JPH04232850A - 電気泳動分離のための内部標準 - Google Patents
電気泳動分離のための内部標準Info
- Publication number
- JPH04232850A JPH04232850A JP3196018A JP19601891A JPH04232850A JP H04232850 A JPH04232850 A JP H04232850A JP 3196018 A JP3196018 A JP 3196018A JP 19601891 A JP19601891 A JP 19601891A JP H04232850 A JPH04232850 A JP H04232850A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- control
- nucleotide sequence
- gel
- size
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 86
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 41
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 41
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 19
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 4
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 4
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 4
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010086786 HLA-DQA1 antigen Proteins 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 2-bromophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1Br VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000538 analytical sample Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M xylene cyanol Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(\C=1C(=CC(OS([O-])=O)=CC=1)OS([O-])=O)=C\1C=C(C)\C(=[NH+]/CC)\C=C/1 NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
- C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Devices For Indicating Variable Information By Combining Individual Elements (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】本発明は、電気泳動分離におけるバンド位
置を同定する方法に関する。
置を同定する方法に関する。
【０００２】電気泳動は、電場の影響下に液体媒質中の
帯電した溶質または粒子の移動を呼ぶ。電気泳動分離は
高分子の分析に広く使用されている。タンパク質および
核酸配列の同定は、とくに重要である。このような分離
は、大きさおよび／または電荷の差に基づくことができ
る。電気泳動は支持されていない液体媒質（例えば、毛
管電気泳動）中で実施することができるが、より普通に
は液体媒質は固体の支持媒質を通して移動することがで
きる。最も広く使用されている支持媒質はゲル、例えば
、ポリアクリルアミドゲルおよびアガロースゲルである
。
帯電した溶質または粒子の移動を呼ぶ。電気泳動分離は
高分子の分析に広く使用されている。タンパク質および
核酸配列の同定は、とくに重要である。このような分離
は、大きさおよび／または電荷の差に基づくことができ
る。電気泳動は支持されていない液体媒質（例えば、毛
管電気泳動）中で実施することができるが、より普通に
は液体媒質は固体の支持媒質を通して移動することがで
きる。最も広く使用されている支持媒質はゲル、例えば
、ポリアクリルアミドゲルおよびアガロースゲルである
。
【０００３】ヌクレオチド配列は、均一な電荷を有し、
したがって大きさの差に基づいて分離される。タンパク
質は大きさおよび電荷の両者が異なり、そして性質に基
づくか、あるいは２つの組み合わせにより分離すること
ができる。タンパク質は、それに均一な電荷対大きさの
比を与えるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を使用す
ることによって、大きさの差に基づいてのみ分離するこ
とができる。
したがって大きさの差に基づいて分離される。タンパク
質は大きさおよび電荷の両者が異なり、そして性質に基
づくか、あるいは２つの組み合わせにより分離すること
ができる。タンパク質は、それに均一な電荷対大きさの
比を与えるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を使用す
ることによって、大きさの差に基づいてのみ分離するこ
とができる。
【０００４】篩でないゲルは分子の流れを妨害せず、そ
して分離される種の電荷にのみ基づく分離に使用される
。等電点電気泳動において、種は篩でないゲル中でつく
られるｐＨの勾配に沿って移動して、最後に種はそれら
の等電点に到達する。
して分離される種の電荷にのみ基づく分離に使用される
。等電点電気泳動において、種は篩でないゲル中でつく
られるｐＨの勾配に沿って移動して、最後に種はそれら
の等電点に到達する。
【０００５】篩のゲルは分子の流れを妨害する。ゲルの
孔の大きさは、ゲルを通して自由に流れることができる
分子の大きさを決定する。ゲルを通して移動する時間は
、分子の大きさが増加するにつれて、増加する。結局、
小さい分子は大きい分子より急速にゲルを通して移動す
る。このようなゲルは大きさに基づくか、あるいは大き
さ／電荷に基づく分離に使用される。
孔の大きさは、ゲルを通して自由に流れることができる
分子の大きさを決定する。ゲルを通して移動する時間は
、分子の大きさが増加するにつれて、増加する。結局、
小さい分子は大きい分子より急速にゲルを通して移動す
る。このようなゲルは大きさに基づくか、あるいは大き
さ／電荷に基づく分離に使用される。
【０００６】電気泳動の臨床的適用について主要な問題
は、この方法の固有の変動性である。変動性の多くは、
とくにゲルのへりにおける、ゲルを通る不均一な移動の
ためである。しかしながら、温度、時間、電圧および電
流は、また、分離に影響を与える。通常、既知の大きさ
（または等電点）の１または２以上の種を包含する対照
は、試料と同一の条件下に電気泳動して、そのゲルにつ
いての既知の大きさ（または電荷）のマーカーを得る。 スラブゲルについて、通常対照はゲルの一方または双方
のへりにおいて、そして時には、また、ゲルの中央線に
おいて展開する。しかしながら、試料の分子の明瞭な同
定は、とくにゲルのへりにおいて、レーン対レーンまた
はゲル対ゲルの比較により、しばしば行うことができな
い。
は、この方法の固有の変動性である。変動性の多くは、
とくにゲルのへりにおける、ゲルを通る不均一な移動の
ためである。しかしながら、温度、時間、電圧および電
流は、また、分離に影響を与える。通常、既知の大きさ
（または等電点）の１または２以上の種を包含する対照
は、試料と同一の条件下に電気泳動して、そのゲルにつ
いての既知の大きさ（または電荷）のマーカーを得る。 スラブゲルについて、通常対照はゲルの一方または双方
のへりにおいて、そして時には、また、ゲルの中央線に
おいて展開する。しかしながら、試料の分子の明瞭な同
定は、とくにゲルのへりにおいて、レーン対レーンまた
はゲル対ゲルの比較により、しばしば行うことができな
い。
【０００７】分析用ゲルの調製および染色はよく知られ
ている。例えば、臭化エチジウムを使用して染色される
３％のヌシーブ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）１％のアガロースゲ
ルは、ベルウィンクル（Ｂｏｅｒｗｉｎｋｌｅ）ら、Ｐ
ＮＡＳ ８６：２１２−２１６（１９８９）に記載さ
れている。銀の染色を使用するポリアクリルアミドゲル
中のＤＮＡの検出は、次の文献に記載されている：ゴー
ルドマン（Ｇｏｌｄｍａｎ）ら、電気泳動（Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）３：２４−２６（１９８２）；
マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）、電気泳動（Ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）４：２６９−２７２（１９８
３）；テゲルストロム（Ｔｅｇｅｌｓｔｒｏｍ）、電気
泳動（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）７：２２６−
２２９（１９８７）；およびアレン（Ａｌｌｅｎ）ら、
バイオテクニークス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）７
：７３６−７４４（１９８９）。アレン（Ａｌｌｅｎ）
らが記載する方法は、大きい孔大きさの極めて薄い層の
、再水和可能なポリアクリルアミドゲルを使用し、銀で
染色する。
ている。例えば、臭化エチジウムを使用して染色される
３％のヌシーブ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）１％のアガロースゲ
ルは、ベルウィンクル（Ｂｏｅｒｗｉｎｋｌｅ）ら、Ｐ
ＮＡＳ ８６：２１２−２１６（１９８９）に記載さ
れている。銀の染色を使用するポリアクリルアミドゲル
中のＤＮＡの検出は、次の文献に記載されている：ゴー
ルドマン（Ｇｏｌｄｍａｎ）ら、電気泳動（Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）３：２４−２６（１９８２）；
マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）、電気泳動（Ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）４：２６９−２７２（１９８
３）；テゲルストロム（Ｔｅｇｅｌｓｔｒｏｍ）、電気
泳動（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）７：２２６−
２２９（１９８７）；およびアレン（Ａｌｌｅｎ）ら、
バイオテクニークス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）７
：７３６−７４４（１９８９）。アレン（Ａｌｌｅｎ）
らが記載する方法は、大きい孔大きさの極めて薄い層の
、再水和可能なポリアクリルアミドゲルを使用し、銀で
染色する。
【０００８】前述の参考文献の各を、ここに引用によっ
て加える本発明は、電気泳動分離においてバンド位置を
同定する方法を提供する。この方法は、試料と一緒に内
部標準として少なくとも１つの対照を電気泳動すること
からなる。この方法は、電気泳動分離が大きさ、電荷ま
たはそれらの組み合わせに基づくかどうかにかかわらず
、ヌクレオチド配列またはタンパク質の同定に使用する
ことができる。好ましい実施態様において、対照を試料
に直接した後、試料を調製してゲルに負荷する。
て加える本発明は、電気泳動分離においてバンド位置を
同定する方法を提供する。この方法は、試料と一緒に内
部標準として少なくとも１つの対照を電気泳動すること
からなる。この方法は、電気泳動分離が大きさ、電荷ま
たはそれらの組み合わせに基づくかどうかにかかわらず
、ヌクレオチド配列またはタンパク質の同定に使用する
ことができる。好ましい実施態様において、対照を試料
に直接した後、試料を調製してゲルに負荷する。
【０００９】本発明は、試料とともに内部標準として対
照を電気泳動することによって、電気泳動分離において
バンド位置を同定する方法を提供する。内部標準を試料
物質に直接添加することによって、何らかの変動は同一
方法において試料および対照の両者に影響を与える。こ
れは、へりの効果によるか、あるいは電気泳動の方法ま
たは条件に関連する他の変動によりつくられる不明瞭さ
を排除する。
照を電気泳動することによって、電気泳動分離において
バンド位置を同定する方法を提供する。内部標準を試料
物質に直接添加することによって、何らかの変動は同一
方法において試料および対照の両者に影響を与える。こ
れは、へりの効果によるか、あるいは電気泳動の方法ま
たは条件に関連する他の変動によりつくられる不明瞭さ
を排除する。
【００１０】本発明の方法は、タンパク質およびヌクレ
オチド配列の分離により例示する。しかしながら、この
方法は、また、他の方法の電気泳動分離に適用され、そ
して本発明はそれらの実施態様を包含することを意味す
る。
オチド配列の分離により例示する。しかしながら、この
方法は、また、他の方法の電気泳動分離に適用され、そ
して本発明はそれらの実施態様を包含することを意味す
る。
【００１１】本発明の方法は、内部標準として使用のた
めに３つの型を包含する：（１）試料の分析物と同一の
大きさまたは電荷の範囲にある既知の大きさ、電荷また
は両者のマーカー；（２）試料の分析物と同一の大きさ
、電荷または両者を有するマーカー；および（３）試料
の分析物と同定であるマーカー。
めに３つの型を包含する：（１）試料の分析物と同一の
大きさまたは電荷の範囲にある既知の大きさ、電荷また
は両者のマーカー；（２）試料の分析物と同一の大きさ
、電荷または両者を有するマーカー；および（３）試料
の分析物と同定であるマーカー。
【００１２】ヌクレオチドの電気泳動分離は大きさに基
づく。ヌクレオチド配列について、大きさは配列中のヌ
クレオチドの数（または配列の長さ）に直接相関関係を
もつ。タンパク質の電気泳動分離は、大きさ、電荷また
はそれらの組み合わせに基づく。しかしながら、通常、
分離は、組み合わせよりむしろ、大きさ（篩のゲルおよ
びＳＤＳを使用する）または電荷（篩でないゲルを使用
する等電点電気泳動）に基づくであろう。
づく。ヌクレオチド配列について、大きさは配列中のヌ
クレオチドの数（または配列の長さ）に直接相関関係を
もつ。タンパク質の電気泳動分離は、大きさ、電荷また
はそれらの組み合わせに基づく。しかしながら、通常、
分離は、組み合わせよりむしろ、大きさ（篩のゲルおよ
びＳＤＳを使用する）または電荷（篩でないゲルを使用
する等電点電気泳動）に基づくであろう。
【００１３】分離の型が何であっても、内部標準の第１
の型は、それに対して試料の成分を測定することができ
る、ある種の内部の定規を形成する対照物質である。大
きさに基づく、対照は既知の等電点を有する分子である
。大きさおよび電荷に基づく分離について、対照は既知
の大きさおよび等電点を有する分子である。好ましくは
、試料中の予測される範囲の分析物にまたがる既知の大
きさおよび／または電荷のある数の分子を対照混合物中
で一緒にする。
の型は、それに対して試料の成分を測定することができ
る、ある種の内部の定規を形成する対照物質である。大
きさに基づく、対照は既知の等電点を有する分子である
。大きさおよび電荷に基づく分離について、対照は既知
の大きさおよび等電点を有する分子である。好ましくは
、試料中の予測される範囲の分析物にまたがる既知の大
きさおよび／または電荷のある数の分子を対照混合物中
で一緒にする。
【００１４】遺伝子の型別が試料中のアレルに依存する
長さが異なる、増幅されたＤＮＡ配列を産生する場合、
中間の長さを有するＤＮＡ配列は２つのアレルの配列の
間で区別することができる。例えば、１つの場合におい
て２５０ｎｔそして他の場合において３５０ｎｔの試料
のヌクレオチド配列の間で区別するために、長さが３０
０ｎｔの対照の配列を使用することができる。３５０ｎ
ｔの配列はゲル中で長さが大きいために対照より上に位
置し、そして２５０ｎｔの配列はより速く移動しそして
対照より下に位置するであろう。２つの試験物質の間の
中間の分子量および／または等電点を有するタンパク質
の配列は、同一の方法で機能することができる。
長さが異なる、増幅されたＤＮＡ配列を産生する場合、
中間の長さを有するＤＮＡ配列は２つのアレルの配列の
間で区別することができる。例えば、１つの場合におい
て２５０ｎｔそして他の場合において３５０ｎｔの試料
のヌクレオチド配列の間で区別するために、長さが３０
０ｎｔの対照の配列を使用することができる。３５０ｎ
ｔの配列はゲル中で長さが大きいために対照より上に位
置し、そして２５０ｎｔの配列はより速く移動しそして
対照より下に位置するであろう。２つの試験物質の間の
中間の分子量および／または等電点を有するタンパク質
の配列は、同一の方法で機能することができる。
【００１５】試料のヌクレオチド配列について、対照は
予測する試料の大きさの範囲にまがりかつ既知の長さだ
け異なる、１系列のヌクレオチド配列であることができ
る。例えば、５０〜５００ヌクレオチドの大きさの範囲
の試料のヌクレオチド配列について、対照は５０〜５０
０ｎｔの範囲でありかつ長さが５０ｎｔだけ異なる、１
系列のヌクレオチド配列であることができる。重量によ
り分離されるタンパク質について、対照は重量が既知の
量だけ異なりかつ期待する試料の重量範囲をカバーする
、１系列の調製であることができる。同様に、既知の範
囲の等電点を有する対照を等電点電気泳動分析に使用さ
れる。
予測する試料の大きさの範囲にまがりかつ既知の長さだ
け異なる、１系列のヌクレオチド配列であることができ
る。例えば、５０〜５００ヌクレオチドの大きさの範囲
の試料のヌクレオチド配列について、対照は５０〜５０
０ｎｔの範囲でありかつ長さが５０ｎｔだけ異なる、１
系列のヌクレオチド配列であることができる。重量によ
り分離されるタンパク質について、対照は重量が既知の
量だけ異なりかつ期待する試料の重量範囲をカバーする
、１系列の調製であることができる。同様に、既知の範
囲の等電点を有する対照を等電点電気泳動分析に使用さ
れる。
【００１６】対照の第２の型は、分離の型に依存して、
試料物質と同一の大きさ、等電点（電荷）または両者を
有する物質を含有する。対照は試料の分析物と同一であ
る組成物であることは必要ではない。例えば、３００ｎ
ｔのヌクレオチド配列についての対照は同一の長さを有
するヌクレオチド配列である。対照は試料の分析物と同
一のヌクレオチド配列を有することは必要ではない。所
定の等電点をもちかつ等電点電気泳動により分離される
タンパク質のための対照は、その等電点を有する物質で
ある。対照物質は好ましくはタンパク質である。
試料物質と同一の大きさ、等電点（電荷）または両者を
有する物質を含有する。対照は試料の分析物と同一であ
る組成物であることは必要ではない。例えば、３００ｎ
ｔのヌクレオチド配列についての対照は同一の長さを有
するヌクレオチド配列である。対照は試料の分析物と同
一のヌクレオチド配列を有することは必要ではない。所
定の等電点をもちかつ等電点電気泳動により分離される
タンパク質のための対照は、その等電点を有する物質で
ある。対照物質は好ましくはタンパク質である。
【００１７】対照の第３の型は、試料の分析物と同一で
ある物質である。したがって、対照は分析されるタンパ
ク質またはヌクレオチド配列を包含する。例えば、ヒト
血清アルブミン（ＨＳＡ）を同定することを試みるとき
、対照はＨＳＡである。ヒト血清タンパク質を分離する
とき、タンパク質の各々は対照混合物の中に存在するこ
とができる。あるいは、試料の部分を各血清タンパク質
と別々に展開するか、あるいは２または３種類のタンパ
ク質の混合物とともに展開して、試料の分析物の各々を
同定することができる。
ある物質である。したがって、対照は分析されるタンパ
ク質またはヌクレオチド配列を包含する。例えば、ヒト
血清アルブミン（ＨＳＡ）を同定することを試みるとき
、対照はＨＳＡである。ヒト血清タンパク質を分離する
とき、タンパク質の各々は対照混合物の中に存在するこ
とができる。あるいは、試料の部分を各血清タンパク質
と別々に展開するか、あるいは２または３種類のタンパ
ク質の混合物とともに展開して、試料の分析物の各々を
同定することができる。
【００１８】遺伝子位置のアレルに関連するヌクレオチ
ド配列を同定するとき、１または２以上のアレルにより
産生される配列を使用することができる。例えば、正常
のベータ−グロビン遺伝子が試料中に存在しそして２つ
のより小さい配列が鎌状赤血球貧血に関連する試料中に
存在するとき、１つのヌクレオチド配列が存在する場合
、ヌクレオチド配列の組（正常または病気に関連する）
またはすべての３つの配列の混合物を対照として使用す
ることができる。
ド配列を同定するとき、１または２以上のアレルにより
産生される配列を使用することができる。例えば、正常
のベータ−グロビン遺伝子が試料中に存在しそして２つ
のより小さい配列が鎌状赤血球貧血に関連する試料中に
存在するとき、１つのヌクレオチド配列が存在する場合
、ヌクレオチド配列の組（正常または病気に関連する）
またはすべての３つの配列の混合物を対照として使用す
ることができる。
【００１９】より複雑なヌクレオチド配列のパターン、
例えば、ＨＬＡ ＤＱＡ１位置のアレルにより産生さ
れる断片のパターンを試料とともに添加することができ
る。ある数の断片がアレルに関連するとき、試料の一部
分を各アレルのための断片とともに添加することができ
る。容易に区別することができるアレルからの断片のパ
ターンをプールして、複数のアレルを検出することがで
きる。このようにして、試料のヌクレオチド配列が対照
のヌクレオチド配列と整列する、試料／対照の混合物を
同定するとき、試料中に存在するアレルを決定する。
例えば、ＨＬＡ ＤＱＡ１位置のアレルにより産生さ
れる断片のパターンを試料とともに添加することができ
る。ある数の断片がアレルに関連するとき、試料の一部
分を各アレルのための断片とともに添加することができ
る。容易に区別することができるアレルからの断片のパ
ターンをプールして、複数のアレルを検出することがで
きる。このようにして、試料のヌクレオチド配列が対照
のヌクレオチド配列と整列する、試料／対照の混合物を
同定するとき、試料中に存在するアレルを決定する。
【００２０】試料とともに電気泳動する内部標準として
分析物を使用すると、試料の分析物がゲル中の対照と整
列することを観察することによって、バンドが同定され
る。内部標準は試料と区別されなくてはならない。対照
を同定する適当な方法は、分析方法の型および感度に依
存して変化する。２つの基準を適用する。まず、対照は
分析方法により検出可能でなくてはならない。第２に、
対照は、分析方法により容易に検出される方法で、試料
と異ならなくてはならない。
分析物を使用すると、試料の分析物がゲル中の対照と整
列することを観察することによって、バンドが同定され
る。内部標準は試料と区別されなくてはならない。対照
を同定する適当な方法は、分析方法の型および感度に依
存して変化する。２つの基準を適用する。まず、対照は
分析方法により検出可能でなくてはならない。第２に、
対照は、分析方法により容易に検出される方法で、試料
と異ならなくてはならない。
【００２１】試料を電気泳動後に染色する方法のために
、対照はゲルの中に試料の量と区別される量で存在し、
こうして試料および対照により産生されるバンドが容易
に同定することができるようにする。このような決定は
、ヌクレオチドについて臭化エチジウムまたは銀の染色
か、あるいはタンパク質についてクーマッシーブルー（
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）または他の色素の使
用を包含する。対照および分析物について区別可能な濃
度を決定することは、当業者の技量の範囲内である。
、対照はゲルの中に試料の量と区別される量で存在し、
こうして試料および対照により産生されるバンドが容易
に同定することができるようにする。このような決定は
、ヌクレオチドについて臭化エチジウムまたは銀の染色
か、あるいはタンパク質についてクーマッシーブルー（
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）または他の色素の使
用を包含する。対照および分析物について区別可能な濃
度を決定することは、当業者の技量の範囲内である。
【００２２】例えば、臭化エチジウムまたは銀で染色し
たヌクレオチド配列について、配列により生成したバン
ドは視的にまたは光学密度により検出される。対照のヌ
クレオチド配列は、好ましくは、ゲル中の試料のヌクレ
オチド配列の約１／１０〜１／２の濃度で存在する。し
かしながら、ある分析試料について、試料の濃度の１０
倍以上の濃度で存在する対照は、対照のバンドが試料の
バンド付近に存在するか、あるいは試料のバンドと同一
位置に存在するかどうかにかかわらず、試料と容易に区
別される。
たヌクレオチド配列について、配列により生成したバン
ドは視的にまたは光学密度により検出される。対照のヌ
クレオチド配列は、好ましくは、ゲル中の試料のヌクレ
オチド配列の約１／１０〜１／２の濃度で存在する。し
かしながら、ある分析試料について、試料の濃度の１０
倍以上の濃度で存在する対照は、対照のバンドが試料の
バンド付近に存在するか、あるいは試料のバンドと同一
位置に存在するかどうかにかかわらず、試料と容易に区
別される。
【００２３】標識の存在により検出される試料について
、対照混合物を、また、標識する。例えば、放射線標識
したタンパク質またはヌクレオチド配列をオートラジオ
グラフィーにより分離しそして検出す場合、対照混合物
中のタンパク質またはヌクレオチドを、また、輻射線ヌ
クレオチドで標識し、これをフィルムに露出する。試料
および対照は異なる濃度であることができる。色素、酵
素などで標識した試料のタンパク質またはヌクレオチド
について、対照をまた標識する。このような場合におい
て、色素は試料の色素と同一であるか、あるいは異なる
ことができる。例えば、対照のタンパク質は試料のタン
パク質のそれと異なる検出可能な色素で標識することが
できる。示差的標識づけはよく知られており、そして異
なる色の蛍光色素の使用；ＤＮＡ断片酵素および順次の
色発生の使用；および試料および対照のときについて異
なる色素の使用を包含する。
、対照混合物を、また、標識する。例えば、放射線標識
したタンパク質またはヌクレオチド配列をオートラジオ
グラフィーにより分離しそして検出す場合、対照混合物
中のタンパク質またはヌクレオチドを、また、輻射線ヌ
クレオチドで標識し、これをフィルムに露出する。試料
および対照は異なる濃度であることができる。色素、酵
素などで標識した試料のタンパク質またはヌクレオチド
について、対照をまた標識する。このような場合におい
て、色素は試料の色素と同一であるか、あるいは異なる
ことができる。例えば、対照のタンパク質は試料のタン
パク質のそれと異なる検出可能な色素で標識することが
できる。示差的標識づけはよく知られており、そして異
なる色の蛍光色素の使用；ＤＮＡ断片酵素および順次の
色発生の使用；および試料および対照のときについて異
なる色素の使用を包含する。
【００２４】対照は好ましくは電気泳動のための調製の
前に添加して、処理における潜在的な差を最小にする。 しかしながら、試料と前以て混合せずに、ゲルまたは他
の電気泳動の支持媒体へ対照を直接添加することが、ま
た、考えられる。
前に添加して、処理における潜在的な差を最小にする。 しかしながら、試料と前以て混合せずに、ゲルまたは他
の電気泳動の支持媒体へ対照を直接添加することが、ま
た、考えられる。
【００２５】内部標準は、電気泳動法において使用する
緩衝液と適合性の緩衝液中に存在する。好ましくは、内
部標準は試料と同一の緩衝液である。内部標準の成分の
濃度は変化することができる。好ましくは、この濃度は
少量の内部標準を試料に添加して、ゲル中で使用するた
めの適当な最終濃度を与える。内部標準は好ましくは、
電気泳動のための調製の前に、試料に添加する。
緩衝液と適合性の緩衝液中に存在する。好ましくは、内
部標準は試料と同一の緩衝液である。内部標準の成分の
濃度は変化することができる。好ましくは、この濃度は
少量の内部標準を試料に添加して、ゲル中で使用するた
めの適当な最終濃度を与える。内部標準は好ましくは、
電気泳動のための調製の前に、試料に添加する。
【００２６】電気泳動のための試料の調製は、内部標準
を使用するとき、先行技術の調製と異ならないであろう
。調製物は、一般に、組成物を添加して試料を電気泳動
の緩衝液より重くすること（例えば、スクロースまたは
グリセロール）を包含し、そしてトラッカー色素（例え
ば、ヌクレオチドについてキシレンシアノール、タンパ
ク質についてブロモフェノールブルー）を包含すること
ができる。タンパク質について、通常試料の調製物は、
また、β−メルカプト−エタノールおよび２〜５％のＳ
ＤＳの添加、および約２分間の試料混合物の沸騰を包含
する。前述したように、内部標準は、好ましくは、この
ような調製の前に試料に添加して、差を最小にする。し
かしながら、電気泳動についての内部標準の別の調製は
、また、考えられる。
を使用するとき、先行技術の調製と異ならないであろう
。調製物は、一般に、組成物を添加して試料を電気泳動
の緩衝液より重くすること（例えば、スクロースまたは
グリセロール）を包含し、そしてトラッカー色素（例え
ば、ヌクレオチドについてキシレンシアノール、タンパ
ク質についてブロモフェノールブルー）を包含すること
ができる。タンパク質について、通常試料の調製物は、
また、β−メルカプト−エタノールおよび２〜５％のＳ
ＤＳの添加、および約２分間の試料混合物の沸騰を包含
する。前述したように、内部標準は、好ましくは、この
ような調製の前に試料に添加して、差を最小にする。し
かしながら、電気泳動についての内部標準の別の調製は
、また、考えられる。
【００２７】好ましい実施態様において、この方法は個
体のＨＬＡ位置についてのＨＬＡアレル型の決定に使用
する。この方法は、個体からのＤＮＡから前記個体のＨ
ＬＡアレルの特徴を示すヌクレオチド配列を生成して、
試料のヌクレオチド配列を生成することを包含する。試
料のヌクレオチド配列は、ＨＬＡ位置の少なくとも１つ
のアレルの特徴を示す対照のヌクレオチド配列とともに
電気泳動する。試料のヌクレオチド配列は、前記対照の
ヌクレオチド配列と比較し、そして試料のアレルについ
ての内部の対照と整列する。
体のＨＬＡ位置についてのＨＬＡアレル型の決定に使用
する。この方法は、個体からのＤＮＡから前記個体のＨ
ＬＡアレルの特徴を示すヌクレオチド配列を生成して、
試料のヌクレオチド配列を生成することを包含する。試
料のヌクレオチド配列は、ＨＬＡ位置の少なくとも１つ
のアレルの特徴を示す対照のヌクレオチド配列とともに
電気泳動する。試料のヌクレオチド配列は、前記対照の
ヌクレオチド配列と比較し、そして試料のアレルについ
ての内部の対照と整列する。
【００２８】次の特定であるが、非限定的実施例によっ
て、本発明をさらに説明する。特記しない限り、温度は
セ氏であり、そして濃度は重量％である。構成的に実施
に変形した手順は現在時制で記載し、そして実験室にお
いて実施した手順は過去の時制で実施する。
て、本発明をさらに説明する。特記しない限り、温度は
セ氏であり、そして濃度は重量％である。構成的に実施
に変形した手順は現在時制で記載し、そして実験室にお
いて実施した手順は過去の時制で実施する。
【００２９】
【実施例】実施例１
ＨＬＡ ＤＱＡ位置の分析
ＨＬＡ ＤＱＡ１ ０１０２アレルの３つのＤＲ／
ＤＱハプロタイプを、後述するように分析した。３つの
ハプロタイプの各をもつ個体からのＤＮＡを、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅し、次いでエン
ドヌクレアーゼ（ＡｌｕＩ）で消化して、３つのハプロ
タイプに相当する３つの明確な断片のパターンを生成し
た。 増幅したＤＮＡ配列および消化物を生成する方法は、こ
の出願と同日に提出しそして「ハプロタイプとして隣接
するおよび遠い位置のアレルの検出のためのイントロン
配列の分析法」と題するマルコルム・Ｊ．シモンス（Ｍ
ａｌｃｏｌｍ Ｊ．Ｓｉｍｏｎｓ）による同時継続出
願に詳細に説明されている。その出願をここに引用によ
って加える。
ＤＱハプロタイプを、後述するように分析した。３つの
ハプロタイプの各をもつ個体からのＤＮＡを、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅し、次いでエン
ドヌクレアーゼ（ＡｌｕＩ）で消化して、３つのハプロ
タイプに相当する３つの明確な断片のパターンを生成し
た。 増幅したＤＮＡ配列および消化物を生成する方法は、こ
の出願と同日に提出しそして「ハプロタイプとして隣接
するおよび遠い位置のアレルの検出のためのイントロン
配列の分析法」と題するマルコルム・Ｊ．シモンス（Ｍ
ａｌｃｏｌｍ Ｊ．Ｓｉｍｏｎｓ）による同時継続出
願に詳細に説明されている。その出願をここに引用によ
って加える。
【００３０】パターン（塩基対の大きさで決定した断片
）は、次の通りであった： １、ＤＲ１５ ＤＱ６ Ｄｗ２：１２０、
３５０、３７０、４８０ ２、ＤＲ１３ ＤＱ
６ Ｄｗ１９：１２０、３３０、３５０、４８０
３、ＤＲ１６ ＤＱ６ Ｄｗ２１：１２０、３
３０、３５０生成後、ほぼ０．１μｇの「ラダー（ｌａ
ｄｄｅｒ）」ヌクレオチド配列を試料のＤＮＡ配列（約
０．５および１μｇのＤＮＡ）に添加する。ラダー配列
は、長さ１２３ｂｐで開始し、長さが１２３ｂｐで約５
，０００ｂｐの最終大きさまで増加するヌクレオチド配
列の１つの群である［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｉｅｓ）、マリイランド州ベセスダ、から
商業的に入手可能である］。
）は、次の通りであった： １、ＤＲ１５ ＤＱ６ Ｄｗ２：１２０、
３５０、３７０、４８０ ２、ＤＲ１３ ＤＱ
６ Ｄｗ１９：１２０、３３０、３５０、４８０
３、ＤＲ１６ ＤＱ６ Ｄｗ２１：１２０、３
３０、３５０生成後、ほぼ０．１μｇの「ラダー（ｌａ
ｄｄｅｒ）」ヌクレオチド配列を試料のＤＮＡ配列（約
０．５および１μｇのＤＮＡ）に添加する。ラダー配列
は、長さ１２３ｂｐで開始し、長さが１２３ｂｐで約５
，０００ｂｐの最終大きさまで増加するヌクレオチド配
列の１つの群である［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｉｅｓ）、マリイランド州ベセスダ、から
商業的に入手可能である］。
【００３１】試料および内部標準の塩化マグネシウムを
、４％の水平の極めて薄いポリアクリルアミドゲル［Ｅ
−Ｃ装置、クリアーウォーター（Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ
）ＦＬＡ］を使用して電気泳動にかける。ゲル中のバン
ドは、銀の染色を使用して可視化（染色）した［アレン
（Ａｌｌｅｎ）ら、バイオテクニークス（ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ）７：７３６−７４４（１９８９）］。 断片のパターンおよび内部標準は容易に区別することが
できる。内部標準の使用は、断片の大きさの計算を容易
にする。
、４％の水平の極めて薄いポリアクリルアミドゲル［Ｅ
−Ｃ装置、クリアーウォーター（Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ
）ＦＬＡ］を使用して電気泳動にかける。ゲル中のバン
ドは、銀の染色を使用して可視化（染色）した［アレン
（Ａｌｌｅｎ）ら、バイオテクニークス（ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ）７：７３６−７４４（１９８９）］。 断片のパターンおよび内部標準は容易に区別することが
できる。内部標準の使用は、断片の大きさの計算を容易
にする。
【００３２】この手順は、ＤＱＡ１ ０１０２ Ｄ
Ｒ１５ ＤＱ６ Ｄｗ２ハロタイプを有する第２試
料、および対照としてＤＱＡ１ ０１０２に関連する
ハロタイプの各々のＤＮＡの既知の源の増幅の第２系列
を使用して反復する。増幅反応混合物の１／１０を内部
標準として使用し、そして試料のＤＮＡの３つのアリコ
ートに添加する。３つの試料混合物を、６．５％の垂直
のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そして臭化
エチジウムで染色する。試料の配列はＤＱＡ１０１０２
ＤＲ１５ ＤＱ６ Ｄｗ２ハロタイプの内部対照の
配列と同一に整列する。他の２つのレーンにおいて、内
部標準により生成されるより軽いバンドは試料のバンド
と明瞭に区別することができる。
Ｒ１５ ＤＱ６ Ｄｗ２ハロタイプを有する第２試
料、および対照としてＤＱＡ１ ０１０２に関連する
ハロタイプの各々のＤＮＡの既知の源の増幅の第２系列
を使用して反復する。増幅反応混合物の１／１０を内部
標準として使用し、そして試料のＤＮＡの３つのアリコ
ートに添加する。３つの試料混合物を、６．５％の垂直
のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そして臭化
エチジウムで染色する。試料の配列はＤＱＡ１０１０２
ＤＲ１５ ＤＱ６ Ｄｗ２ハロタイプの内部対照の
配列と同一に整列する。他の２つのレーンにおいて、内
部標準により生成されるより軽いバンドは試料のバンド
と明瞭に区別することができる。
【００３３】実施例２
ｐＭＣＴ １１８ ＶＮＴＲ位置の分析個体からの
ＤＮＡを分析して、ｐＭＣＴ １１８ ＶＮＴＲ位
置（また、Ｄ１Ｓ８０ ＶＮＴＲ位置と呼ぶ）の７つ
の変異型のどれが個体の中に存在するかどうかを決定し
た。位置の変異型は、位置に対して特異的なプライマー
の対を使用してゲノムのＤＮＡを増幅し、そして生ずる
増幅されたＤＮＡ配列の長さを決定することによって、
決定することができる。増幅に使用する手順は実施例１
に記載するものと同一であるが、ただし増幅は９４℃で
３０秒間、６５℃で３０秒間、および７２℃で６０秒間
の３０サイクルを使用した。プライマーの配列は、次の
通りであった： ５′ＧＡＡ ＡＣＴ ＧＧＣ ＣＴＣ ＣＡＡ
ＡＣＡ ＣＴＧ ＣＣＣ ＧＣＣ Ｇ
３′；および５′ＧＴＣ ＴＴＧ ＴＴＧ ＧＡ
Ｇ ＡＴＧ ＣＡＣ ＧＴＧ ＣＣＣ ＣＴ
Ｔ ＧＣ ３′プライマーは、ｐＭＣＴ １１８
ＶＮＴＲ配列をフランキングする保存された配列に
ハイブリダイゼーションする。前述のプライマーの少な
くとも１５の連続的ヌクレオチドに相当する配列を有す
るプライマーを、また、使用することができる。
ＤＮＡを分析して、ｐＭＣＴ １１８ ＶＮＴＲ位
置（また、Ｄ１Ｓ８０ ＶＮＴＲ位置と呼ぶ）の７つ
の変異型のどれが個体の中に存在するかどうかを決定し
た。位置の変異型は、位置に対して特異的なプライマー
の対を使用してゲノムのＤＮＡを増幅し、そして生ずる
増幅されたＤＮＡ配列の長さを決定することによって、
決定することができる。増幅に使用する手順は実施例１
に記載するものと同一であるが、ただし増幅は９４℃で
３０秒間、６５℃で３０秒間、および７２℃で６０秒間
の３０サイクルを使用した。プライマーの配列は、次の
通りであった： ５′ＧＡＡ ＡＣＴ ＧＧＣ ＣＴＣ ＣＡＡ
ＡＣＡ ＣＴＧ ＣＣＣ ＧＣＣ Ｇ
３′；および５′ＧＴＣ ＴＴＧ ＴＴＧ ＧＡ
Ｇ ＡＴＧ ＣＡＣ ＧＴＧ ＣＣＣ ＣＴ
Ｔ ＧＣ ３′プライマーは、ｐＭＣＴ １１８
ＶＮＴＲ配列をフランキングする保存された配列に
ハイブリダイゼーションする。前述のプライマーの少な
くとも１５の連続的ヌクレオチドに相当する配列を有す
るプライマーを、また、使用することができる。
【００３４】増幅後、増幅したＤＮＡ配列を電気泳動し
て変異型を決定した。増幅反応混合物の２μｌのアリコ
ートを、等しい体積の内部標準の対照と混合した。
て変異型を決定した。増幅反応混合物の２μｌのアリコ
ートを、等しい体積の内部標準の対照と混合した。
【００３５】内部標準は、各混合物において、既知のＶ
ＮＴＲ変異型のＤＮＡを使用して同一条件下に調製した
、７つのＶＮＴＲ変異型の各々について、等しい量の増
幅反応混合物の混合物であった。反応混合物の各々をプ
ールし、そして希釈した。最終混合物は反応混合物の各
々のもとの濃度の１：１０の希釈物であった。試料は、
実施例１に記載するように、４％の水平の極めて薄いポ
リアクリルアミドゲルおよび銀の染色を使用して電気泳
動にかけた。
ＮＴＲ変異型のＤＮＡを使用して同一条件下に調製した
、７つのＶＮＴＲ変異型の各々について、等しい量の増
幅反応混合物の混合物であった。反応混合物の各々をプ
ールし、そして希釈した。最終混合物は反応混合物の各
々のもとの濃度の１：１０の希釈物であった。試料は、
実施例１に記載するように、４％の水平の極めて薄いポ
リアクリルアミドゲルおよび銀の染色を使用して電気泳
動にかけた。
【００３６】試験した個体の変異型を内部標準とともに
同時に電気泳動にかけ、そして容易に同定することがで
きた。
同時に電気泳動にかけ、そして容易に同定することがで
きた。
【００３７】本発明の特徴および態様は以下のとおりで
ある。
ある。
【００３８】１、工程：
ａ、試料物質に少なくとも１つの対照を直接添加し、こ
こで試料および対照は標識されていないか、あるいは同
一標識を有し、 ｂ、対照を試料とともに電気泳動し、そしてｃ、電気泳
動分離後、試料物質を対照と比較する、からなる、試料
の電気泳動ゲルの分離においてバンド位置を同定する方
法。
こで試料および対照は標識されていないか、あるいは同
一標識を有し、 ｂ、対照を試料とともに電気泳動し、そしてｃ、電気泳
動分離後、試料物質を対照と比較する、からなる、試料
の電気泳動ゲルの分離においてバンド位置を同定する方
法。
【００３９】２、試料はヌクレオチド配列を含有し、そ
して対照は既知の大きさのヌクレオチド配列からなる、
上記第１項記載の方法。
して対照は既知の大きさのヌクレオチド配列からなる、
上記第１項記載の方法。
【００４０】３、試料はタンパク質を含有し、そして対
照は既知の大きさのタンパク質からなる、上記第１項記
載の方法。
照は既知の大きさのタンパク質からなる、上記第１項記
載の方法。
【００４１】４、試料はタンパク質を含有し、そして対
照は既知の等電点を有するタンパク質からなる、上記第
１項記載の方法。
照は既知の等電点を有するタンパク質からなる、上記第
１項記載の方法。
【００４２】５、電気泳動のための試料の調製の前に、
対照を試料に直接添加する、上記第１項記載の方法。
対照を試料に直接添加する、上記第１項記載の方法。
【００４３】６、前記対照は試料濃度の１／１０〜１／
２の濃度で存在する、上記第１項記載の方法。
２の濃度で存在する、上記第１項記載の方法。
【００４４】７、工程：
ａ、個体からの試料のＤＮＡから前記個体のＨＬＡアレ
ルの特徴を示すヌクレオチド配列を産生して、試料のヌ
クレオチド配列を産生し、 ｂ、ＨＬＡ位置の少なくとも１つのアレルの特徴を示す
対照のヌクレオチド配列とともに前記試料のヌクレオチ
ド配列を電気泳動にかけ、そして ｃ、前記試料のヌクレオチド配列を前記対照のヌクレオ
チド配列を比較する、からなる、個体のＨＬＡ位置につ
いてのＨＬＡアレル型を決定する方法。
ルの特徴を示すヌクレオチド配列を産生して、試料のヌ
クレオチド配列を産生し、 ｂ、ＨＬＡ位置の少なくとも１つのアレルの特徴を示す
対照のヌクレオチド配列とともに前記試料のヌクレオチ
ド配列を電気泳動にかけ、そして ｃ、前記試料のヌクレオチド配列を前記対照のヌクレオ
チド配列を比較する、からなる、個体のＨＬＡ位置につ
いてのＨＬＡアレル型を決定する方法。
Claims (2)
- 【請求項１】 工程： ａ、試料物質に少なくとも１つの対照を直接添加し、こ
こで試料および対照は標識されていないか、あるいは同
一標識を有し、 ｂ、対照を試料とともに電気泳動し、そしてｃ、電気泳
動分離後、試料物質を対照と比較する、からなる、試料
の電気泳動ゲルの分離においてバンド位置を同定する方
法。 - 【請求項２】 工程： ａ、個体からの試料のＤＮＡから前記個体のＨＬＡアレ
ルの特徴を示すヌクレオチド配列を産生して、試料のヌ
クレオチド配列を産生し、 ｂ、ＨＬＡ位置の少なくとも１つのアレルの特徴を示す
対照のヌクレオチド配列とともに前記試料のヌクレオチ
ド配列を電気泳動にかけ、そして ｃ、前記試料のヌクレオチド配列を前記対照のヌクレオ
チド配列を比較する、からなる、個体のＨＬＡ位置につ
いてのＨＬＡアレル型を決定する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/550,940 US5096557A (en) | 1990-07-11 | 1990-07-11 | Internal standard for electrophoretic separations |
| US550940 | 1995-10-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04232850A true JPH04232850A (ja) | 1992-08-21 |
Family
ID=24199193
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3196018A Pending JPH04232850A (ja) | 1990-07-11 | 1991-07-11 | 電気泳動分離のための内部標準 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5096557A (ja) |
| EP (1) | EP0466479B1 (ja) |
| JP (1) | JPH04232850A (ja) |
| AT (1) | ATE159589T1 (ja) |
| DE (1) | DE69127999T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015518169A (ja) * | 2012-05-29 | 2015-06-25 | ヘルス・ダイアグノスティック・ラボラトリー，インコーポレーテッド | ｉｎ−ｓｉｔｕキャリブレーションを用いるゲル電気泳動用の組成物及び方法 |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5110434A (en) * | 1990-12-20 | 1992-05-05 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Use of zwitterions to mobilize isoelectrically focused ampholyte zones |
| WO1993014224A1 (en) * | 1992-01-14 | 1993-07-22 | Applied Biosystems, Inc. | Size-calibration dna fragment mixture and method |
| US5843680A (en) * | 1992-01-31 | 1998-12-01 | Biometric Imaging, Inc. | Differential separation assay methods and test kits |
| US5221454A (en) * | 1992-01-31 | 1993-06-22 | Biometric Imaging Inc. | Differential separation assay |
| US5137609A (en) * | 1992-01-31 | 1992-08-11 | Biometric Imaging Inc. | Differential separation assay |
| DE69322266T2 (de) * | 1992-04-03 | 1999-06-02 | Perkin Elmer Corp | Proben zusammensetzung und verfahren |
| EP0654090A4 (en) * | 1992-08-10 | 1998-07-08 | Biometric Imaging Inc | METHOD OF DETECTION BY DIFFERENTIAL SEPARATION AND TEST EQUIPMENT. |
| EP1044370B1 (en) | 1997-12-30 | 2017-08-23 | Caliper Life Sciences, Inc. | Software for the display of chromatographic separation data |
| US7058517B1 (en) | 1999-06-25 | 2006-06-06 | Genaissance Pharmaceuticals, Inc. | Methods for obtaining and using haplotype data |
| DE1233364T1 (de) * | 1999-06-25 | 2003-04-10 | Genaissance Pharmaceuticals | Verfahren zur herstellung und verwendung von Haplotype Daten |
| MXPA02002507A (es) * | 1999-09-07 | 2004-09-10 | Decode Genetics Ehf | Deteccion de alteraciones en un gen por pcr de largo alcance mediante el uso de elementos moviles humanos. |
| US6931326B1 (en) | 2000-06-26 | 2005-08-16 | Genaissance Pharmaceuticals, Inc. | Methods for obtaining and using haplotype data |
| US6397150B1 (en) * | 2000-07-27 | 2002-05-28 | Visible Genetics Inc. | Method and apparatus for sequencing of DNA using an internal calibrant |
| US7790368B1 (en) | 2000-09-22 | 2010-09-07 | Hitachi, Ltd. | Method for analyzing nucleic acid |
| EP1236738A1 (en) * | 2001-02-23 | 2002-09-04 | Jungbauer, Alois, Professor Dr. | Internal standard for electrophoretic and chromatographic separation process |
| US7222059B2 (en) * | 2001-11-15 | 2007-05-22 | Siemens Medical Solutions Diagnostics | Electrophoretic trace simulator |
| US20040267458A1 (en) * | 2001-12-21 | 2004-12-30 | Judson Richard S. | Methods for obtaining and using haplotype data |
| US20030207310A1 (en) * | 2002-05-01 | 2003-11-06 | Zhaowei Liu | System and method for determining the sizes and quantity of polynucleotides with capillary array electrophoresis |
| EP1396962A1 (en) * | 2002-08-05 | 2004-03-10 | Sony International (Europe) GmbH | Bus service interface |
| CN100516862C (zh) * | 2006-07-14 | 2009-07-22 | 中国科学院上海有机化学研究所 | 精对苯二甲酸中杂质含量的毛细管电泳内标定量分析方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3607695A (en) * | 1969-02-14 | 1971-09-21 | Pfizer & Co C | Hemoglobinopathy controls |
| DK105582A (da) * | 1982-03-11 | 1983-09-12 | Nordisk Insulinlab | Fremgangsmaade til bestemmelse af humane hla-d(r) vaevstyper og gensonde til brug ved fremgangsmaaden |
-
1990
- 1990-07-11 US US07/550,940 patent/US5096557A/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-07-10 EP EP91306263A patent/EP0466479B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-10 AT AT91306263T patent/ATE159589T1/de active
- 1991-07-10 DE DE69127999T patent/DE69127999T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-11 JP JP3196018A patent/JPH04232850A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015518169A (ja) * | 2012-05-29 | 2015-06-25 | ヘルス・ダイアグノスティック・ラボラトリー，インコーポレーテッド | ｉｎ−ｓｉｔｕキャリブレーションを用いるゲル電気泳動用の組成物及び方法 |
| JP2018028549A (ja) * | 2012-05-29 | 2018-02-22 | ヘルス・ダイアグノスティック・ラボラトリー，インコーポレーテッド | ｉｎ−ｓｉｔｕキャリブレーションを用いるゲル電気泳動用の組成物及び方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0466479A1 (en) | 1992-01-15 |
| DE69127999T2 (de) | 1998-04-02 |
| US5096557A (en) | 1992-03-17 |
| EP0466479B1 (en) | 1997-10-22 |
| DE69127999D1 (de) | 1997-11-27 |
| ATE159589T1 (de) | 1997-11-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH04232850A (ja) | 電気泳動分離のための内部標準 | |
| Petersen et al. | Capillary electrophoresis and its application in the clinical laboratory | |
| Ulfelder et al. | Restriction fragment length polymorphism analysis of ERBB2 oncogene by capillary electrophoresis | |
| Cremonesi et al. | Double-gradient DGGE for optimized detection of DNA point mutations | |
| Tian et al. | Single-strand conformation polymorphism analysis by capillary and microchip electrophoresis: a fast, simple method for detection of common mutations in BRCA1 and BRCA2 | |
| Thormann et al. | Advances of capillary electrophoresis in clinical and forensic analysis (1999–2000) | |
| Butler et al. | Application of dual internal standards for precise sizing of polymerase chain reaction products using capillary electrophoresis | |
| US5858658A (en) | Method of quantitating genomic DNA | |
| Cossu et al. | Rh D/d genotyping by quantitative polymerase chain reaction and capillary zone electrophoresis | |
| Bulinski et al. | Microtubule-associated proteins from cultured HeLa cells. Analysis of molecular properties and effects on microtubule polymerization. | |
| Thormann et al. | Capillary electrophoresis in clinical and forensic analysis: recent advances and breakthrough to routine applications | |
| CN110577990B (zh) | 一种检测地贫基因突变的试剂盒 | |
| US7672786B2 (en) | Non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures (NECEEM)—based methods for drug and diagnostic development | |
| Jin et al. | Miniaturized electrophoresis: an evolving role in laboratory medicine | |
| Felmlee et al. | Capillary electrophoresis of DNA potential utility for clinical diagnoses | |
| Arakawa et al. | Analysis of polymerase chain reaction-product by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection and its application to the diagnosis of medium-chain acyl-coenzyme A dehydrogenase deficiency | |
| Hawtin et al. | Utility of lab‐on‐a‐chip technology for high‐throughput nucleic acid and protein analysis | |
| Baba et al. | Rapid typing of variable number of tandem repeat locus in the human apolipoprotein B gene for DNA diagnosis of heart disease by polymerase chain reaction and capillary electrophoresis | |
| García-Descalzo et al. | Gel electrophoresis of proteins | |
| Cantàfora et al. | Rapid sizing of microsatellite alleles by gel electrophoresis on microfabricated channels: application to the D19S394 tetranucleotide repeat for cosegregation study of familial hypercholesterolemia | |
| Gelfi et al. | Gene dosage in capillary electrophoresis: pre-natal diagnosis of Down's syndrome | |
| Le et al. | Applications of capillary electrophoresis in DNA mutation analysis of genetic disorders. | |
| Righetti et al. | Recent advances in capillary electrophoresis of DNA fragments and PCR products | |
| Ren et al. | Inverse-flow derivatization for capillary electrophoresis of DNA fragments with laser-induced fluorescence detection | |
| Zhu et al. | Detection of clonal T-cell receptor-gamma gene rearrangement by PCR/temporal temperature gradient gel electrophoresis |