１％Ｌ−グルタミン添加ＩＭＤＭ（１０ｍ
ｌ）中に再懸濁した。ついで、血球計を用いて細胞をカ
ウントして１％ペンストレップおよび１％Ｌ−グルタミ
ン添加ＩＭＤＭの１ｍｌ当たりの細胞濃度を得た。 【０１５０】ハイブリドーマの産生に用いるミエローマ
細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ロックビル、メリーランド）から入手することがで
きる。該ミエローマ細胞は、９５％を越える生存力を有
する健全な対数期になければならない。最も望ましいミ
エローマ細胞は、継代数の少ないもの（新たなストック
から得たもの）である。加えて、ミエローマ細胞とＢリ
ンパ球との融合において、ミエローマ細胞の数はＢリン
パ球細胞の数と１：１の比率にあることが好ましい。 【０１５１】ＳＰ２／０ミエローマ細胞を１０００ｒｐ
ｍで５分間遠心分離した。遠心管から上澄み液をデカン
トした後、ミエローマ細胞をＢリンパ球細胞に融合させ
るためにセンダイウイルスの代わりにＰＥＧ１４５０溶
液（分子量１３００〜１６００、ポリエチレングリコー
ル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、
ロックビル、ＭＤ）を用いる他はコーラーおよびミルシ
ュテインの上記文献に記載の方法に従い、上記Ｂリンパ
球細胞をＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合させた（ミエ
ローマ細胞に対するＢリンパ球細胞の比が２：１にて）
。一般に、遠心分離後に得られたミエローマ細胞のペレ
ットを上記Ｂリンパ球細胞の懸濁液と再懸濁し、ついで
、得られた懸濁液を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離に
かけた。ついで、上澄み液を遠心管から吸引して非常に
乾燥したペレットを得た。遠心管の底を固い物体の上で
穏やかにたたくことによりペレットを緩め、この緩んだ
ペレットにＰＥＧ１４５０溶液（ＰＥＧ１４５０溶液（
１ｍｌ）を１％ペンストレップおよび１％Ｌ−グルタミ
ン添加ＩＭＤＭ（２ｍｌ）で希釈して調製）を１０秒間
かけてゆっくりと加えた。ついで、ＰＥＧ溶液が細胞混
合物に均一に分散するように遠心管を約２０秒間回転さ
せた。 【０１５２】ついで、得られた融合混合物を１％ペンス
トレップおよび１％Ｌ−グルタミン添加ＩＭＤＭ（１０
ｍｌ）でゆっくりと再懸濁し、ついで１０００ｒｐｍで
５分間遠心分離にかけた。ついで、上澄み液を吸引除去
し、得られたペレットをＨＡＴ選択ＩＭＤＭ［ＩＭＤＭ
に１％Ｌ−グルタミン、１％ペンストレップ、１％ＨＡ
Ｔ培地（ギブコ、グランドアイランド、ニューヨーク）
および１０％ウシ胎仔血清（ハイクローン、ローガン、
ユタ）を添加したもの］（１０ｍｌ）でゆっくりと再懸
濁し、ついで９６−ウエル組織培養プレート（ヌンク、
ネイパービル、イリノイ）中、ＨＡＴ選択ＩＭＤＭ中に
ウエル当たり３×１０５細胞の濃度にてプレーティング
した。 ハイブリッドの生存を促進するため、最初のプレーティ
ング培地にＳＴＭマイトジェン（ＲＩＢＩイムノケム、
ハミルトン、モンタナ）を加えた。得られたハイブリッ
ドコロニーに、融合後５日目および７日目にＨＴ培地［
ＩＭＤＭに１％Ｌ−グルタミン、１％ペンストレップ、
１％ＨＴ（ギブコ、グランドアイランド、ニューヨーク
）および１０％ウシ胎仔血清を添加したもの］を与えた
。 【０１５３】得られたすべてのコロニーについて１０日
目に上記パンデックススクリーンマシーン上で分析した
。全シグナルの５０％が５００ｎｇ／ｍｌの遊離フェン
シクリジンによって置換された抗体を産生するハイブリ
ッドをクローニングした。ハイブリッドのクローニング
は、ＨＴ培地中での限界希釈により行った。一般に、Ｈ
Ｔ培地を用い、下記ハイブリッド希釈を調製した。 （ａ）培地９．９ｍｌ中の細胞懸濁液０．１ｍｌ（ｂ）
（ａ）の調製液０．１１ｍｌを培地１０．８９ｍｌに加
えて、１×１０−４細胞希釈を得る （ｃ）（ｂ）の調製液１．１ｍｌを培地９．９ｍｌに加
えて、１×１０−５細胞希釈を得る （ｄ）（ｃ）の調製液１．１ｍｌを培地８．９ｍｌに加
えて、１×１０−６細胞希釈を得る 【０１５４】上記１×１０−４、１×１０−５および１
×１０−６希釈を９６−ウエルプレートにそれぞれプレ
ーティングした（０．１ｍｌ／ウエル）。クローニング
から５日後および７日後に０．１ｍｌ／ウエルのＨＴ培
地を各プレートに与えた。融合増殖が明らかになったら
（クローニングから約１０〜１４日後）、これらクロー
ンを上記のようにしてスクリーニングした。真のクロー
ンは、≦１０％の増殖を示し、下記スクリーニング特性
を通過したクローニングプレートからの細胞として定義
される。 【０１５５】クローンの選択は、該クローンによって産
生された抗体が（１）上記トレーサーを５００ｎｇ／ｍ
ｌの遊離フェンシクリジンで置換する能力（８０％以上
の置換）；および（２）１０の異なる化合物の最初の交
差反応性パネルにより阻害されないこと（アミトリプチ
リン、ノルトリプチリン、イミプラミン、デシプラミン
、デキストロメトルファン、レバロルファン、プロマジ
ン、ケタミン、オルフェナドリン、ジフェンヒドラミン
のそれぞれに関して５０％以上、それぞれＰＢＳ中に１
００μｇ／ｍｌにて試験した）に基づいて行った。 【０１５６】プリスタンで初回抗原刺激した雌ＢＡＬＢ
／ｃマウスを用い、上記クローンから腹水を得た。つい
で、この腹水を、アイ（Ｅｙ）らの「アイソレーション
・オブ・ピュア・ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ・アンド・Ｉｇ
Ｇ２ｂ・イミュノグロブリンズ・フロム・マウス・シー
ラム・ユージング・プロテイン・Ａ・セファロース（Ｉ
ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｕｒｅ　ＩｇＧ１，ＩｇＧ
２ａ　ａｎｄ　ＩｇＧ２ｂ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉ
ｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｍｏｕｓｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ｕｓｉｎｇ
Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）」、Ｉｍｍ
ｕｎｏｃｈｅｍ、１５：４２９〜４３６（１９７８）に
記載のプロテインＡ−セファロースカラムクロマトグラ
フィーにより精製した。 【０１５７】これらハイブリドーマ細胞株（ＢＡＬＢ／
ｃマウスＢリンパ球−ＳＰ２／０ミエローマ融合細胞株
）のうち最も好ましい細胞株、すなわちクローン細胞株
は、ＰＣＰ２−１０１−１８９の名称であり、１９９０
年５月１６日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ＡＴＣＣ）（ロックビル、メリーランド、Ｕ
ＳＡ）にＨＢ１０４５６の受託番号にて寄託してある。 すべての特許および公報は参照のため本明細書中に引用
した。

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　式： 【化１】 ［式中、ＷはＣＨまたはＮ；Ｒは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐまた
    はＦから選ばれた４個までのヘテロ原子を含み、合計０
    〜８個のヘテロ原子および炭素原子が直鎖状または分枝
    鎖状に配列しており、１個までの脂肪族または芳香族環
    構造を含む、連結基；ＺはＮＨ、ＣＯまたはＣＮＨ；ｎ
    はＷがＮである場合に０または１、ＷがＣＨである場合
    に１；Ｑはポリ（アミノ酸）またはポリ（アミノ酸）誘
    導体である］で示される化合物。
  2. 【請求項２】　　式： 【化２】 で示される請求項１に記載の化合物。
  3. 【請求項３】　　ポリ（アミノ酸）がチログロブリンで
    ある、請求項２に記載の化合物。
  4. 【請求項４】　　請求項１、２または３に記載の化合物
    に対する抗体。
  5. 【請求項５】　　式： 【化３】 ［式中、ＷはＣＨまたはＮ；Ｒは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐまた
    はＦから選ばれた４個までのヘテロ原子を含み、合計０
    〜８個のヘテロ原子および炭素原子が直鎖状または分枝
    鎖状に配列しており、１個までの脂肪族または芳香族環
    構造を含む、連結基；ＺはＮＨ、ＣＯまたはＣＮＨ；ｎ
    はＷがＮである場合に０または１、ＷがＣＨである場合
    に１；Ｑはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体
    である］で示される化合物。
  6. 【請求項６】　　ＲがＮＨである請求項５に記載の化合
    物。
  7. 【請求項７】　　ＺがＣＯである請求項５または６に記
    載の化合物。
  8. 【請求項８】　　式： 【化４】 で示される請求項５に記載の化合物。
  9. 【請求項９】　　試料中のフェンシクリジンおよび／ま
    たはフェンシクリジン代謝物の存在または量を検出する
    方法であって、 （ａ）請求項４に記載の抗体および請求項５に記載の化
    合物に試料を接触させ、 （ｂ）工程（ａ）で得られた溶液に平面偏光を通して蛍
    光偏光応答を得、ついで （ｃ）工程（ｂ）の溶液の蛍光偏光応答を検出して試料
    中のフェンシクリジンおよび／またはフェンシクリジン
    代謝物の存在および量を測定する ことを特徴とする方法。
  10. 【請求項１０】　　試料にリボフラビン結合タンパク質
    を加える工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】　　請求項４に記載の抗体が請求項３に
    記載の化合物に対して産生させたものである、請求項１
    ０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】　　（ａ）請求項４に記載の抗体；およ
    び（ｂ）請求項５に記載の化合物 からなることを特徴とする、試料中のフェンシクリジン
    および／またはフェンシクリジン代謝物の存在または量
    を検出するためのキット。
JP3125955A 1990-05-29 1991-05-29 フェンシクリジンの蛍光偏光イムノアッセイ Pending JPH04235199A (ja)

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