JPH04179494A - 抗凝固性および抗寄生虫性タンパク質およびその製法 - Google Patents

抗凝固性および抗寄生虫性タンパク質およびその製法

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JPH04179494A
JPH04179494A JP2249911A JP24991190A JPH04179494A JP H04179494 A JPH04179494 A JP H04179494A JP 2249911 A JP2249911 A JP 2249911A JP 24991190 A JP24991190 A JP 24991190A JP H04179494 A JPH04179494 A JP H04179494A
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ジョ―ジ　エヌ．コックス
Michael Milhausen
マイケル　ミルホーセン
Robert Hageman
ロバート　ヘイグマン
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はタンパク質、および哺乳動物特にヒツジの寄生
虫に対するワクチンとしてのその使用に関する。本発明
はまた、実質的に純粋な形態のこれらタンパク質の製法
に関する。
ヘモンカス・コントルツス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃ
ｏｎｔｏｒｔｕｓ）はヒツジ、ウシ、ヤギおよび多くの
種の野生型反別動物に普通に見られる血液栄養性寄生虫
である。これら寄生虫は宿主の血液を食へ、そして宿主
の系に溶血液タンパク質を注入し、それにより貧血、や
せ、浮腫および腸障害を引き起こす。
重い感染の場合には、宿主は通常死ぬ。
感染は、また第二期の角度の残余をまとっている第三期
幼虫を食べた場合に起る。前胃で脱皮が起り、その時点
で寄生虫はＸＬ３幼虫（ＸＬ３）と呼はれる。第四胃に
入ると、虫は４８時間以内に脱皮してＬ４幼虫（Ｌ４）
となるかまたは第四期幼虫となり、このものがその宿主
の血液を養分とする。約３日で、虫は最後の脱皮をして
、約１５日後に産卵をはじめる。
これら寄生虫に対するワクチンを開発する試みは数多く
なされてきた。しかしなから、防御を担う免疫メカニズ
ムは解明されておらず、また特異的なタンパク質抗原も
同定されていなかった。研究では、宿主内でχＬ３から
５４期まで虫を発育させることが、幼虫による再感染に
対する防御を付与するのに充分であることか示唆されて
いる（Ａｄａｍｓ。
Ｄ、　Ｂ、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇ
ｙ　１２：　４３９−４４３．　（１９８２）；　０ｚ
ｅｒｏｌら、Ｊ、　　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　５６
：　１１９９−１２０５（１９７０）およびＮｅ１ｌｓ
ｏｎ、　Ｅｘｐ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　２５：
１３１−１４１　（１９６９）。これと一致して、実験
的に再感染させた免疫動物の第四胃から回収されたＸＬ
３およびＬ４幼虫の数は未経験の対照ヒツジに比較して
大きく減少していることが示されており、このことは宿
主の免疫応答かこれら２種の発育状態に対するものであ
ることを示唆している（Ｂｉｔａｋａｒａｍｉｒｅ。
Ｐ、　Ｋ、、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　５６：　６
１９−６２２．　１９６６）。今日までの大部分の研究
はへモンヵス・コンドルラスをインビトロでＸＬ３およ
び５４期まで育てることにより得られる液体中の防御抗
原を同定することに焦点かおかれてきた（Ｏｚｅｒｏｌ
ら、Ｊ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ５５：　７９−８
７　（１９６９））。かかる濃度液を用いるヒツジでの
予防接種研究では、６か月またはそれより大きい子ヒツ
ジを部分的防御できることか示されたが、６か列以内の
子ヒツジでは二義的な防御しか示されなかった（Ｏｚｅ
ｒｏｌら、ＰａｒａＳｉｔｏｌｏｇＹ　５６゜５ｕｐｒ
ａ、　Ｎｅ１ｌｓｏｎ、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐａｒａｓ
ｉｔｏｌｏｇｙ　５：　４２７−４３０　（１９７５）
およびＢｉｏｉｓｖｅｎｕｅら、Ａｍ、　Ｊ、　ｖｅｔ
。
Ｒｅｓ、　４８：　１２３６−１２３８）１９８７））
。
寄生虫である線虫の角度表面に存在するある種のタンパ
ク質が宿主による抗体の形成を誘発しうろことも知られ
てる（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅら、Ｂｕｒ、　Ｊ、　ｏｆＩ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１０：　５９４−６０１　（１９
８０）およびＭａｉｚｅｌｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
　３８：　１０７−１２１　（１９８３））。これらの
タンパク質は発育期と発育期の間で、およびある場合に
は一発育期間中に原基な抗原的変化を受けることも知ら
れている（Ｐｈｉｌｌｉｐら、Ｎａｔｕｒｅ　２８７：
５３８−５４０　（１９８０）およびＭａｉｚｅｌｓら
、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　３８：１０７−１２１　（１
９８３））。インビトロ研究では、ある種の寄生性線虫
の表面抗原に対する抗体が顆粒球およびマクロファージ
による付着および殺虫を促進することか示されている（
Ｋａｚｕｒａら、Ｎａｔｕｒｅ　２７４：５８８−５８
９　（１９７８）；　Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ　　ら、Ｅｕ
ｒ、　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎ。
ｌｏｇｙ：　５９４−６０１　（１９８０）およびＳｕ
ｂｅｈｍａｎｙａｍら、Ｎｕｔｕｒｅ　２６０：　５２
９−５３０　（１９８４）。抗体およびエフェクター細
胞（好酸球およびマクロファージ）かインビトロで虫を
殺す能力を有することは、寄生性線虫が宿主内で発育す
るに伴い表面抗原を変化させるという所見を一緒にする
と、表面タンパク質がサブユニットワクチンとして有効
でありうるという考えに到達する。しかしなから、この
仮説を試験することは細胞性タンパク質を含まない表面
タンパク質を充分な量で精製できないことが壁となって
妨げられてきた。
トリキネラ・スピラリス（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ　５
ｐｉｒａｌｉｓ）の新生幼虫の表面成分に対するモノク
ローナル抗体が受動転移実験においてインビトロで部分
的な防御を付与することは示されている（Ｏｒｔｅｇａ
Ｐｉｅｒｒｅｓら、Ｐａｒａｓｉｔｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌ
、　　６：　２７５−２８４　（１９８４））。また、
ヘモンカスの腸の微絨毛に存在する膜関連タンパク質か
へモンカスからヒツジを部分的に防御するためのワクチ
ンとして使用できることも知られている（Ｐａｒａｓｉ
ｔｏｌｏｇｙ　９４：　３８５−３９７（１９８７））
。
ヘモンカスを含む寄生虫の制御は駆虫剤の投与によっで
ある程度達成されたか、この方法は任意の度合いの制御
を達成するには反復投薬を必要とするので満足できるも
のではない。
驚くべきことに、従来法の欠点にもかかわらず、本発明
者らは細胞性タンパク質を含有しない角質表面タンパク
質を充分な量で精製する方法を見出し、コラーゲンペプ
チドを同定しそして抗凝固性タンパク質抽出物の製法を
見出した。これらタンパク質抽出物のすべてはヒツジの
寄生虫による感染に対するワクチンとして有用である。
発明の要約 本発明は従来知られているタンパク質および方法の欠点
を克服するものである、ヒツジの抗寄生虫ワクチンとし
て有用なタンパク質およびその製法を提供することを目
的とする。
本発明の他の目的および利点は以下の記載に示され、一
部はそれら記載から明らかであるかまたは本発明を実施
することにより学習されうる。本発明の目的および利点
は特に特許請求の範囲に示されている記載およびその組
み合わせによって実現および得られよう。
前記目的を達成するには、そしてここに具体的に広範に
記載されている本発明の目的によれば、ヒツジの寄生虫
による感染の予防に有用な種々のタンパク質が提供され
る。
さらに、抗凝固性で抗寄生虫性のタンパク質の組換えＤ
ＮＡ法による製法、および角質タンパク質の精製法が提
供される。
ここまでの記載および以下に示す詳細な記載は例示およ
び説明のためのみてあって本発明を限定するものではな
いことは理解される。
以下に図面について簡単に説明する。
第１図、生きたＸＬ３およびＬ４の１２５Ｉ−標識化に
より得られたタンパク質パターン。生きた虫を１２５１
およびクロラミンＴで標識した。標識後、虫を音波処理
しそして微粒子状の虫フラグメントを遠心分離により集
めた。上清中に残る標識タンパク質をＳ／Ｎと表示した
レーンに示す。ＳＤＳおよびＳＤＳ　＋ＢＭＥを用いる
連続抽出により虫フラグメントペレットから可溶化され
た標識タンパク質をそれぞれＳＯ３およびＢＭＨのレー
ンに示す。各フラクションの一部分（ＳＤＳおよびＢＭ
Ｅレーンでｔｏ、　ＯＯＯｃｐｍ）をＳＤＳ試料緩衝液
中に希釈して１２％ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲルで
電気泳動した。ゲルを乾燥しそして一７０°ＣでＸ線フ
ィルムに露出させた。タンパク質標準物の分子量を（キ
ロダルトンで）右側に示す。
Ｌ４の主要な２７および２９　ｋＤａ　５ＤＳ−可溶性
タンパク質はこのオートラジオグラムて一個の太いバン
ドとして現われる。
第２図、細菌性コラ−ゲナーゼて処理したＸＬ３および
１４表面タンパク質のオートラジオグラム。
虫から５ＯＳ（ＳＤＳレーン）またはＳＯ３＋　ＢＭＥ
（ＢＭＥレーン）を用いて可溶化したｕｓ（−標識タン
パク質を未標識成体角質タンパク質と混合しそして細菌
性コラ−ゲナーゼ（＋レーン）または緩衝剤（−し−ン
）と−夜インキユベートした。反応はＳＤＳ試料緩衝液
中に希釈することにより停止させ、続いて試料を１２％
ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した。
ゲルをクマシーブルーで染色して（＋）レーンで成体角
質コラーゲンの消化を検査し、そして非特異的なタンパ
ク分解の非存在について確認した（染色されたゲルは示
されず）。ゲルを乾燥して一７０℃でＸ線フィルムに露
出させた。タンパク質標準物の分子量を左側に示す。
第３図、エンドグリコシダーゼＦて処理後のＸＬ３およ
びＬ４表面タンパク質のオートラジオダラム。ＸＬ３お
よびＬ４の１２ｓＩ−標識された、ＳＤＳ可溶性表面タ
ンパク質をエンドグリコシダーゼＦ（＋レーン）または
緩衝剤（−レーン）と−夜インキユベートした。反応混
合物をＳＤＳ試料緩衝液中に希釈しそして１２％５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。タンパク質
標準物の位置および分子量（キロダルトン）を左側に示
す。
第４図１種々の抗−角質血清を用いる生きたＸＬ３およ
びＬ４の蛍光顕微鏡写真。生きたＸＬ３およびＬ４とウ
サギ抗−天然型ＸＫ３／　Ｌ４角質血清（Ｒｂ８０６１
）との反応をそれぞれ（Ａ）および（Ｃ）に示す。生き
たＸＬ３トウサキ抗−３ＤＳ処Ｗ　ＸＬ３角質血清（Ｒ
ｂ６７９１）との反応を（Ｂ）に示す。生きたＬ４とウ
サギ抗−３ＤＳ−処理し４角質血清（Ｒｈ−７５３９）
との反応を（Ｄ）に示す。−次抗血清とのインキュベー
ション後に虫を洗浄しそしてＦＩＴＣ接合ヤギ抗−ウサ
ギＩｇＧ血清とインキュベートした。さらに洗浄後、虫
を蛍光機器を備えた光学顕微鏡中で観察した。プレ採血
した血清とＸＬ３およびＬ４との反応は（Ｂ）および（
Ｄ）に示される反応とほぼ等しかった。Ｒｂ６７９１血
清とＬ４の反応およびＲｂ７５３９血清とＬ３との反応
も（Ｂ）および（Ｄ）に示される反応とほぼ等しかった
。全ての顕微鏡写真がほぼ等しい露出を示した。顕微鏡
写真（Ａ）および（Ｂ）の倍率は（Ｃ）および（Ｄ＞の
それのおよそ２倍である。
第５図は１２５Ｉ−標識ＸＬ３表面タンパク質と免疫ヒ
ツジ血清との免疫沈降を示す。ＳおよびＢはＸＬ３のＳ
ＤＳまたはＳＤＳ　＋　ＢＭＥ抽出物を指す。
第６図は＋２５１−標識ＸＬ３表面タンパク質と免疫ヒ
ツジ血清との免疫沈降を示す。ＸＬ３タンパク質試料は
ＢＭＥ（＋レーン）で減少されるかまたはＢＭＥ（−レ
ーン）で減少されなかった。
第７図は＋２５Ｉ−標識Ｌ４表面タンパク質と免疫ヒツ
ジ血清との免疫沈降を示す。ＳおよびＢはＬ４のＳＤＳ
もしくはＳＤＳ＋ＢＭＥ抽出物を指す。
第８図はエンドグリコシダーゼＦで処理する前（−レー
ン）または後（＋レーン）の＋２５１−標識Ｌ４表面タ
ンパク質の免疫沈降を示す。
第９図　１［［表面標識化により同定されそして種々の
抽出操作により精製されたヘモンカス・コントルツスＸ
Ｌ３およびＬ４表面タンパク質の比較。
ｌ２Ｓ（およびクロラミンＴにより標識された表面タン
パク質（”’Ｉレーン）をＳＤＳ　（ＳＤＳレーン）ま
たはＮａＣ１（ＮａＣｌレーン）操作により抽出された
タンパク質のクマシーブルー染色ゲルパターンと比較す
る。タンパク質試料を１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲルで電気泳動した。染色されたゲルレーンのそれぞ
れは１０マイクログラムのタンパク質を含有する。タン
パク質標準物の分子量（キロダルトン）を示す。
第１０図、　　ＸＬ３およびＬ４表面タンパク質抽出物
に対して生成されたウサギ抗血清とインキュベートした
生きたヘモンカス・コントルツスＸＬ３およびＬ４の蛍
光顕微鏡写真。抗−ＸＬ３表面タンパク質血清（Ｒｈ−
９４４６）とＸＬ３およびＬ４の混合物との反応を（Ａ
）に示す。視野の中心にある２個のＸＬ３は明るい蛍光
を発するか、Ｌ４は陰性である。矢印はＬ４の幾つかの
位置を示す。抗−Ｌ４表面タンパク質血清（Ｒｈ−１５
３）と生きたＸＬ３およびＬ４との陽性反応をそれぞれ
（Ｂ）および（Ｃ）に示す。Ｒｈ−１５３プレ採血血清
とＬ４との陰性反応を（Ｄ）に示す。Ｒｈ−１５３プレ
採血血清とＸＬ３との反応はＬ４とで見られたそれとほ
ぼ等しかった。免疫Ｒｈ−１５４血清（抗−３ＤＳ変性
Ｌ４表面タンパク質血清）とＸＬ３およびＬ４との反応
は（Ｂ）および（Ｃ）に示される反応とほぼ等しかった
。
第１１図　１２ＳＩ−標識ＸＬ３（左図）およびＬ４　
（右図）表面タンパク質と、表面タンパク質に対して調
製されたウサギ抗血清との免疫沈降反応。ＸＬ３および
Ｌ４対照レーンは免疫沈降反応は用いられた試料中の１
２５１−標識ＸＬ３およびＬ４タンパク質のパターンを
示す。　１２５Ｉ−標識表面タンパク質の一部分をプレ
採血ＣＰ’）または免疫（１）抗−ＸＬ３（Ｒｈ−９４
４６）　マｆニー　ハ抗−Ｌ４（Ｒｂ−１５３およびＲ
ｂ−１５４）ウサギ血清と一夜インキユベートした。Ｓ
Ｏ３可溶性（Ｓ）およびＳＯ８十ＢＭＥ可溶性（Ｂ）表
面標識タンパク質を別々に分析した。
免疫沈降物を１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで
分析した。ゲルを乾燥しそしてオートラジオグラフィー
した。タンパク質標準物の分子量（ＭＷ）を左側にキロ
ダルトンで示す。
第１２図、　３５　ｋＤａプロテアーゼに対して調製さ
れたウサギ抗血清のゲル精製および特性決定。セファロ
ースＣＬ−４Ｂカラムのボイド量に溶出してくる活性フ
ラクシ由ン中に存在するタンパク質をレーン（１）に示
す。矢印３５　ｋＤａチオールプロテアーゼの位置を示
す。調製用ＳＤＳゲルから電気的溶離により得られた３
５　ｋＤａタンパク質をレーン（２）に示す。
溶出した３５　ｋＤａバンドをウサギ１１０２８５の免
疫化に使用した。この免疫血清と成体虫全タンパク質、
およびＦＰＬＣＭｏｎｏ　Ｑカラムクロマトグラフィー
により得られた抗凝固性抽出物との反応をそれぞれレー
ン（３）および（４）に示す。抗血清と弱く反応する３
７ｋＤａタンパク質を矢印で示す。タンパク質標準物の
分子量を右側に示す。
第１３図９組換えファージクローンによす選択された抗
体のウェスタンプロット分析。Ｇｇｔｌｌ・ヘモンカス
・コントルツス成体ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリ
ーニングすることにより単離されたファージクローンを
寒天プレートに塗布し、ニトロセルロースフィルターと
重ね、−夜増殖させ、そしてフィルターをＲｈ−１０２
８５抗血清とインキュベートしそして洗浄した。結合さ
れた抗体を低ｐＨグリシン緩衝液て溶離し、中和しそし
てこれをプローブとして用いた成体虫全タンパク質（Ａ
図）またはＭｏｎｏ　Ｑ精製抗凝固性抽出物（Ｂ図）の
ウェスタンプロットを示す。レーン１はこれら抗原とＲ
ｂ−１０２８５との反応を示す。ファージλｇｔ１１．
２Ａ、２Ｂおよび４Ａにより選択された抗体の反応をそ
れぞれレーン２．３．４および５に示す。ファージ２Ｂ
のみがＡ図およびＢ図で３５　ｋＤａタンパク質（矢印
で示す）と反応する抗体を選択した。このファージクロ
ーンにより選択された抗体は３７ｋＤａタンパク質（矢
印）とも弱く反応する。タンパク質標準物の分子量を左
側に示す。
第１４図、　ｃＤＮＡ　２Ｂ、　　３−１およびＦ−１
の関係。ｃＤ、ＮＡ２Ｂ、３−１およびＦ−１の相対的
な寸法および制限地図を示す。厚い水平ラインはコード
領域を示す。薄い水平ラインは３−非翻訳配列を表わす
。配列決定されたｃＤＮＡの領域を矢印で示す。星印は
合成オリゴヌクレオチドブライマーを用いて決定された
配列を示す。示される制限酵素部位はＥｃｏＲＩ（Ｅ）
；Ｈｉｎｄｌｌｌ　（Ｊ（）　；　５ａｌｌＣ３）　；
およびＸｈｏｌ（Ｘ）である。
ｃＤＮＡの５′および３゛末端に存在するＥｃｏＲ１部
位はクローニング操作の間に付加されたものであって、
これらをカッコ内に示す。ＣＤＮＡ　Ｆ−１はその５゛
末端に欠陥ＥｃｏＲ１部位を有する。３°非翻訳領域の
長さは２Ｂ対３−１およびＦ−１で異なることに注意さ
れたし。
第１５図、　ＡＣ−１のヌクレオチドおよび予想される
アミノ酸配列。示される配列はｃＤＮＡ　２Ｂ、　３−
１およびＦ−１の種々の領域から得られた配列の混成物
である。示されるイニシエーターＡＴＧのＡＴはｃＤＮ
Ａ中に存在せず、ヘモンカス・コントルッス：λＥＭＢ
Ｌ−３ファージライブラリーから単離されたＡＣ−２遺
伝子の配列から推定された。クローニング過程で付加さ
れたＥｃｏＲＩリンカ−は示されない。Ｎ一連結グリコ
シル化の可能性のある部位を点線のアンダーラインで示
す。星印は終止コドンを示す。ポリ（Ａ）付加シグナル
の可能性のある部位ＡＡＴＡＡをアンダーラインで示す
。ヌクレオチド１０７３ての黒い三角はｃＤＮＡ　Ｆ−
１および３−１のポリ（Ａ）足部の位置を示す。
第１６図、　ＡＣ−１ｍＲＮＡ転写物のノーザンプロッ
ト分析。１６５Ｉｇの成虫ポリＡ”　ｍＲＮＡを１，５
％変性ボルムアルデヒドアガロースゲルに電気泳動し、
ナイトセルローズ膜上にプロットしｃＤＮＡ　Ｆ−１の
〜１、　Ｏｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントを含有する２
２ｐ標識した１）ＢＲ３２５プラスミドとハイブリッド
形成した。ハイブリッド形成したｍＲＮＡのサイズは約
１．２５ｋｂである。ＲＮＡサイズマーカーの位置は左
側に示した。
第１７図、　ＡＣ−１の予想したアミノ酸配列とヒト力
テブシンＢとの比較。上の配列はＡＣ−１であり、下の
配列は［１７］から引用したヒト力テプシンＢ、アミノ
酸の位置は左側に示す。黒丸はプロティン間の類似性を
増加するために導入したギャップを示す。タンパク質中
の同定のアミノ酸は星印で示す。
矢印は、カテプシンＢの成熟中におこる切断位置を表す
。カテブシンＢのシグナル配列、　“プロ”配列および
成熟酵素配列の場所を矢印により示し、ブロックする。
カテプシンＢの最後の６アミノ酸は成熟酵素中に存在し
ない（切断は矢印により示す）。
第１８図、エンドグリコシダーゼＦによるＡＣ−１の脱
グリコジル化、モノＱ精製抗凝血物タンパク質（〜２μ
ｇ）ヲ１％ＳＤＳ／　５％メルカプトエタノール中で、
しゃ沸し変性し、緩衝液（−レーン）または緩衝液＋１
．５単位のエンドグリコシダーゼＦ（＋レーン）ととも
に−夜インキユベートした。
翌日、試料は１２％ＳＤＳゲルで電気泳動し、ナイトロ
セルローズ膜にプロットし、Ｒｂ−１０２８５抗血清と
反応した。タンパク質標準物の分子量は右側に示す。
第１９図、活性部位システィン周辺の、カテプンンＢ、
パパインおよびＡＣ−１のアミノ酸配列の比較。
カテプシンＢのアミノ酸基９７−１１７［１７］、成熟
体パパインの１４−３４［１８］およびＡＣ−１の１０
２−１２２を比較する。３プロテアーゼ全てに同定であ
るアミノ酸はボックスで囲う。カテプシンＢおよびパパ
インの活性部分、システィン基は陰影をつける。ＡＣ−
１において相当するシスティン基はこのプロティン間の
活性部位システィンであると推定される。
第２０図、　Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕ
ｓ　ＡＣ−２遺伝子の制限酵素地図およびエキラン／イ
ントロン組織。
ＡＣ−２遺伝子およびその両側領域の合成制限酵素地図
は（Ａ）に示す。組換えλＥＭＢＬ−３、ファージλＭ
Ｂ−１、λＭ−２、およびλＭ−３の範囲は地図で上に
示す。示す制限酵素部位は、すなわちＥ、　ＥｃｏＲＩ
；　Ｓ、５ａｌｌおよびＨ，ＨｉｎｄＩ［、カッコ内の
５ａｌｌ部位は、ＥＭＢＬ−３ポリリン力−配列中にあ
り、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓＤＮＡには存在しない。そ
れらはＤＮＡ配列決定のために制限フラグメントを生成
するために使用したのでそれらを示す。λＭＢ３を単離
するために、λＭＢ２の３．９ｋｂおよび３．５　ｋｂ
　ＥｃｏＲＩフラグメントを使用し、λＥＭＢＬ−３ラ
イブラリーを２度スクリーンしたものはカッコにより示
す。
ｃＤＮＡ　２Ｂにハイブリッド形成する１、　Ｏｋｂの
ＥｃｏＲ［フラグメントは印をつける。配列決定された
ＥＭＢＬ−３フアージの領域は、（Ａ）に関連する領域
の拡大版である（Ｂ）中に矢により示される。星印は合
成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成された
配列を示す。示した、さらにある制限酵素部位は、すな
わちＢＳＢａｍＨＩ、　Ｂｇ、　ＢｇｌｌＩ　；　Ｈｐ
ｌＨｐａｌ；に、　Ｋｐｎｌ、　Ｔ、　５ａｃｌ；　Ｘ
、　Ｘｂａｌ、いくつかの場合、ＥＭＢＬ−３フアージ
は示していない、これらの制限酵素のさらにある部位を
含有する。またＡＣ−２遺伝子のエキラン／イントロン
組織は（Ｂ）に示す。黒のボックスはエキソンを示す。
ボックスの横の長さは、エキソンの長さに近いものであ
るが、開始コドンＡＴＧのみからなるエキソンｌは除く
。
第２１図、　Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕ
ｓ　ＡＣ−２遺伝子のヌクレオチドおよび推定アミノ酸
配列。小文字はイントロンを示す。ヌクレオチドは、約
５．２ｋｂの長さがあるイントロン４まて連続して番号
をつけであるが完全には配列決定してない。イントロン
４から後のヌクレオチド番号は概算である。ＡＣ−１ｃ
ＤＮＡのＦ−１および２Ｂにおける相異するヌクレオチ
ドおよびアミノ酸は上に示し、ＡＣ−２配列を下に示す
。ｃＤＮＡの初めと終りに相当するヌクレオチドは切れ
目のない三角形で印する。Ｎ結合グリコジル化の可能性
がある部位は、二重の下線で印する。
活性部位に依存し、ＡＣ−１、ＡＣ−２、カテプシンＢ
およびパパインに保存されている６アミノ酸はダッシュ
で下線する。矢印はＡＣ−１：β−ガラクトシダーゼ遺
伝子融合を生成するのに使用したＡＣ−１およびＡＣ−
２に存在するＥｃｏＲＶ切断部位を印する。終止コドン
は星印で印する。真核生物のＴＡＴＡプロモーターエメ
レントおよびＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナルに類
似する配列は下線する。
第２２図、　Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕ
ｓ　ＡＣプロテアーゼ遺伝子のサザンプロット分析。Ｈ
，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓゲノムＤＮＡ　（２μｇ）をＥｃ
ｏＲＩ（Ｅ）　；　ＨｉｎｄＩ［［（Ｈ）またはＮｈｅ
ｌ（Ｎ）にて消化し、０．８％アガロースゲルてサイズ
分画し、ナイトロセルローズ膜にプロットし、低い緊縮
条件下にて３３ｐ標識したＡＣ−１ｃＤＮＡ２Ｂ（１８
０ｂｌ）の長さ）とハイブリッド形成した。マーカーＤ
ＮＡフラグメント（ＭＷ）のサイズは左側にキロベース
対にて示す。
第２３図、　Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕ
ｓ　ＡＣプロテアーゼｍＲＮＡのノザンプロット分析。
成虫またはＸＬ３ｓおよび幼虫Ｌ４Ｓの混合群から単離
したポリＡ”　ｍＲＮＡを変性ホルムアルデヒドゲルで
サイズ分画し、低い緊縮条件の下でＡＣ−１ｃＤＮＡ　
Ｆ−１の〜Ｉ　ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントを含有す
る３２ｐ標識したｐＢＲ３２５プラスミドでハイブリッ
ド形成した。ハイブリッド形成するｍＲＮＡのサイズは
１．２５ｋｂである。
第２４図、プラスミドｐＳＥＶ６：：ＡＣ−１（Ｄ構築
。β−ガラクトシダーゼ発現ベクターρ５ＥＶ６はｐＳ
ＥＶ４から構築された（Ｕ、　Ｓ、出願番号０２３１１
３）。β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、１ａ
ｃｌ’　リプレッサー遺伝子（ｌａｃｒ）および特有の
ＥｃｏＲＩ、　５ｓｔｌ、　Ｋｐｎｌ、Ｂ（ＩＩＩＩ、
およびＮｃｏ１部位の相対的位置を示す。ｐＳＥ　Ｖ６
：：ＡＣ−１を構築するために、ｐＢＲ３２２のＥｃｏ
Ｒ１部位にＡＣ−１ｃＤＮＡ　３−１を挿入したものを
含有するプラストｐＢＲ３２２：　：３−１をＥｃｏＲ
Ｖ（コ（Ｄ制限部位はＡＣ−２にも存在し、第２図上印
しである）にて消化し、合成ＥｃｏＲｒ　リンカ−に結
合し、超過量のＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶにて消化し
、アガローズゲル電気泳動により８４０ｂｐフラグメン
トを精製した。このフラグメントをｐＳＥＶ６のβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子中に存在するＥｃｏＲ１部位に挿
入した。発現のために正しい方向で挿入されているｃＤ
ＮＡを含有するプラスミドは、１ａｃＺ細菌コロニーを
Ｒｈ−１０２８５抗血清でスクリーニングすることによ
り、およびＸｈｏ　ＩてプラスミドＤＮＡの地図をつく
ることにより固定する。
第２５図、　Ｅ、ｃｏｌｉ中の組換えＡＣ−１：　：β
ガラクトシダーゼ融合タンパク質の発現。プラスミドｐ
ｓＥＶ６また（ｔｐｓＥＶ６：　：ＡＣ−１を含むＥ、
ｃｏｌｉ細胞ハＩＰＴＧ（７）存在（誘導）または非存
在（不誘導）の下で成育した。培養体の同等量の部分量
をＳＤＳ試料緩衝液中でじゃ沸し、１２％ＳＤＳゲルで
電気泳動した。パネル（Ａ）はＥ、ｃｏｌｉタンパク質
のクーマシープルー染色したゲルを示す。パネル（Ｂ）
は、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ成虫から精製した３５　ｋ
Ｄａタンパク質に対して調製したウサギ抗血清（Ｒｈ−
１０２８５）で探査したＥ、ｃｏｌｉタンパク質のウェ
スタンプロットを示す（１１）。示すレーンは、すなわ
ち（１）　１）ＳＥＶ６　、不誘導；　（２）ｐＳＥＶ
６、誘導；　（３）　ｐＳＥＶ６：：ＡＣ−１、不誘導
；および（４）　　Ｉ）ＳＥＢ６：：ＡＣ−１、誘導。
ＡＣ−１融合タンパク質は矢じりで示す。分子量マーカ
ーの位置は左側に示す。
第２６図０組換えＡＣ−１プロテアーゼに対して作成し
たウサギ抗血清と成虫タンパク質のウェスタンプロット
分析。全成虫タンパク質の部分量（レーン１）またはモ
ノＱカラム精製抗凝血物タンパク質（レーン２）を１２
％ＳＣＤゲルにて電気泳動し、ニトロセルロース膜にプ
ロットし、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓプロテアーゼに対し
て作成したウサギ抗血清と反応した。パネル（Ａ）は、
成虫から精製した３５　ｋＤａプロテアーゼに対して作
成したＲｈ−１０２８５抗血清の反応を示す。パネル（
Ｂ）および（Ｃ）は、組換えＡＣ＝１：　β−ガラクト
シダーゼ融合タンパク質に対して作成したＲｈ−９１９
０およびＲｈ−８５５２抗血清のそれぞれの反応をする
。パネル（Ｄ）は、Ｒｂ−９１９０プレ採血血清の反応
を示す。免疫血清の全ては、成虫および精製抗凝血物抽
出物中にあるプロテアーゼの３５および３７　ｋＤａ形
態と反応する。矢印はプロテアーゼの３５および３７　
ｋＤａ形態の位置を指し示す。
３７　ｋＤａタンパク質とのＲｈ−８５５２血清の反応
は、他の免疫血清の反応より、−貫してずっと強い。分
子量マーカーの位置は左側に示す。
第２７図、　Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕ
ｓ　ＡＣ−１（ＡＣ−２）プロテアーゼの発達期の発現
。同等のタンパク質を含有する５Ｌ−３、ＸＬ３、Ｌ４
および成虫の部分量を１２％ＳＯＳゲルで分離し、ニト
ロセルロース膜にプロットし、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ
プロテアーゼに対して作成した種々のウサギ抗血清と反
応した。パネル（Ａ）はＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎ
ｔｏｒｔｕｓ成虫から精製した３５　ｋＤａプロテアー
ゼに対して作成したＲＢ−１０２８５の反応を示す。こ
の抗血清は、プロテアーゼの他に、他のタンパク質と反
応する。プロテアーゼの３５　ｋＤａおよび３７　ｋＤ
ａは矢印で示す。星印で示すバンドはブロチアーゼでは
なく、たぶんトロポミオシンである。パネル（Ｂ）およ
び（Ｃ）は、組換えＡＣ＋β−ガラクトシダーゼ融合タ
ンパク質に対して作成したウサギ抗血清Ｒｈ−９１９０
およびＲｈ−８５５２それぞれの反応を示す。パネル（
Ｄ）は、Ｒｂ−９０９０からのプレ採血血清の反応を示
す。
第２８図は、ｃＤＮＡ　ｈａｅｍ　Ｖ２４のヌクレオチ
ドおよび推定アミノ酸配列を示す。
第２９図は、ｃＤＮＡ　ｈａｅｍ　Ｖ２２のヌクレオチ
ドおよび推定アミノ酸配列を示す。
第３０図は、Ｅ、ｃｏｌｉ中に発現するＡＣ−１のクー
マシー染色ゲルおよびウェスタンプロットを示す。非融
合へモンカス抗凝固プロテアーゼを発現するＥ。
ｃｏｌｉ溶解物のウェスタンプロット。ウェスタンをゲ
ル精製３５　ｋＤａヘモンヵスブロテアーゼに対して生
成されたウサギ抗血清と反応させた。Ｘ−８およびＲＶ
−２構築物により発現された組換えタンパク質の分子量
を示す。
第３１図、　３５　ｋＤａ組換えタンパク質の単離から
の部分のクーマシー染色した５ＤＳ−ＰＡＧＥ、分子量
マーカー（Ｍ）を有する１２％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルは
組換え３５ｋＤａタンパク質の単離の最終産物の染色パ
ターンを示す。矢印は３７および３２　ｋＤａポリペプ
チドを示す。また操作中に得られた部分からのタンパク
質プロフィールとして包含するものはライセイト、Ｌ；
第１番目の遠心の上清液、Ｓｌおよび再可溶化したペレ
ット、　ＰＩｏ 第３２図、抗凝血物質アッセイの染色した５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ抗凝血物質は、漸増量でアッセイした。すなわち−
ン２および８．０．１μｌ；レーン３および９．０．２
μｌ：レーン４および１０Ｓ０．４ｔｔｌ　；　レーン
５および１１，０．６μ！：そしてレーン６および１２
、ｌμ１０レーンｌおよび７は抗凝血物質の非存在下で
インキュベートしたフィブリノゲン。
レーン２から６は調製Ｅからの酵素、そしてレーン８か
ら１２は調製Ｇからの酵素。Ｍは分子量レーンを示した
ｋｄで示す。矢印はフィブリノゲンポリペプチドを示す
。すなわちａ、アルファー；ｂ、ベータ：およびｇ、ガ
ンマ。
第３３図、抗凝血物質のシルバー染色５ＤＳ−ＰＡＧＥ
。
別々の酵素調製ＥおよびＧを示す。Ｇ１は冷凍および解
凍のいくつかのサイクルを受けたＧ調製からの試料であ
る。分子量マーカーはｋ（ｆである。
第３４図、　３５　ｋＤａポリペプチドに対する抗血清
を使用した抗凝血物質阻止アッセイ。レーンｌから５．
６から１０．および１１から１５は、調製Ｅの漸増量す
なわち０．０．１．０．４．０．６およびｌμｌをそれ
ぞれ示す。レーン１から５は３５　ｋＤａに対する免疫
前の血清（Ｒｈ−１０２８５）と前もってインキュベー
トした酵素を示す、レーン６から１０は３５　ｋＤａに
対する抗血清（Ｒｈ−１０２８５）と前もってインキュ
ベートした酵素を示し、レーン１１から１５は酵素のみ
を示す。
第３５図６　“免疫複合体”実験のゲル分析。抗凝血物
質は種々のＩｇＧ抗血清部分とインキュベートし、次に
複合体はスタフィロコッカスＡ細胞を使用し、溶液から
引き離す。上溝液は次に標準フィブリノゲンアッセイに
使用した。レーンの下にある十印は酵素Ｅの存在；　Ｐ
−３５，３５ｋＤａに対する免疫前血清（Ｒｈ−１０２
８５）　；　３５．３５　ｋＤａに対する免疫血清（Ｒ
ｈ−１０２８６）　；　Ｐ−３５１５５，５５／３５　
ｋＤａに対する免疫前血清（Ｒｂ−１０２８６）　；　
３５１５５．３５１５５　ｋＤａに対する免疫血清（Ｒ
ｂ−１０２８６）およびＳＡ、スタフィロコッカスＡ細
胞処理を示す。ＭはｋＤａにより示された分子量レーン
を示す。
第３６図、第３５図記載の実験の“免疫複合体“構成物
のウェスタン分析。第３５のスタフィロコッカスＡ細胞
は、ＳＤＳ試料緩衝液中でじゃ沸し、生じた上溝液は電
気泳動し、プロットし３５および５５　ｋＤａポリペプ
チドと反応する抗血清で探査した。第２抗体は、ヤギ抗
ウサギＨＲＰで超過量のウサギ重鎮と反応する。示した
略語およびレーンは第３５図中のものである。
第３７図、免疫ヒツジ血清による酵素阻止のゲル分析。
使用したＩｇＧ抗血清は各レーンの上に示す。
すなわち６７および７５は対照ヒツジであり、一方５９
．６３．８１および８５は免疫ヒツジである。各レーン
の下の＋および一サインは、アッセイにて酵素の存在お
よび非存在を示す。
第３８図は、λ００２中のシステインプ口テアーゼのヌ
クレオチドおよび推定アミノ酸配列である。
第３９図は、λ００３中のシスティンプロテアーゼのヌ
クレオチドおよび推定アミノ酸配列である。
第４０図は、λ００４中のシスティンプロテアーゼのヌ
クレオチドおよび推定アミノ酸配列である。
第４１図は、λ００７中のシスティンプロテアーゼのヌ
クレオチドおよび推定アミノ酸配列である。
第４２図は、０ｓｔｅｒｔａｑｉａシステインプロテア
ーゼの配列とＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ＡＣ−１システイ
ンプロテアーゼの配列と比較する。星印は異なるアミノ
酸を示す。
第４３図、抗ペプチド抗血清と反応するコラーゲンの存
在を調べた線虫の系統的関係。分析した線虫は、Ｓｃｈ
ｍｉｄｔおよびＲｏｂｅｒｔｓ（１９８１）から引用し
た、それらの網および目の指定に従い記載する。
第４４図、抗ペプチド抗血清と交差反応するコラーゲン
の存在について種々の線虫のウェスタンプロット分析。
種々の線虫のＳＤＳ＋ＢＭＥ抽出は、アセトインで沈降
し、自然乾燥し、緩衝液（−レーン）あるいは緩衝液十
コラーゲン（＋レーン）中に再懸濁し、３７°Ｃにて一
夜インキユベートした。
ＳＤＳ試料緩衝液に希釈した後、抽出物は、１２％ＳＤ
Ｓゲルて電気泳動し、ニトロセルロース膜にプロットし
、免疫Ｒｈ−９５８２血清とインキュベートした。各抽
出物の一部分は、別々のＳＤＳゲルで分析し、クーマシ
ーブルーでタンパク質を染色した（ゲルは示していない
）。ゲルレーンは（１）　Ｃ。
ｅｌｅｇａｎｓ　（２）　Ｐ、　ｒｅｄｉｖｉｖｕｓ　
（３）　Ｎ、　ｃａｒｐｏｃａｐｓａｅ（４）　Ｈ，ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｐｈｏｒａ　（５）　０．ｏｓｔｅｒｔ
ａｇｉ　（６）　Ｔ。
ｃａｎｉｓ　（７）　Ｄ、　　１ｍｍ１ｔｉｓおよび（
８）　Ｔ、　５ｐｉｒａｌｉｓｌ：Ｚ該当する。
第４５図、　Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕ
ｓコラーゲンペプチド免疫原の場所およびアミノ酸配列
。予想した３Ａ３コラーゲンタンパク質のドーメイン組
織を表す概要の図表は（Ａ）に示し、Ｓｈａｍａｎｓｋ
ｙら（１９８９）より引用する。ボックスの点描した領
域はグリシンが３番目毎のアミノ酸である仮定上の三重
らせん状ドメインを示す。横の直線は非三重らせん状領
域を示す。３Ａ３タンパク質のペプチドの場所はカッコ
をつける。ペプチド（カッコをつけた領域）のアミノ酸
配列は（Ｂ）に示す。アミノ酸は標準の１字略語で示す
。ボックスの点描した領域はタンパク質の最終の三重ら
せん状ドメインを示し、方向を示す目的で示す。星印は
終止コドンを示す。
第４６図は、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ成虫タンパク質の
成虫タンパクロット（Ａ）およびＲｂ−１０２８４抗血
清で単離したファージクローン８４−１−８４−１７よ
り選択した抗体と反応した精製抗凝血物タンパク質のウ
ェスタンプロット（Ｂ）を示す。５５　ｋＤａバンドの
位置を示す。
第４７図は、Ｒｈ−１０２８４抗血清から、ファージ８
４−１．８４−２．８４−３．８４−４および８４−８
により選択した抗体と反応するＨ、　ｃｏｎｔｏｒｔｕ
ｓタンパク質の発達期のウェスタンプロットを示す。分
析した発達期はＸＬ３Ｓ（Ｌ３）、Ｌ４ｓ（Ｌ４）およ
び成虫（Ａ）である。分子量マーカーの位置は示されて
いる。
第４８図は、ｃＤＮＡ８４−１および８４−２の部分制
限酵素地図を示す。
第４９図はｃＤＮＡ　８４−１および８４−２の完全な
ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。ダッシュ
は、ｃＤＮＡ　８４−１および８４−２中で同一のヌク
レオチドを示す。
第５０図は、ＥｃｏＲＩ（Ｅ）、ＢａｍＨＩ（Ｂ）およ
び５ａｌｌ（Ｓ）で消化したＨ、　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ
Ｄ　Ｎ　Ａのサザンプロットを示す。複製のプロットを
ｃＤＮＡ　８４−２の７５０ｂｐおよび９００ｂｐ　Ｅ
ｃｏＲＩフラグメントとハイブリット形成した。ＤＮＡ
サイズ標準物の位置はキロベース対にて示す。
第５１図は制限酵素で消化したλＭＢＩ、λＭＢ３、λ
００２およびλ００７ＤＮＡのサザンプロットを、３０
％ホルムアミド溶液を使用しＦ−１エキソン１−４特異
的ＤＮＡプローブと３２°Ｃてハイブリッド形成したオ
ートラジオグラムである。λＭＢＩＤＮＡは５ａｌｌ＋
ＥｃｏＲＩで消化し、他のファージＤＮＡは、５ａｌＩ
＋ＢａｍＨＩで消化した。ハイブリッド形成するファー
ジのバンドのサイズは、λＭＢＩ（１，７ｋｂ）、λＭ
Ｂ３（３，５ｋｂ）、λ００２（７，９ｋｂ）およびλ
００７（３，６ｋｂ）である。ＤＮＡサイズマーカーの
位置は右側に示す。
第５２図は、０．　ｏｓｔｅｒｔａｇｉシスティンプロ
テアーゼ遺伝子を含有する組換えλＥＭＢＬ−３ファー
ジの部分制限酵素地図を示す。プラスミドｐＢＲ３２５
：　：　Ｆ−１とハイブリッド形成するファージＤＮＡ
の領域の黒のボックスで示す。プラスミドｐＢＲ３２５
：　：ＦＩエキソンｌ−４プローブとハイブリッド形成
するファージＤＮＡの領域は色抜きホックスで示す。配
列決定されたファージＤＮＡの領域（第３８−４１図に
存在する配列）は上線を引く。遺伝子の５゛から３′の
コード方向を示す。ファージ中の全制限酵素部位を示し
てはいない。略語は、Ｓ、　５ａｌＩ；　ＢＳＢａｍＨ
Ｉ；Ｒ，ＥｃｏＲＩ、　Ｔ、　５ｓｔｌ；およびＨ，Ｈ
ｉｎｄｌｌＩである。カッコの５ａｉｌ部位はλＥＭＢ
Ｌ−３ポリリンカー配列より白米する。
第５３図は、配列決定されたλ００２、λＯＯ３、ａ　
００４、およびλ００７の領域の拡大版を示す。エキソ
ンの場所は黒のボックスで示す。配列決定したファージ
ＤＮＡの領域は矢印により示す。制限酵素部位は第５２
図のように略語している。λ００７は、方向定めまたは
配列をまたしていない４００ｂｐおよび６００ｂｐのＥ
ｃｏＲＩフラグメントを含有する（その場所は疑問符マ
ークにより示す）。これらのフラグメントのひとつは、
エキソンｌＯにないアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を
含有する。
第５４図は、ｃＤＮＡ　８４−４の部分ヌクレオチド配
列を示す。
第５５図は、ｃＤＮＡ　８４−８の部分ヌクレオチド配
列を示す。
第５６図は、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ　５５Ａタンパク
質の相同体をコードする０、　０Ｓｔｅｒｔａｑｉ遺伝
子を含有する組換えλＥＭＢＬ３ファージ５５Ａ−１１
の制限酵素地図である。Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ　ｃＤ
ＮＡ　８４−２の７５０ｂｌ）（５’領域）および９０
０ｂｐ（３’領域）のＥｃｏＲＩフラグメントとハイブ
リッド形成するファージＤＮＡの領域を示す。示した制
限酵素部位は、ＥｃｏＲＩ（Ｅ）；　５ａｉｌ（Ｓ）；
Ｈｉｎｄｌ［（Ｈ）　；およびＢａｍＨ［（Ｂ）である
。
好ましい実施態様の詳細な記載 参照事項は本発明の現在の好ましい実施態様に詳細にさ
れ、それと図面および下記の実例は本発明の詳細な説明
するのに役立つ。
下記のタンパク質は、かなり純粋な形で、ヒツジの免疫
原としておよびヒツジをＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ感染か
ら保護するワクチンとして有用だとして本発明者らに発
見された。すなわちコラーゲンペプチド、クチグラタン
バク質および抗凝血物質抗血清である。
クチクラタンパク質 本発明は、ぜん虫から比較的純粋な形で、クチクラ、表
面タンパク質を単離する方法を提供する。
さらに詳細には、本発明はＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏ
ｎｔｏｒｔｕｓのふたつの寄生的幼虫期から、表面タン
パク質を単離する方法を提供する。これらの方法により
精製する表面タンパク質は、免疫原性があり、生きてい
る虫の特有の表面タンパク質に反応する抗体を誘導する
。
本発明者らは、生きているＸＬ３ｓおよびＬ４Ｓのクチ
クラタンパク質は比較的純粋な形で差別的に取り出しう
ろことを見い出した。生きているＸＬ３ｓおよびＬ４ｓ
は、表面タンパク質を特別に可溶化する溶液の中で短時
間しゃ沸する。ＸＬ３ｓの表面タンパク質を取り出すた
めに、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の溶液を使う
のが好ましく、さらに好ましくは、１％ドデシル硫酸ナ
トリウムを使うのか好ましい。下記に詳細に記載するよ
うに、１％ＳＯ３中で、生きたＸＬ３ｓを短時間じゃ沸
することは、この発達期にあるものから表面タンパク質
を特別に可溶化する（第１図）。またこの方法は他の線
虫のクチクラタンパク質、表皮で詰まった口と肛門を育
するＨ、　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ　ＸＬ３のような特に発
達期のものから精製するために適用すべきである。
ＳＤＳ中で短時間のしゃ沸するのは、Ｌ４Ｓの表面タン
パク質を精製するためには便利ではないとわかった。な
ぜなら、この方法は、体のタンパク質およびクチクラタ
ンパク質の両方を可溶化するからである。これは、この
発達期の口と肛門は環境に開いているという事実によっ
ているように思える。ＸＬ３表面表面タンパ音質ＤＳ中
で短時間じゃ沸することにより、精製する能力は、たぶ
ん、少なくとも部分的には、ＸＬ３の口および肛門の両
方が表皮で詰まり、環境に対して閉じているという事実
による。したがって、しゃ沸すると、ＸＬ３表面表面タ
ンパ音質溶化し、細胞タンパク質は、虫内部てとし込め
られたままとなる。
また食塩中で、さらに好ましくは１００ＭのＮａＣｌ中
でＸＬ３およびＬ４を短時間じゃ沸することは本発明の
好ましい実施態様である。この方法では、生きているＸ
Ｌ３ｓまたはＬ４Ｓを食塩水中に懸濁し、次に表面タン
パク質を可溶化するために短時間しや沸する。ＮａＣ１
方法によりＸＬ３ｓから得た表面タンパク質は、ＳＤＳ
の結果から予想したように、かなり純粋であったが、Ｌ
４ｓより抽出した表面タンパク質は、高度に濃縮してい
るが、表皮コラーゲンおよび細胞タンパク質により少し
だけ不純であった。
不純物は、表皮コラーゲン遺伝子の配列より出来の合成
１８アミノ酸長のペプチドに対して調製した抗血清でＬ
４表面タンパク質抽出物のウェスターンプロットを探査
することにより検出できる。
ＮａＣｌ抽出操作は、Ｌ４表面タンパク質を高度に濃縮
するのはたしかであるが、ＳＤＳゲルから溶解のような
簡単な操作によりさらにタンパク質を精製することか可
能である。
本発明の特に好ましい実施態様においては、生きたＸＬ
３ｓまたばＬ４ｓを１００ｍＭ　ＮａＣ１，１００ｍＭ
　トリス−ＨＣｌ、　ｐ［（７，４の１ｒｌＬｌ中に懸
濁し、沸とうした湯の中に２分間入れ、湯から取り出し
、さかさまにすることでさらに２分間混合する、次に小
遠心機で１分間ペレットにした。上滑液は、抜き取り、
全ての虫を取り除くためにいく度か遠心をくり返し、ド
ライアイス／エタノール液中で凍結し一２０°Ｃにて貯
蔵した。これらの試料は、後に解凍し、２−のｃｅｎｔ
ｒｉｃｏｎ器（Ａｍｉｃｏｎ）を使用し４°Ｃにて濃縮
した。
この過程により精製した虫クチクラタンパク質のヒツジ
に対する注射は、ヒツジ中に特異的な保護的抗体の生成
を誘導した。
しゃ沸および塩水にさらす時間を短かくすることは、一
般により純粋なし４表面タンパク質調製物を生成する。
長くさらすことは、さらに細胞タンパク質不純物を生じ
た。例えば、ＸＬ３ＳをＳＤＳに一夜さらすことにより
、かなりの量の細胞タンパク質を可溶化した。
タンパク質抽出研究は、ＸＬ３表面の主な部分とおそら
くおおっている。単一の６８−９０　ｋＤａの主要表面
タンパク質をＸＬ３は有することを示す。種々の分子量
の他のタンパク質もまた同定した。１８０ｋＤａタンパ
ク質は二番目に量の多いＸＬ３表面タンパク質であるよ
うだ。予備実験は、ＳＤＳゲルから電気溶解した６８−
９７　ｋＤａおよび１８０　ｋＤａタンパク質を免疫沈
降し、表面タンパク抽出物のウェスタンプロッドの１８
０　ｋＤａタンパク質と反応することを示す。これらの
予備結果６８−９７　ｋＤａおよび１８０ｋＤａタンパ
ク質は抗原性上関連しており、異なる形態である可能性
があるということを示す（例えば、同じタンパク質の集
合体）。Ｌ４期において、タンパク質の主な種類は分子
量２７．２９．７５および２００　ｋＤａを有する。
明白な好ましい実施態様によると他の方法は、１１１ｓ
ｉおよびクロラミンＴで表皮タンパク質の表面標識する
ことを包含する。ふたつの部類のタンパク質がこの方法
により同定した。これらのタンパク質の性質はＸＬ３ｓ
およびＬ４ｓにおいて類似しているように見える。タン
パク質のひとつの部類は、ＳＯ３で表皮から抽出され得
るタンパク質を含んでなる。他の部類は効率的な可溶化
のためにジシルフィド還元剤を必要とするこれらのタン
パク質を含んでなる。ＸＬ３ｓおよびＬ４ｓのＳＤＳ可
溶性表面タンパク質は、比較的数少ない主要な種類を包
含する。いくつかのタンパク質は、類似する分子量を有
するが、標識したタンパク質のパターンは、各発達期毎
に異なる。タンパク質は、ジシルフィド還元剤非存在下
で、ＳＤＳで虫から、はぼ完全に抽出される。
ＳＯＳ可溶性表面タンパク質は、細菌のコラ−ゲナーゼ
で消化できないので、それらは線虫表皮のタンパク質構
成物であるコラーゲンの特徴的な（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）　
＜り返し構造を欠いている、ことを示す。タンパク質の
いくつかは、グリコジル化しており、それらは細胞外の
もので、クチクラ表面にたぶん位置しているという概念
を支持する。ＢｏｎｅおよびＢｏｔｔｊｅｒは、特別の
レクチンが、成虫および幼虫Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの
表面に結合していると以前報告した。上記の性質におい
て、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの主要５ＤＳ−可溶性表面
タンパク質は、他の線虫について記載された表面タンパ
ク質に類似する。
これらのタンパク質のいくつか、または全てか虫の表面
に由来するというもつとも強力な証拠は、ＳＤＳ抽出し
たＸＬ３およびＬ４表皮に対して調製したウサギ抗血清
を使用したＩＦＡ実験の産物である。
これらの抗血清が生きた虫に反応しないことは、ＳＤＳ
抽出がＸＬ３およびＬ４表皮から主要表皮タンパク質を
効率的に取り出したことを示す。これらのタンパク質が
クチクラ表面に位置している最も確実な証拠は、モノス
ペシイフイック抗血清の開発を待たねばならない。線虫
表皮は、共有結合交差結合タンパク質、例えばコラーゲ
ンを含有すると知られているので、ここに記載した１２
５Ｉ標識のタンパク質のいくつかは、また第一次遺伝子
産物というよりむしろ交差結合の集合体であるという可
能性かある。
ＳＤＳ可溶性タンパク質とは対照的に１２５１で標識し
たＳＤＳ　＋ＢＭＢで抽出可能なタンパク質の大部分は
、コラ−ゲナーゼで消化できるということは、それらか
コラーゲンであることを示す。しかしなから、これらの
タンパク質のいくつかはコラ−ゲナーゼで消化されず、
したかってたぶんコラーゲンではない。発明者らは、こ
れらのタンパク質を標識することは、人工物を生じ、そ
れらは表皮の内部部分からでクチクラ表面から由来する
ものでないことを予想する。この予想は、ＳＯ３処理の
表皮（それはコラーゲンを含有する）に対して調製した
抗血清は生きている虫と弱い反応があるかまたは全くな
いという観察に由来し、ＳＤＳは主要表面抗原を取り除
くことを示す。しかしなから、表皮のＳＯ８処理が、残
りの不可溶性表皮タンパク質の形態構造を変換させ、そ
れらが生きている虫の表面にある特有なタンパク質に反
応することが可能な抗体の形成を誘導することができる
という可能性を我々は除外できない。コラーゲンが本当
にクチクラ表面に露出しているかどうか決定するために
は、さらに研究することが必要であろう。
２４　ｋＤａおよび３６　ｋＤａのＳＤＳ可溶性ＸＬ３
表面タンパク質は、ＸＬ３表面表面タンパ土質も表皮と
かたく関連していないように見える。なぜなら、それら
は洗浄剤非存在下で音波処理により表皮から一部放出さ
れるからである。親和性における、もしあるとすれば、
この相異の生理的役割は現在のところ不明である。他の
研究者らは、寄生虫的線虫の特別な表面タンパク質はイ
ンビトロでの生きた虫とのインキュベーション研究中に
培地に自然に落ちる、と報告している（９．２０）我々
は、これか任意のＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ表面タンパク
質に表面タンパ画質あるか否か決定していない。
１２５■標識研究により明らかになった表面タンパク質
の異なるパターンは、ＸＬ３およびＬ４Ｓの表面に露出
する抗原における相異があることを示す。
発明者らは、精製したＸＬ３表面表面タンパ土質して精
製した抗血清を使用してこの結果を確認した。
成虫表皮は抗原性工具なった組の表面タンパク質をおそ
らく含有する。なぜなら成虫特有の表皮に対して作成し
た抗血清はＩＦＡ実験において、生きているＸＬ３ｓま
たはＬ４ｓと反応しなかったからである。同様に、抗Ｘ
Ｌ３／Ｌ４特有表皮血清もまた抗成虫表皮血清も、生き
ている５Ｌ３ｓとは反応しなかったことは、この発達期
のクチクラ表面タンパク質もまた個有のものであること
を示す。
段階特異的表面抗原は、いくつかの寄生的線虫について
記載されている（９．１０）。古い表皮か自然に落ち新
しい表皮が形成される脱皮の時に表面タンパク質を変化
させる寄生的線虫の能力は、宿主免疫反応を回避するた
めのメカニズムであろうし、比ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの第
１次感染では成虫段階まで進むのに対し、免疫動物にお
ける第２次感染は一般にＸＬ３またはＬ４段階で止まる
という理由をいくぶんかは説明する。
ＸＬ３およびＬ４タンパク質抽出物のアミノ酸組成を決
定し第１表に示す。タンパク質組の両方は親水性アミノ
酸で豊んでおり、アラニンおよびグリシンを除いて疎水
性アミノ酸が比較的少ない。主要な６８−９７　ｋＤａ
タンパク質はグルタミン酸および／またはグルタミン基
が非常に豊富に見える。事実、主要な６０−９０ｋｄの
種類のアミノ酸組成を主に反映するＸＬ３表面表面タン
パ抽質抽出物中６％のアミノ酸は、またアスパラギン酸
またはグルタミンであった。このタンパク質は、またア
スパラギン酸および／またはアスパラギン酸か豊富であ
る。
両者合わせると、これら４アミノ酸は、ＸＬ３表面表面
タンパ抽質抽出物中出した全アミノ酸のおよそ４０％近
くの割合を占める。他の線虫の表面タンパク質について
比較可能な分析か報告されてないので、本発明者らは、
この結論の示すものかどれ程普通であるかまたは異常で
あるかわからない。
非相同混合タンパク質である、５４表面タンパク質は、
これらのアミノ酸がそれ程豊富ではない。
クーマシーブルー染色および１２５ｆ標識により検出し
たＸＬ３表面表面タンパ上質対的量の相異は、チロシン
基を優位的に標識する＋２５１およびクロラミンＴによ
る６８−９７　ｋＤａタンパク質の非効率的標識を反映
しているのであろう。チロシンはＸＬ３表面表面タンパ
抽質抽出物中なく表われるので、したかって６８−９７
　ｋＤａタンパク質でもそうである。
＋２ｓＨ標識研究により表面タンパク質として同定した
他のＳＤＳ可溶性ＸＬ３タンパク質（すなわち２４．２
６．３０、および３６　ｋＤａ種）は、おそら＜　ＸＬ
３表面の少数派構成物である。
多くの線虫の、ある発達期のクチクラ表面はクチクラ表
面が陽イオンフェリチン粒子に結合するという事実のた
めに結局陰性電荷を有することを示す（Ｈｉｍｍｅｌｈ
ｏｃｈら、Ｅｘｐ、　Ｐａｔａｓｉｔｏｌｏｇｙ　４１
：　１１８−１２３　（１９７７）；　Ｍｕｒｒｅｌｌ
ら、Ｅｘｐ、　Ｐａｔａｓｉｔｏｌｇｙ　５５：３３１
−３３９　（１９８９）；　Ａｂｒａｈａｍ　ら、Ｖｅ
ｔ、　　Ｐａｒａｓｉｔｉｌｏｇｙ１３：　３４１−３
４７　（１９８８）。本発明者らは、Ｈａｅｍｏｎｃｈ
ｕｓｃｏｎｔｏｒｔｕｓ　ＸＬ３幼虫について同様の実
験を行なわなかったが、ＸＬ３表面表面タンパ上質いて
決定したアミノ酸組成は、ＸＬ３表面上に結局陰性電荷
を有すると考えられた。
抗ＸＬ３表面タンパク質血清でのＩＦＡおよび免疫沈降
実験は、ＸＬ３ＳおよびＬ４Ｓの表面上に露出した抗原
は免疫学的に相異するという、さらに進んだ事実を提供
する。抗ＸＬ３表面タンパク質血清か主要２７および２
９　ｋＤａの５４表面タンパク質を沈降させないという
ことは、これらＬ４タンパク質が、主要６８−９７　ｋ
ＤａのＸＬ３表面表面タンパ上質抗原性上別個のもので
あることを示す。抗−Ｌ４表面タンパク質血清の、ＩＦ
Ａ実験における生きているＸＬ３ｓとの、および免疫沈
降実験における１２５Ｉ標識のＸＬ３表面表面タンパ上
質反応は、少量のＸＬ３表面表面タンパ上質４表面タン
パク質が不純となったためであろう。この研究に使用し
たＬ４Ｓは、ＸＬ３ｓを数日間培養することによって得
た。インビトロにおける発達は完全に同時におこるもの
ではないし、沢山の虫の群を表面タンパク質単離のため
に必要であったので、発明者ら、全ＸＬ３ｓを完全に含
まないし４群およびＬ４ｓに脱皮したＸＬ３ａとして捨
てられた、自然に落ちたＸＬ３表皮を完全に含まないＬ
４群を得ることは決してできなかった。ＸＬ３ｓでのＬ
４Ｓの不純度および遊離ＸＬ３表皮は５−１０％と推定
した。
それとは対照的に、分析したＸＬ３群はインビトロで０
０２を用い、さや落ちにより得て、Ｌ４ｓは含有しなか
った。したかって、発明者らは、抗ＸＬ３表面タンパク
質血清で観察した段階特異性は、ＸＬ３および５４表面
タンパク質の抗原関連性のさらに正確な反映であると信
じる。しかしなから、発明者らは抗し４表面タンパク質
血清は、ＸＬ３とＬ４の表面タンパク質の間で保存され
、抗ＸＬ３表面タンパク質血清により認識されないエピ
トープを認識する、という可能性を除外できない。個々
のＸＬ３および５４表面タンパク質に対するモノスペイ
フィック抗血清およびモノクローナル抗体は、表面タン
パク質問の抗原関連性をよりよく明らかにするであろう
し、ＸＬ３およびＬ４表面上のこれらのタンパク質の正
確な局在化を可能にするであろう。
抗凝血物質抗血清 本発明の別の態様に於て、本発明者らはへモンカス・コ
ンドルラス中にフィブリノーゲン分解酵素、フィブリノ
ゲナーゼ様の抗凝血活性を同定した。フィブリノゲナー
ゼは３１２分子篩カラム上でのゲル濾過クロマトグラフ
ィーによって天然型分子量が１．０００．０００以上で
あると、特徴付けられており、このカラムに於てカラム
の排除容積で溶出する。標準タンパク質により、排除容
積に相当する分子量は百方の桁であることが示された。
ラットで生じた抗凝血物質に対する抗体をヘモンカス・
コントルツス抽出物並びに精製画分のウェスタンプロッ
トのプローブとして使用した。この抗体は３５および５
５ｋＤのバンドと特異的に反応することか判明した。さ
らにこの抗体を用いて酵素活性を阻害した。これは、フ
ィブリノーゲンとインキュベートする前に抗体標品を抗
凝血物質とインキュベートすることによって行われた。
成虫由来の抗凝血酵素活性は、特異的なフィブリノーゲ
ン分解活性であることが既に決定されている。第１図に
示すように、ウシフィブリノーゲンのアルファおよびベ
ータバンドは、増加量の部分精製酵素標品とインキュベ
ートしたときに分解される。５Ｏ３−ＰＡＧＥおよびそ
の後のクマシープルー染色による酵素標品の分析は、約
３５および５５　ｋＤａの二つの主要なバンドを示す。
抗凝血酵素を同様に電気泳動し、より高感度の銀染色法
によって染色する場合には、多数の追加のポリペプチド
が観察される（第２図）。より高分子量のマイナーバン
ドの一部は、コラーゲンポリペプチドに相当すると考え
られる。防御実験に於てラット並びにヒツジで生じた抗
凝血物質標品に対する抗血清は、コラーゲンと反応する
。
３５　ｋＤａポリペプチドか触媒サブユニットである証
拠が活性部位標識実験から与えられる。フィブリノゲナ
ーゼ活性はチオール依存であり、適当な阻害剤およびチ
オール標識試薬を用いることによって、３５　ｋＤａポ
リペプチドが活性チオールを含有することが示される。
フィブリノゲナーゼ活性か他のポリペプチドと結合して
いる可能性があり、またはひとつのポリペプチド集合体
であるという証拠が、最低でも百方の分子量で溶出する
活性を示す天然型分子量決定カラムから与えられる。こ
の複合体を分解し、活性を維持させる試みは成功しなか
った。
この抗凝血物質はヒツジにおいて免疫原性であり、これ
をワクチンとして用いてヘモンカス・コントルツスの感
染からヒツジを防御することができる。
以下の実施例は、本発明の望ましい実施態様をより詳細
に説明する。実施例はどの点においても決して限定を考
慮したものではなく、単に本発明の様々な特徴の例証で
ある。
１、Ｈ，コントルラスの表面タンパク質に関する実施例 Ａ、　ＸＬ３およびＬ４表面タンパク質の同定１、Ｈ，
コントルラス幼虫および成虫の由来Ｈ，コントルッス成
虫および５Ｌ３（さやに包まれた３齢）、ｘＬ３（脱皮
した３齢）およびＬ４（４齢）幼虫を、Ｅｌｉ　Ｌｉ１
ｌｙ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ
、　ＩＮ）のＲ，Ｊ、　Ｂｉｏｓｖｅｎｕｅ博士から入
手した。　ＸＬ３は、ＳＬ３を３分間１００％ＣＯ□を
用いてインビトロで脱皮させ、そのＸＬ３をはわせて、
最低８時間生理食塩水に浸した木綿のフィルターリング
を通過させる。Ｌ４幼虫を得るために、ＸＬ３を、抗生
物質、アンホテリシンＢ１ペニシリンおよびストレプト
マイシンを加えたＥＢＳＳ／ＭＢＳ培地で数回洗浄し、
洗浄の間に７０Ｏｒｐｍで５分間緩やかに遠心した。
次に、幼虫ペレットを２．７１コーニングプラスチツク
デイスポーザブルローラーボトルに入った抗生物質添加
培地に加え、−当り１２，０００　ＸＬ３の濃度とした
。最終１）Ｈが６．２となるように４０％ＣＯ□／６０
％空気を５分間培地に通し、滅菌条件下でボトルのキャ
ップを閉めた。培養ボトルをインキュベーターセットの
中に備えつけられた回転ミルにのせた。培養条件は、３
９°ＣＣ１１ｒｐ／　ｔ、　５分の速度で、最低７２時
間である。５分間緩やかに遠心した後、上溝を吸引後Ｌ
４ペレットを集める。はとんどの培養に於て、ＳＬ３の
９０％以上に脱皮が起こり、ＸＬ３の８５％がＬ４段階
に発育した。
Ｂｏｉｓｖｅｎｕｅ博士により提供されたＨ、コントル
ラス成虫は、動物側体当たり２５．０００　ＸＬ３を前
胃内に接種して単一特異的感染を受けたヒツジの皺胃か
ら得られた。虫接種の約３０日後に、宿主動物を感電死
によって安楽死させ、主な成虫集団を食塩水で洗浄した
皺胃内容物から個々に集め、液体窒素中で凍結した。
２、虫の齢の分離 ａ、ＸＬ３ 木綿のフィルターリングを通過させたＸＬ３を脱皮過程
の間にはずれて抜は落ちた角質から分離した。その方法
はこれらを小量の食塩水に懸濁し、２ｒＩｄ！のクツシ
ョン様の水冷１５％フィコール（Ｓｉｇｍａ）上をそれ
らの層で覆い、これを３００ｇ５分遠心することによる
。ペレットは生きたＸＬ３を含有しており、これを食塩
水で数回洗浄し、次に２回目の上記のような１５％フィ
コール段階濃度勾配にかけた。ＸＬ３ペレットを食塩水
で数回洗浄した後、他の実験に使用した。
ｂ、Ｌ４ Ｌ４、ＸＬ３　、およびＸＬ３から抜は落ちた角質を含
有する培養物を遠心し、ペレットを食塩水で洗浄し、２
−のクツション様の水冷１５％フィコール（Ｓｉｇｍａ
）上をそれらの層で覆い、これを３００ｇ５分遠心した
。フィコール／食塩水境界面にある物（おもにＬ４およ
び脱落した角質）を食塩水で洗浄し、２−のクツション
様の水冷１０％フィコール（Ｓｉｇｍａ）上をそれらの
層で覆い、これを３００ｇ５分遠心した。Ｌ４ペレット
を食塩水で数回洗浄した後、他の実験に使用した。はと
んどの場合、すへての脱落した角質を除去するために幼
虫を数回のｌＯ％フィコール段階濃度勾配にかけること
が必要てあった。
３、虫の１２５１−表面標識 下記のようなりロラミンーＴ法を用いて生きた虫を１２
５１で標識することによって、ＸＬ３およびＬ４の表面
タンパク質を同定した。この方法はおもにチロシン残基
を標識する。このような実験のために、虫を食塩水で数
回、ＰＢＳ　（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，４
，０，１４５Ｍ　ＮａＣ１）で−回洗浄し、ｌ−のＰＢ
Ｓに再懸濁した。この混合物に０．３ｍＣ１の”’Ｉ（
Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）および１０
フイクロリツターのクロラミンＴ（１■／−水溶液）を
添加した。室温で２分間インキュベートした後、さらに
ｌＯマイクロリッターのクロラミンＴ溶液を添加した。
２分後、チロシン飽和水を滴下して標識化反応を止めた
。未結合標識を除去するために虫を食塩水で数回洗浄し
た。
標識した虫を氷上で１−３ｒＩＬｌの音波処理緩衝液（
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，４，１ｍＭ　
ＥＤＴＡ、　　ｌ　ｍＭフェニルメチルスルフォニルフ
ルオライド）中で音波処理し、微粒子状の物質を臨床用
遠心機での遠心分離によって集めた。上溝（音波処理上
清と呼ぶ）を−２０℃で保存した。ペレットは０．５ｍ
ｔ’ＳＴ緩衝液（１％ＳＯＳ、　０．１２５Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ６，８）中で２分間煮沸し室温で一
晩振盪した。微量遠心機で２分間遠心してペレットを得
た後、上溝（ＳＤＳ上清と称する）を−２０℃で保存し
た。このペレットを２分間０．５１ｙｄ！ＳＴ緩衝液、
５％２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）中で煮沸し、
室温で一晩振盪した。微量遠心機で２分間遠心した後、
上溝（ＢＭＥ上清と呼ぶ）を抜取り、−２０℃で保存し
た。放射能測定のために、不溶性角質物質をＰｒｏ−ｔ
ｏｓｏｌ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）に
溶解した。一部の実験では音波処理段階を省略し、標識
した虫を直接ＳＤＳで抽出した。
上記の方法によって虫から遊離された標識タンパク質を
５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動）によって分析し、続いてオートラジオグラフィー
を行った。ＬａｅｍｍｌｉおよびＦａｖｒｅ　（Ｊ。
Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　８０：　５７５−５９９．１９
７３）によって記載された緩衝液系を用いて５Ｏ３−Ｐ
ＡＧＥを行った。オートラジオグラフィーのために、ゲ
ルを５０％メタノール／１０％酢酸で一晩固定し、６０
分間ｌＯ％グリセロール／１０％エタノールで洗浄し、
減圧乾燥し、Ｘ−線フィルムに露光した。Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから
購入した以下の１４ｃ−標識タンパク質を標準として用
いて相対的な分子量を決定した：ミオシン（２００ｋＤ
ａ）、ホスホリラーゼＢ　（９７，４ｋＤａ）、ウシ血
清アルブミン（３８ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋ
Ｄａ）、アルファーキモトリプシノーゲン（２５，７ｋ
Ｄａ）、−ラクトグロブリン（１８ｋＤａ、およびリゾ
チーム（１，４３ｋＤａ）。
第１図は表面標識実験の典型的な結果を示す。
ＸＬ３では、６個の主要なタンパク質が１２５■で一様
に標識され、ＳＤＳ中での煮沸によって虫または角質か
ら可溶化された。最も強く標識された分子種は６８−９
７　ｋＤａの分子量を有し、特徴的な幅広のＨ型のバン
ドを形成する。標識程度のそれほど強くない５個のタン
パク質は、それぞれ２４ａ、　２６．３０ａ、　３６（
はっきりしないバンド）および１８０ｋＤａの分子量を
有する。２４ａ　ｋＤａタンパク質は二重のバンドとし
て見えることかあった。２４ａおよび３６ａｋＤａタン
パク質は、一部か、界面活性剤無添加で音波処理段階で
虫から可溶化した（第１図）。
ＳＯ３で抽出したＸＬ３角質をＳＤＳ　十ＢＭＥ中で煮
沸することによってさらに抽出した時、２４ｂおよび３
０ｂ　ｋｌｌａの分子量を持つタンパク質が、４ｏから
〉２００　ｋＤａまでの分子量を持つ多数のマイナータ
ンパク質と同様に可溶化された。２４ｂおよび３０ｂ　
ｋＤａＳＤＳ　＋　ＢＭＥ−可溶性タンパク質がこのよ
うな分子量を持つ５ＤＳ−可溶性タンパク質と同一であ
るがどうかは確かではない。したかって“ａ”および“
ｂ“という記号をこれらの区別のために用いた。角質に
取り込まれた全放射能の約８％は、上記の処理によって
可溶化されなかった。
標識したＬ４のＳＤＳを用いた抽出は、上記の１２５１
標識表面タンパク質とは異なるパターンを示した（第１
図）。最も強く標識された分子種はそれぞれ２７．２９
および２００　ｋＤａの分子量を有する。２７および２
９　ｋＤａタンパク質は第１図では一本のバンドに見え
るが、もっと短時間露光したオートラジオダラムでは二
本のバンドにはっきりと分かれる。
分子量かそれぞれ１６．１８．１９．３６　（不明瞭）
、　４２゜５４、７８．９８および１２５　ｋＤａであ
るマイナータンパク質も、ＳＤＳによって可溶化される
。量の変化する上記タンパク質並びに新たに１８０　ｋ
Ｄａタンパク質か、通常、ＳＯＳ処理し４角質からＳＯ
Ｓ　＋　ＢＭＥ中での煮沸によって可溶化される。さら
に、分子量範囲４０から＞２００　ｋＤａまでの数多く
のマイナータンパク質が通例抽出された。これらのタン
パク質はこの分子量範囲において背景に一面に塗り付け
たように見えた。Ｌ４角質に取り込まれた全放射能の約
３％は、これらの方法によって可溶化されなかった。
Ｂ、ＸＬ３およびＬ４表面タンパク質の性質検討１、コ
ラゲナーゼ消化 ＸＬ３またはＬ４表面タンパク質を細菌のコラゲナーゼ
で処理して、これらのタンパク質の中にコラーゲンがあ
るかどうかを決定した。標識した表面タンパク質を、成
虫角質の標識しないＳＯＳ十ＢＭＢ抽出物（この抽出物
は角質コラーゲンを含有する）５０マイクロリツターと
混合し、氷上で１時間、９容の水冷アセトンで沈澱させ
、微量遠心機で遠心してペレットを得た。水冷アセトン
で１回洗浄した後、ベレットを風乾し、４０マイクロリ
ツターのコラーゲン消化緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｊｓ−
ＨＣＩ、　ｐＨ７，４゜１０ｍＭ　ＣａＣｌ２．　ｏ、
　１５Ｍ　ＮａＣ１）中にいれ、２ＢＴＣユ＝ツトのク
ロストリジウムコラゲナーゼ（■型、Ａｄｖａｎｃｅｄ
　Ｂｉｏｆａｃｔｕｒｅｓ　Ｃｏｒｐ、）存在下で３７
°Ｃで一晩インキユベートした。さらに２ユニツトのコ
ラゲナーゼを翌朝添加し、消化をさらに６時間進行させ
た。次に、試料を５％ＢＭＥを加えたＳＯＳ試料緩衝液
で希釈し、２分間煮沸し５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオート
ラジオグラフィーによって分析した。オートラジオグラ
フィーに先立って、成虫角質コラーゲンの消化の程度を
モニターし、なんらかの非特異的タンパク質加水分解を
検出するために、ゲルをクマシーブルーで染色した。
主要な５ＤＳ−可溶性ＸＬ３またはＬ４表面タンパク質
はいずれもコラゲナーゼによって消化されず、このこと
はいずれもコラーゲンでないことを示す（第２図）。こ
れとは対照的に、ＳＤＳ＋ＢＭＨにのみ可溶性のＸＬ３
およびＬ４の標準タンパク質の大半は消化され、これら
がたぶんコラーゲンであることを示した。例外は、ＳＤ
Ｓ十〇ＭＨによって可溶化された２４および３０　ｋＤ
ａのＸＬ３表面タンパク質であった：これらはコラゲナ
ーゼで消化されなかった。
２、グリコシダーゼ消化 ＸＬ３またはＬ４表面タンパク質のどれかがグリコジル
化されているかどうかを調べるために、これらのタンパ
ク質をエンドグリコシダーゼＦおよびＮ−グリカナーゼ
で処理した。二つの酵素はいずれも、Ｎ−結合糖類を切
断する。エンドグリコシダーゼＦ消化については、ＳＴ
緩衝液中の１！ｉ（−標識表面タンパク質を等量の２０
０ｍＭリン酸ナトリウム、Ｉ）Ｈ８，６、６，２％ＮＰ
−４０，２％ＢＭＥ、　０．２％ＳＤＳ、と混合し、５
分間煮沸し、室温まで冷却した。エンドグリコシダーゼ
Ｆまたは水を添加し、その混合物を３７℃で一晩インキ
ユベートした。
Ｎ−グリカナーゼ反応については、ＳＴ緩衝液中の１２
１■標識表面タンパク質にＢＭＥを加えて最終濃度１０
％となるようにし、５分間煮沸し、室温まで冷却した。
試料を等量の０．５５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ８，６，
３％ＮＰ−４０と混合し、３７°Ｃて一晩Ｎ−グリカナ
ーゼとともにインキュベートした。試料をＳＤＳ試料緩
衝液で希釈することによって反応を止め、２分間煮沸し
た。試料を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフ
ィーによって分析した。場合によっては、オボアルブミ
ンを対照筒タンパク質として消化反応に加えた。ゲルの
クマシーブルー染色によって、オボアルブミンの脱グリ
コジル化をモニターした。
エンドグリコシダーゼＦおよびＮ−グリカナーゼの両者
に関する結果は、定性的には類似しており、エンドグリ
コシダーゼＦの結果を第３図に示す。５ＤＳ−可溶性タ
ンパク質のみをこの実験では分析した。３０ａおよび３
６　ｋＤａのＸｌ３表面タンパク質が両方ともグリコシ
ダーゼ処理後に消失した。新たに２６　ｋＤａのバンド
が出現し、２４　ｋＤａのバンドは濃くなった。このこ
とは、これらかこのようなタンパク質のグリコジル化さ
れていない前駆体の分子量であることを示す。２４ａ、
６８−９７および１８０ｋＤａのＸｌ３タンパク質の移
動度は、エンドグリコシダーゼＦまたはＮ−グリカナー
ゼ処理後に変化しなかった。２７．２９．３６および７
８　ｋｌ）ａのし４表面タンパク質かこれらのグリコシ
ダーゼによって消化された。２５　ｋＤａの新たな強い
バンド（ゲルの短期露光においても単一バンド）かグリ
コシダーゼ処理後に現われ、おそらくこれは２７および
２９　ｋＤａのＬ４タンパク質のグリコジル化されてい
ない前駆体であろう。７８　ｋＤａのＬ４表面タンパク
質の移動度はグリコシダーゼ処理後６８　ｋＤａに変化
した。このタンパク質のグリコシダーゼに対する感受性
は、それが対応する分子量を持つ主要なＸｌ３表面タン
パク質とは区別されることを示す。３３　ｋＤａの新し
い弱いバンドがグリコシダーゼ処理後のＬ４抽出物中に
存在し、３６　ｋＤａタンパク質の前駆体である可能性
かある。他のマイナーなし４表面タンパク質か消化され
たかどうかをこれらの実験から決定することはできなか
った。
３、免疫蛍光研究 生きたＸｌ３およびＬ４を、天然型またはＳＯ３−処理
角質のいずれかに対して調製されたウサギ抗血清を使用
して免疫蛍光アッセイで分析した。天然型ＸＬ３および
Ｌ４角質の混合物は、Ｌ４虫およびＸｌ３から剥離され
た（Ｌ４に脱皮したのて）遊離Ｘｌ３角質から調製した
。Ｌ４虫および遊離Ｘｌ３角質を、−緒に超音波処理し
、そして角質片を、上記した超音波処理緩衝液でよく洗
浄した。天然型成体角質は、凍結成体を液体窒素上で乳
鉢および乳棒を用いて微粒子に粉砕することによって得
られた。次いで主原料を超音波処理緩衝液でよく洗浄し
た。卵殻は成体角質調製物における主要汚染物質であり
、除去されなかった。５ＤＳ−処理角質は、Ｆｉｃｏｌ
１段階匂配を使用して別々に精製されたＸｌ３およびＬ
４から調製した。超音波処理および超音波処理緩衝液に
よる数回の洗浄の後、角質片をＳＴ緩衝液中で２分間煮
沸し、そして振盪しなから一晩室温でインキュベートし
た。５ＤＳ−処理成体角質は、天然型成体角質フラグメ
ントを同じ方法でＳＴ緩衝液で処理することによって調
製した。次の日、角質片を遠心分離により回収し、新し
いＳＴ緩衝液中で２分間煮沸し、そして室温で数時間振
盪した。次いて、角質片を３回ＳＴ緩衝液で洗浄し、そ
して生理食塩水に再懸濁させた。
角質片をＦｒｅｕｎｄ完全アジュバントと混合し、そし
てニューシーラント白ウサギ（Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ
　ｗｈｉｔｅｒａｂｂｉｔｓ）に数カ所に筋肉内接種し
た。ウサギを、−箇月間隔でＦｒｅｕｎｄ不完全アジュ
バントと混合された付加的角質抗原で追加免疫した。各
追加免疫に続いてウサギから１０〜１４日採血した。
間接的免疫蛍光検定に関して、生きた虫を、生理食塩水
で数回、ＰＢＳで１回洗浄し、そしてＰＢＳでｌ：５０
希釈された抗血清を用いて室温でインキュベートした。
６０分後、この虫をＰＢＳ　３　Ｘｌ０−で洗浄し、そ
し１’ＰＢＳ　で１：１００希釈されたＦＩＴＣ−標識
されたヤギー抗−ウサギＩｇＧ第２抗体と共に６０分間
インキュベートした。次いて、虫をＰＢＳ　３　Ｘｌ０
−で洗浄し、そして蛍光顕微鏡中で可視化した。
これらの抗血清を用いて得られた結果の代表的顕微鏡写
真を第４図に示す。
ＸＬ３およびＬｉ角質の混合物に対して調製されたウサ
ギ抗−天然型角質血清（Ｒｂ−８０６１）は、生きたＸ
Ｌ３およびＬｉの全表面に渡って強くかつ均一に反応し
た（各々、第４図Ａおよび第４図Ｃ）。これと対比して
、５ＤＳ−抽出ＸＬ３およびＬｉ角質に対して調製され
たウサギ抗血清（各々、Ｒｈ−６９７１およびＲｈ−７
５３９）は、同様な実験における生きた虫の表面と反応
し損なったかあるいは非常に弱く反応した（各々、第４
図Ｂおよび第４図Ｄ）。これらの後者の抗血清は、ＸＬ
３の口腔としか有意に反応しないことが観察された。以
下に示す抗−天然型ＸＬ３　／Ｌ４角質血清および抗−
成体角質血清のいずれも生きたＸＬ３と有意に反応しな
かった（データ示さず）。　天然型またはＳＯ３−処理
成体角質に対して調製されたウサギ抗血清（各々、Ｒｂ
−８１００およびＲｈ−８１０１）もまた、ＩＦＡ実験
で生きたＸＬ３またはＬｉとの反応について試験された
。生きた虫との有意な反応は、これらの抗血清では観察
されなかった。これらの抗血清を用いてインキュベート
されたＸＬ３およびＬｉの外観は、第４図ＢおよびＤに
記載されたものと対照的であった。これらの抗血清は、
全土抽出物のウェスタンプロットにおけるＸＬ３および
Ｌｉの多くのタンパク質、例えば角質コラーゲンと強く
反応する（データ示さず）。
４、　免疫ヒツジ血清との１２５１−標識ＸＬ３および
５４表面タンパク質の反応 ２種類の免疫ヒツジ（＃６９７および６９８）および対
照である非−接種ヒツジ（＃６９５）からの血清を免疫
沈降実験に使用して、これらが１１！５ｉ−標識表面タ
ンパク質と反応するか否かを測定した。これらの血清は
、Ｅｌｉ　Ｌｉ１ｌｙ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（Ｇ
ｒｅｅｎｆｉｅｌｄ。
ＩＮ）のＲｊ、　Ｂｏｉｓｖｅｎｕｅ博士から得られた
。ヒツジ＃６９７および６９８を２．５　ＸＩＯ’のへ
モンカス・コントルツスＳＬ３幼虫で経口感染させ、成
熟した卵−産生成体に成長させた。接種約４０日後に、
非産生は成虫の駆除により急激に停止した。この時に、
ヒツジを、さらに２．５ＸＩＯ’幼虫で挑戦した。糞便
における卵数の検査は、若干の上昇しか示さず、このヒ
ツジが免疫処理感染に耐性であったことを示した。血液
サンプルを、挑戦感染後の種々な時間でこのヒツジから
採り、凝結させ、血清サンプルを一２０°Ｃで凍結させ
た。５ＤＳ−溶解性の１２５１−標識表面タンパク質だ
けを、これらの実験で分析した。これらの血清を用いた
免疫沈降実験は、アフィニティー精製されたウサギ抗−
ヒツジＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）１２．５１をプロティン−Ａセファロースインキ
ュベーションに包含してヒツジＩｇＧを確実に沈降させ
た以外は、第１　（Ｄ）　（２）節に記載された通り行
われた。
ａ、　　ＸＬ３表面タンパク質 ヒツジ＃６９７および６９８からの血清は、３６ｋＤａ
　５ＤＳ−溶解性ＸＬ３表面タンパク質を特異的に沈降
したが、対照ヒツジ＃６９５からの血清およびアフィニ
ティー精製されたウサギ血清は、沈降しなかった（第５
図）。ヒツジ＃６９７および６９８からの血清と３６ｋ
Ｄａ　ＸＬ３表面タンパク質との反応は、ＸＬ３表面タ
ンパク質をヒツジ血清によるインキュベーションニ先立
って１〜５％２−メルカプトエタノールで還元した場合
、廃止されるかあるいは非常に低減された（第６図）。
この結果は、免疫ヒツジ血清によって認識される３６ｋ
Ｄａ表面タンパク質上のエピトープかコンホーメーショ
ン的に依存するということを暗示している。
ｂ、　５４表面タンパク質 ヒツジ＃６９７および６９８からの血清は、２７．２９
．３６および２００ｋＤａの５ＤＳ−溶解性１４表面タ
ンパク質を特異的に沈降した（第７図）。３６ｋＤａタ
ンパク質との反応は、５４表面タンパク質をヒツジ血清
によるインキュベーションに先立って１〜５％２−メル
カプトエタノールで還元した場合（これはデグリコシル
化実験に要求される）、観察されなかった。ヒツジ＃６
９７および６９８からの血清をエンドグリコシダーゼＦ
でデグリコシル化された５４表面タンパク質と反応させ
た場合に（第１（Ｂ）（１）節に記載の方法）、本発明
者等は、この血清がおそらく２７および２９ｋＤａタン
パク質に対するデグリコシル化された前駆体である２５
ｋＤａタンパク質を沈降することを見出した（第８図）
。これらのヒツジ血清はまた、エンドグリコシダーゼＦ
による処理後、移動度を変化しない２００ｋＤａタンパ
ク質とも反応した。
Ｃ，ＸＬ３およびＬ４表面タンパク質の精製本発明者等
は、簡単に１％ＳＤＳ中で生きたＸＬ３を煮沸するとこ
の発達段階からの表面タンパク質を可溶化することを知
見した（第９図）。生存ＸＬ３（約２００マイクロリツ
トルパツク容量）を、１％ＳＤＳ　１ｍ／、０．１２５
Ｍ　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ６，８中に懸濁し、沸騰水中
に２分間入れ、水から取り出し、更に２分間逆転により
混合し、そしてマイクロフユージ中で１分間ペレット化
した。上清を抜き取り、数回再遠心して全ての虫を除去
し、ドライアイス／エタノール浴中で凍結し、そして−
２０℃で保存した。サンプルを後に解凍し、そして２　
ｄ　Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０装置（Ａｍｉｃｏｎ、　
１０ｋＤａ分子量カットオフ）を使用して４℃で濃縮し
た。
濃縮されたタンパク質サンプルを５ＤＳ−サンプル緩衝
液中に希釈し、モして５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し
た。クマシーブルー染色によれば、ゲル上で特徴的Ｈ−
形外観を有する６８〜９７ｋＤａ表面タンパク質かこれ
らの抽出物における断熱主要な種であった（第９図）。
１８０ｋＤａ表面タンパク質は、一般にかすかなバンド
として検出することかできた。分子量か他の１２５１−
標識ポリペプチドに相当するより少量のタンパク質は、
重負荷されたゲル上で銀−染色によって目視できた（ゲ
ルは示さず）。これらの抽出物のミー染色ゲルパターン
は、゛′５Ｉ−標識表面タンパク質にさらに密接に近似
した。
１２５■−標識化およびクマシーブルー染色により検出
された表面タンパク質のパターンの定量的な相違は、タ
ンパク質の標識化および／または示差染料染色特性への
チロシン残基有効性によるものであったのであろう。
煮沸ＳＤＳ方法は、Ｌ４表面タンパク質を精製するのに
有効でない。この方法によって得られたタンパク質のパ
ターンは、超音波処理された虫溶解物をＳＤＳ中で煮沸
する際にみれるのと同様であった（ゲルは示さず）。光
学穎微鏡において、ＳＯ３−処理し４は中空であるらし
く、はとんどの細胞性タンパク質が空の角質を残して可
溶化したらしかった。
これとは対照的に、５ＤＳ−処理されたＸＬ３は明らか
に死亡していたが損なわれていないらしかった。
驚くべきことに、本発明者等は、緩衝液中の１００ｍＭ
　ＮａＣ１中でＬ４虫（およびＸＬ３）を煮沸すると表
面タンパク質が特異的に可溶化されることを知見した。
生きた虫（約２００マイクロリツトルパツク容量）を、
沸騰水中に入れた１００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　ト
リス−ＨＣｌ　ｐＨ７，４１ｏｌｌに２分間懸濁し、水
から取り出し、更に２分間逆転により混合し、そしてマ
イクロフユージ中で１分間ペレット化した。上滑を抜き
取り、数回再遠心して全ての虫を除去し、ドライアイス
／エタノール洛中で凍結し、そして−２０℃で保存した
。サンプルを後に解凍し、そして２　ｍｌ’　Ｃｅｎｔ
ｒｉｃｏｎ−１０装置（Ａｍｉｃｏｎ、　１０ｋＤａ分
子量カットオフ）を使用して４℃で濃縮した。
濃縮されたタンパク質サンプルを５ＤＳ−サ・ンプル緩
衝液中に希釈し、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析
した。ＮａＣ１法によって可溶化されたＸＬ３およびＬ
４タンパク質のクマシーブルー染色パターンを第９図に
示す。ＸＬ３のＮａＣ１−抽出物は、簡単に１％ＳＤＳ
中で煮沸することによって得られたものと本質的に同一
であり、６８〜９７ｋＤａタンパク質か優勢であり、そ
して１８０ｋＤａタンパク質か次に豊富な種であった。
このＮａＣｌ法は、５Ｏ３−ＰＡＧＥにより分離された
同量の抽出物のクマシーブルー染色によって判定すると
ＳＤＳ法より少ないタンパク質を生成すると思われた。
ＮａＣｌ法は、５　ＸＩＯ’　ＸＬ３当たり表面タンパ
ク質１００〜１５０マイクログラムを代表的に生成した
。
Ｌ４　ＮａＣ１抽出物パターンは、１２５Ｉ−標識によ
って得られたパターンと定性的にも定量的にも同様であ
る。優勢な種は、分子量２７．２９．７８および２００
ｋＤａを有する。このＬ４　ＮａＣ１抽出物は、３６ｋ
Ｄａ１２Ｊ−標識種を比較的に少なく、１２５■−標識
抽出物において少量である４２ｋＤａタンパク質をより
多く有している。後者のタンパク質の量は抽出により異
なったが、決して主要量ではなかった。この分子量のタ
ンパク質はまた、ＸＬ３のＮａＣｌおよびＳＤＳ抽出物
においてしばしば目視可能であったか、ここでもまた＋
２１■−標識によってほんの僅かしか目視てきなかった
。１４表面タンパク質の収量は、ＸＬ３に関して得られ
たのとほぼ同じであった。
Ｄ、　精製ＸＬ３および１４表面タンパク質の特性決定 １、　間接的免疫蛍光研究 ニューシーラント白ウサギを、Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュ
バントと混合された表面タンパク質１００マイクログラ
ムで皮下免疫した。このウサギを、１箇月後にＦｒｅｕ
ｎｄ不完全アジュバントと混合されたタンパク質５０マ
イクログラムで追加免疫した。ウサギから１０〜１４日
後に採血した。ウサギ９４４６および１５３に、各々Ｎ
ａＣ１−抽出ＸＬ３および１４表面タンパク質を与えた
（第Ｃ節を参照のこと）。ウサギ１５４には、アジュバ
ントと混合する前に１％ＳＤＳ、　５％ＢＭＥ中で２分
間煮沸することによって変性および還元されたＮａＣｌ
−抽出し４表面タンパク質を与えた。
免疫化されたウサギは、間接免疫蛍光実験で測定された
ように生きた虫の表面に存在する天然型タンパク質と反
応することができる抗体を産生した（第１０図）。生き
たＸＬ３およびＬ４の混合物と抗−ＸＬ３表面タンパク
質血清（Ｒｂ−９４６６）との反応は、ＸＬ３だけを標
識する。これとは対照的に、抗−Ｌ４表面タンパク質血
清（Ｒｈ−１５３）は、生きたＸＬ３およびＬ４の両方
と反応する。後者の血清によるＸＬ３の標識は、Ｌ４表
面タンパク質抽出物を調製するのに使用される大きい虫
集団におけるＸＬ３および脱皮ＸＬ３角質によるＬ４の
５〜１０％が汚染されているためであろう。Ｌ４は、主
要６８〜９７ｋＤａ　ＸＬ３表面タンパク質と同じ領域
において移動する７８ｋＤａ表面タンパク質を有してお
り、それゆえ−次元ゲル電気泳動によって汚染を検出す
ることはできない。
ＮａＣｌを使用して単離され、後に１％ＳＤＳ＋　５％
ＢＭＥ中で煮沸することによって変性および還元された
し４表面タンパク質に対して調整された別のウサギ抗血
清（Ｒｈ−１５４）もまた、生きたＸＬ３およびＬ４の
表面と強く反応した（データ示さず）。
２、　免疫沈降実験 免疫沈降実験のために、１２５Ｉ−標識ＸＬ３および１
４表面タンパク質（標識虫のＳＤＳまたはＳＤＳ＋ＢＮ
Ｅ抽出物）を１分間煮沸し、マイクロフユージ中て１０
分間遠心し、そして１０〜５０マイクロリツトルの小部
分を１−の２％トリトン−Ｘ−１００，５０ｍＭ　トリ
ス−ＨＣｌ　ｐＨ８，１，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，Ｏ，
１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび２５マイクロリツトル高免疫ま
たは予備出血ウサギ血清と混合した。穏やかに振動させ
なから一晩４°Ｃでインキュベートした後、１００マイ
クロリツトルのプロティン−Ａセファロ−ススラリ−（
１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ８，０，１ｍｔ’中２
５０マイクログラムのプロティン−Ａセファロース（Ｓ
ｉｇｍａ））を添加し、４°Ｃて更に６０分間振動させ
なからインキュベートした。
結合抗体を含有するセファロースビーズをマイクロフユ
ージ中で遠心することによってベレット化した。このビ
ーズを２％　トリトン−Ｘ−１００，５０ｍＭトリスＨ
ＣＩ　ｐＨ８，１，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，０，１ｍＭ
　ＥＤＴＡの溶液ｌ−で３回洗浄した。結合抗原を、ビ
ーズを３分間１００マイクロリツトルの１％５ＤＳ１０
．１２５ｍ　　）リス−ＨＣｌ　ｐｌ　６．８．５％Ｂ
ＭＥ中で煮沸し、そして清を回収することによって溶離
した。サンプルを、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジ
オグラフィーによって分析した。
これらの実験の結果は、ＩＦＡ結果と相関し、そして第
１１図に示される。抗−ＸＬ３表面タンパク質血清は、
全ての５ＤＳ−可溶性１２ｓＩ−標識ＸＬ３表面タンパ
ク質を沈降する。弱い反応か、Ｌ４　ＳＤＳ抽出物中の
６８〜９７ｋＤ＆および２００ｋＤａタンパク質に対す
るこの血清で観察される。これらのタンパク質は、ＸＬ
３またはＬ４由来であろう。抗−ＸＬ３表面タンパク質
血清は、主要２７および２９ｋＤａ　５ＤＳ−可溶性Ｌ
４表面タンパク質を沈降しない。これとは対照的に、抗
−Ｌ４表面タンパク質血清（Ｒｈ−１５３およびＲｈ−
１５４）両者は、全テ（７）　５ＤＳ−可溶性１２３Ｉ
−標識Ｌ４オヨヒＸＬ３表面タンパク質を沈降する。Ｒ
ｈ−１５３およびＲｈ−１５４血清ハマタ、＋２Ｓｉ−
標識ＸＬ３　オヨヒＬ４（７）ＳＤＳ十ＢＥＭ　抽出物
における４０〜＞２００ｋＤａスミアと弱く反応する（
第３図におけるＢと標識されたレーン）。これらのタン
パク質は、主として角質コラーゲンであると先に示され
ている（第１（Ｂ）（１）節）。
３、　アミノ酸組成 精製ＸＬ３および１４表面タンパク質のアミノ酸組成を
測定た。これを第１表に示す。ＮａＣｌ抽出方法を使用
して精製された表面タンパク質をこれらの実験で分析し
た。タンパク質サンプルを１％ＳＯ３となし、そして９
容量の水冷アセトンの添加によって沈降させた。９０％
アセトンで２回洗浄し風乾した後、サンプルを減圧下に
６Ｎ塩酸で２４時間１１０°Ｃて加水分解し、そしてＢ
ｅｃｋｍａｎアミノ酸分析器で分析した。
タンパク質の両セットは、親水性アミノ酸に関して豊富
であり、ただしアラニンおよびグリシンを除いて疎水性
アミノ酸において比較約２しい。
これらのタンパク質は、グリシンおよびプロリン残基に
関しては豊富でなく、タンパク質がコラーゲンでないと
いう本発明者等の先の知見に一致する（第１（ＢＸＩ）
節）。主要６８〜９７ｋＤａ種のアミノ酸組成を大いに
反映するはずであるＸＬ３表面表面タンパ抽質抽出物け
る２６％のアミノ酸かグルタミン酸またはグルタミンの
いずれかであったという知見か注目される。１４表面タ
ンパク質は、より少量のこれらのアミノ酸を含有した。
（本質以下余白） 第１表 ヘモンカス・コントルツスＸＬ３および１４表面タンパ
ク質のアミノ酸組成１ アミノ酸　　　　　　　ＸＬ３　　　　　　　Ｌ４”Ｎ
ａＣｌ法を使用して精製された二つの異なるタンパク質
調製に関する測定の平均。各分析は、７．５マイクログ
ラムのタンパク質について行われた。
ｂ測定せず。
０アミド形を含む。
本発明者らは、ＳＤＳゲルからのタンパク質の溶離後に
またはＸＬ３　ＮａＣ１抽出物の直接配列化によって主
要６８〜９７ｋＤａ　ＸＬ３タンパク質のアミノ−末端
配列を得ることを試みた。いずれの場合にも、配列情報
が得られず、タンパク質のアミノ−末端アミノ酸か修飾
されるかもしれないことを示唆している。
■、抗凝固実施例 １、ヘモンカス・コントルツス：λＥＭＢＬ−３ファー
ジライの形成 ａ、ヘモンカス・コントルツスＤＮＡの単離液体窒素中
で凍結されたＳＬ３は、Ｅｌｉ　Ｌｉ１ｌｙ　ａｎｄＣ
ｏｒｏｐａｎｙ、　Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、　　Ｉｎｄ
ｉａｎａのＲ，Ｊ、　Ｂｏｉｓｖｅｎｕｅ博士によって
提供された。凍結されたＳＬ３を乳鉢および乳棒を用い
て微粒子に粉砕し、液体窒素浴中に入れた。生粉を３０
−コルテックス管に移し、そして４５分間６５°ＣでＯ
，１Ｍ　）リス−ＨＣｌ　ｐＨ８，５，５０ｍＭＥＤＴ
Ａ、　０．２Ｍ　ＮａＣｌ、　１％ＳＯＳの溶液中のブ
ロテイナーゼＫ　（２００μｇ／ｍｌ）で消化した。消
化混合物を、交互にフェノールおよびクロロホルム：イ
ソアミルアルコール（２４：　１比）で数回洗浄した。
ＤＮＡを、この溶液を０．３Ｍ酢酸ナトリウムに調整し
そして３容量のエタノールを添加することによって水相
から沈降させた。沈降したＤＮＡを、ガラス棒て巻き戻
し、風乾し、モしてＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　トリス−Ｈ
ＣｌｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。
このＤＮＡ溶液を、ＲＮＡアーゼ（５０μ／ｍｌ）で６
０分間３７°Ｃで処理し、フェノールおよびクロロホル
ム：イソアミルアルコールで連続的に数回抽出し、０．
３Ｍ酢酸ナトリウムとし、ＤＮＡを３容量のエタノール
の添加によって沈澱させた。風乾した後、ＤＮＡをＴε
緩衝液に再懸濁させた。
ｂ、　サイズ−選択されたヘモンカス・コントルツスＤ
ＮＡの調製およびλＥＭＢＬ−３ファージＤＮＡへの凍
結 ８０マイクログラムのへモンカス・コンドルラスＤＮＡ
を、ＤＮＡの嵩をアガロースゲル電気泳動によって測定
して１５〜２Ｏｋｂサイズ範囲となるように５ａｕ３Ａ
で部分的に消化した。消化されたＤＮＡを６５°Ｃに１
０分間加熱し、室温に冷却し、そして５Ｗ４１管中の１
０〜４０％シュクロース匂配上に積層した（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ等、　１９８２年）。２５時間３０．００Ｏｒｐ
ｍで２０°Ｃて遠心した後、匂配を低部から２３ゲージ
針により滴下させ、そして１５０〜２００　Ｉ！のフラ
クションを集めた。代わりのフラクションを、０．７％
アガロースゲル上で電気泳動し、そして１７〜２０ｋｂ
　ＤＮＡフラグメントを含有するフラクションをプール
した。
プールされたＤＮＡを、ＴＥ緩衝液によりよく透析し、
エタノールで沈降させ、そしてＴＥ緩−液に再懸濁させ
た。
サイズ選択されたヘモンカスＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよ
びＢａｍＨＩで消化されたラムダファージベクターＥＭ
ＢＬ−３（Ｆｒｉｓｃｈａｕｆら、１９８３年）に−晩
連結させた。
連結混合物をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ
から購入したキットを使用してインビトロでパックし、
そしてＥ、ｃｏｌｉ株Ｑ３５９．１　（これは組み換え
ファージだけを成長させる）およびＫＲＯ（これは非−
組み換えＥＭＢＬ−３だけを成長させる）上にプレート
した。これらの試験プレート化により、ヘモンカス・コ
ントルツスＤＮＡ挿入物を含有する１６０．０００組み
換えファージのライブラリーが形成されていたことか明
らかにされた。完全ライブラリーは、Ｅ、ｃｏＬｉＱ　
３５９．１上にプレート化することによって増幅された
（１５ｃｍ寒天プレート１６個のそれぞれ当たり１０．
０００フアージ）。増幅されたライブラリーは、６．６
　Ｘｌ０９組み換えファージからなる。
２、　ラムダｇｔｌｌ：成虫ｃＤＮＡライブラリーの形
成ａ、　成虫からのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの単離成虫は
、Ｅｌｉ　Ｌｉ１ｌｙ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｇ
ｒｅｅｎｆｉｅｌｄ。
ＩｎｄｉａｎａのＲ，Ｂｏｉｓｖｅｎｕｅ博士から得ら
れた。この虫は、実験的に感染されたヒツジのしゅう胃
から得られ、生理食塩水で洗浄し、液体窒素中で凍結し
た。凍結された成虫を、乳鉢および乳棒で液体窒素浴上
で微粒子に粉砕した。生粉を５０−プラスチック円錐遠
心管に移し、そしてｌＯ容量のＲＮＡ溶解緩衝液（４Ｍ
グアニジン塩酸塩、０．１３Ｍ酢酸ナトリウム、　ｐＨ
５，２，０，５％ザルコシル、ＩＭ　２−メルカプトエ
タノール）で可溶化した。この混合物を、０．５容量の
５．７ｍＣｓＣ１，５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，
２上に積層化し、そして５Ｗ２８０−ター中で２．５０
０ｒｐｍて１８時間１８°Ｃて遠心した。このＲＮＡペ
レットを、ＲＮＡ溶解緩衝液中に再懸濁し、そして３容
量のエタノールの添加により沈澱させた。遠心後；　Ｒ
ＮＡベレットを０．３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５，２に懸
濁させ、エタノール沈澱させ、乾燥し、そして水に再懸
濁させた。上記の方法は、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（１９７
９年）に記載された方法を若干変更したものである。
ポリ（Ａ）＋　ｍＲＮＡを、基本的にＥｆｓｔｒａｔｉ
ａｄｉｓおよびＫａｆａｔｏｓ（１９７６年）により記
載されたごとくオリゴｄＴセルロースのカラムにＲＮＡ
を通過させることによって単離した。このポリ（Ａ）＋
ｍＲＮＡを、エタノールにより沈澱させ、乾燥し、そし
て水に再懸濁させた。全ＲＮＡ　４．８ｍｇから、本発
明者等はポリ（Ａ）＋　ｍＲＮＡ　　１９１μｇを単離
した。
ｂ、　　ｃＤＮＡの合成およびラムダｇｔｌｌへの連結
二重鎖ｃＤＮＡを、Ａｍｅｒｓｈａｍから購入したキッ
トを使用してポリ（Ａ）＋　ｍＲＮＡ　　２μｇから調
製した。使用した方法は、本質的に上記キットに添付さ
れた指示マニュアルに要約されたものであった。簡単に
説明すると、第１１の合成を、ＡＭＰリバーストランス
クリプターゼを使用してＲＮＡをポリ（ｄＴ）でプライ
ムして行われた。少量の”Ｐ−ｄＡＴＰが、反応を追跡
して続く単離段階においてｃＤＮＡを同定するために反
応混合物中に包含された。第２鎖の合成は、ＲＮＡアー
ゼＨおよび　　　ＤＮＡ　Ｐｏ１−１を使用して行われ
、そしてｃＤＮＡ末端はＴ４　ＤＮＡポリメラーゼでプ
ラントエンドにした。二重鎖ＣＤＮＡを、Ｅｃ。
Ｒ１メチラーゼでメチル化し、フェノールおよびエーテ
ルで抽出し、そして２０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ８
，０゜１００ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ
を緩衝液として使用して５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３０
０の１−カラムに通過させることによって単離した。ホ
スホリル化したＥｃｏＲＩリンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから購入した８量体）を、Ｔ４
　ＤＮＡリガーゼを使用して一晩１５℃でｃＤＮＡに連
結した。次いで、このｃＤＮＡを、数百単位のＥｃ。
ＲＩテ消化させ、そしてｃＤＮＡを、５ｅｐｈａｃｒｙ
ｌ　Ｓ−３００の１ｒｎ１カラムに通過させることによ
って遊離リンカ−から分離した。エタノール沈澱および
真空乾燥の後、このｃＤＮＡを水に再懸濁させた。二重
鎖ｃＤＮＡ約１．３μｇが得られた。
このｃＤＮＡ（ベクターｌμｇ当たり１０〜３０ｎｇ）
を、ＥｃｏＲｔで消化させ、そしてデホスホリル化され
た発現ベクターλｇｔｌｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　
Ｉｎｃから購入）に連結した（ＹｏｕｎｇおよびＤａｖ
ｉｓ、　１９８３年）。連結混合物をインビボでパッケ
ージしくＳｔｒａｔａｇｅｎｅ。
Ｉｎｃ、から購入のキット）、そしてＩＰＴＧおよびＸ
ＧＡＬの存在下または不存在下にＥｃｏＲＩ株Ｙ１０８
８（ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ、　１９８３年）上に
プレートしてｃＤＮＡ挿入物を含有する組み換えファー
ジの数を測定した。
試験プレートは、４　ＸＩＯ”組み換えファージか構成
されていたことを示した。このライブラリーを、ＥＣ０
ＲＩＹ１０８８上にプレート化することによって増幅し
た（１５ｃｍ寒天プレート当たり１００．０００フアー
ジ）。ファージをラムダｄｉｌで溶離して集めた後、試
験プレート化は、増幅されたライブラリーか総計７．５
　Ｘ１０’２フアージを含存し、そのうちの９７％がｃ
ＤＮＡ挿入物を含有したことを示した。
Ｂ、抗凝固抽出物の精製 １、　ヘモンカス・コントルツス生体源ヘモンカス・コ
ントルツス成虫を、純粋な薬剤−感受性Ｕｎｉｔｅｄ　
５ｔａｔｅｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒｅ単離ＢＰＬＩで感染させた若年ラムから
回収した。虫不含ラムの反側胃内接種によって３５．０
００±３％鞘内感染性第３段階幼虫（ＳＬ３）の個々の
接種による実験的感染の約３５日後に、ドナーラムを安
楽死させた。壊死に際して直ちに、成体上を個々にしゅ
う胃から回収し、十分な数の虫か回収されるまで虫を燐
酸緩衝塩溶液中に置き、次いて液体窒素中で凍結した。
凍結した虫を液体窒素中でまたは一７０℃で保存した。
２、抗凝固抽出物の調製 ヘモンカス・コントルツス成体をホモジナイズしく１０
ｍＭ　ＭＯＰＳ、　１５０ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ７，０
）　、次いで２５％（ｗ／ｖ）’グリセロール、１ｍＭ
ジチオトレイトールおよびフェニルメタンスルホニルフ
ロリドを添加して最終濃度１ｍＭにした。低速遠心（１
０，０００ｒｐｍで２０分、ＪＡ−２０ローター中）後
、上溝中のタンパク質を、２０ｍＭビス−トリス−プロ
パンｐＨ７，０（ｗ／ｖ）グリセロール、１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ、　　１ｍＭジチオトレイトールの緩衝液を使用し
てセファロースＣＬ−４Ｂカラム上てサイズ−分別した
。フラクションを、以下に記載するアッセイを使用して
フィブリノーゲン−分解活性についてアッセイした。空
隙容量は、大部分の酵素活性を含有した。これらのフラ
クションをプールし、そしてＦＰＬＣＭｏｎｏ　Ｑカラ
ムに塗布した。
結合タンパク質を、２０ｍＭビス−トリス−プロパンｐ
Ｈ７，０、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、１ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ。
１ｍＭジチオトレイトール中（７）０．０５〜０，５Ｍ
　ＮａＣ１０）匂配で溶離し、そしてフラクションをフ
ィブリノーゲン−分解活性について試験した。活性フラ
クションを溶離してプールした。タンパク質濃度を、Ｂ
ｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏ
ｎｄ、　ＣＡ）から購入したタンパク質アッセイキット
を使用して測定した。
フィブリノーゲン減成アッセイは、５〜２０μｌの部分
のカラムフラクションを同容量のＭＢＳ、　１ｍＭＥＤ
ＴＡ、　１ｍＭジチオトレイトールに懸濁させた１％（
Ｗ／Ｖ）ウシフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ）の溶液と
混合し、サンプルを１時間３７°Ｃでインキュベートす
ることから構成された。次いで、サンプルをＳＯＳサン
プル緩衝液中に希釈し、５分間煮沸し、そして９％；５
ＩＩＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析した（Ｌａｅ
ｍｍｌｉ、　１９７０年）。コのゲルを、クマシーブル
ーで染色してフィブリノーゲンを分解したフラクション
を同定した。
Ｃ０ヘモンカス・コントルツスにおける抗凝固活性の同
定 ヘモンカス・コントルツス成虫を、冷ＭＢＳてよく洗浄
し、食料粒子を除去した。次いて、この虫を、虫１グラ
ム当たり（湿潤重量）１０ｍｔ’の冷抽出緩衝液を使用
してガラスホモジナイザー中でホモジナイズした。次い
で、抽出物を遠心することによって透明にした。次いで
、上清を、カゼイン寒天上のタンパク質分解活性につい
ておよびカゼイン寒天の阻害について試験した。クエン
酸塩添加ヒツジ血漿と混合した際、凝固時間の非常に少
ない増加が観察された。しかしなから、抽出物を凝固の
開始前に血漿と共に３７℃でインキュベートした際には
、凝固時間の劇的な増加が観察された。
この増加は、プロトロンビン時間および部分的トロンボ
プラスチン時間の両方に影響した。これは、抗凝固活性
か凝血の最終的共通経路で導かれたことを示唆した。ク
ロッティング反応を精製トロンビンの添加によって開始
すると、凝固時間はまた、ヘモンカス・コントルツス抽
出物とのインキュベーションの際に上昇した。これは、
抗凝固物質かサンプルにおけるフィブリノーゲンに作用
したことを示した。
この着想は、抽出物を精製ヒツジフィブリノーゲンとイ
ンキュベートすることによって確認された。精製フィブ
リノーゲンのＡ（アルファ）およびＢ（ベータ）の両サ
ブユニットは、抽出物により分解された。（ガンマ）サ
ブユニットは、抽出物により分解されないらしい。プラ
スミノーゲンアクティベーターストレプトキナーゼの存
在下にみられるフィブリノーゲンの分解は、ヘモンカス
・コントルツス抽出物とのインキュベーションによるの
とは異なるタンパク質分解フラグメントを導く。
抽出物における抗凝固物質かプラスミノーゲン活性化で
ない更なるインキュベーションは、フィブリノーゲン減
成かあるプラスミノーゲンインヒビターに感受性でない
ことである。インヒビターの結果は、後に詳細に考察さ
れる。抽出物はまた、ウェスタンプロット分析により示
されるように血漿におけるフィブリノーゲンの分解を引
き起こす。
抗凝固活性がフィブリノーゲン分解酵素として同定され
た後、更なる特性決定が望まれた。可能なブロテイナー
ゼインヒビターを、フィブリノーゲン分解活性に対する
その作用について試験した。
チオールブロテイナーゼのインヒビターだけか、阻害活
性において有効であった。これらのうち最も有効なもの
は、プロテイナーゼの活性部位チオールに特異的であり
、そしてその他の酵素の活性部位におけるチオールに対
して反応性でなくかつタンパク賃上に遊離ＳＨ基が存在
するＥ６４である。
チオールプロテアーゼの活性部位に対するＥ６４の特異
性は、放射線標識化に有利に用いられた。
［目Ｃ１−ヨード酢酸を使用してフィブリノ−ゲナーゼ
の部分的に精製された調製物に存在するチオールを標識
化した。酵素であるので、この試薬はチオールプロテア
ーゼに対して高度に選択的である。
Ｅ６４とのフィブリノ−ゲナーゼの予備インキュベーシ
ョンにより、活性部位チオールは標識されたＩＡＡとの
反応前にブロックすることかできる。これにより、反応
性チオールか事実ブロテイナーゼの活性部位にあること
を確認できる。この技術を部分的に精製されたプロテイ
ナーゼに適用すると、いくつかのバンドがＩＡＡで標識
化され、そしてＥ６４で特異的に保護される。この標識
パターンは、約３５ｋＤａにおける精製フィブリノーゲ
ンに存在する主要バンドを包含する。他のバンドもこれ
らの条件下に標識され、これらもまたチオールプロテア
ーゼに相当することを示唆する。これらは、フィブリノ
−ゲナーゼに関連し、あるいはこれらはおそらくフィブ
リノ−ゲナーゼで同時精製する別の活性によるのであろ
う。３５ｋＤａバンドの標識化は、これかフィブリノー
ゲン溶解性酵素の活性部位を含有することを示す。
フィブリノ−ゲナーゼは、ヘモンカス・コントルツス抽
出物からゲル濾過クロマトグラフィーおよびイオン交換
により精製されている。抽出物をセファ０−ス４Ｂカラ
ムに適用した。フラクションを、ゲル上で観察されるよ
うなフィブリノーゲン分解によって活性について監視し
た。最高の活性を有するフラクションをプールし、そし
てＭｏｎｏＱカラムに適用した。活性を、塩勾配により
溶離した。この二段階精製によってＳＤＳ電気泳動上の
２つの主要バンド並びにいくつのマイナーバンド（この
うちのいくつかはＩＡＡ標識化によってチオールブロテ
イナーゼとして同定されたペプチドに相当した）を含有
する調製物が得られた。この調製物をフィブリノ−ゲナ
ーゼの活性を保持しつつ更に精製するのは可能でなかっ
た。
このフィブリノ−ゲナーゼは、カラムの空隙容量で溶離
する、Ｓ１２サイジングカラム上のゲル濾過クロマトグ
ラフィーによる１、　０００．０００以上の天然型ＭＮ
を有するとして特性決定されている。標準タンパク質は
、空隙容量に相当するＭＷが１００万のオーダーである
ことを示した。また、活性は、いっそう高いカットオフ
を有する４Ｂカラムの空隙容量において溶離する。
抗体は、ウサギにおいて抗凝固物質高められている。こ
の抗体を使用してヘモンカス・コントルツス抽出物並び
に精製されたフラクションのエラスタンプロットを精査
した。この抗体は、３５および５５ｋＤａバンドと特異
的に反応した。この抗体を更に使用して酵素の活性を阻
害した。これは、フィブリノーゲンとのインキュベーシ
ョンに先立って抗体調製物を抗凝固物質とインキュベー
トすることによって達成された。この抗体の阻害力を更
に試験して、高免疫ウサギからの血漿および対照血漿の
クロッティング時間を研究した。この実験は、高免疫血
漿における抗凝固物質の有効性の実質的低下を示した。
Ｄ、抗凝固タンパク質および個々の３５ｋＤａおよび５
５ｋＤａタンパク質に対するウサギ抗血清の調製 １、抗凝固抽出物に対するウサギ抗血清の調製Ｍｏｎｏ
−Ｑカラムからの部分的精製抗凝固原料を、Ｆｒｅｕｎ
ｄ完全アジュバントで乳化し、そしてウサギ＃９５０３
の背中に沿っていくつかの部位で皮下接種した。−箇月
後、このウサギを、Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジュバントで
乳化された付加的タンパク質で追加免疫した。このウサ
ギをほぼ一箇月間隔で追加免疫した。各追加免疫２週間
後、このウサギから採血し、血液を一晩４°Ｃてクロッ
トした後に血清か得られた。
２、　３５　ｋＤａおよび５５ｋＤａタンパク質に対す
るウサギ抗血清の調製 セファロースＣＬ−４Ｂサイジングカラムの空隙容量か
ら得られた部分的に精製された抗凝固物質を、ＳＯＳサ
ンプル緩衝液中に希釈し、１２％調製ＳＤＳゲルゲル（
厚さ０．７５ｍｍ）上で電気泳動し、１５分間水中の０
．１％クマシーブルーで染色してタンパク質バンドを局
在化した。３５ｋＤａおよび５５ｋＤａタンパク質を含
有するゲルスライスを、剃刀で切断し、賽の目切りし、
そしてタンパク質を、ｌ５ｃｏ　Ｉｎｃ、から購入した
溶離装置を使用してゲルから溶離した。
操作緩衝液中の溶離したタンパク質を、−２０℃で保存
した。
溶離緩衝液２８０μ！中の溶離した３５ｋＤａタンパク
質４０マイクログラムを、ＰＢＳ２００μｌと混合し、
Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュバント５００μｌで乳化した。
こノ混合物を、つｆキ＃１０２８５（Ｒｂ−１０２８５
）（７）背中に沿っていくつかの部位で皮下接種した。
約−箇月後、このウサギを、Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジュ
バント５００μｌで乳化されたタンパク質更に４０μｇ
で追加免疫した。最後の追加免疫の２週間後、このウサ
ギを殺し、そして採血した。このウサギを３週間後に２
回目の高揚した。−晩４℃でクロットした後、血液を遠
心し、そして血清を回収し、小部分に分け、そして使用
まで一２０℃で保存した。
−回の接種当たり溶離した５５ｋＤａタンパク質５０μ
ｌを使用した以外は同じ方法で、５５ｋＤａタンパク質
に対するウサギ抗血清を調製した。これらのウサギ抗血
清を、Ｒｂ−１０２８４およびＲｈ−１０２８６と命名
する。
Ｅ、　３５　ｋＤａシスティンプロテアーゼをコードす
るｃＤＮＡおよび遺伝子のクローニング １、　ＡＣ−１のクローニング ３５　ｋＤａプロテアーゼをコードするｃＤＮＡを、成
虫ｃＤＮＡ　：λｇｔｌｌライブラリーをＲｂ−１０２
８５抗血清てスクリーニングすることにより単離した。
成体ｃＤＮＡ：λｇｔｌ１発現ライブラリーを１５ｃｍ
寒天プレート１個につき２０．０００フアージの密度で
Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０に塗布した（Ｙｏｕｎｇおよ
びＤａｖｉｓ、　　１９８３）。プレートを４２℃で４
時間インキュベーションし、次いで１０ｍＭＩＰＴＧで
湿潤して空気乾燥したニトロセルロースフィルターで被
覆した。フィルター付きのこのプレートを３７℃で１夜
インキユベートした。翌日、プレートを４°Ｃに６０分
間冷却し、ニトロセルロースフィルターを静かに取り出
し、ＴＢＳ　（５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、　ｐＨ８，
１５０ｍＭ、　ＮａＣ１）中て３×１５分間バッチ洗浄
した。フィルターをＴＢＳ＋２％ＢＳＡ　（ウシ血清ア
ルブミン）中で６０分間、次いでＴＢＳ＋　２％ＢＳＡ
中にＩ　：　２００に希釈されたｌ？ｂ−１０２８５と
共に室温で穏やかに揺動しなから２時間インキュベート
した。インキュベーションは液体２０−を含有する１５
ａｎペトリ皿中で行った。１皿につき２枚の裏と裏を合
わせたフィルターをインキュベートした。
次いでフィルターをＴＢＳ＋　０．５％ＮＰ−４０中で
３×１５分間洗浄し、ＴＢＳ＋２％ＢＳＡ中に１　：　
５００に希釈されたホースラデイツシュパーオキシダー
ゼ接合ヤギ抗つサギｒｇＧ抗血清（Ｃａｐｐｅｌｌ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有する１５ａｎペトリ皿
中で６０分間インキュベートした。ＴＢＳ中で３×１５
分間洗浄したのち、フィルターを染色液（２００ｍ／　
ＴＢＳ＋　２．５　ｍｌ　Ｈ２０□＋４−クロロ−１−
ナフトール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏｒｐ、
）３■／−を含有するメタノール４０−）中に入れた。
８０、０００フアージのスクリーニングにより４つの陽
性ファージが生じた。陽性ファージを含有する寒天プラ
グをラムダｄｉｌ中に採り、再プレート化し、プラーク
純粋になるまで前記のようにして抗体により数回ファー
ジを再スクリーニングした。
プラーク純粋なファージを集密になるまで増殖させたＥ
、ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０に塗布し、ラムダｄｉｌで被覆
して液状溶解物ストックを生成した。
ポリクローナルウサギ血清からのそれらの発現された抗
原と反応する抗体のアフィニティー精製のためにこれら
の組換えファージクローンを用いた（「抗体溶出実験Ｊ
）。次いで溶出された抗体を、虫タンパク質のウェスタ
ンプロットをプローブするために用いて各ファージクロ
ーン中のｃＤＮＡに対応する標的抗原を同定した。Ｅ、
ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０を用いて直径１５ｃｍの寒天プレ
ート１個につきｌＸｌ０’の密度てファージを塗布し、
４２℃で４時間インキュベートした。１０ｍＭ　ＩＰＴ
Ｇで含浸して空気乾燥したニトロセルロースフィルター
をファージの上に置き、プレートを３７°Ｃで一夜イン
キユベートした。
冷却後、フィルターを取り出し、７０　Ｘ　１００ｍｍ
のストリップに切断し、ＴＢＳ＋２％ＢＳＡと共に１時
間インキュベートし、ＴＢＳ＋２％ＢＳＡ中にｌ　：　
２００に希釈されたＲｈ−１０２８５血清と共に一夜イ
ンキユベートシた。
翌日、フィルターストリップをＴＢＳ＋０．１％（ｖ／
ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ２Ｏで３×１５分間洗浄した。
３００μｌの５ｍＭグリシン１５００ｍＭ　ＮａＣ１／
　０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０／１００ｇ　ｍｌ−’　Ｂ
ＳＡ、　ｐＨ２，３でストリップを３回洗浄することに
より結合した抗体を溶出した。溶出された抗体を１／１
２容量のＩＭ　トリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，４で中和し
、ＴＢＳ＋　２％ＢＳＡて約３倍に希釈し、そして全成
虫タンパク質またはＦＰＬＣＭｏｎｏ　Ｑ−カラムて精
製した抗凝固タンパク質（１２％ＳＤＳゲルで分離）の
ウェスタンプロットから切断されたニトロセルロースス
トリップと共に一夜インキユベートした。
続く洗浄、二次抗体のインキュベーションおよび４−ク
ロロ−１−ナフトールおよび過酸化水素での染色を標準
的操作法により行った。
これらの抗体溶出実験により、ファージ２Ｂだけか成虫
抽出物のウェスタンプロット上でおよびＭｏｎｏ　Ｑ−
カラムで精製した抗凝固抽出物中で３５ｋＤａタンパク
質と特異的に反応した抗体を選択したことが明らかにさ
れた（第１３図）。ファージ２Ｂにより選択された抗体
はＭｏｎｏ　Ｑ−カラムで精製した抗凝固調製物中の３
７　ｋＤａタンパク質とも一貫して弱く反応した（第１
３図）。以下で示唆されるように、この３７　ｋＤａタ
ンパク質は３５　ｋＤａタンパク質のより高度にグリコ
ジル化された形であるかもしれない。
宿主としてＥ、ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０を用いるプレート
溶解物法（Ｄａｖｉｓら、１９８０）により、ファージ
２ＢからのＤＮＡを調製した（３Ｘ１０’フアージを遠
心分離して１５ａｎ寒天プレ一ト１個につき各容量の１
０ｍＭＭｇ５Ｏａ中に再懸濁させたＹ１０９０の一夜培
養物０．７−と混合した）。ＣｓＣｌステップおよび確
立された方法（Ｄａｖｉｓら、１９８０）を用いる平衡
勾配に結合してファージ粒子を精製した。ホルムアミド
抽出およびエタノール沈澱によりファージＤＮＡを単離
した（Ｄａｖｉｓら、１９８０）　、ファージＤＮＡを
ＴＥ緩衝液中に再懸濁した。
ファージ２Ｂ　ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化することによ
り、これが約１８０ｂｐのｃＤＮＡ挿入物を含有するこ
とか明らかにされた。このｃＤＮＡのヌクレオチド配列
を、Ｍ１３ｍｐ１８のＥｃｏＲ１部位中へのサブクロー
ニング後にジデオキシヌクレオチド配列決定法（Ｓａｎ
ｇｅｒら、１９７７；　Ｂｉｇｇｅｎら、１９８３）に
より決定した。このｃＤＮＡのヌクレオチド配列から、
これかβ−ガラクトシダーゼに融合した１２アミノ酸だ
けをコードし；　ｃＤＮＡの残りが３°非非翻訳列およ
びポリ（Ａ）テイルを構成することが明らかになった。
この３°非翻訳領域は規範的なポリ（Ａ）付加配列ＡＡ
ＴＡＡＡを含育していた。
ｃＤＮＡ　２Ｂをニック−翻訳により２２ｐで標識し、
より大きいｅＤＮＡを同定するためにブラークツ１イブ
リダイゼーシヨンによるｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングするのに用いた。かかる最初のスクリーニング
はｃＤＮＡ　３−１を生成し、これは約８７０ｂｐの長
さであった。ｃＤＮＡ　３−１の５′末端における配列
に相当する４０ヌクレオチド長さのすリボマーを合成し
、末端を３！Ｐで標識し、さらに大きいｃＤＮＡについ
てのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用
いた。２通りのフィルターを［ｐ−標識ｃＤＮＡ　２Ｂ
でスクリーニングした。下記の配列 ５’　−ＣＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＧＧＧＡＴＣＴＴＣ
ＴＴＴＧＡＣＣＡＴＡＡＧＡＴＴＴＡＧＣ−３’を有す
るオリゴヌクレオチドをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓＤＮＡ合成機を用いて合成した。標識オリゴマ
ーを、２　Ｘ　ＳＳＣ／　５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ／
　０．５％ドデシル硫酸ナトリウムを用いて３２−５２
℃でニトロセルロースフィルターにハイブリダイズさせ
た。フィルターを２ＸＳＳＣ１５℃ドデシル硫酸ナトリ
ウムで５２℃で洗浄した。このスクリーニングはｃＤＮ
Ａ　Ｆ−１，０−１およびＴ−１を生成し、これらのす
べてはオリゴマーおよびｃＤＮＡ　２Ｂにハイブリダイ
ズした。ｃＤＮＡＦ−１は最も大きく約１１００ｂｐで
、さらに特性決定するために選ばれた。
ｃＤＮＡ　２Ｂ、　３−１およびＦ−１の関係をｃＤＮ
Ａの合成制限マツプと共に第１４図に示す。ＣＤＮＡの
種々の領域を配列決定し、そして配列か重複する領域か
一致することが見出された。認められた１つの相違は、
ｃＤＮＡ　３−１およびＦ−１の３′翻訳領域かｃＤＮ
Ａ　２Ｂのそれよりも短いことであった（第１５図）。
ＣＤＮＡの合成ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配
列を第１５図に示す。この遺伝子はＡＣ−１と命名され
た。
最大のｃＤＮＡであるＦ−１は１個の長いオーブン読み
枠を含有していたが、その５°末端にイニシエーターメ
チオニンコドンか欠けており；それ故に本発明者らはこ
のｃＤＮＡが完全な長さでないと推定した。ノーザンブ
ロットハイプリダイゼーション（ＩＦ（Ｇ）（１）節参
照）は、ｃＤＮＡ　Ｆ−１が成体虫ポリ（Ａ）２ｍＲＮ
Ａ調製物中で１．２５ｋｂ　トランスクリプトにハイブ
リダイズしたことを示した。成体ポリ（Ａ）”ｍＲＮＡ
およびｃＤＮＡ　３−１の５°末端からの４０ヌクレオ
チド長のオリゴマーを用いたブライマー拡張実験は、ｃ
ＤＮＡ　Ｆ−１がその５′末端において完全長よりも約
ｌＯヌクレオチド短いことを示した。ヘモンカス・コン
トルツスから単離されたＡＣ−１遺伝子：λＥＭＢＬ−
３ライブラリーのヌクレオチド配列分析（ＩＩ（Ｅ）（
３）節参照）によりこの結果が確認され、ｃＤＮＡ　Ｆ
−１はただ１個のアミノ酸、イニシエーターメチオニン
用のコドンを欠いていることが示された。完全にするた
めに、第１５図に示す配列にはイニシエーターメチオニ
ンが含められている。
ＡＣ−１タンパク質は３４２アミノ酸から構成され、３
８．４　ｋＤａの推定分子量を有する。このタンパク質
のＮ−末端においては約１５の疎水性アミノ酸が伸びて
おり、これは粗大な細胞質網状構造にこのタンパク質を
隔離するためのシグナル配列として、細胞外分泌または
細胞小器官への局在化の前座として機能することができ
た。コンピューター分析により、このシグナル配列はア
ミノ酸１８と１９（Ａｌａ−Ａｓｐ）との間で開裂され
るものと予想される。このタンパク質には他の有意な疎
水性領域は存在しない。
ＡＣ−１タンパク質は１６システイン残基を含有し、そ
のうち２つは推定シグナル配列中に存在し、成熟タンパ
ク質中には存在しないであろう。このタンパク質は４個
の可能性のあるＮ一連結グリコシル化配列（Ａｓｎ−Ｘ
−３ｅｒ／Ｔｈｒ、ここにＸは任意のアミノ基であって
よい）をも含有し、これらを第１５図に示す。精製抗凝
固タンパク質をエンドグリコシダーゼＦで処理すると、
ＡＣ−１タンパク質の見掛けの分子量が３３　ｋＤａに
減少しく第１８図）、これはこのタンパク質がインビボ
でグリコジル化されることを示す。酵素は供給者（Ｇｅ
ｎｚｙｍｅ）により提供された方法に従って使用した。
Ｒｂ−１０２８５抗血清を用いるウェスタンプロット分
析により、脱グリコジル化タンパク質は通常若干より小
さくより明るいバンドの上に暗色バンドとして現われ、
これはタンパク質の脱グリコジル化形における少ない異
質性を示唆した。第１８図において明確に見えないが、
Ｒｈ−１０２８５抗血清も弱くおよびファージ２Ｂによ
り選択された溶出抗体（上記参照）と弱く反応する３７
　ｋＤａタンパク質は消失しており、おそらくエンドグ
リコシダーゼＦ処理後に３３　ｋＤａへの移動性も変化
しており、このことはそれかＡＣ−１のより高度にグリ
コジル化された翻訳であるかもしれないことを示唆して
いる。
Ｅ、ｃｏｌｉ中で合成された組換えＡＣ−１タンパク質
に対して調製された抗血清もこの３７　ｋＤａタンパク
質と反応する（第２６図）。
ＡＣ−１の一次配列を他の既知のチオールプロテアーゼ
の配列と比較した。これらの分析により、ＡＣ−１が哺
乳類カテブシンＢ（ヒト、ラットおよびマウス）と、そ
してより少ない程度で他のカテプシンと、そして植物プ
ロテアーゼパパインと有意な相同性を示すことが明らか
にされた（Ｃｈａｎら、１９８６；　Ｃｏｈｅｎ　ら、
１９８６；　Ｗａｄａら、１９８７）　、　ＡＣ−１は
全体で４２％のアミノ酸がヒト力テブシンＢと一致して
共通である。カテブシンＢ活性部位システィンを包含す
る６個の一致するアミノ酸の延長かＡＣ−１中に存在す
る（第１９図）。この配列はパパイン中ても保存されて
おり（第１９図）、３つのすへてのプロテアーゼにおけ
る同じ相対的位置に存在する。
これらの相同性に基づいて、本発明者らはシスティン−
１１４かＡＣ−１プロテアーゼの活性部位プロテアーゼ
であると予想する。ＡＣ−１は、このタンパク質に２つ
の単一アミノ酸ギャップを導入することにより成熟力テ
プシンＢとの相同関係のために整列させることかできる
（第１７図）。これらの小さい整列を導入すると、成熟
カテプシンＢタンパク質中の全１４システインはＡＣ−
１中のシスティン残基と整列し、これはＡＣ−１および
カテブシンＢか同様の第三級構造を有することを示唆し
ている。さらに、タンパク質のＣ−末端に向かってＡＣ
−１中にヒスチジン残基（残基＃　２８５）があり、こ
れはカテプシンＢの活性部位の一部を形成するヒスチジ
ン残基（＃２７８）と同じ位置にある。これらのヒスチ
ジン残基を直接に包囲するこれらのアミノ酸は、活性部
位システィン残基を包囲するものと同様には保存されて
いない（第１７図）。
Ｎ−末端シグナル配列を含有するプレープロ酵素として
カテブシンＢを合成し、次いで６２アミノ酸を延長させ
、これらのアミノ酸はプロ酵素により開裂されて活性な
成熟ブｄテアーゼを生成しなければならない。「プロＪ
領域はまた、カテブシンＢをリソシームに局在させる際
に伴われてもよい。
カテブシンＢの前記のアミノ酸開裂の位置は第１７図に
おいてマークが付されている。ＡＣ−１とカテブシンＢ
との間で一致するほとんどすべてのアミノ酸は、活性な
成熟酵素を構成するカテブシンＢの領域内に位置してい
る（第１７図）。長さ以外に、カテブシンＢおよびＡＣ
−１の「ブレ」配列と「プロ」配列との間には類似性は
ほとんどない。カテプシンＢの成熟形をＡＣ−１の対応
する領域と比較すると、両者のプロテアーゼ間のアミノ
酸類似性は４９％に増大する。
２、　ＡＣ−３およびＡＣ−４のクローニングＩＦ（Ｅ
）（１）節に記載された操作用をわずかに変更して用い
て成虫ｃＤＮＡ　：λｇｔｌｌをスクリーニングするの
にＲｈ−９５０３を用いた。このスクリーニングはｃＤ
ＮＡ　２−１．６−１および７−２を生成した。ｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列分析により、それらか互いに重複
しており、関連するかＡＣ−１から区別されるタンパク
質をコードすることが明らかにされた。長さか約２００
ｂｐである最長のｃＤＮＡである２−１をアガロースゲ
ルから溶出し、ランダムプライマーを用いて２２ｐで標
識し、プラークハイブリダイゼーションによる成虫ｃＤ
ＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。いくつか
の陽性ファージを同定し、プラーク精製した。純粋なフ
ァージからＤＮＡを調製し、ｃＤＮＡ挿入物をＭ１３フ
ァージベクター中にクローニングし、そのヌクレオチド
配列を決定した。
これらの研究によりｃＤＮＡ　Ｖ−２４が同定された。
これはｃＤＮＡ　２−１のより長い翻訳ならびに密接に
関連するｃＤＮＡのｖ−２２である。Ｖ２４およびＶ２
２はそれらが重複する領域において一致する９４％のア
ミノ酸配列が共通である。ｃＤＮＡ　Ｖ−２２およびＶ
−２４のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を第
２９図および第２８図に示す。ｃＤＮＡ　Ｖ−２４およ
び■−２２により同定されたこれらの遺伝子はそれぞれ
ＡＣ−３およびＡＣ−４として示される。これらのｃＤ
ＮＡの配列から推定されるタンパク質はＡＣ−１および
ＡＣ−２と一致する約７０％のアミノ酸配列か共通であ
る。■−２２およびｖ−２４の両者は不完全なｃＤＮＡ
である。より長いｃＤＮＡはｃＤＮＡの５′末端から誘
導される″′Ｐ−標識才リゴヌすレ才チド（またはｃＤ
ＮＡ配列の他の任意の領域）を用いて成体ｃＤＮＡ発現
ライブラリーをスクリーニングすることにより単離する
ことができる。完全な遺伝子配列は遺伝子ＤＮＡライブ
ラリーから遺伝子を単離し、ｃＤＮＡを欠いたＤＮＡの
領域を同定し、この領域を配列決定することによっても
得ることができる。
３、　ＡＣ−２のクローニング 遺伝子をコードするＡＣ−２をヘモンカス・コントルツ
スλＥＭＢＬ−３ファージライブラリーからこのライブ
ラリーを３２Ｐ−標識ｃＤＮＡ　２Ｂでスクリーニング
することにより単離した。ｃＤＮＡを１．５％アガロー
スゲルからＮＡ４５ペーパー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒお
よび５ｃｈｕｅｌｌ）を用いて単離した。ｃＤＮＡ挿入
物をＴ４リガーゼにより１５°Ｃで一夜自己連結させ、
エタノール沈澱し、２２ｐでニック−翻訳した。この標
識ｃＤＮＡヲハイプリダイセーションプローブとして用
いてＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ＤＮＡ　：　ＥＭＢＬ−３
ライブラリーをスクリーニングした。このライブラリー
をＥ、ｃｏｌｉ　ＬＥ３９２に１０ｃｍプレート１個に
つき５×１０３フアージの密度で塗布し、プラークハイ
ブリダイゼーシヨンによりスクリーニングした（Ｂｅｎ
ｔｏｎおよびＤａｖｉｄｓ。
１９７７）。用いたハイブリダイゼーション条件は５０
％ホルムアミド、Ｏ，１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７，０
゜ｏ、　ｉ％ＳＤＳ、　ｌｏμｇ／ｒｎｌ共通サケ精子
ＤＮＡ、３×５ＥＴ（Ｉ　Ｘ　ＳＥＴは５０ｍＭ　）リ
ス−ＨＣ１，１）Ｈ８，０，１５０ｍＭＮａＣＩ，１ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡである）、３７°Ｃであった。１００．０
００組み換えＥＭＢＬ−３フアージのスクリーニングに
より、λＭＢＩおよびλＭＢ２と称する２つの陽性ファ
ージか生成した。これらのファージを標識２ＢｃＤＮＡ
への反復ハイプリダイゼーショによりプラーク精製した
。宿主としてＥ、ｃｏｌｉ　ＬＥ　３９２を用いてＣｓ
Ｃ１勾配に結合することによりプレート溶解物からファ
ージを調製した。
ファージＤＮＡを制限酵素でマツピングすることにより
、ファージのＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入物
が重複することか示された。この遺伝子のコード領域を
制限酵素消化物のサザンプロットを３２ｐ−標識２Ｂｃ
ＤＮＡてハイブリダイゼーションすることにより局在化
させた。ハイブリダイジング領域およびこの領域の上流
の制限フラグメントを、第２０図に示す方法を用いて配
列決定した。適切な制限フラグメントをＭ１３ファージ
ベクター中にサブクローニングし、ヌクレオチド配列を
［３５Ｓｌ−標識ヌクレオチドを用いるために変更した
ジデオキシ連鎖停止法により決定した。この遺伝子のヌ
クレオチド配列をほぼ完全長のＡＣ−１ｃＤＮＡ　Ｆ−
１のそれと比較することにより（第２１図）、この遺伝
子は複数のイントロンを含有することか明らかにされた
。
この比較はまた、この遺伝子とｃＤＮＡとの間にいくつ
かの相違があることをも明らかにした。大イントロンに
は、ｃＤＮＡの５”末端に対応する遺伝子の領域により
同定しようと試みたときに遭遇した。失われたエクソン
（１個または数個）を配置するために、λＭＢＩおよび
λＭＢ２のサザンプロットをｃＤＮＡの失われた領域に
配列か対応する″′Ｐ−標識４０ｎｔオリゴマーで探測
した。下記の配列 ５’　−ＣＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＧＧＧＡＴＣＴＴＣ
ＴＴＴＧＡＣＣＡＴＡＡＧＡＴＴＴＡＧＣ−３’を有す
るオリゴマーをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
　ＤＮＡ合成機で合成した。このオリゴマーをポリヌク
レオチドキナーゼを用いて（γ−３２Ｐ）−ＡＴＰで末
端標識し、２　ｘ　ＳＳＣ／１５ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ
／　０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（２０Ｘ　ＳＳＣ
＝　３　Ｍ　ＮａＣ１／　０．３　Ｍクエン酸ナトリウ
ム、ｐｌ（７，ｏ）を用いて４２°Ｃてニトロセルロー
スフィルターにハイブリダイゼーションした。フィルタ
ーをＤｅｎｈａｒｄｔを抜いた同じ溶液を用いて４５〜
５５℃で洗浄した。このオリゴマーはより高い洗浄温度
で特異的なハイブリダイゼーションシグナルを与えた。
（本質以下余白） これらのハイブリット形成は、一つ以上の失われたエキ
ソンがλＭＢＩもしくは２中に存在しないことを示した
。それ故、本発明者らは、λＭＢＩおよび２中に存在す
る領域の上流に更に伸びるヘモンカスＤＮＡインサート
を含むファージを同定するためにλＥＭＢＬ−３ライブ
ラリーを再スクリーニングした（“染色体ウオーキング
技術）。λＥＭＢＬ−３ライブラリーを、λＭＢ２の左
側末端（３，９ｋｂ　ＥｏＲＩフラグメント）および中
央部（３，５ｋｂ　ＥｏＲＩフラグメント）からの３２
Ｐでラベルした制限フラグメントで重複してスクリーニ
ングした（第２０図を参照のこと）。制限フラグメント
をＮＡ４５紙を用いてアガロースゲルから溶離し、−夜
自己連結し、エタノールで沈澱させ、水中で再懸濁し、
ニックトランスレーションにより２２ｐでラベルした。
３．９ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントのみとハイブリッ
ド形成したこれらのファージを同定し、プラーク精製し
た。４０ｎｔオリゴマーによるファージＤＮＡのハイブ
リッド形成は、それらの夫々が一つ以上の失われたエキ
ソンを含むことを明らかにした。ファージの−っである
λＭＢ３を、制限酵素で遺伝地図作成し、予想されるよ
うに、λＭＢＩおよび２と重複することを示した。（第
２０図を参照のこと）。４０ｎｔオリゴマーにハイブリ
ッド形成したλＭＢ３の領域、およびそれの直ぐ上流の
領域を、第２０図に略記されたように配列決定し、ｃＤ
ＮＡ３−１およびＦ−１の失われた領域に関する配列を
含むことかわかった。ｃＤＮＡＦ−１はイニシエーター
メチオニンコドンを含まない。遺伝子はｃＤＮＡＦ−１
が終止する部位の上流のメチオニンの三つのアミノ酸を
暗号化する。このメチオニンコドンの直ぐ上流にはイン
フレームＴＧＡ停止コドンがある。このメチオニンコド
ンは遺伝子のためのイニシエーターメチオニンコドンで
あることが可能であるか、本発明者らはそう考えない。
このメチオニンコドンとｃＤＮＡＦ−１が終止する部位
との間に配列ＴＴＴＣＡＧ／Ａがあり、これは共通３′
イントロンアクセプタ一スプライス配列である。スラッ
シュはスプライシングが起こる場所を示す。この配列が
スプライスアクセプター配列として機能する場合には、
上記のメチオニンコドンはイントロン中に存在し、成熟
ｍＲＮＡ中に存在し得ない。上流領域を、その他の潜在
的なイニシエーターメチオニンコドンに関して調べた。
推定上の３′アクセプタ一配列の約８０ｂｐ上流には、
配列ＡＴＧ／ＧＴＡＡかあり、これは共通イントロン５
′スプライスドナ一配列と適合する。スプライシングは
このＡＴＧメチオニンコドンインフレームをエキソン２
および遺伝子の残部と結合する。このメチオニンの１８
ｂｐ上流には、インフレームＴＧＡ終止コドンがある。
それ故、本発明者らはこのＴＧＡが遺伝子に関する実際
のイニシエーターメチオニンであると考えられる。３−
１−４０オリゴマーおよび成虫から単離されたポリ（Ａ
）　”ｍＲＮＡを用いるブライマー延長実験は、ｃＤＮ
ＡＦ−１か完全な長さよりも約１０ｂｐ短いことを示し
た。（節ＩＦ　（Ｅ）（１）を参照のこと）。この分析
が正しいとすれば、ｃＤＮＡＦ−１はイニシエーターＡ
ＴＧコドンのＡＴおよび５′非翻訳配列の約８個のヌク
レオチドを失っている。
小さいイントロン配列を含む遺伝子のヌクレオチド配列
が第２１図に示されている。その遺伝子はＡＣ−１ｃＤ
ＮＡＦ−１と９７％のヌクレオチド同一性を有しており
、このｃＤＮＡＦ−１に対し遺伝子が第２１図で比較さ
れている。ヌクレオチド相違の殆どは、遺伝子（ｃＤＮ
Ａ）の推定される３′非翻訳領域中、並びにアミノ酸を
変化しない第三塩基コドンゆらぎの位置で生じる。７個
のヌクレオチドの変化は、異なるアミノ酸をもたらす。
全般に、遺伝子およびＦ−１ｃＤＮＡは９８％のタンパ
ク質配列の同一性を有する。この時点て本発明者らは、
その遺伝子がＡＣ−１ｃＤＮＡを暗号化する遺伝子と区
別されるか否かについて、またはヌクレオチド（タンパ
ク質）の相違かｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリ
ーを構成するのに使用されるＨ、コントルラス昆虫集団
中の単一遺伝子中の多形性によるものであるか否かにつ
いて不明である。本発明者らは、成虫ｃＤＮＡライブラ
リーから遺伝子として同一のヌクレオチド配列を存する
部分ｃＤＮＡ　（長さ３５０ｂｐ）を単離したところ、
その遺伝子は形質発現されていることか明らかである。
（データは示されていない）。プロテアーゼが多重遺伝
子族により暗号化されることか明らかであるという事実
（以下を参照のこと）か、この問題を複雑にしている。
こらの不明確なことのため、本発明者らは、ｃＤＮＡ２
Ｂ、３−１およびＦ−１により同定ささたＡＣ−１遺伝
子からそれを区別するために遺伝子ＡＣ−２と命名した
（節ＩＩ　（Ｅ）（１）を参照のこと）。
第２０図および第２１図に示されるように、ＡＣ−２遺
伝子は５７ｂｐ〜５．２ｋｂの大きさの範囲である１１
のイントロンを含む。提案されたイニシエーターメチオ
ニンの約４０ｂｐ上流には、真核のＴＡＴＡプロモータ
ー要素に類似する配列かある。本発明者らは、この配列
がＡＣ−２遺伝子のためのプロモーターとして機構する
ことを未だ確かめていない。ＴＧＡ停止コドンの下流に
は、正規のＡＡＴＡＡＡポリ（Ａ）付加配列がある。こ
れらの配列は、第２１図に下線を施されている。
ＡＣ−１プロテアーゼの活性部位は、カテプシンＢおよ
びパパインの活性部位配列との相同性により暫定的に固
定されていた。ＡＣ−１プロテアーゼ、カテブシンＢお
よびパパインは、これらのその他のプロテアーゼの活性
部位システィンを含む同一の６個のアミノ酸配列を有す
る。また、これらの６個のアミノ酸（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−
３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｒｌ）−Ａｌａ；下線を施されたＣ
ｙｓはパパインおよびカテブシンＢの活性部位システィ
ンである）は、予想されるＡＣ−２プロテイン中に保存
される（第２１図に印を付けられる）。イントロンクは
、この保存された領域をＧｌｙとＳｅｔとの間で中断し
、保存された活性部位配列が単一エキソン単位として発
展しなかったことを示す。その他の束縛状態（ｃｏｎｓ
ｔｒａｉｎｔ）は、ポリペプチド鎖中のこの配列の保存
を維持するように作用する必要かある。前記の如く、Ａ
Ｃ−１は、４個の潜在的なＮ一連鎖グリコシル化部位（
Ａｓｎ−Ｘ−３ｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘは如何なるアミ
ノ酸であってもよい））を有する。
全ての４個の潜在的なグリコジル化部位は、ＡＣ−２中
に保存され、第２１図に印を付けられている。
Ｆ、　ＡＣプロテアーゼはＨ，コンドルラス中に多重遺
伝子族を含む。
ＡＣ−１，ＡＣ−２、ＡＣ−３およびＡＣ−４のヌクレ
オチドは配列相違のため、Ｈ，コントルラスゲノム中に
存在する遺伝子のコピー数を測定することが重要であっ
た。低い緊縮制御下のＨ，コ゛ントルツスゲノムＤＮＡ
のサザンプロットハイブリッド形成は、幾つかの制限酵
素との多重ハイブリッド形成帯を明らかにした（第２２
図を参照のこと）。
Ｈ，コントルラスゲノムＤＮＡ（２〜３μｇ）を制限酵
素で消化し、アガロースゲルでサイズ分別し、ニトロセ
ロルースフイルター上でプロットした。
フィルターを５０％ホルムアミド１０．１Ｍリン酸ナト
リウム、ｐＨ７，４１０，１％ドデシル硫酸ナトリウム
／１０μｇ／−のサケ精子ＤＮＡ／３　ｘ　５ＥＴ（ｌ
　ｘ　５ＥＴ＝０、１５Ｍ　ＮａＣ１１０，０５Ｍ　Ｎ
ａＣ１１０，０５Ｍ　トリス／１ｍＭ　ＥＤＴＡ：２０
Ｘ原液のｐＨをｐＨ７，９に調節した）の溶液中で３０
℃でハイブリッド形成し、０．　Ｉ　Ｘ　５ＥＴ１０．
１％ドデシル硫酸ナトリウム中で３９℃で洗浄した。
ＤＮＡサイズ標準物質、即ちＨｊｎｄｌｌｌで消化され
たλフアージＤＮＡおよびＨａｅｍで消化されたφＸ１
７４ＤＮＡを、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリイズ（
Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）から購入した。これらのハイブリッド形成
に使用したラベルしたプローブはＡＣ−１ｃＤＮＡ２Ｂ
であった。これはλＭＢＩ中の単一の１．Ｏｋｂ　Ｅｃ
ｏＲＩフラグメント（このフラグメントは第２０図に印
をつけられている）にハイブリッド形成する。ＣＤＮＡ
２Ｂにハイブリッド形成し、おそらくλＭＢＩ中の１．
　Ｏｋｂ帯に相当するｌｋｂゲソムＤＮＡフラグメント
かある（第２２図を参照のこと）。Ｈ，コントルラスＤ
ＮＡのＥｃｏＲＩ消化物中に検出された４つのその他の
ハイブリッド形成帯は、プロテアーゼの追加された遺伝
子コピーから誘導する必要がある。２ＢｃＤＮＡプロー
ブにより検出された多重ハイブリッド形成帯は、トロポ
ミオシン遺伝子プローブにより検出された単一のハイブ
リッド形成帯と接触している（データは示されていない
）。これらのデータはＨ、コントルラスゲノム中にＡＣ
ブロテアーゼに関する遺伝子の多重コピーかあることを
示す。この結果は４つの異なった遺伝子配列（ＡＣ−１
，ＡＣ−２，ＡＣ−３およびＡＣ−４）か３５ｋＤａプ
ロテアーゼを暗号化するという知見と一致する。
その遺伝子族のその他の員は、上記のハイブリッド形成
条件を用いるＤＮＡ交差ハイブリッド形成により単離し
得る。λｇｔｌｌｃＤＮＡライブラリーまたはλＥＭＢ
Ｌ−３ライブラリーが、プラークハイブリッド形成によ
りスクリーニングし得る。その他の放置より暗号化され
るタンパク質は、関連するが、必ずしも同一ではないＤ
ＮＡおよび予想されるアミノ酸配列を有する。
Ｇ、ＡＣプロテアーゼｍＲＮＡおよびＡＣタンパク質の
発育形質発現 １、Ａｃプロテアーゼの発育形質発現 ＡＣ−１ｃＤＮＡＦ−１（節ＩＩ　（ＥＸＩ）を参照の
こと）の１、Ｏｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントを含む３
２Ｐてラベルしたプラスミドと成虫ポリ（Ａ）　”ｍＲ
ＮＡとのノーザンプロットハイブリッド形成は、低い緊
縮条件下で長さ約１２５０ｎｔの単一のハイブリッド形
成ｍＲＮＡ帯を示した（第２３図を参照のこと）。ＲＮ
Ａを変性ホルムアルデヒドゲル（レーラッチ（Ｌｅｈｒ
ａｃｈ）ら、１９７７年を参照のこと）でサイズ分別し
、ニトロセルロースフィルター上にプロットした。フィ
ルターをササンプロットに関して記載された溶液中でハ
イブリッド形成し、同溶液中で３７°Ｃて４×３０分洗
浄した。ノーザンプロットに使用したプローブはプラス
ミドｐＢＲ３２５：　Ｆ−］てあった。これはｐＢＲ３
２５のＥｃａＲ１部位中に挿入された　ＡＣ−１ｃＤＮ
Ａ　Ｆ−１の１．０ｋｂＥｃｏ［フラグメントを含む。
フレウェル（ＣｌｅｗｅｌｌＸ１９７２年）に従って、
プラスミドＤＮＡを調整し、ニックトランスレーション
（リグビイ（Ｒｉｇｂｙ）ら、１９７７年）により２２
Ｐでラベルした。ＲＮＡサイズ標準物質（０，１６〜ｌ
−７７ｋｂ）をベセスダ・リサーチ・ラボラトリイズか
ら購入した。このｍＲＮＡのサイズは最大（７）ＡＣ−
ＩＣＤＮＡ（７）サイズ（Ｆ−１＝Ｉ　ｌ００ｂｐ）お
よび遺伝子の予想サイズと良く一致する。データーは、
多ｉＡｃプロテアーゼ遺伝子が同様のサイズのｍＲＮＡ
を生産することを示唆する。同じサイズの弱いハイブリ
ッド形成帯を、第三段階の幼虫および若齢の第四段階の
幼虫の混合物から単離されたポリ（Ａ）“ｍＲＮＡ中で
検出した。
２、ＡＣタンパク質の発育形質発現 ８０組替えＡＣ−１タンパク質に対する抗血清の調整 Ｈ，コンドルラスの種々の発育段階に於けるタンパク質
の形質発現を調べるために、ウサギ抗血清をＡＣ−１４
ガラクトシダ一ゼ融合タンパク質に対して調整した。予
想されるＡＣ〜１とＡＣ−２タンパク質との間のアミノ
酸配列の同一性の高い程度のため、本発明者らは、ＡＣ
−１タンパク質に対して生じた抗血清がＡＣ−２タンパ
ク質と交差反応すると予想する。しかしなから、この仮
説を試験することは、未だ可能であることが証明されて
いなかった。ｃＤＮＡ３−１のフラグメントをβ−ガラ
クトシダーゼ形質発現プラスミドｐｓＥＶ６にサブクロ
ーン化することにより、遺伝子融合を行った。プラスミ
ド１）ＳＥＶ６をプラスミド９ＳＥＶ４から誘導した。
このプラスミドｐｓＥＶ４は、ｐＬＧ２の二つのＥｃｏ
ＲＩ部位の一つか分解されて、β−ガラクトシダーゼ遺
伝子中に特異なＥ　ｃｏＲ１部位を残した以外は、プラ
スミドｐＬＧ２　（グアレント（Ｇｕａｒｅｎｔｅ）ら
、１９８０年）と同しである。ｐＳＥＶ４ＤＮＡをＳｐ
ｈ　ｒで完全に消化し、その後Ａａｔｌｌで部分消化し
た。Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを使用してＤＮＡ末端を
平滑にした。アガロースゲル電気泳動後に７．６ｋｂの
部分消化生成物を電気溶離し、エタノールで沈澱し、乾
燥し、緩衛液中で再懸濁し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼと一
夜でつないで平滑末端をシールした。この工程は５ｐｈ
ＩｆＩｉ限部位およびＡａｔｌｒ制限部位を破壊する。
連結混合物を使用してＥ、　ｃｏｌｉＡＭＡ１００４（
カサダバン（Ｃａｓａｄａｂａｎ）ら、１９８３年）を
形質転換し、細胞をアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸＧ
ＡＬの存在下で塗布した。プラスミドを青色のコロニー
から単離し、適当な形態を有する一つのプラスミドをｐ
ＳＥＶ５と称した。
ｐｓＥＶ６を生じるため、９ＳＥＶ５　ＤＮＡをＮｃｏ
　Ｉで消化し、配列５’　ＣＡＴＧＡＧＡＴＣＴＧＧＴ
ＡＣ３’　オヨヒ５’ＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴ
３’　（７）相補的ＤＮＡアタプタート−夜てつないた
。Ｅ、　ｃｏ　ｌ　ｉＡＭＡ　１００４の形質転換後に
、プラスミドＤＮＡを幾つかの青色のコロニーから単離
し、適当な方向性の特異なＮｃｏ　Ｉ部位、Ｋｐｎ　Ｉ
部位およびＢｇ１１１部位の存在に関して分析した。一
つのこのようなプラスミドをｐＳＥＶ６と称した。ｐＳ
ＥＶ６の地図か第２４図に示される。
ｐｓＥＶ６：　：ＡＣ−１をつくるため、ＡＣ−１ｃＤ
ＮＡ３−１を含むｐＢＲ３２２プラスミドをＥｃｏＲＶ
て消化し、配列５′ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧ−３’を
有するＥｃｏＲＩリンカ−につないだ。ＥｃｏＲＩによ
る消化後に、ＡＣ−１を暗号化する配列の殆とを含む約
５ｓｏｂｐのフラグメントをアガロースゲルから溶離し
た。その制限フラグメントをプラスミドｐＳＥＶ６中の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子の特異なＥｃｏＲＩ部位に
サブクローン化した（第２４図を参照のこと）。β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子に関して適当な方向性のｃＤＮＡ
を抗体スクリーニングにより、およびＸｈ。
Ｉ（これは３−１　ｃＤＮＡ内で非対象的に切断する）
による消化により、選択した。
適当な構成物を含むバクテリアを、６００ナノメーター
に於ける光学密度か０．３になるまで、５０μｇ／ｍｊ
’のアンピシリンを含むＬＢ培養液中で増殖した。その
後、イソプロピル−〇−チオガラクトピラノシドを１ｍ
Ｍまで添加し、培養液を３７°Ｃて更に２時間振とうし
た。バクテリアを遠心分離により回収し、ＳＤＳ試料緩
衛液（ラムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）およびフアツジ（Ｆａ
ｖｒｅ）、　１９７３年）中で短時間沸騰し、旋回させ
ることにより溶菌した。
ＡＣ−１：　β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質は、
１４０ｋＤａの分子量を有し、ＡＣ−１の最終的に２旧
個のアミノ酸を含む。ウサギ＃１０２８５　（これは成
虫から単離された天然の３５ｋＤａタンパク質で免疫化
されたものであり、その血清を使用してλｇｔｌｌ成虫
ｃＤＮＡ形質発現ライブラリーからｃＤＮＡ２Ｂを単離
した）の抗血清はウェスタンプロットで組換えＡＣ−１
：　β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（第２５図を
参照のこと）と反応し、これは変性ｃＤＮＡか適当な読
取り枠中に結合されたことを確かめる。
ＡＣ−１：β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を分取
ＳＤＳゲルから電気溶離し、ウサギ＃８５５２および＃
９１９０を免役化するのに使用した。フロイント完全ア
ジュバント中に乳化された全タンパク質１００μｇをウ
サギに一次注射した。その後、フロイント不°完全アジ
ュバントと混合された全タンパク質１００〜２００μｇ
を１ケ月毎の間隔てブースター注射した。全ての注射を
皮下で施した。夫々のブースター注射の１０〜１４日後
に血清を得た。両方の免役抗血清は成虫エキス中の３５
ｋＤａタンパク質と反応した（第２６図を参照のこと）
。加えて、両方の免役血清はフィブリノーゲン分解分析
を用いて成虫から精製された“抗凝固物質”エキス中の
同一サイズのポリペプチドと反応する。また、両方の免
疫抗血清は成虫エキス中、および抗凝固物質エキス中の
３７ｋＤａタンパク質と反応した。Ｒｂ−８５５２血清
は、Ｒｂ−９１９０またはＲｂ−１０２８５抗血清より
も激しくこのタンパク質と反応した。エンドグリコシダ
ーゼＦ消化実験は、３７ｋＤａタンパク質か３５ｋＤａ
タンパク質の一層重度にグリコジル化された形態である
ことを示唆する。何となれば、両方のタンパク質の見掛
分子量かエンドグリコシダーゼＦ処理の後に３３ｋＤａ
に減少するからである。上記の分析は、ＡＣ−１（ＡＣ
−２）がＨ，コントルラス成虫から調整された抗凝固物
質エキス中に存在する３５ｋＤａプロテアーゼを暗号化
することを示し、しかもこれらのエキス中の３５ｋＤａ
および３７ｋＤａのタンパク質か抗原的に関連し、おそ
らく同一タンパク質の異なる形態であるという追加され
た確証を与える。
ｂ、　寄生虫発育中のＡＣタンパク質のウェスタンプロ
ット分析 Ｈ，コントルラスを５Ｌ３（第二幼虫段階のクチクラを
保持する第三段階の幼虫）としてヒッギに摂取させる。
第一胃中て、ＳＬ３は第二段階のり千クラを脱皮し、生
じるＸＬ３幼虫が第四胃に移動する。数日中に、ＸＬ３
はＬ４　（第四段階の幼虫）に脱皮する。Ｌ４は、血を
吸うことにより活発に給餌する最初の段階である。Ｌ４
は数日後に若齢の成体に脱皮する。非常に小さい成長が
ＳＬ３と若齢の成体段階との間で起こる。若齢の成体は
長さ約０．５ｍｍであり、次の４週間中に長さ２５ｍｍ
以上まで成長する。この成長のための栄養物は宿主血液
成分の代謝により与えられる。Ｒｂ−８５５２抗血清お
よびＲｈ−９１９０抗血清を使用して、ＳＬ３゜ＸＬ３
．　Ｌ４および成体のタンパク質エキスのウェスタンプ
ロット（トウピン（Ｔｏｗｂｉｎ）ら、１９７９年）を
精査した。技術上の理由のため、これらの実験で分析さ
れるＸＬ３虫およびＬ４虫を、特定培地中の試験管内で
虫を培養することにより得、感染ヒツジから単離しなか
った。第２７図に示されるように、３５ｋＤａタンパク
質（および３７ｋＤａ形態）を成虫のエキス中のみて検
出した。Ｒｈ−１０２８５血清を用いて、同じ結果を得
た。この血清は成虫から単離された天然の３５ｋＤａタ
ンパク質に対して調整した（第２７図を参照のこと）。
これらの結果は、３５ｋＤａプロテアーゼ遺伝子族の全
ての員（少なくとも、これらの抗血清により認識される
タンパク質を暗号化するこれらの員）か同様の発育形質
発現パターンを有することを示唆する。
Ｈ９抗凝固物質タンパク質による生体内保護実験１、保
護実験＃ｌ ａ、実験設計 生後約１２ケ月の虫のいないヒツジに、アジュバントで
乳化された節ＩＩ　（Ｂ）に記載されたように調製され
た精製抗凝固物質（ワクチン投与グループ）またはアジ
ュバントのみ（対照グループ）を幾つかの部位で筋肉内
注射した。注射の時間経過、注射に使用した抗凝固物質
の量および使用したアジュバントの種類を第工表に示す
。
最後のブースト（ｂｏｏｓｔ）の１０日後に、ヒツジに
、１回の第一胃内（ｉｎｔｒａｒｕｍｉｎａｌ）注射に
より与えられる２５００　Ｈ，コントルラス被鞘第三段
階幼虫（ＳＬ３）で抗原投与した。糞試料を次の２ケ月
にわたって回収し、数■の試料当りのＨ，コンドルラス
卵の数を測定した。これらの数を、適当な変換因数を掛
けることにより、糞便１ｇ当りの卵（ＥＰＧと称する）
に変換した。虫抗原投与後５６日目に、ヒツジを犠牲に
し、それらの第四胃を取り出し、成虫の存在を調べた。
見つけた虫を数え、性別を見分けた。試験の前、抗原注
射の後、虫抗原投与の前および検死時に、血清試料を集
めた。血清試料を使用して全成虫タンパク質エキス、部
分精製抗凝固物質または精製した３５ｋＤａおよび５５
ｋＤａのタンパク質のウェスタンプロットを精査して、
これらのタンパク質と反応性の抗体に関して分析した。
駆虫活性を、虫の卵精製の減少により、および検死時の
虫集団個体数の減少により記録した。
第１表 抗凝固物質注射のスケジュール 日数　　　　量 ＯｃＦＡｂ中　５０μｇ ７　　　　　　　　　１ＦＡｃ中　７５μｇ１４ＩＦＡ
中１００μｇ ２１　　　　　　１ＦＡ中１００μｇ ３１　　　　　　　ＩＦＡ中４００μｇ４１　　　　　
　　　　虫抗原投与 ９７　　　　　検死 ａ、対照のヒツジは、同じスケジュールに従ってアジュ
バントのみを受けた。
ｂ、フロイント完全アジュバント Ｃ，フロイント不完全アジュバント ｂ、結果 抗凝固物質でワクチン投与したヒツジは、第■表に示さ
れるように、減少したグループ平均ＥＰＧおよび検死時
の虫の合計数の両方を示した。
ワクチン投与したヒツジのグループ平均ＥＰＧは、虫抗
原投与後４２日目に、対照のヒツジのグループ平均より
も７７％少なかった。検死時（抗原投与後５６日目）に
、４匹のワクチン投与したヒツジのうちの３匹が卵の計
数に関して負であった。
ワクチン投与したグループに関する検死時の平均の合計
数は、対照グループの平均合計数より７９％少なかった
。
２、保護実験＃２ ａ、実験設計 この試験は、ヒツジを３つのグループに分けた以外は、
最初の抗凝固物質実験の繰返してあリ、実験の全てのパ
ラメーターか同じてあった。
グループｌは、試験＃ｌのワクチン投与したグループと
同様に処置した。グループ２は、試験＃ｌの対照グルー
プと同様に処置した。グループ３は、最初の抗凝固物質
注射の１７５を静脈内に与えた以外は、グループｌと同
様に処置した。
グループ３に関するブースター注射は、グループｌと同
様に筋肉内に与えた。
ｂ、結果 最初の試験と同様に、抗凝固物質てワクチン投与したヒ
ツジは、第■表に示されるように、減少したグループ平
均ＥＰＧおよび検死時の虫の合計数の両方を示した。研
究の終了時（即ち、虫抗原投与後５６日目）に、グルー
プ１のヒツジの全ては、対照グループ２に関して３２５
のグループ平均に対して虫の数に関して陰性であった。
グループ１のヒツジに関する検死時の虫の合計数は、対
照のヒツジに関する合計よりも８６％少なかった。抗凝
固物質でワクチン投与した８匹のヒツジ（グループ１お
よび３）のうち７匹は、対照のヒツジに関して平均２６
９に対して検死時の虫の平均合計数４２を有していた。
グループ３のワクチン投与したヒツジの１匹だけ（ヒツ
ジ＃３３０）か検死時の非常に多い虫の数を有しており
、非応答動物であることが明らかである。
３、保護実験＃３ ａ、実験設計 この試験をは、ワクチンとしての個々の３５ｋＤａおよ
び５５ｋＤａのタンパク質の効能を試験するように設計
した。モノーＱカラムで精製した抗凝固物質タンパク質
の分取ＳＤＳゲルを運転し、３５ｋＤａおよび５５ｋＤ
ａの帯を個々に分離し、節ＩＩ　（Ｄ）（２）に記載さ
れたようにして実質的に溶離した。
試験のヒツジを６つのグループに分けた。グループＡの
ヒツジは抗凝固物質＋アジュバントを受けた。グループ
Ｂのヒツジは、０．１％ＳＯＳ中で変性され、アジュバ
ント中に乳化された抗凝固物質を受けた。グループＣの
ヒツジはアジュバントのみを受けた。グループＤのヒツ
ジはアジュバント＋０．１％ＳＤＳを受けた。グループ
Ｅのヒツジは３５ｋＤａタンパク質＋アジユバントを受
け、グループＦのヒツジは５５ｋＤａタンパク質＋アジ
ユバントを受けた。各グループは４匹のヒツジを含み、
それらに第工表に概説したスケジュールに従ってタンパ
ク質を注射し、但しグループＥおよびＦのヒツジは、示
された多量の抗凝固物質タンパク質ではなく、５０．７
５．１００゜１００、　１００μｇのタンパク質の注射
を続けて数週にわたって受けた。−次注射はフロイント
完全アジュバントを使用し、一方、ブースター注射はフ
ロイント不完全アジュバントを使用した。
全ての注射を筋肉内で与えた。
ｂ、結果 ＳＤＳを使用し、またはＳＯ３を使用しないて抗凝固物
質タンパク質てワクチン投与したヒツジ、並びに３５ｋ
Ｄａまたは５５ｋＤａのタンパク質でワクチン投与した
ヒツジは、アジュバントのみて注射したヒツジに較へて
減少されたグループ平均ＥＰＧおよび検死時の虫の合計
数の両方を示した（第■表を参照のこと）。抗凝固物質
、即ち３５ｋＤａまたは５５ｋＤａのタンパク質を受け
るワクチン投与グループの夫々の４匹のうち３匹か卵数
に関して陰性であり、あるいは不妊卵のみを生じた。同
様に、抗凝固物質でワクチン投与した、即ち３５１５５
ｋＤａのタンパク質でワクチン投与したグループの４匹
のヒツジのうち３匹が検死時に通常に現れる成虫を有し
ていなかった。ヒツジの成るものは、小さい不妊成虫を
有し、これは虫に対して向けられる免疫反応を示唆した
。
４、結論 本発明者らは、保護実験１．２および３から、抗凝固物
質かヒツジで免疫原性であり、駆虫活性の二つの測定、
即ち虫の卵数の減少および虫集団個体数の減少により測
定されるようにヒツジをＨ，コントルラス感染から保護
するためのワクチンとして使用し得ることを結言する。
更に、本発明者らは、３５ｋＤａまたは５５ｋＤａのタ
ンパク質のいずれもかヒツジをＨ，コントルラス感染か
ら保護するためのワクチンとして個々に使用し得ること
を結言する。
ｒ、　Ｅ、ｃｏｌｉ中のへセンカス３５ｋＤａタンパク
質の形質発現 ヘモンカスＡＣ−１プロテアーゼを、二つの形態てＥ、
ｃｏｌｉ中で形質発現した。Ｘ−８と称する一つの構成
はＡｓｐ−１９で開始する。ＲＶ−２および３と称する
第二の構成は１ｉｅ−８７で開始する。組換えタンパク
質の形質発現を誘導するためのＴ７フアージプロモータ
ーまたはＴａｃプロモーターを含むプラスミドを用いて
、これらの構成物を形質発現した。
１、Ｔ７プロモータープラスミドーｐＴ５Ｔａ、Ｘ−８
構成 ｃＤＮＡＦ−１をＸｂａｌで消化した。切断したＤＮＡ
を、下記の配列の合成リンカ−につないだ。
ＭｅｔＡｓｐＧｌｕＡｓｎＡｌａＡｌａＧｌｎＧｌｙｌ
　１ｅＰｒ。
連結混合物をＥｃｏＲＩで消化し、１０６２ｂｐ　ＤＮ
Ａフラグメントをゲル精製した。このＤＮＡ片を、Ｅｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化されたＴ７プロモーター
ブラスミドｐＴ５ＴＤＮＡＣ’）とつないだ。連結ＤＮ
Ａを使用してＥ、ｃｏＪｉ株ＢＬ２１／Ｄε３を形質転
換し、そのプラスミドを含むコロニーをアンピシリンプ
レートで選択した。迅速沸騰法（ホルメス（Ｈｏｌｍｅ
ｓ）およびキグレイ（Ｑｕｉｇｌｅｙ）、１９８１年）
を使用して、幾つかのコロニーからのプラスミドＤＮＡ
を精製し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、そ
れらが適当なサイズのＤＮＡインサートを含むことを確
かめた。正しいサイズのインサートを有する二つのプラ
スミドを同定し、ｐＴ５Ｔ：：Ｘ−１およびｐＴ５Ｔ：
　：Ｘ−８と称した。
ｂ、ＲＶ構成 ｃＤＮＡＦ−１をＥｃｏＲＶで消化し、下記の配列の合
成リンカ−とつないだ。
ｅｔ 連結ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、８５７ｂｐ帯をゲル
精製した。このＤＮＡ片を、ＥｃｏＲｒおよびＢａｍＨ
で消化されたプラスミドｐＴ５Ｔ　ＤＮＡとつないだ。
連結ＤＮＡを使用してＥ、ｃｏｌｊ株ＢＬ２１／ＤＥ３
を形質転換し、プラスミドを含むコロニーをアンピシリ
ンプレートで選択した。幾つかのコロニーからのプラス
ミドを精製し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨで消化して、
それらが適当なサイズのＤＮＡインサートを含むことを
確かめた。正確なサイズのインサートを有する二つのプ
ラスミドを同定しｐＴ５Ｔ：：ＲＶ−２およびｐＴ５Ｔ
：　：ＲＶ−３と称した。
２、ＴａＣプロモータープラスミドｐＴ３ＸＩ−ｔａｃ
ｌｏＸ−８構成物を、以下のようにしてＴＡＣプロモー
タープラスミドｐＴ３ＸＩ−２−ｔａｃｌＯに転移した
。
プラスミドｐＴ５Ｔ：：Ｘ−８ＤＮＡをＳａｍ　Ｉで消
化しくＳｍａ１部位はＸ−８配列の下流のポリリンカー
配列中に生じる）、配列５−ＧＣＣＧＣＧＧＣ−３°の
Ｓａｃ　Ｉ　Ｉリンカ−とつなぎ、ＢａｍＨＩおよびＳ
ａｃ　Ｉ　Ｉで消化した。
１０７８ｂｌ）のＢａｍＨＩ　：　Ｓａｃ　［Ｉフラグ
メントをゲル精製し、Ｂａｍｆ（Ｉおよび５ａｃｌｌで
消化されゲル精製されたｐＴ３ＸＩ−２−ｔａｃｌＯＤ
ＮＡとつないだ。連結混合物を使用してＥ、　ｃｏｌｉ
ＪＭ１０７を形質転換し、コロニーをテトラサイクリン
プレート選択した。所望の構成物（ｐＴ３ＸＩ−２−ｔ
ａｃｌｏ：　：Ｆ−１（Ｘ−８）−８、または簡単にＴ
ａｃ　ｘ−ｓと称する）を含むコロニーを、ハイブリッ
ド形成プローブとして′２ｐでラベルしたＦ−１ｃＤＮ
Ａインサートを用いるコロニーハイブリッド形成（グル
ンステイン（Ｇｒｕｎ−ｓｔｅｉｎ）およびホグネス（
Ｈｏｇｎｅｓｓ）　、１９７５年）により選択した。Ｔ
ａｃ　Ｘ−８を制限遺伝地図作成により、およびインサ
ートの５°末端のＤＮＡ配列決定により確かめた。
３、組換えへモンカスプロテアーゼの合成Ｔ７プロモー
ター：ＲＶ２（ｐＴ５Ｔ：　：ＲＶ２）プラスミドおよ
びＴ７プロモーター：Ｘ−８（ｐＴ５Ｔ：　：Ｘ−８）
プラスミドを含むＥ、　ｃｏ１ｉＢＬ２１／ＤＥ３を、
ＯＤ、、、か０．３になるまで、テトラサイクリン約１
２゜５■／ｙｔｔ’を含むＬＢ培養液中で増殖させた。
この時点て、ＩＰＴＧを１ｍＭまで添加することにより
、タンパク質の形質発現を誘導した。細胞を種々の長さ
の時間にわたって増殖させ、遠心分離により回収し、Ｓ
ＤＳ試料緩衝液中で溶菌し、１２％ＳＯＳゲルで電気泳
動させた。ゲルのコマシーブルー染色か第３０図に示さ
れ、成体へモンカスから精製された３５ｋＤａタンパク
質に対する抗血清（Ｒｈ−１０２８５血清１節ＩＩ　（
ＤＸ２）を参照のこと）を用いるタンパク質のウェスタ
ンプロットか第３０図に示される。
ＲＶ−２構成物は、Ｒｂ−１０２８５血清と反応しＩＰ
ＴＧによる誘導の際に多量に増加する３０ｋＤａ帯を生
産する。Ｘ−８構成物は、Ｒｂ−１０２８５血清と反応
する分子量３８ｋＤａおよび３２ｋＤａのタンパク質を
生産する。３２ｋＤａタンパク質は３８ｋＤａタンパク
質より多量である。両タンパク質はＩＰＴＧによる誘導
の際に多量に減少する。
Ｅ、　ｃｏｌｉＪＭ１０７中のＴａｃ　Ｘ−８の形質発
現は、ｐＴ５Ｔ中のＸ−８構成物の形質発現と同様の結
果を生じた。生産されたプロテアーゼの大部分の形態は
３２ｋＤａである（第３０図を参照のこと）。また、３
８ｋＤａの形態か生産される。３２ｋＤａおよび３８ｋ
Ｄａのタンパク質の両方がＲｈ−１０２８５血清と反応
しく第３０図を参照のこと）、両タンパク質は１ｍＭの
ｒＰＴＧによる誘導の際に多量減少する。
４、組換え３５ｋｄタンパク質の単離 上記のＪＭ１０７中のＴＡＣＸ−８構成物を、約１２．
５■／７ｎｌのテトラサイクリンを含むルリア（Ｌｕｒ
ｉａ）培養液（ＬＢと称する）中で後期の対数増殖期ま
で増殖させた。細胞を、誘導しないで回収した。
ペレットにした細胞を、２５ｍＭ　トリス・ＭＣＩ　ｐ
Ｈ８，０，５ｍＭＤＴＴおよび１５ｍＭ　ＮａＣ１中て
細胞の湿潤重量１ｇに対し２０ｒＩＬｌの割合で再懸濁
した。懸濁液を１２６５ｋｇ／ｃａｒ　（１８，０ＯＯ
ｐｓｉ）のフレンチプレスに３同人れた。ついで、細胞
溶解産物を３０．００　ｇで３０分間遠心分離した。ペ
レ１．トを、夫々の最初の細胞１ｇに対してｌｏｒ／Ｌ
ｌの容量の６Ｍ尿素および１００ｍＭ　２−メルカプト
エタノールの溶液中でゆるく備え付けたドウンス（ｄｏ
ｕｎｃｅ）で再懸濁した。再懸濁後に、０．７Ｍボラツ
クス、ｐＨ７，０および１０％ポリエチレンイミンを再
懸濁容量各ｌ〇−に夫々Ｏ，１５ｒｎＩおよび０．０Ｗ
で添加した。再懸濁溶液を３０．０００　ｇで３０分間
遠心分離した。
その後、上澄液を、カラムの高さ１１．０ｃｍ、直径サ
イズ１．０ｃｍの充填ビーズｌ−に対し１０ｒＩＬｌの
割合でＳ−セファローズカラム（ファーマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ））に装填した。カラムを、２５ｍＭ　ト
リス：ＨＣｌ、　ｐＨ８，０，５ｍＭ　ＤＴＴ、　　１
　ｍＭ　ＥＤＴＡおよび６Ｍ尿素を含む緩衝液中で平衡
にした。試料の適用後に、同緩衝液を使用してカラムを
洗浄した。カラムに結合したタンパク質を、５００ｍＭ
までのＮａＣ１の線形勾配を用いて溶離した。組換え３
５ｋＤａタンパク質を１２５ｍＭ〜１７５−のＮａＣ１
で溶離した。３７ｋＤａおよび３２ｋＤａの両方の種か
、もとの溶解産物中に観察されたのと同じ比率で存在し
ていた。最終の冷却した組換え物質のコマシー染色５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥゲルの走査は、３７ｋＤａおよび３２ｋＤ
ａの種か染色タンパク質の６０％より多くに相当するこ
とを示した。第３１図は、この操作により得られた画分
の代表的なタンパク質プロフィールを示す。
Ｊ、抗凝固物質抗血清実験 以下に示されるように、ＳＤＳ変性３５ｋｄポリペプチ
ドに対して特異的なウサギ血清は、標準酵素分析でフィ
ブリノゲナーゼ活性を直接抑制しない。
しかしなから、この抗血清は、この活性を選別するのに
使用でき、こうして、このポリペプチドか、完全でない
としても少なくとも一部、フィブリノゲナーゼ活性に応
答性であるという根拠を支持する。また、その他の大部
分のポリペプチド、５５ｋｄタンパク質がフィブリノー
ゲン切断活性に欠くことができない要素であり得ること
は、除外し得ない。
対照ヒツジからの血清および抗凝固物質調製物で免疫化
したヒツジからの血清は、フィブリノゲナーゼ活性の部
分抑制を示した。これらの血清から単離されたＩｇＧ画
分は酵素の抑制を示し続け、それ故、保護と酵素抑制と
の間の直接の関連は、ない得なかった。免疫化したヒツ
ジからの血清は、ウェスタンプロット分析により３５ｋ
Ｄａおよび５５ｋＤａのポリペプチドと反応する。直接
の抑制は虫の抗原投与に有効な保護に必要とされないが
、免疫クリアランスまたは補体媒介損傷が保護に関する
機構であり得ることは、可能である。
成虫からの抗凝固活性は、特異的なフィブリノーゲン切
断活性であることが決定されていた。第３２図に示され
るように、ウシフィブリノーゲンのα帯およびβ帯は、
次第に増加する量の部分精製酵素調製物と共に保温され
る場合に、分解される。
５ＤＳ−ＰＡＧＥによる酵素調製物の分析およびその後
のコマシーによる染色は、約３５ｋＤａおよび５５ｋＤ
ａの二つの主要な帯を示す。アンチーコアギュラーセ（
ａｎｔｉ−ｃｏａｇｕｌａｓｅ）か同様に電気泳動され
、−層感受性の銀染色法で染色される場合には、幾つか
の追加のポリペプチドが視覚化される（第３３図を参照
のこと）。−層高い分子量のごく少ない帯の幾つかは、
コラーゲンポリペプチドに相当すると考えられる。保護
実験中にウサギおよびヒツジ中に生じた抗凝固物質に対
する抗血清は、コラーゲンと反応する。
３５ｋＤａが触媒サブユニットであるという支持は、活
性部位ラベリング実験から得られる。フィブリノゲナー
ゼ活性はチオール依存性であり、適当なインヒビターお
よびチオールラベリング試薬の使用は、３５ｋＤａポリ
ペプチドが活性チオールを含むことを示す。フィブリノ
ゲナーゼ活性か、その他のポリペプチドと関連し得るか
、あるいは単一のポリペプチド凝集物であるという根拠
は、少なくとも百方の分子量で溶離する活性を示す天然
の分子量サイジングカラムから得られる。複合体を分離
し活性を維持する試みは、成功しなかった。
（本質以下余白） ２、ウサギ血清による阻害の研究 ３５　ｋＤａポリペプチドおよび５５　ｋＤａポリペプ
チドのクローニングに役立てるため、多クローン性ウサ
ギ血清をこれらポリペプチドにより感作させた。
抗凝固剤（ａｎｔｉ−ｃｏａｇｕｌａｎｔ）の調製量を
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、該ゲル
から該タンパク質を溶離した。この精製したＳＤＳ変成
タンパク質（ペプチド）をウサギに注射し、得られた血
清のウェスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎｓ）に対する反応性を
テストした。こうして得たある血清は、３５　ｋＤポリ
ペプチドに特異性であったが、他の血清は、単離段階お
よび／または注射段階で汚染され、３５　ｋＤポリペプ
チドおよび５５　ｋＤポリペプチドの両者に反応する血
清を生成した。
直接酵素阻害研究：該ウサギ血清かフィブリノゲナーゼ
活性を直接阻害する能力についてテストした。血清およ
び酵素を予備インキュベートした後、基質を添加してイ
ンキュベートし、ゲル電気泳動により分析した。未免疫
血清（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ−ｓｅｒｕｍ）および免疫
血清（抗３５および抗３５１５５）のいずれも、フィブ
リノゲナーゼに対し阻害性であった。
この明らかな非特異的阻害を解明するため、これら血清
サンプルからＩｇＧを分別した。ウェスタンの対照サン
プルを分析したところ、ポリペプチドに対する反応性は
、　［ｇＧフラクションに対するそれと別異であること
を示した。
未免疫血清および免疫血清から分画したＩｇＧフラクシ
ョンを用いて阻害テストを繰り返したところ、未免疫血
清はもはや酵素を阻害しなかった。
しかしなから、第３４図に示すように、３５　ｋＤａポ
リペプチド特異性のＩｇＧフラクションは、この分析に
おいてフィブリノゲナーゼに対し存意な阻害を示さなか
った。３５　ｋＤａポリペプチドおよび５５　ｋＤａポ
リペプチドに特異性の抗血清から分画したＩｇＧフラク
ションの場合にも、同様の結果が得られた。
これらの抗血清がＳＤＳ変性ポリペプチドに対して感作
された事実は、それらか天然酵素を阻害しないことと符
号する。
免疫選択阻害実験：これらＩｇＧをさらに利用し、３５
　ｋＤａポリペプチドかフィブリノゲナーゼ活性の一部
であることを支持するため、以下の実験を行った。まず
、　ＩｇＧフラクションを抗コアグラーセ（ａｎｔｉ−
ｃｏａｇｕｌａｓｅ）試料と共にインキュベートした。
ついて、固定した５ｔａｐｈ　Ａ細胞と共にインキュベ
ートすることにより、免疫グロブリンに反応したポリペ
プチドおよびＩｇＧを試料から除去した。遠心分離後、
５ｔａｐｈ　Ａ細胞処理を繰り返した。遠心分離により
得られた上清のフィブリノゲナーゼ活性を分析した。
上記酵素分析の結果を第３５図に示した。同図に示すと
おり、複数の対照を使用した。３５　ｋＤａポリペプチ
ドに対する未免疫血清および抗血清を示すレーン５およ
び８．３５　ｋＤａポリペプチドおよび５５ｋＤａポリ
ペプチドの両者に対する未免疫血清および抗血清を示す
レーン１１および１４を詳しく調べることにより、これ
ら免疫１ｇＧ試料はいずれも、それらに対応する未免疫
１ｇＧフラクションと比較して、酵素活性を低下させる
ことがわかる。すなわち、これらポリペプチドと反応す
るＩｇＧフラクションは、いずれも抗血清試料の活性を
低下させる。
この結果は、再現可能であった。
本実験の第２部として、上記活性の低下か問題の特定ポ
リペプチドの選択に基づくものであることを確認した。
この確認は、各サンプル中の５ｔａｐｈ　Ａ細胞を集め
、該細胞か抗凝固剤試料から選択したポリペプチドおよ
びＩｇＧの両者を煮沸により分離することによって行っ
た。これらサンプルを５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動し
、ニトロセルロースにプロットした。ついでウェスタン
を、これら３５ｋＤａポリペプチドおよび５５　ｋＤａ
ポリペプチドに特異性の抗血清と共にインキュベートし
た。このウェスタンを第３６図に示す。ウサギから最初
の血清を作成したので、カラー可視化のための第２の抗
体の作成には、ＨＲＰに結合したヤギ抗ウサギＩｇＧを
使用した。したがって、もし５５　ｋＤａポリペプチド
が選択されていれば、全ての複合ウサギＩｇＧが反応し
、５５　ｋＤａポリペプチドは見られないはずである。
しかしなから、該当するレーン（すなわち、レーン８お
よび１４）から、３５　ｋＤａポリペプチドか複合物を
形成していることは明らかである。
ある血清が３５　ｋＤａポリペプチドに特異性であると
いうことは、該ポリペプチドかフィブリノゲナーゼ活性
を担っていることを示す強力な証拠である。しかしなか
ら、５５　ｋＤａポリペプチドまたは他のポリペプチド
が関与している可能性も排除できない。５５　ｋＤａポ
リペプチドまたは他のポリペプチドに特異性の血清を使
用することにより、これらペプチド（タンパク質）が関
与しているか否か見分けることが可能である。
３、免疫化ヒツジ血清による酵素阻害 抗凝血剤投与実験＃ｌにより作成した免疫化ヒツジ血清
および対照ヒツジ血清について、フィブリノゲナーゼ阻
害能力をテストした。ウサギの血清についてテストした
場合と同様に、免疫化ヒツジ血清、対照ヒツジ血清は、
いずれもフィブリノゲナーゼを阻害した。このため、対
照血清（２個）および免疫化血清（４個）からＩｇＧを
単離し、それらによる酵素阻害についてテストした。そ
の結果、テストした全てのＩｇＧフラクションが該酵素
に対する部分阻害を示した（第３７図参照）。これを仔
細に調へると、免疫化ＩｇＧフラクションの方が、僅か
なから強く阻害しているようにも見受けられる。しかし
なから、結論としては、該結果からはとちらとも言えな
い、とせざるを得ない。すなわち、該阻害は、非特異性
ファクター、該凝固剤に特異性の免疫グロブリンのいず
れに基づくものか決定することはできない。非特異性阻
害を排除するための追加工程か必要である。あるいは、
阻害の測定に、より高感度な分析法を使用することが必
要である。
テストしたヒツジ血清が３５　ｋＤａポリペプチドおよ
び５５　ｋＤａポリペプチドに反応することは既に確認
されている。したがって、上記免疫選択の類似実験は、
類似した結果を与えるであろう。
Ｋ、　ＡＣ−３ｃＤＮＡおよびＡＣ−４ｃＤＮＡをコー
ドするＨ、　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ遺伝子の単離セクショ
ンＩＩ、Ｅ、３の記載と同様の手順に従って、２２ｐで
標識したｃＤＮＡ　Ｖ−２２を用い、プラークハイブリ
ダイゼーションによりＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ　：λＥ
ＭＢＬ−３ライブラリーをスクリーニングした。ハイブ
リダイゼーションおよび洗浄は３７°Ｃで行った。ｃＤ
ＮＡ■−２２をアガロースゲルから溶離し、ランダムプ
ライマーを用いて２２ｐで標識した。約９０．０００の
ファージのうち３個か該ｃＤＮＡにハイブリダイズした
ので、これらをプラーク精製し、３ＭＢ４．３ＭＢ５、
λＭＢ６と命名した。Ｖ−２２ｃＤＮＡおよびＦ−１ｃ
ＤＮＡとハイブリダイズしたプラークの領域は、λＭＢ
Ｉ中のＡＣ−２遺伝子のマツプ作成に関連してセクショ
ン■に記載した手法と同様の手法により、決定すること
ができた。エクソン１〜４をコードしているＤＮＡ配列
は、低ストリンジエンシーハイブリダイゼーション条件
下（３０％ホルムアミド溶液、セクション■参照）でＦ
−１エクソンの１〜４プローブを使用することにより同
定することができる。エクソン１〜４に対応する配列が
λＭＢ４〜６中に存在しない場合には、「クロモソーム
ラオーキング（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｗａｌｋｉｎｇ
）Ｊ法を用い、ライブラリーを再スクリーニングするこ
とにより、λＭＢ４〜６中に存在するコーディング配列
の５′に延在するＨ、　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓのＤＮＡ配
列を含むリコンビナントλＥＭＢＬ−３ファージを同定
することかできる。その手法については、Ｈ，ｃｏｎｔ
ｏｒｔｕｓ　ＡＣ−２遺伝子のエクソン１〜４をコード
するλＥＭＢＬ−３ファージの単離およびマツピングに
ついて記載したセクションＩＩ　、　Ｅ、　３．中に詳
述されている。Ｖ−２２ｃＤＮＡ　、　Ｆ−１ｃＤＮＡ
またはＦ−１エクソン１〜４プローブにハイブリダイズ
するλＥＭＢＬ−３ファージの領域の配列を決定するこ
とにより、ｃＤＮＡ−２２およびｃＤＮＡ−２４中に存
在しない遺伝子をコードする配列に対応するＤＮＡ配列
を同定することができる。
Ｌ、線虫システィンプロテアーゼ遺伝子のエクソン１〜
４に特異的なりＮＡプローブの構造プラスミドｐＢＲ３
２５：：Ｆｌ　（これはｐＢＲ３２５のＥｃｏＲ［部位
に挿入されたｃＤＮＡ　Ｆ−１の約１．０　ｋＢのＥｃ
ｏＲＩフラグメントを含んでいる）をＸｂａｌで消化し
、下記配列のオリゴヌクレオチドアダプターと結合させ
た。
ＡＴＣＴＴＴＧＴＴＣＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＣＡＧＡ
ＣＧＡＧＡＡＴＧＣＴＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＧＴＴ
ＴＧＧＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＣＣ
ＡＡＧＧＣＡＴＴＣＣＴ　　　−３゜ＧＧＧＴＴＣＣＧ
ＴＡＡＧＧＡＧＡＴＣ−５゜該結合混合物をＥｃｏＲＩ
およびＢａｍＨＩで消化し、Ｆ−１オリゴヌクレオチド
・アダプターＤＮＡ配列を含む１．１ｋｂバンドをゲル
精製した。溶離したＤＮＡバンドを、ＥｃｏＲＩ＋Ｂａ
ｍ旧で消化しゲル精製したプラスミドｐｃＤＮＡ　１ベ
クターＤＮＡ　（カリフォルニア州すンディエゴのＩｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と結合させた。この結合混合物
をＥ、　ｃｏｌｉのＭＣ１０６１／Ｐ３株（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ社）の形質転換に使用した。該プラスミドに
含まれる５ｕｐＦ遺伝子を利用して、プラスミド含有コ
ロニーをアンピシリン＋テトラサイクリン培地上で選択
した。正しく結合したＨｏｃｏｎｔｏｒｔｕｓ　Ｆ−１
配列を含むプラスミドを制限酵素地図作成およびヌクレ
オチド配列決定により同定した。そのようなプラスミド
の１つをｐｃＤＮＡ：：Ｆｌと命名した。
ＢａｍＨＩおよびＸｈｏｌを用いてｐｃＤＮＡ：：Ｆ−
Ｉ　ＤＮＡを消化することにより２８０ｂｐ　ＤＮＡプ
ローブを調製することができる。このＤＮＡフラグメン
トをアガロースゲルから精製し、３２ｐて標識し、ササ
ンプロット・ハイブリダイゼーション実験を行うことに
より、線虫システィンプロテアーゼ遺伝子のエクソン１
〜４をコードするＤＮＡ配列の位置を知ることかできる
。このＤＮＡフラグメントは、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ
　ＡＣ−２遺伝子のエクソン１〜４に対応する配列、お
よびエクソン５の３アミノ酸をコードする配列を含有す
る。本発明者は、このエクソン１〜４のプローブを、λ
Ｍ旧、２ＭＢ３、λ００２およびλ００７中のエクソン
１〜４をコードする配列の同定に使用した。エクソン１
〜４プローブは、ホルムアルデヒド３０％〜４０％を含
有するハイブリダイゼーション液を３２℃で使用するこ
とにより、λＭＢＩ中に存在する１、７ｋｂのＥｃｏＲ
ＩフラグメントおよびλＭＢ３中に存在する３、５ｋｂ
のフラグメント（第５１図）に特異的にハイブリダイズ
した（ハイブリダイゼーション液の組成についてはセク
ションＩ［、Ｐ、３参照）。第２０図に、λＭＢＩおよ
びλＭＢＳ中のハイブリダイゼーション領域の位置を示
した。
該プローブがλＭＢＩＤＮＡにハイブリダイズする事実
は、λＭＢＩ中のＨ，ｃｏ口ｔｏｒｔｕｓ配列により部
分的に（エクソン１〜４）にコードされた第２のシステ
ィンプロテアーゼ遺伝子が存在することを示している。
この第２の遺伝子の残部をクロモソームラ−キング法（
セクション］１．Ｅ、参照）により同定し、λＭＢＩ中
に存在する該コーディング配列の３゛に延在する新しい
λＥＭＢＬ−３ファージの単離に用いることかできる。
新しいλＥＭＢＬ−３ファージ上のエクソン５〜１２の
位置決定には、ｃＤＮＡ　Ｆ−１をハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして使用することかできる。
本発明者は、λ００２およびλ００７中のエクソン１〜
４プローブと交差ハイブリダイズするＤＮＡ配列を検出
するには、ハイブリダイゼーション溶液（セクションＩ
Ｉ　、　Ｐ、　３）中のホルムアルデヒドの濃度を３０
％（３２°Ｃにおいて）に低下させることか必要である
ことを見出した。該条件下において、エクソン１〜４プ
ローブは、λ００７中の３．６　ｋｂＢａｍＨＩフラグ
メント、λ００２中の７．９　ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグ
メント、およびλ００２中の３．５　ｋｂ　５ｓｔｌ／
ＢａｍＨ［フラグメントにハイブリダイズした。第５２
図にこれら制限フラグメントの位置を示した。エクソン
１〜４かハイブリダイズする領域の位置から、本発明者
は、２個の連鎖したシスティンプロテアーゼ遺伝子のタ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列を両ファージか含むも
のと推測した。
Ｍ、抗凝固剤、抽出物中に存在する５５　ｋ［）ａタン
パク質をコードするｃＤＮＡの単離 調製ＳＤＳゲルから溶離した５５　ｋＤａタンパク質て
感作したウサギ抗血清およびヒツジ抗血清を用いて、Ｈ
，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの成虫ｃＤＮＡ−ｒ−クスプレワ
ークス・ライブラリーをスクリーニングした。ウサギ抗
血清としては、セクションＩ［、Ｄ、　２．に記載した
Ｒｂ−１０２８４およびＲｈ−１０２８６を使用した。
ヒツジ血清としては、ヒツジ保護実験＃３（セクション
Ｉ１．Ｈ，３）の一部である、ヒツジ＃６４１．６４８
．６７３および８４２からの血清プールを使用した。
該ライブラリーを、セクションＩ［、Ｅ、１記載の抗血
清でスクリーニングした。Ｒｈ−１０２８４を希釈中１
　：　５００で使用した。この抗血清を用いて４×１０
５個のリコンビナントファージをスクリーニングしたと
ころ、１７個のホジティブファージか生成したので、こ
れらをプラーク精製の上、８４−１ないし８４−１７と
命名した。また、Ｒｂ−１０２８６血清を希釈率１　：
　５００で用いることにより、該ｃＤＮＡエクスプレッ
ション・ライブラリーをスクリーニングした。
このスクリーニングにより、ｃＤＮＡ　８６−５．８６
−７および８６−８が生成した。さらに、該ライブラリ
ーを、上記ヒツジ血清のプールを用いてスクリーニング
した。１．２Ｘ１０＠個のファージをスクリーニングす
ることにより、５個の陽性ファージが生成したので、こ
れらを５Ｈ−２７ａ、　５Ｈ−２９ａ、　５Ｈ−３４ａ
、　５Ｈ−３４ｂ、５Ｈ−３７ａと命名した。セクショ
ンＩ１．Ｅ、１記載の方法により、これらファージから
ＤＮＡを調製した。
これらファージＤＮＡをＥｃｏＲＩを用いて消化した後
、ｃＤＮＡ挿入物のサイズをアガロースゲル電気泳動に
より決定した。選択したｃＤＮＡ挿入物を該ゲルから溶
離し、ニックトランスレーションにより３２Ｐで標識し
、該ファージの整然とした配列を含むニトロセルロース
フィルターにハイブリダイズさせることにより、とのｃ
ＤＮＡか関連するか決定した。この実験により、ｃＤＮ
Ａ　８４−１．８４−２．８４〜３．８４−５．８４−
７．８４−１１．８４−１２．８４−１４．８４−１５
゜５Ｈ−２９ａ、　５Ｈ−３４ａおよび５Ｈ−３７ａか
交差）＼イブリダイズすること、したかって、これらか
同一遺伝子ないし関連遺伝子の産物であることか示され
た。
ｃＤＮＡ　８４−８．８６−７および８６−８も交差ハ
イブリダイズし、したがって、同一ないし密接に関連す
る遺伝子の産物であることが判明した。ｃＤＮＡ　８４
−４はユニークであった。
セクションｎ、Ｅ、１記載の方法に準じて抗原溶離実験
を行うことにより、ｃＤＮＡ　８４−１ないし８４−１
７によりコードされたＨ、　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓタンパ
ク質を同定した。ｌ？ｂ−１０２８４血清は、希釈率１
　：　５００で使用した。ファージ８４−１．８４−２
．８４−３．８４−５．８４−７゜８４−１１．８４−
１２．８４−１４および８４−１５により選択された抗
体は、全ての成虫抽出物中および精製抗凝固抽出物中の
５５　ｋＤａタンパク質と反応した（第４６図参照）。
これらファージにより選択された抗体と反応するタンパ
ク質は、時として、５５　ｋＤａにダブレットとして現
れた。これらの結果は、このｃＤＮＡグループか抗凝固
剤抽出物中に存在する主要５５　ｋＤａタンパク質（５
５Ａと呼ぶ）をコードしていることを示している。ファ
ージ８４−２により選択された抗体を用いるデベロップ
メンタル・ウェスタン・プロットにより、上記５５Ａタ
ンパク質は成虫では発現するが、ＸＬ３またはＬ４では
発現しないことが示された（第４７図参照）。
ファージ８４−８．８６−７および８６−８により選択
された抗体は、全成虫抽出物中の５５　ｋＤａタンパク
質と強く反応したが、精製した抗凝固剤抽出物とは弱く
反応したのみてあった（第４６図参照）。それ故、本発
明者は、これらｃＤＮＡが、抗凝固剤のマイナーな成分
である５５　ｋＤａ（５５Ｂと呼ぶ）をコードしている
と結論した。これらファージクローンによ選択された抗
体を親和力精製したものも、全土抽出物中の約１００　
ｋＤａのタンパク質と弱く反応した（第４６図参照）。
この約１００　ｋＤａのタンパク質は恐らく該５５　ｋ
Ｄａタンパク質の凝集物である。ファージ８４−８によ
り選択された抗原を用いるデベロップメンタル・ウェス
タン・プロットにより、これらｃＤＮＡによりコードさ
れた５５Ｂタンパク質および抗原的に関連する１００　
ｋＤａタンパク質は、ＸＬ３　、Ｌ４および成虫により
発現されることか示された（第４７図）。ファージ８４
−４により選択された抗体も、全成虫タンパク質中に存
在する１つの５５　ｋＤａタンパク質と強く反応し、１
つの１００　ｋＤａタンパク質と弱く反応した（第４６
図）。このタンパク質（５５Ｃと呼ぶ）も、精製した抗
凝固剤のマイナー成分であるように見受けられる。タン
パク質５５Ｃは、ＸＬ３、Ｌ４および成虫により発現さ
れた（第４７図）。
部分制限酵素地図および交差ハイブリダイゼーションに
より、　５５Ａタンパク質をコードするｃＤＮＡの配列
を研究した。この研究によりｃＤＮＡ　８４−１および
８４−２が最も大きいことか分った。これら２個のｃＤ
ＮＡの関係を第４８図に示した。
セクションＩ［、Ｅ、１に記載した手法を用い、ｃＤＮ
Ａ８４−２および８４−１のヌクレオチド配列を決定し
た。
それらのヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列を第
４９図に示した。
同様の手法によりｃＤＮＡ　８４−４および８４−８の
部分ヌクレオチド配列を決定した。それらを第５４図お
よび第５５図に示す。
３２ｐで標識したｃＤＮＡの制限フラグメント、または
該ｃＤＮＡ配列に対応する、ｆｆ２ｐで標識したオリゴ
ヌクレオチドプローブを使用することにより、Ｈ，ｃｏ
ｎｔｏｒｔｕｓ　５５Ａ、　５５Ｂまたは５５Ｃタンパ
ク質をコードしているより長いｃＤＮＡまたは完全鎖Ｄ
ＮＡを単離することができる。Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ
　３５　ｋＤａＡＣ−１システインプロテアーゼをコー
ドする長鎖ｃＤＮＡの単離について記載したセクション
Ｉ１．Ｅ、中に、そのような操作の例が記載されている
。セクション■に記載した手順に準じ、ｃＤＮＡ　８４
−２（又は８４−１）　、８４−４および８４−８によ
り部分的にコードされたタンパク質を、Ｅ、ｃｏｌｉ中
で発現することができる。精製したりコンビナンドタン
パク質を、Ｈｏｃｏｎｔｏｒｔｕｓの感染から保護する
ため、ヒツジに投与することができる。
下記方法により、５５Ａタンパク質をＥ、　ｃｏｌｉ中
に発現させた。すなわち、プラスミドｐＴ５ＴＤＮＡを
ＢａｍＨＴを用いて消化し、下記配列の合成リンカ−に
結合させた。
５°ＧＡＴ　ＣＣＧ　ＡＴＣＴＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　
ＧＡＴ　ＴＡＡ　ＡＴＧ　Ｇ　−３’３°−ＧＣＴＡＧ
　ＡＡＣＣＴＣＣＴＡ　ＣＴＡ　ＡＴＴ　ＴＡＣＣＴＴ
ＡＡ　−５“該混合物をＥｃｏＲＩで消化し、ベクター
バンドをアガロースゲル電気泳動後、精製した。ｃＤＮ
Ａ　８４−２をＥｃｏＲＩにより部分消化し、１．７ｋ
ｂのｃＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動後、精製した
。ゲル精製した１、　７　ｋｂのｃＤＮＡバンドおよび
ＥｃｏＲＩて消化したベクターバンドを一夜配置結合さ
せ、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＢＬ２１／ＤＥ３の形質転換に使用
した。テトラサイクリン耐性コロニーを、抗体スクリー
ニングまたは制限酵素消化により分析し、５５Ａ　ｃＤ
ＮＡが適切な配置で含まれているか調べた。セクション
Ｉ［，１，３に記載した方法により、５５Ａ　ｃＤＮＡ
を適切な配置で含むＥ、ｃｏｌｉ細胞に５５Ａタンパク
質を合成させた。
タンパク質化学における標準的手法を用いて該′リコン
ビナント５５Ａタンパク質を、発現ホスト細胞の抽出物
から精製することにより、該リコンビナントタンパク質
を医薬製剤として使用可能な程度まで純化することがで
きる。精製に使用し得る手法の例として次のものを挙げ
ることかできる。
（但し、これらに限定されない）：イオン交換クロマト
グラフィー（例えば、Ｑ−１Ｓ−およびＤＥＡＥ−３ｅ
ｐｈａｒｏｓｅイオン交換カラム）、ゲル透過クロマト
グラフィー（例えば、５ｕｐｅｒｏｓｅサイジングカラ
ム）、クロマトフオーカシング（例えば、Ｍｏｎｏ−Ｐ
カラム）、疎水性インタラクションクロマトグラフィー
（例えば、オクチル−およびフェニル−セファローズ旧
Ｃカラム）、および親和クロマトグラフィー（例えば、
亜鉛、銅、および水銀親和カラム）。
（本質以下余白） Ｎ、　　Ｈ，コントルラス５５Ａ　ｋＤａタンパク質を
コード化する遺伝子の分離 Ｈ，コントルラス：第１１．Ｅ、３節に記載された方法
と同様の方法を使用して、ＥＭＢＬ−３ライブラリーを
３２ｐ−ラベル化ｃＤＮＡ　８４−２によるプラークハ
イブリッド形成法によりスクリーンした。ハイブリッド
形成および洗浄温度は３７°Ｃであった。複製ニトロセ
ルロースフィルターはｃＤＮＡ　８４−２の７５０ｂｐ
および９００ｂｐ　ＥｃｏＲＩ断片でスクリーンした。
スクリーンされた９０．０００フアージのうち１１個の
ファージがラベル化したプローブとハイブリッド形成し
、そしてプラーク精製された。このファージはｇＭＢ７
から１７までと命名された。ｃＤＮＡｓ　８４−２およ
び８４−１に対合するファージの領域は制限酵素消化お
よびサザンプロットハイブリッド形成実験により決定す
ることができる。遺伝子の５′から３′へのコード化の
方向はｃＤＮＡ　８４−２の既知の配列、例えば、遺伝
子の５°半分をコードする７５０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ断片
並びに遺伝子の３°半分をコードする９００ｂｐ　Ｅｃ
ｏＲＩ断片を使用して決定することができる。これらの
２個のラベル化されたプローブによる別個のサザンプロ
ット実験は、遺伝子の５°から３°への方向を決定する
のを可能とするであろう。ｃＤＮＡｓ内の既知の制限酵
素部位［例えば、ｃＤＮＡ　８４−２の３゛末端近＜　
（７）Ｘｈｏ１部位（第４８図）］も、５５Ａ遺伝子の
５°から３°コード化方向を方向づけるために使用しつ
る。
ｃＤＮＡｓ　８４−１および８４−２からの消失したコ
ード配列はいかなるものも、ｃＤＮＡｓが終止する５°
部位に位置するＥＭＢＬ−３フアージの配列部位により
決定しつる。
０、５５Ａ　ｋＤａタンパク質をコード化するｃＤＮＡ
ｓによるゲノムサザンプロット実験 Ｈ，Ｄ：／トルッスノゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ、　５
ａｌｌ又はＢａｍＨＩで消化し、アガロースゲル上でサ
イズ分画し、そして第１１．Ｆ節に記載のようにしてニ
トロセルロースフィルター上ヘプロットした。複製フィ
ルターはｃＤＮＡ　８４−２の２個のＥｃｏＲＩ断片で
ハイブリッド形成させた。このフィルターは対合させ、
そして第１［、Ｆ節に記載された溶液を使用して３２°
Ｃで洗浄した。これらの実験は両方のプローブか各消化
物中の複数帯域に対合することを示しており（第５０図
）、このことはＨ，コントルラスゲノム中には５５Ａ　
ｋＤａタンパク質をコード化する１以上の遺伝子か存在
することを示唆している。この結果はｃＤＮＡｓの８４
−１と８４−２かＤＮＡ配列において僅かに相違してい
るとの知見と合致しており、これらのＣＤＮＡ５は２個
の密接に関連するが、別個の遺伝子の産物であることを
示唆している。
Ｐ、オステルタジアオステルタジ（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉ
ａｏｓｔｅｒｔａｇｉ）システィンプロテアーゼ遺伝子
の分離 １、オステルタジアオステルタジからのＤＮＡの分離 液体窒素中で凍結され、−７０°Ｃで保存された、さや
でおおわれた第３段階の幼生をＲ，ボイスベニラ（Ｒ，
Ｂｏｉｓｖｅｎｕｅ）博士（Ｅｌｉ　Ｌｉ１ｌｙ　ａｎ
ｄ　ＣｏｍｐａｎｙＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、ＩＮ）から
入手した。この虫をモルタル中で細かな粉末にすりつぶ
し、液体窒素上に詰めた。次いで、この虫を第１［（１
）節で記載したようにして、６５℃でプロティンキナー
ゼにで消化した。
フェノールおよびクロロホルムで交互に抽出した後で、
ＤＮＡはｌ／１０容量の３モルの酢酸ナトリウムおよび
３容量のエタノールを添加して沈澱させた。高分子量の
ＤＮＡはガラス製のキャピラリーを使用して巻き取り、
空気乾燥し、そして、１０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸ｐＨ８
，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ＴＥ緩衝液）中に再懸濁さ
せた。ＤＮＡはＲＮアーゼで処理し、フェノールおよび
クロロホルムで抽出し、乾燥させ、そして、ＴＥ緩衝液
に再懸濁させた。約３００μｇのＤＮＡか得られた。
２．０．オステルタジの構築：　ＥＭＢＬ−３ライブラ
リこのライブラリーは、本質的に第１Ｉ（１）節に記載
されているようにして構築された。０．オステルタジＤ
ＮＡの１００μｇをＳａｕ　３Ａで部分的に消化し、そ
して、１０−４０％のショ糖勾配上でサイズ−分画した
。１５−２０ｋｂのＤＮＡ断片を含有する分画はアガロ
ースゲル電気泳動により同定し、プールし、そして、３
ＸＳＥＴとＴＥ緩衝液に対して透析した。
透析したＤＮＡはエタノールで沈澱させ、そして、遠心
分離により集めた（ＳＷ２８０−ターを使用して、４°
Ｃて２５．００Ｏｒｐｍを３０分間）。このＤＮＡをＴ
Ｅ緩衝液中に再懸濁した。約２μｇのサイズ−分画され
たＤＮＡが得られた。このＤＮＡの分割量はＥｃｏＲ［
／Ｂａｍ旧て消化されたλＥＭＢＬ−３ＤＮＡ　（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に結合され
、インビトロでパッケージングされ（Ｇｉｇａｐａｃｋ
　Ｐｌｕｓ　ｋｉｔｓ、　ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎから購入）　、Ｅ、Ｃｏ１１株Ｑ３５
９．１上に塗布した。全量ｌＸｌ０＠組み換えファージ
は数個の連結反応とパッケージングから得られた。増巾
されたライブラリーを創製するために、プラークが目に
見えるが、オーバーラツプしない程度にまで、約４．４
ＸｌＯ’フアージをＥ、　ｃｏｌｉ　Ｑ３５９．１（１
５ａｎの直径の皿当たり２５．０００個のファージ）の
ローンに塗布した。プラークはλｄｉｌで重ねて置かれ
、４°Ｃで１晩放置され、そして、翌日液体が集められ
た。増巾されたライブラリーの力価はｌＸｌ０”ｐｆｕ
／ｒＩｄｌであった。
３．０．オステルタジシステインプロテアーゼ遺伝子の
同定 ０、オステルタジ：　ＥＭＢＬ−３ライブラリーは、ハ
イブリッド形成プローブとしてＨ，コントルラスｃＤＮ
Ａ　Ｆ−１の１０１４ｂｐ、　ＥｃｏＲＩ断片を含有す
る３２ｐ−ラベルの切断修復（ｎｉｃｋｔｒａｎｓｌａ
ｔｏｄ）て標識されたプラスミドを使用して、プラーク
ハイブリッド形成（ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓＳ１
９７７）によりスクリーンした。ｃＤＮＡ　Ｆ−１のＥ
ｃｏＲＩ断片は、ｐＢＲ３２５のＥｃｏＲ１部位に導入
される。このライブラリーは、宿主としてＥ、ｃｏｌｉ
　ＬＥ　３９２を使用して、１０ｃｍの直径のプレート
当り８Ｘ１０２個のファージの密度で塗布された。ニト
ロセルロースフィルターは、４０％ホルムアミド（Ｋｏ
ｄａｋ、　Ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｄｅ）／　３　Ｘ５Ｅ
Ｔ１０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７，４１０，１％ド
デシル硫酸ナトリウム／１０μｓ　ｄ−’のさやでおお
われたサケの精子ＤＮＡから成る溶液中で６０分間前ハ
イブリッド形成させた。フィルターは、次いで、新鮮な
ハイブリッド形成緩衝液中で３２℃にて１晩ハイブリツ
ド形成させた。翌日、このフィルターは数百−の新鮮な
ハイブリッド形成緩衝液で３０分間４回洗浄し、次いで
、２ＸＳＥＴ緩衝液で１〜２回洗浄した。ｌ晩Ｘ線フィ
ルムに露した後で、陽性のファージは収集し、そして、
プラークが純粋になる迄、類似の方法を使用して再スク
リーンした。
幾つかの実験においては、ニトロセルロースは前対合、
対合させ、さらに、４０％ホルムアミドの代わりに３０
％のホルムアミドを含有する溶液を使用して洗浄した。
より低いホルムアミド濃度は非特異的なバッグラウンド
ハイブリッド形成を増大させた。１０個のプレートをス
クリーニングすると、プラーク精製された９個の陽性の
ファージを得られた。、これらのファージは、ｌａｍｂ
ｄａ　００１−００９と命名された。ブラークー純粋フ
ァージからのＤＮＡはプレート溶解物方法により得られ
た（Ｄａｖｉｓら、１９８０）。このファージの制限酵
素地図は１個および２個の制限酵素消化を使用して製造
された（第５２図）。限定されたＤＮＡ５はアガロース
ゲル上でサイズ分画し、ニトロセルロースフィルターに
プロットし、フィルターは８０℃でベーキングし、そし
て、既述のハイブリッド形成条件を使用して２ｔｐ−ラ
ベルＦ−１ｃＤＮＡプラスミドにハイブリッド形成させ
た。このプラスミドに対合した制限断片はＮＡ−４５ペ
ーパー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよび５ｃｈｕｅｌｌ）
を使用して分離用アガロースゲルから溶出させ、ＭＩ３
ファージベクターへサブクローンし、そしてジデオキシ
ターミネーション法を使用して配列決定した。
配列決定されたλ００２、λ００３、λ００４およびλ
００７の領域は第５２図および第５３図に示されている
。これらの領域のヌクレオチド配列は第３８図から第４
１図で表わされる。これらのファージ中の０、オステル
タジシステインプロテアーゼ遺伝子は、Ｈ，コントルツ
スＡＣ−２遺伝子と同一のイントロン／エキラン構成を
存している（第４２図）。０゜オステルタジシステイン
ブロテアーゼ遺伝子の演欅されたアミノ酸配列は第３８
図から第４２図中に示されている。オステルタジアシス
テインブロテアーゼアミノ酸配列は、第４２図において
２個のへモンチュース（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）システ
ィンプロテアーゼ配列の相応の領域と比較される。ヘモ
ンチュースと、オステルタジシステインブロテアーゼは
、比較した領域において平均〜７０％のアミノ酸配列の
同一性を共有する。λ００１−００９における０、オス
テルタジアシステインプロテアーゼ遺伝子の完全な配列
を得るためには、Ｈ，コントルラスｃＤＮＡｓ　Ｆ−１
又はＦ−１エキソンｌ−４プローブ（第１Ｉ　（Ｅ）（
３）およびＩＩ　（Ｌ）節）に対合するファージＤＮＡ
５の余部の配列決定を行ない、そして、ｃＤＮＡ　Ｆ−
１からｖ−２４とヌクレオチドおよびアミノ酸配列を比
較しさえすればよい。もし遺伝子の一部かλ００１−０
０９に存在しないならば、次に、これらのファージから
の制限断片を、λ００１−００９中のコード化配列のさ
らに上流又は下流に広がる２個のファージのためのＥＭ
ＢＬ−３ライブラリーをスクリーンするために、使用す
ることができる。このライブラリーは、ファージが同定
される迄この方法で再スクリーン可能であり、これはｃ
ＤＮＡｓ　Ｆ−１又はＦ−１エキソン１−４プローブの
消失領域に対合する。これを実行するための方法は第１
［、Ｅ、３節に詳細に記述され、これはλＭＢ３の分離
を記載している。
代わりに、システィンプロテアーゼに対するｃＤＮＡｓ
を分離するために、比　コンドルラスｃＤＮＡＦ−１お
よびｖ−２４、又は、これらの０１オステルタジアハイ
ブリツド形成領域のいかなるものも使用しうる。ポリ（
Ａ）”　ｍＲＮＡは０．オステルタジＸＬ３ｓ、Ｌ４ｓ
から、又は、好ましくは成虫から分離可能であり、第■
（２）節に記載された方法を用いてｃＤＮＡライブラリ
ーをつくるために使用可能である。
ＣＤＮＡライブラリーハ、”Ｐラヘル化Ｆ−１又ハＶ−
２４ｃＤＮＡｓ、又はＯ，オステルタジシステインプロ
テアーゼ遺伝子（アガロースゲルから精製）の３１１ｐ
ラベル化制限断片を使用し、第１Ｉ　（Ｆ）およびＩＩ
　（Ｋ）（３）節に記載されたハイブリッド形成条件を
使用してスクリーンすることができる。第１Ｉ（Ｅ）（
１）節に記載されているように、不完全ｃＤＮＡｓの５
−末端からのオリゴヌクレオチドを使用してｃＤＮＡラ
イブラリーを再スクリーニングすることにより、０゜オ
ステルタジシスティンブロテアーゼに対する全長さのｃ
ＤＮＡｓを単離することかできる。
代わりに、龜オステルタジ遺伝子のヌクレオチドおよび
演欅されたアミノ酸配列に基づいて合成されたオリゴヌ
クレオチドを使用して、“偽ｃＤＮＡ”を構築すること
が可能である。“偽ｃＤＮＡ”を構築するための他の代
替方法は、インビトロの突然変異法によってイントロン
配列を削除することてあろう。
０、オステルタジシステインブロテアーゼｃＤＮＡｓ又
は“偽ｃＤＮＡ”は次いて組換えタンパク質の合成のた
めに、第１［（１）節に記載されているような発現ベク
ター内で発現させることがてきる。この組換えタンパク
質は、０．オステルタジの感染から牛を保護するために
、牛に投与することができる。
Ｈ，コントルラスおよび０．オステルタジについて記述
した方法と同様の方法は、あらゆる寄生性の線虫からシ
スティンプロテアーゼ遺伝子を単離するために使用する
ことができる。システィンプロテアーゼ遺伝子をワクチ
ンとして使用することができる寄生性の線虫の例は、こ
れに限定されないか、他のへモンチュース種、他のオス
テルタジア種、トリコストロンギルス種（Ｔｒｉｃｈｏ
ｓｔｒｏｎ−ｇｙｌｕｓ）、コーベリア種（Ｃｏｏｐｅ
ｒｉａ）、アスカリス種（Ａｓｃａｒｉｓ）、トキツカ
ラ種（Ｔｏｘｏｃａｒａ）、鉤虫［アンシロストーマ（
Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ）およびネカトール種（Ｎｅｃ
ａｔｏｒ）　］、フィラリア線虫［ジロフィラリア（Ｄ
ｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）およびプルギア種（Ｂｒｕｇｉ
ａ）］およびトリキネーラ種（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ
）を含む。
Ｑ、１．：＋ントルツス５５Ａ、　５５Ｂおよび５５Ｃ
ｋＤａタンパク質の０．オステルタジ同族体の分離Ｈ，
コントルツス５５Ａ、　５５Ｂおよび５５ＣｋＤａの遺
伝子の同族体をコード化する０、オステルタジ（および
他のいずれの寄生性の線虫）の遺伝子は、ハイブリッド
形成プローブとしてｃＤＮＡｓ　８４−１および８４−
２（５５Ａ）、　８４−８（５５−Ｂ）、又は８４−４
（５５−Ｃ）を使用して、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡフ
ァージライブラリーから分離することかできる。これら
の遺伝子の分離のために示唆されたハイブリッド形成条
件は、第１１．Ｐ、３節に記載されているものであり、
これは、Ｈ，コントルツスシステインブロテアーゼＤＮ
Ａプローブ（ｃＤＮＡ　Ｆｌ）を使用する０、オステル
タジシステインブロテアーゼ遺伝子の分離を詳述してい
る。示唆されている前ハイブリッド形成、ハイブリッド
形成および洗浄溶液は３０％又は４０％のホルムアミド
を含有すべきである。この分野における専門家に知られ
た他の演鐸されたハイブリッド形成の緊縮条件も満足し
て使用できる。
Ｈ，コントルラス５５Ａ（８４−２）　ｃＤＮＡを使用
して、０、オステルタジから５５ｋｄの同族体を分離す
る例は、第５６図に示されている。この図は５５Ａ　ｃ
ＤＮＡを使用して０．オステルタジから選択されたＥＭ
ＢＬ−３ゲノムクローンの地図を描写している。ｃＤＮ
ＡはＥｃｏＲＩを存する制限酵素により５°および３゛
領域に切断された。７５０ｂｐの小さい方の断片はクロ
ーンの５′領域を表わす；　　９００ｂｌ）の長い方の
断片は３領域を表わす。各断片はラベル化され、別個の
ハイブリッド形成プローブとして使用された。
５５Ａプローブは、第１［、Ｐ、３節に記載されている
ように、３２℃で４０％ホルムアミドを使用して、０、
オステルタジＥＭＢＬ−３ライブラリーの一セットの二
重リフトに対合させた。両方のプローブと交差ハイブリ
ッド結合する、１２個の初期のホジティブである、００
５５Ａ−１から−１２が選択され、そして、プラークは
精製された。第５６図に示されている０、オステルタジ
５５Ａ−１１、ゲノムクローンの地図は、同様にして選
択されたこの種から得られる５５ｋｄタンパク質の１個
の同族体を表わす。
■、コラーゲンペプチドの実施例 Ａ、コラーゲンペプチド保護の実験 １、実験の目的 約１２ケ月令の、寄生虫を保持しない羊に対して、フロ
イント完全アジュバント中に乳化した１■のコラーゲン
ペプチド：　ＬＫＨ共役体（第１［［（Ｂ）節中に記載
したとおりのもの）（ワクチン化群）、又はアジュバン
トのみ（コントロール群）を、数ケ所に筋肉内注射した
。１ケ月後に、この羊はフロイント不完全アジュバント
中に乳化した０、５■のコラーゲンペプチド：　　ＫＬ
Ｈ共役体（ワクチン化群）またはアジュバントのみ（コ
ントロール群）の筋肉内投与により追加免疫した。１０
日後に、羊は１日当たり５００幼虫の投与量の２５００
へモンチュースコントルツスのさやでおおわれた第三段
階の幼生（ＳＬ３ｓ）で５日間、抗原投与された。幼生
は反羽内注入された。糞サンプルをその後２ケ月間隔て
集め、そして、数百ミリグラムのサンプル当たりのへモ
ンチュースコントルツスの卵の数を測定した。
この数は、相応の転換係数を乗することにより、糞１ｇ
当たりの卵（ＥＰＧ）に変換された。５６日目に虫の攻
撃後の羊を殺し、反側動物の第４胃を取り出し、成虫の
存在を試験した。発見された虫はすべて測定し、その性
別を鑑別した。試験前、後抗原注射、虫攻撃前および剖
検時に血液試料を集めた。血清試料は虫の攻撃に反応性
の抗体の存在を検定するために全成虫タンパク質抽出物
のウェスタンプロットをプローブするのに使用された。
抗駆虫活性（ａｎｔｉｈｅｌｍｉｎｔｉｃ）は虫の卵生
成（ＥＰＧ）の減少により、そして、剖検の際の虫の集
まりの減少により測定した。
２、結果 ワクチン化した、およびコントロールの年中で測定され
たＥＰＧおよび虫の全計数は第４表に掲げられている。
ワクチン化した羊は、コントロールである非ワクチン化
の羊に比較して、剖検時に虫の全計数において減少を示
した。剖検時における虫の全計数は、コントロールの羊
に比較して、ワクチン化した羊においては７３％少なか
った。２つのグループの間の虫の全計数は統計的分析に
より有意な差（ｐ＞０．０５）であった。
３、結論 −我々はこの研究からコラーゲンペプチドが羊において
免疫性であり、虫の集まりの減少により測定されるよう
に、ヘモンチュースコントルッス感染から羊を守るため
のワクチンとして使用することができると結論した。
我々は、線虫煩悶の幾つかの他の目および他の種からの
代表的な線主について、抗原性に関連する配列を有する
コラーゲンが存在することを検討した。我々は、２個の
自由生活性の線虫［Ｃ，エレガンス（Ｃ，ｅｌｅｇａｎ
ｓ）およびバナグレルス　レディビブス（Ｐａｎａｇｒ
ｅｌｌｕｓ　ｒｅｄｉｖｉｖｕｓ）の混合段階の集まり
１．２個の昆虫寄生性の線虫［ヘテロールアブディティ
スバクテリオフォーラ（Ｈｅｔｅｒｏｒｈａｂ−ｄｉｔ
ｉｓ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈｏｒｅ）およびネオアブレ
クターナカルポカプサエ（Ｎｅｏａｐｌｅｃｔａｎａ　
ｃａｒｐｏｃａｐｓａｅ）のダウェル（ｄａｕｅｒ）−
幼生１および４個の動物寄生性の線虫［オステルタジア
オステルタジ（Ｏｓｔｅｒ−ｔａｇｉａ　ｏｓｔｅｒｔ
ａｇｉ）　５Ｌ３ｓ、シロフイラリアイミチス（Ｄｉｒ
ｏｆｉｌａｒｉａ　１ｍｍ１ｔｉｓ）およびトキソカラ
カニス（Ｔｏｘｏｃａｒａ　ｃａｎｉｓ）成虫およびト
リキネラスヒラリス（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ　５ｐｉ
ｒａｌｉｓ）第一段階幼生１を試験した。これらの線虫
の系統発生的関係は第４３図に示されている。各々の線
虫は抗血清と強固に反応する多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）
高分子量タンパク質を保持していた（第４４図）。反応
性タンパク質の型は種特異的であった。少数の例外（例
えば、Ｐ、レディビブス中の幾つかのタンパク質）を除
いて、反応性タンパク質はコラゲナーゼ感受性であった
。
これらのタンパク質試料をクーマシーブルー染色したゲ
ルは、反応性タンパク質のコラゲナーゼ感受性が特異的
であり、一般的なタンパク質分解によるものでないこと
を示している（データは示されてない）。
ペプチドに対して生じた抗血清かこれらの線虫と反応す
るという事実は、このペプチドがそれらの目および種に
おける線虫および他の線虫により引き起こされる感染か
ら哺乳動物を保護するためのワクチンとして使用しうる
ことを示している。
Ｂ、線虫源および抽出手段 ヘモインチユースコントルラス５Ｌ３ｓおよび成虫は前
述のようにして羊から採取した。ヘモンチュースコンド
ルツスＸＬ３ｓは５Ｌ３ｓをインビトロでＣＯ□により
さやを取り除き、ＸＬ３Ｓをムルチンフィルター環を通
してはわずことにより得られた。ＸＬ３ｓは遠心により
集め、そして、凍結保存するか、又は、インビトロでＬ
４段階へ成長させた。オステルタジアオステルタジ５Ｌ
３ｓはへモンチュースコンドルッスに対して開発した方
法を僅かに修正したものを使用して、実験的に感染させ
た牛の糞から集めた。
混合状態の発達段階のＣ，エレガンスおよびパナグレル
スレディビブスを含有する集団は、スーザンベクテフシ
ｘｃｓｕｓａｎ　Ｂｅｋｔｅｓｈ、　Ｓｙｎｅｒｇｅｎ
、　　Ｉｎｃ、）から購入した。ジロフィラリアイミチ
スおよびトキソカラカニスの成虫は、ロバ−トゲリーブ
（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｇｒｉｅｖｅ、　Ｃｏ１ｏｒａｄｏ　
５ｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）からの好意により
提供された。トリキネラスビラリスＬｌはドナルドワッ
ソム（Ｄｏｎａｌｄ　Ｗａｓｓｏｎ。
υｎ１ｒｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）の
好意で得られた。ヘテロールアブディティスバクテリオ
フォーラ、およびネオアブレフターナ力ルポカブサエの
ダウェル幼生（ヘモンチュースコンドルツスのＳＬ３段
階に類似する捕獲された第三段階の幼生）はジ工−ムズ
ホワイト（Ｊａｍｅｓ　Ｗｈｉｔｅｓ、　Ｂｉｏｓｙｓ
　Ｃｏｒ−ｐｏｒａｔ　１ｏｎ）により送られた。虫は
使用される迄−７０°Ｃで凍結保存された。我々に送ら
れたＨ、バクテリオフォーラおよびＮ、カルボカプサエ
虫は０℃で船積みされ、到着まで一７０℃で保存された
。
ヘモンチュース　コトンルツス幼生、Ｐ、レディビブス
および０．オステルタジの抽出物は、１０ｍＭ）リス−
塩酸　ｐＨ７，４，１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１
ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド中で虫を音波
処理し、最終濃度が１％ＳＤＳ。
０、１２５Ｍ　）リス−塩酸ｐＨ６，８，５％ＢＭＨに
なるような混合物に希釈し、この試料を２分間沸とうす
ることにより製造された。混合されたＣ、エレガンスの
集まり、および、Ｈ，バクテリオフォーラの幼生および
Ｎ、カルポカブサエの幼生は、１％ＳＯ３，０，１２５
Ｍのトリス−塩酸ｐＨ６，８，５％ＢＭＥの溶液中て２
分間沸とうさせた。ヘモンチュースコントルツス成虫、
Ｔ、カニメおよびり、イミチスは、カミソリの刃で切断
するか、凍結した虫をモルタルすりつぶすことにより破
壊し、１％ＳＯ３゜０．１２５Ｍ）リス−塩酸　ｐＨ６
，８，５％ＢＭＥ中で沸とうさせる前に液体窒素上です
りつぶした。沸とう後に、虫は室温で１晩振とうさせ、
そして、使用時まで一２０°Ｃで抽出物を保存した。主
に表皮に由来する不溶性物質は、抽出物から除去しなか
った。
Ｃ，ペプチド合成およびにＬＨへのカップリング第４５
図に示される配列を有する１８個のアミノ酸の長さのペ
プチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　
Ｍｏｄｅ１４３０Ａ、ペプチドの合成機を使用して合成
された。
ペプチドは、スーザンホルバス（Ｓｕｚａｎｎｅ　Ｈｏ
ｒｖａｔｈ）により開発され、ジヲンアベルソン（Ｊｏ
ｈｎ　Ａｂｅｌｓｏｎ）により本発明者に連絡された方
法を使用して、ＫＬＨに結合された。１０ｍｇのＫＬＨ
を１ｒｎｌのＰＢＳに溶解し、室温で２４００ナノモル
のスクシンイミジル４−（Ｎ−マライミドーメチル）シ
クロヘキサン−１カルボキシレート（Ｐｉｅｒｃｅ）と
３０分間反応させた。
１２■のペプチドは３００μｌの４Ｍグアニジン塩酸：
　ＰＴＳ　ｐＨ７，５に溶解させ、３７℃で３０分間ジ
チオスレイトールで還元し、溶液のｐＨを１７％Ｈ，Ｐ
Ｏ４で３−４に調整した。修飾したＫＬＨおよび還元し
たペプチドは、次いで、４Ｍグアニジン塩酸：　ＰＢＳ
　ｐＨ７，５で平衡化したセファデックスＧ−１０の５
艷のスピンカラムの頂部に層として置いた。このカラム
は、ＩＥＣ臨床用遠心分離器においてセツティングｂで
１分間遠心分離し、４Ｍのグアニジン塩酸二ＰＢＳ　ｐ
Ｈ７，５の３００μ！で洗浄し、再び沈澱させた。
フロースルー（ｆ　ｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）の状態で
のＫＬＨ：ペプチド共役体は４℃で保存した。８■のＫ
ＬＨが回収されウサギに対する免疫投与量を決定するた
めの計算において使用された。ＫＬＨに対するペプチド
の結合効率は決定されなかった。
−１−ｌｌ’ｌ　　Ｌｌ’ｌ　　Ｌｌ’１−　　　≧ｇ
＠”Ｈ！！蕊耗１ 一 を１ｔぞ０水仏　　　　　　　表終ｆｌｐ仁赫ｌ　　　
　　閣　　　　　　　　　　　　　　　１ｍａｌｌ　　
　　　　　１−　　　　　　　　　　　　　　　　　詐
旙（、（ａ）・ｊｌ？ｌ’Ｊ ＰｒＯＣ，Ｎａｔｌ、　　ＡＣａｄ、　　Ｓｃｉ　　　
ＵＳＡ［１０，３９６３−３９６５゜ ａｓｎｔｏｎ、ｌ−１，０４：よぴｏａｖＬｓ、　ｕ、
ｗ、　　　（１９７〕）Ｓｃｉ＠ｎｃｅ １９６．１ｅＯ−１８２゜ ｃａｘｎ＊ｒ　ｘ、＠よびＭｏｏｒ−、Ｃ，）１．　　
（１９７８１Ｂｉａｃｈ＠ｍ、　　Ｊ。
１）３．　フ３−８３゜ Ｃａ５ａｄａｂａｎ、　　Ｍ、Ｊ、、　　Ｍａｒｔ１ｎ
＠ｚ−八ｒｉａｓ、　　＾、、　　５ｈａｐＬｒａ、　
　Ｓ、Ｋ　　店、よひ１１Ｃ■盾浮■ Ｊ、　　（１９８３１ Ｍｔｈ、ＥｎｔｙｍｏＬｏｇｙ １００．２１１３−３０８゜ Ｃｈａｎ、Ｓ、Ｊ、ｒ　　Ｓｅｇｕｎｄｏ、ＬＨ，、Ｍ
ｃＣｏｒｍｉｃｋ、Ｍ、ＢＪよにＳｅｍ１ｎａｒ、ｏ、
ｒＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａａａｄ、ＳＣＬ、ＬＩＳＡ８
３、　フッ２１−フフ２５１ Ｃｈｉｘｇｗｉｎ、　Ｊ、Ｍ、、　Ｐｒｚｙｂｙｌａ、
　Ａ、！、、　ＭａｃＤｏｎａｌｄ、　Ｒ，Ｊ、ｊｉｆ
σＲｕｔｔｅｒ。
冒、Ｊ、　　　（１９）９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｌｌ、　　５２９４−５２９９゜ Ｃ１５ｗ＊ｌｌ、　　Ｄ、Ｂ、　　　（１９）２）Ｊ、
Ｂａａｔ＠ｒｉｏｌｏｇｙ １１０、　６６７−６７６゜ ＣｏＭｎ、　　Ｌ、％４．．　　ＣｏｇｈＬａｎ、　　
Ｖ、Ｍ、ｊ２よ０口１ｈｅｌ、　　Ｉ、、Ｃ，９１９８
６１Ｇ・ｎｅ ４Ｂ、　　２１９−２２７゜ 口ａｖ４ｓ、　　Ｒ，Ｗ、、　　１ｌｏｔｓｔｓｉｎ、
　　Ｄ、　ｔ、、ｇσＲｏｔハ、　　Ｊ、　　　（１９
８０１＾ｄｖａｎｃａｄ　　１１ａａｔａｒＬａｌ　Ｇ
ｓｎ＠ｔＬａｓ。
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒａｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、
　Ｎ、Ｙ。
ｇｆｓｔｒａｔｉａｄＬｍ、　　＾、ア・よＪ区ａｆａ
ｔｏａ、Ｆ、Ｃ，（１９７ｓ）Ｍ＠ｔｈｏｄｓ　Ｌｎ　
Ｍｏｉ・ｃｕｉａｒ　ＩＩＬｏｌｏｇｙｌｌ、ｌ−１２
４゜ ＦｒＬｓｃｈａｕｆ、Ａ、、Ｌ＠ｈｒａｃｈ、Ｉｆ、、
Ｐｏｕ＠ｔｋａ、　　入、劣、χσＭｕｘｒａｙ、Ｎ。
Ｊ、Ｍｏ１．ｌ１ｉｏ↓。
ｌ）０．　Ｂ２フー＠４２゜ ０ｒｕｎａｔ＠Ａｒｔ、　　Ｍ４ｔｊ６１１ｏｇｎｏｍ
ｓ、　　Ｄ、　　　（１９７５１９ｒｏｃ、Ｎａｃｌ、
　　Ａａａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ７２、　コ９６
１゜ Ｇｕａｒｓｎｔｓ、Ｌ、、ＬＡｕ＠Ｆ、Ｇ、ｇＲｏｂｅ
ｒｔｓ、Ｔ、Ｍ、弯＋よ（ンゝ！’ｔａａｈｎａ、Ｉイ
。
２０、５４３−５５３゜ Ｈｏ１ｍ＠ｓ、　　ｏｐｓ、あ、よｇ　Ｑｕｉｇｌ＊ｙ
、　　Ｍ、　　　（１９ｆ１１）＾ｎａｐ、　　ＢＬｏ
ｃｈｗａ。
１４．１９３゜ ）１ｏ七ａｍ、Ｐ、Ｊ、、Ｔｗａｎｇ、Ｎ、ム、、ＭＣ
Ｋ＠ｒＫＩＷ、Ｊ、）１．＄７よσＣａｒａｍＬ　　八
（１９＋１５１ Ｊ、　　Ｒｌａｌ、Ｃｈ＠飄。
スｇｏ、　　）３４コーフ３４６゜ Ｌａａ＋＋ｗ＋ＬＬ、　　υ、に、Ｊ：よぴゝＦａｖｒ
ｅ、　　Ｍ、　　　（１９）３）Ｊ、Ｍｏ１．　８１口
１゜ １１０、！１７５−５９９゜ Ｌｅｈｒａｃｈ、　Ｈ，、Ｄｉａｍｏｎｄ、　Ｄ、、　
Ｗｏｚｎｅｙ、　Ｊ、Ｈ，４，よ（ｊ−Ｂｏｅｄｔｋｅ
ｒ、　Ｈ。
（１９フフ］ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６、　４７４３−４７５１゜ ＭａＸａＪｌｌ、＾、Ｈ，ｉ、ｚ４　ａｔｘｂｏｔｔ、
　）１．　　（１９８０１ｇ＠ｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｌｏｔ。
１１３、　２３７−２５１゜ Ｓａｎｇｅｒ、　　Ｆ、、　　Ｎ１ａｋＬｅｎ、　　Ｓ
、ろｔよりゝＣｏｕ１ｍｏｎ、　　八、Ｒ，＋１９７７
）Ｐｒｏｃ、　　Ｈａｔｅ、　　Ａａａｄ、　　ＳｃＬ
、　　ＵＳＡｔＬｔａｎＬ、　Ｋ、　　（１９１１３１
ＰＩ：ｏＱ、　　Ｍａｒ＋１．　　入ｃａｄ、　　Ｂｃ
Ｌ、　　υＳ八へ１０、　３６６６−３６）Ｏ。
ＴｏｗｂＬｎ、　　！、、　　Ｓｔ、ａ＠ｈ＠ｌｉｎ、
　　Ｔ、ありよ伏Ｇａｒｄｅｎ、　　Ｊ、　　　（１９
）９）ｐｒｏＣ，Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓａｄ
、　　υＳ＾Ｓｃ、　４３５０−４３５４゜ ％４ａｄａ、に、、　　丁ａｋａＬ、Ｔ、およＪＴａｎ
ａｂ−−、（１９１１））ｓｕｒ、　　ｙ、　　！ＩＬ
ｕｖｌ＋＊５−１ｇ７．１３−１８゜ Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，Ａ、か＠−；ＤａＶＬＭ、　Ｒ，凱
（１９８３１Ｓｃｉ・ｎＣ＠ ８０．０９４−１１９１１゜
【図面の簡単な説明】
第１図は生きたＸＬ３およびＬ４の１２５Ｉ−標識化に
より得られたタンパク質パターンを示す図、第２図は細
菌性コラ−ゲナーゼで処理したＸＬ３およびＬ４表面タ
ンパク質のオートラジオグラムを示す図、 第３図はエンドグリコシダーゼＦで処理後のＸＬ３およ
びＬ４表面タンパク質のオートラジオグラムを示す図、 第４図は種々の抗−角質血清を用いる生きたＸＬ３およ
びＬ４の蛍光顕微鏡写真、 第５図は１２５１−標識ＸＬ３表面タンパク質と免疫ヒ
ツジ血清との免疫沈降を示す図、 第６図は１２５ｉ−標識ＸＬ３表面タンパク質と免疫ヒ
ツジ血清との免疫沈降を示す図、 第７図は＋２５（−標識し４表面タンパク質と免疫ヒツ
ジ血清との免疫沈降を示す図、 第８図はエンドグリコシダーゼＦで処理する前（−レー
ン）または後（＋レーン）の１２５１−標識Ｌ４表面タ
ンパク質の免疫沈降を示す図、第９図は１２５１表面標
識化により同定されそして種々の抽出操作により精製さ
れたヘモンカス・コントルツスＸＬ３およびＬ４表面タ
ンパク質の比較を示す図、 第１０図はＸＬ３およびＬ４表面タンパク質抽出物に対
して生成されたウサギ抗血清とインキュベートした生き
たヘモンカス・コントルツスＸＬ３およびＬ４の蛍光顕
微鏡写真、 第１１図は１２５■−標識ＸＬ３（左図）およびＬ４　
（右図）表面タンパク質と、表面タンパク質に対して調
製されたウサギ抗血清との免疫沈降反応を示す図、第１
２図は３５　ｋＤａプロテアーゼに対して調製されたウ
サギ抗血清のゲル精製および特性決定を示す図、 第１３図は組換えファージクローンにより選択された抗
体のウェスタンプロット分析を示す図、第１４図はｃＤ
ＮＡ　２Ｂ、　　３−１およびＦ−１の関係を示す図、 第１５図はＡＣ−１のヌクレオチドおよび予想されるア
ミノ酸配列を示す図、 第１６図はＡＣ−１ｍＲＮＡ転写物のノーザンプロット
分析を示す図、 第１７図はＡＣ−１の予想したアミノ酸配列とヒトカテ
ブシンＢとの比較を示す図、 第１８図はエンドグリコシダーゼＦによるＡＣ−１の脱
グリコジル化を示す図、 第１９図は活性部位システィン周辺の、カテプシンＢ、
パパインおよびＡＣ−１のアミノ酸配列の比較を示す図
、 第２０図はＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ
　ＡＣ−２遺伝子の制限酵素地図およびエキソン／イン
トロン組織を示す図、 第２１図、　Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔ、
ｕｓ　ＡＣ−２遺伝子のヌクレオチドおよび推定アミノ
酸配列を示す図、第２２図はＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃ
ｏｎｔｏｒｔｕｓ　ＡＣプロテアーゼ遺伝子のサザンプ
ロット分析を示す図、第２３図はＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ
　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ　ＡＣプロテアーゼｍＲＮＡのノ
ーザンプロット分析を示す図、第２４図ハブラスミド１
）ＳＥＶ６：：ＡＣ−１（７）構築同第２５図はＥ、　
ｃｏｌｉ中の組換えＡＣ−１：　：βガラクトシダーゼ
融合タンパク質の発現を示す図、第２６図は組換えＡＣ
−１プロテアーゼに対して作成したウサギ抗血清と成虫
タンパク質のウェスタンプロット分析を示す図、 第２７図はＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ
　ＡＣ−１（ＡＣ−２）プロテアーゼの発達期の発現を
示す図、 第２８図はｃＤＮＡ　ｈａｅｍ　Ｖ２４のヌクレオチド
および推定アミノ酸配列を示す図、 第２９図はｃＤＮＡ　ｈａｅｍ　Ｖ２２のヌクレオチド
および推定アミノ酸配列を示す図、 第３０図はＥ、ｃｏｌｉ中に発現するＡＣ−１のクーマ
シー染色ゲルおよびウェスタンプロットを示す図、第３
１図は３５　ｋＤａ組換えタンパク質の単離からの部分
のクーマシー染色した５ＤＳ−ＰＡＧＥを示す図、第３
２図は抗凝血物質アッセイの染色した５ＤＳ−ＰＡＧＥ
を示す図、 第３３図は抗凝血物質のシルバー染色５ＤＳ−ＰＡＧＥ
を示す図、 第３４図は３５　ｋＤａポリペプチドに対する抗血清を
使用した抗凝血物質阻止アッセイを示す図、第３５図は
“免疫複合体”実験のゲル分析を示す図、 第３６図は第３５図記載の実験の“免疫複合体”構成物
のウェスタン分析を示す図、 第３７図は免疫ヒツジ血清による酵素阻止のゲル分析を
示す図、 第３８図はλ００２中のシスティンプロテアーゼのヌク
レオチドおよび推定アミノ酸配列を示す図、第３９図は
λ００３中のシスティンプロテアーゼのヌクレオチドお
よび推定アミノ酸配列を示す図、第４０図はλ００４中
のシスティンプロテアーゼのヌクレオチドおよび推定ア
ミノ酸配列を示す図、第４１図はλ００７中のシスティ
ンプロテアーゼのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列
を示す図、第４２図は０３ｔｅｒｔａｑｉａシステイン
プロテアーゼの配列とＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ＡＣ−１
システインプロテアーゼの配列と比較を示す図、 第４３図は抗ペプチド抗血清と反応するコラーゲンの存
在を調べた線虫の系統的関係を示す図、第４４図は抗ペ
プチド抗血清と交互反応するコラーゲンの存在について
種々の線虫のウェスタンプロット分析を示す図、 第４５図はｔ（ａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕ
ｓコラーゲンペプチド免疫原の場所およびアミノ酸配列
を示す図、第４６図はＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ成虫タン
パク質の成虫タンパクロット（Ａ）およびＲｂ−１０２
８４抗血清て単離したファージクローン８４−１−８４
−１７より選択した抗体と反応した精製抗凝血物タンパ
ク質のウェスタンプロット（Ｂ）を示す図、 第４７図はＲｂ−１０２８４抗血清から、ファージ８４
−１．８４−２．８４−３、および８４−４により選択
した抗体と反応するＨ、　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓタンパク
質の発達期のウェスタンプロットを示す図、 第４８図はｃＤＮＡ８４−１および８４−２の部分制限
酵素地図を示す図、 第４９図はｃＤＮＡ　８４−１および８４−２の完全な
ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す国策５０図
はＥｃｏＲＩ（Ｅ）、ＢａｍＨＩ（Ｂ）および５ａｉｌ
（Ｓ）で消化したＨ、　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓＤ　Ｎ　Ａ
のサザンプロットを示す図、 第５１図は制限酵素で消化したλＭＢＩ、λＭＢ３、λ
００２およびλ００７ＤＮＡのサザンプロットのオート
ラジオグラムを示す図、 第５２図は０．　ｏｓｔｅｒｔａｇｉシステインプロテ
アーセ遺伝子を含有する組換えλＥＭＢＬ−３ファージ
の部分制限酵素地図を示す図、 第５３図は、配列決定されたλ００２、λ００３、λ０
０４、およびλ００７の領域の拡大版を示す図、第５４
図はｃＤＮＡ　８４−４の部分ヌクレオチド配列を示す
図、 第５５図はｃＤＮＡ　８４−８の部分ヌクレオチド配列
を示す図、および 第５６図はＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ　５５Ａタンパク質
の相同体をコードする０、　ｏｓｔｅｒｔａｑｉ遺伝子
を含有する組換えλＥＭＢＬ３ファージ５５Ａ−１１の
制限酵素地図を示す図、である。 出願人　　シナ−ジエン、インコーポレーテッド代理人
　弁理士　　　　　平　木　祐　輔；へＩＴｉ：ｊ’／
で１ニット′内り召二変り、ＥＳＳ、　ｉ　、、ｌ　；
）ＦＩＧ、　ｉ ｒ−ｍ−−７ｒ□“７ ＦＩＧ、　２ にど」ＭＷ−÷　−＋−−１−−＋ ＦＩＧ、　３ ｆ−一繭−−崗岬−−−−−１＋＋　　　　　　　　　
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Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）２４ａｋＤａＸＬ３表面タンパク質、２６ｋＤａＸ
    Ｌ３表面タンパク質、３０ｋＤａＸＬ３表面タンパク質
    、３６ｋＤａＸＬ３表面タンパク質、６８−９７ｋＤａ
    ＸＬ３表面タンパク質および１８０ｋＤａＸＬ３表面タ
    ンパク質からなる群から少なくとも１種を含有する、１
    ２５Ｉ−表面標識調査により同定されそしてＸＬ３から
    １％ＳＤＳにより可溶化された表面タンパク質。 ２）２４ｂｋＤａＸＬ３表面タンパク質および３０ｋＤ
    ａＸＬ３表面タンパク質からなる群の少なくとも１種を
    含有する、表面標識調査により同定されそしてＸＬ３か
    ら１％ＳＤＳおよび５％ＢＭＥにより可溶化された表面
    タンパク質。 ３）２７ｋＤａＬ４表面タンパク質、２７ｋＤａＬ４表
    面タンパク質、３６ｋＤａＬ４表面タンパク質、７８ｋ
    ＤａＬ４表面タンパク質、２００ｋＤａＬ４表面タンパ
    ク質、１６ｋＤａＬ４表面タンパク質、１８ｋＤａＬ４
    表面タンパク質、１９ｋＤａＬ４表面タンパク質、４２
    ｋＤａＬ４表面タンパク質、５４ｋＤａＬ４表面タンパ
    ク質および９３ｋＤａＬ４表面タンパク質からなる群の
    少なくとも１種を含有する、１２５Ｉ−表面標識調査に
    より同定されそして虫から１％ＳＤＳにより可溶化され
    た表面タンパク質。 ４）１８０ｋＤａＬ４表面タンパク質を含有する、１２
    ５Ｉ−表面標識調査により同定されそしてＬ４から１％
    ＳＤＳおよび５％ＢＭＥにより可溶化された表面タンパ
    ク質。 ５）寄生虫である線虫を緩衝剤中の１％ＳＤＳまたは１
    ００ｍＭＮａＣＩ中で煮沸し、虫を遠心分離して除去し
    そして上清液中の表面タンパク質を濃縮することからな
    る、寄生虫線虫からの表面タンパク質の精製法。 ６）ヘモンカス・コントルツス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ
    　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）虫を緩衝剤中でホモジナイズし
    、該ホモジナイズ化から生ずる可溶性タンパク質を分子
    量サイジングカラムで分子量別に分別し次にＦＰＬＣＭ
    ｏｎｏＱカラムクロマトグラフィーを行うことからなる
    方法により調製された、ヘモンカス・コントルツスから
    ヒツジを防御するための抽出物。 ７）該抽出物がフィブリノゲン−分解アッセイにおいて
    フィブリノゲン分解能力を示す、請求項６記載の抽出物
    。 ８）請求項６記載の抽出から得られたヘモンカス・コン
    トルツスタンパク質。 ９）３５ｋＤａタンパク質、３７ｋＤａタンパク質およ
    び５５ｋＤａタンパク質からなる群から選択された請求
    項８記載のヘモンカス・コントルツスタンパク質。 １０）３５ｋＤａタンパク質、３７ｋＤａタンパク質お
    よび５５ｋＤａタンパク質からなる群から選択された請
    求項６記載の抽出物中のタンパク質の少なくとも１種に
    相当するヘモンカス・コントルツスタンパク質。 １１）該タンパク質が組換えＤＮＡ法により得られる、
    請求項１０記載のヘモンカス・コントルツスタンパク質
    。 １２）組換えＤＮＡ法により生成され、Ａｃ−１、Ａｃ
    −２、Ａｃ−３およびＡｃ−４のＤＮＡ配列と交差ハイ
    ブリダイズする遺伝子またはｃＤＮＡによりコードされ
    るプロテアーゼを含有する、ヘモンカス・コントルツス
    システインプロテアーゼ。 １３）組換えＤＮＡ法により生成され、１００１−１０
    ０９に存在するＤＮＡ配列により少なくとも一部分コー
    ドされるオステルタジア・オステルタジ（Ｏｓｔｅｒｔ
    ａｇｉａＯｓｔｅｒｔａｇｉ）システインプロテアーゼ
    。 １４）組換えＤＮＡ法により生成され、ヘモンカス・コ
    ントルツス遺伝子Ａｃ−１、Ａｃ−２、Ａｃ−３、Ａｃ
    −４と、または１００１−１００９に存在するオステル
    タジア・オステルタジシステインプロテアーゼと交差ハ
    イブリダイズするオステルタアジ・オステルタジシステ
    インプロテアーゼ。 １５）請求項６記載の抽出物に存在するヘモンカス・コ
    ントルツスタンパク質の少なくとも１種に対して調製さ
    れた抗血清と反応するオステルタジア・オステルタジタ
    ンパク質。１６）該タンパク質が、ヘモンカス・コント
    ルツス３５ｋＤａタンパク質および５５ｋＤａタンパク
    質の少なくとも１種に対して調製された抗血清と反応す
    る、請求項１５記載のタンパク質。 １７）組換えＤＮＡ法により生成され、ヘモンカス・コ
    ントルツス遺伝子Ａｃ−１、Ａｃ−２、Ａｃ−３、Ａｃ
    −４と、または１００１−１００９に存在するオステル
    タジア・オステルタジシステインプロテアーゼと交差ハ
    イブリダイズする遺伝子またはｃＤＮＡによりコードさ
    れる寄生虫線虫システインプロテアーゼ。 １８）請求項６記載の抽出物中のヘモンカス・コントル
    ツスタンパク質に対して調製された抗血清と反応する寄
    生虫線虫タンパク質。 １９）該タンパク質が、ヘモンカス・コントルツス３５
    ｋＤａタンパク質および５５ｋＤａタンパク質の少なく
    とも１種に対して調製された抗血清と反応する、請求項
    １８記載のタンパク質。 ２０）該タンパク質が組換えＤＮＡ法により得られるも
    のである、請求項１９記載のタンパク質。 ２１）請求項６記載の抽出物のタンパク質に結合する抗
    体を生成せしめるものである、請求項６記載の抽出物の
    タンパク質のペプチド配列。 ２２）請求項６記載の抽出物のタンパク質またはタンパ
    ク質のペプチド配列に結合し、植物、動物またはヒトを
    寄生虫である線虫の感染から防御するのに治療的または
    予防的に使用できる抗血清またはモノクローナル抗体。 ２３）組換えＤＮＡ法により生成され、ｃＤＮＡ８４−
    １、８４−２、８４−４または８４−８により少なくと
    も一部分にコードされるタンパク質を含有するヘモンカ
    ス・コントルツス５５ｋＤａタンパク質。 ２４）組換えＤＮＡ法により生成され、ｃＤＮＡ８４−
    １、８４−２、８４−４または８４−８と交差ハイブリ
    ダイズする遺伝子またはｃＤＮＡにより少なくとも一部
    分にコードされるタンパク質を含有するヘモンカス・コ
    ントルツス５５ｋＤａタンパク質。 ２５）λＭＢ７−１７に存在するＤＮＡ配列により少な
    くとも一部分コードされるヘモンカス・コントルツス５
    ５ｋＤａタンパク質。 ２６）組換えＤＮＡ法により生成され、ヘモンカス・コ
    ントルツス５５Ａ、５５Ｂまたは５５Ｃタンパク質をコ
    ードするＤＮＡ配列にハイブリダイズする遺伝子または
    ｃＤＮＡによりコードされる寄生虫線虫タンパク質。 ２７）組換えＤＮＡ法により生成され、λＭＢ４−６に
    存在するＤＮＡ配列により少なくとも一部分コードされ
    るヘモンカス・コントルツスシステインプロテアーゼ。 ２８）請求項６記載のタンパク質に結合するかまたはそ
    の酵素活性を阻害し、植物、動物またはヒトを線虫感染
    から防御するために予防的または治療的に使用できる有
    機分子。 ２９）線虫コラーゲンペプチドに相当する配列を有する
    実質的に純粋なコラーゲンペプチドの有効量および製剤
    上受容されうる担体を動物に投与することからなる、線
    虫に対して動物を予防接種する方法。
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