JPH0421480B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はα−アミラーゼ活性測定方法に関す
る。

デンプンやグリコーゲン等を加水分解する酵素
α−アミラーゼの活性は、膵臓や唾液腺の機能の
重要な指標であるので、その測定は臨床医学的に
極めて重要である。特に、急性膵炎の診断にはそ
の活性の測定は緊急を要する。

このために特公昭51−14916号公報には、アミ
ロース又はアミロース含有物質に水溶性の反応性
色素、例えばトリアジン染料の一種であるシバク
ロンブルー3G−Ａを共有結合にて結合させた水
不溶性の色素多糖類複合体の水縣濁液を調製し、
これにα−アミラーゼを含有する血清や尿等の試
料を加え、所定条件下に上記複合体にα−アミラ
ーゼの酵素作用を受けさせ、水溶性の色素オリゴ
糖複合体を生成させ、次いで、これを含有する上
澄液を遠心分離等によつて分取し、その着色度を
吸光度分析することにより、α−アミラーゼの活
性を測定する方法が提案されている。

また、特公昭51−34317号公報にも、デンプン、
アミロース等を二官能性架橋剤にて架橋して水不
溶性ゲルとし、これに前記のように水溶性反応性
色素を結合させた粒状の親水性水不溶性の色素多
糖類複合体が記載され、上記と同様にして試料中
のα−アミラーゼ活性を測定する方法が開示され
てる。

しかし、これらの方法は、いずれも上記のよう
に色素多糖類複合体に試料を反応させた後の上澄
液の分取及び分光光度計による吸光度測定のため
に、通常、30分程度を要して緊急性に欠けると共
に操作が煩雑である。

本発明は水不溶性の色素多糖類複合体を用いる
α−アミラーゼ活性測定における上記した問題を
解決するためになされたものであつて、反応後の
上澄液の分取や分光光度計による吸光度測定のよ
うな煩雑な操作を不要とした簡単且つ迅速なα−
アミラーゼ活性測定方法を提供することを目的と
する。

本発明によるα−アミラーゼ活性測定方法は、
α−アミラーゼによつて加水分解され得る多糖類
に水溶性の反応性色素を化学結合させてなる水不
溶性の色素多糖類複合体の第１の層と、親水性で
ある水不溶性の担体物質からなる第２の層とを充
填した小径管に、上記第１の層の外側部よりα−
アミラーゼを含有する水性試料を含浸させて上記
色素多糖類複合体を加水分解させ、生成する水溶
性色素オリゴ糖複合体を上記試料と共に上記担体
層に移動させ、担体層に吸着させて着色させ、こ
の担体層における着色域の長さによりα−アミラ
ーゼ活性を求めることを特徴とする。

本発明の方法において用いる水不溶性色素多糖
類複合体は、前記したようにα−アミラーゼによ
つて加水分解され得るデンプン、アミロース等の
多糖類に水溶性色素を化学的に結合させてなる水
不溶性の複合体であり、α−アミラーゼによる加
水分解を受けてイオン性基を有する水溶性の色素
オリゴ糖複合体を生じる限りは、前記したように
多糖類は多官能性架橋剤にて架橋されていてもよ
い。また、水溶性色素としても前記したシバクロ
ンブルー3G−Ａのほか、種々のものが用いられ
る。このように水溶性色素を多糖類に結合させた
水不溶性の色素多糖類複合体は、例えば、フアル
マシア社から市販されており、入手することがで
きる。

担体物質としては、通常のクロマトグラフイー
用の担体を用いることができ、例えば、無色、微
結晶状のイオン性基を有するジエチルアミノエチ
ル化（DEAE）セルロースが好適に用いられる。
また、小径管としては、通常、内径が数mm程度の
透明なガラス管や合成樹脂管が用いられる。

以下に図面に基づいて本発明を説明する。

第１図は本発明の方法において用いる測定管を
示す。この測定管は、内径１〜２mm程度の透明な
小径管１に、前記した水不溶性色素多糖類複合体
と微結晶セルロースとの混合粉末の充填層２が下
側に、また、担体としての微結晶DEAEセルロー
スの充填層３が上側に充填され、これらの充填層
を管内に固定するために、充填層の外側端部には
適宜の充填物質４、例えば、ガラスウールやセル
ロース綿が充填されて構成されている。更に、通
常は、測定管内に雑菌が混入するのを防止するた
めに、小径管の両端は溶封されており、使用に際
してその溶封部が除去される。

この測定管の使用に際しては、第２図に示すよ
うに、色素多糖類複合体の充填層２内にα−アミ
ラーゼを含有する試料水溶液５が浸透し得るよう
に測定管を試料水溶液中に浸漬し、毛細管現象に
より小径管内を試料水溶液を上昇させる。このよ
うにして試料水溶液が小径管内を上昇する過程
で、色素多糖類複合体は試料水溶液に含まれるα
−アミラーゼによつて加水分解されて水溶性の色
素オリゴ糖複合体を生成し、この色素オリゴ糖複
合体は、第３図に示すように、試料水溶液と共に
更に小径管内を上昇して無色の担体の充填層３に
至り、イオン性基を有する担体に吸着されて、こ
れを着色する。

ここに、生成する上記色素オリゴ糖複合体の量
は、試料水溶液中に含まれるα−アミラーゼの量
に比例し、従つて、担体層にはα−アミラーゼの
量に比例した長さの着色域６が形成される。従つ
て、所定径の小径管に所定量の色素多糖類複合体
と担体とを二層に充填し、これについて予め検量
線を作成しておくことにより、上記担体層におけ
る着色域の長さによつて試料水溶液中のα−アミ
ラーゼの活性を測定することができる。

第４図は小径管の上方より試料水溶液を注入し
て測定するための測定管を示し、試料槽７から下
方に小径管１が連なつて形成され、この小径管内
に上方に色素多糖類複合体層２が充填され、下方
に担体層３が充填されている。この測定管によれ
ば、上記試料槽に試料水溶液を注入し、色素多糖
類複合体層に流下させて、前記と同様に反応させ
て水溶性の色素オリゴ糖複合体を生成させ、これ
を更に担体層に流下させれば、α−アミラーゼの
量に比例した長さの着色域が形成され、この長さ
によつて試料水溶液中のα−アミラーゼの活性を
測定することができる。

以上のように本発明の方法によれば、小径管内
にα−アミラーゼによつて加水分解されて、水溶
性の色素オリゴ糖複合体を生成する水不溶性の色
素多糖類複合体と、上記色素オリゴ糖複合体を吸
着する担体層を二層に充填し、α−アミラーゼを
含有する試料水溶液をこの色素多糖類複合体充填
層に含浸させ、生成した色素オリゴ糖複合体を担
体層に移動させ、色素オリゴ糖複合体による着色
域の長さにより試料中のα−アミラーゼ活性を測
定するから、従来の方法と異なり、反応後の上澄
液の分取やその吸光度分析が不要であつて、非常
に簡単且つ迅速にα−アミラーゼ活性を測定する
ことができる。

以下に本発明の実施例を挙げる。

実施例 １ 市販の色素多糖類複合体（フアルマシア社製）
５錠と微結晶セルロース200mgを乳鉢ですりつぶ
して均一に混合した。

内径２mmの透明ガラス管下端から約10mmの位置
にガラスウールを充填し、この上に上記の混合粉
末を10mmの厚さに充填し、更にこの上に微結晶
DEAEセルロースを厚さ40mmに充填し、これをガ
ラスウールで被覆して測定管とした。

色素デンプン法（奥田清編「臨床化学検査マニ
ユアル」第132頁、医歯薬出版(株)発行）に従つて
測定したα−アミラーゼ活性量がそれぞれ100、
200、400、800、1000及び1500U／Ｌとなるよう
にした水溶液30mlを標準試料として調製し、この
試料水溶液中に上記測定管の下部を浸漬し、α−
アミラーゼ水溶液を毛細管現象によりガラス管内
を上昇させた。α−アミラーゼの酵素作用によつ
て生成された水溶性色素オリゴ糖複合体が着色し
た担体セルロース層の長さは上記の活性単位に対
応してそれぞれ２、５、12、25、27及び30mmであ
つた。

また、各試料水溶液が測定管の全部に浸透する
のに要した時間は、ある程度は試料水溶液の粘度
やガラス管内の充填密度に依存するが、ほぼ７分
であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法において用いる測定管の
一例を示す断面図、第２図はその使用方法を示す
断面図、第３図は担体層における着色域を示す測
定管の断面図、第４図は測定管の別の例を示す断
面図である。 １……小径管、２……色素多糖類複合体の充填
層、３……担体物質の充填層、５……試料水溶
液、６……着色域、７……試料槽。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ α−アミラーゼによつて加水分解され得る多
   糖類に水溶性の反応性色素を化学結合させてなる
   水不溶性の色素多糖類複合体の第１の層と、親水
   性である水不溶性の担体物質からなる第２の層と
   を充填した小径管に、上記第１の層の外側部より
   α−アミラーゼを含有する水性試料を含浸させて
   上記色素多糖類複合体を加水分解させ、生成する
   水溶性色素オリゴ糖複合体を上記試料と共に上記
   担体層に移動させ、担体層に吸着させて着色さ
   せ、この担体層における着色域の長さによりα−
   アミラーゼ活性を求めることを特徴とするα−ア
   ミラーゼ活性測定方法。