JPH04148680A - 生理活性物質生産細胞の選択方法 - Google Patents
生理活性物質生産細胞の選択方法Info
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- JPH04148680A JPH04148680A JP2272338A JP27233890A JPH04148680A JP H04148680 A JPH04148680 A JP H04148680A JP 2272338 A JP2272338 A JP 2272338A JP 27233890 A JP27233890 A JP 27233890A JP H04148680 A JPH04148680 A JP H04148680A
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は細胞刺激能を有する生理活性物質を短時間にて
簡便に定量できる測定法を利用することにより、当該生
理活性物質を生産する細胞を選択する方法に関する。さ
らに詳しくは、本発明は、任意の細胞より生産された細
胞刺激能を宵する生理活性物質をマウス白血病細胞Ｍｌ
に作用させ、当該細胞の還元能の上昇から生理活性物質
の含有量を測定することによって、生理活性物質の生産
細胞を従来法よりも短時間かつ簡便に選択したことを可
能とした方法に関する。
簡便に定量できる測定法を利用することにより、当該生
理活性物質を生産する細胞を選択する方法に関する。さ
らに詳しくは、本発明は、任意の細胞より生産された細
胞刺激能を宵する生理活性物質をマウス白血病細胞Ｍｌ
に作用させ、当該細胞の還元能の上昇から生理活性物質
の含有量を測定することによって、生理活性物質の生産
細胞を従来法よりも短時間かつ簡便に選択したことを可
能とした方法に関する。
従来生理活性物質の生産細胞の選択に際して、培養上清
中の生理活性物質を測定する方法として正常血液細胞ま
たは正常骨髄細胞、あるいは、Ｍ１細胞などの白血病細
胞から機能細胞への銹導能、例えば抗体産生能、貢食能
、細胞表面マーカーの変化、酵素活性の上昇、コロニー
形成能などで測定する方法が一般的であった。
中の生理活性物質を測定する方法として正常血液細胞ま
たは正常骨髄細胞、あるいは、Ｍ１細胞などの白血病細
胞から機能細胞への銹導能、例えば抗体産生能、貢食能
、細胞表面マーカーの変化、酵素活性の上昇、コロニー
形成能などで測定する方法が一般的であった。
これらの測定方法では、測定方法が煩雑であり多検体を
扱うことが難しく、即座に活性を測定し、生理活性物質
の高生産細胞を選択することが困難であった。
扱うことが難しく、即座に活性を測定し、生理活性物質
の高生産細胞を選択することが困難であった。
この課題の解決は、本発明、即ち細胞の培養上清をマウ
ス白血病細胞Ｍ１に作用させることにより、添加したテ
トラゾリウム化合物に対するＭｌ細胞の還元能を上昇さ
せ、かくして生成したホルマザン化合物の吸光度を測定
することを特徴とする特理活性物質生産細胞の選択方法
によって達成される。
ス白血病細胞Ｍ１に作用させることにより、添加したテ
トラゾリウム化合物に対するＭｌ細胞の還元能を上昇さ
せ、かくして生成したホルマザン化合物の吸光度を測定
することを特徴とする特理活性物質生産細胞の選択方法
によって達成される。
即ち、本発明は、細胞増殖あるいは、細胞増殖抑制試験
などに用いられている細胞内ミトコンドリアによるテト
ラゾリウム化合物の分解反応（Ｍ。
などに用いられている細胞内ミトコンドリアによるテト
ラゾリウム化合物の分解反応（Ｍ。
ｓｍａｎｎら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メ
ソッズ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ。
ソッズ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ。
ｄｓ）６５巻、５５頁（１９８３年））を考慮しつつも
、その細胞数依存的に反応することを利用した細胞数測
定の原理とは異なり、生理活性物質をＭｌ細胞の培養系
へ添加することより当該Ｍ１細胞当りのテトラゾリウム
化合物のフォルマザンへの還元能の上昇誘導を発見した
ことに基き、テトラゾリウムの還元量の測定をもって生
理活性物質を短時間に定量する方法を利用することによ
り生理活性物質の生産細胞を容易に選択する方法を発明
した。
、その細胞数依存的に反応することを利用した細胞数測
定の原理とは異なり、生理活性物質をＭｌ細胞の培養系
へ添加することより当該Ｍ１細胞当りのテトラゾリウム
化合物のフォルマザンへの還元能の上昇誘導を発見した
ことに基き、テトラゾリウムの還元量の測定をもって生
理活性物質を短時間に定量する方法を利用することによ
り生理活性物質の生産細胞を容易に選択する方法を発明
した。
さらに詳しくは、本発明は次の（ａ）から（ｅ）の工程
を特徴とする生理活性物質の活性測定法を利用した生理
活性物質の生産細胞選択方法である。
を特徴とする生理活性物質の活性測定法を利用した生理
活性物質の生産細胞選択方法である。
（８）生理活性物質産生細胞の培養上清によりマウス白
血病細胞Ｍ１の還元活性を上昇させ、 （ｂ）当該細胞
の上昇した還元能により、添加したテトラゾリウム化合
物をホルマザン化合物に変化させ、（Ｃ）そのホルマザ
ン化合物を細胞外に溶出、均一化させ、 （ｄ）溶出さ
せたホルマザン化合物の吸光度を測定し、 （ｅ）培養
上清中の生理活性物質を定量し、その中から生理活性物
質を目的の生産量で生産する細胞を選択する方法である
。
血病細胞Ｍ１の還元活性を上昇させ、 （ｂ）当該細胞
の上昇した還元能により、添加したテトラゾリウム化合
物をホルマザン化合物に変化させ、（Ｃ）そのホルマザ
ン化合物を細胞外に溶出、均一化させ、 （ｄ）溶出さ
せたホルマザン化合物の吸光度を測定し、 （ｅ）培養
上清中の生理活性物質を定量し、その中から生理活性物
質を目的の生産量で生産する細胞を選択する方法である
。
（１）生理活性物質
本発明で選択できる細胞の生産する生理活性物質は、マ
ウス白血病細胞Ｍｌにテトラゾリウム化合物の分解活性
を誘導するものであれば特に限定されない。例えば、分
化誘導因子（Ｄ Ｉ Ｆ）、インターロイキン−６（Ｉ
Ｌ−６）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）などが挙
げられる。
ウス白血病細胞Ｍｌにテトラゾリウム化合物の分解活性
を誘導するものであれば特に限定されない。例えば、分
化誘導因子（Ｄ Ｉ Ｆ）、インターロイキン−６（Ｉ
Ｌ−６）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）などが挙
げられる。
ＤＩＦは、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ ミ
ス ト リ −（Ｊ、 Ｂｌｏｔ、 Ｃ
ｈｅｍ、 ） ２６４巻、８９４１頁（１９８
９年）に記載されており、白血病細胞増殖抑制因子（Ｌ
ＩＦ）（プロシーデインゲス・ナチュラル・サイエンス
・アカデミ−・アメリカ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ。
ス ト リ −（Ｊ、 Ｂｌｏｔ、 Ｃ
ｈｅｍ、 ） ２６４巻、８９４１頁（１９８
９年）に記載されており、白血病細胞増殖抑制因子（Ｌ
ＩＦ）（プロシーデインゲス・ナチュラル・サイエンス
・アカデミ−・アメリカ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）８５巻、 ２６２３頁 （１９
８８年））、未分化細胞系白血病細胞増殖因子（ＭＩＬ
ＤＡ）（ネーチャー （Ｎａｔｕｒｅ）３３６巻、６８
８頁（１９８８年））と、同一もしくは、同等の物質で
ある。また、ＤＩＦは、マウス細胞由来のＬＩＦ（ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ ケ ミ ス ト リ
− （Ｊ、 ＢＩｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
） ２６３巻、９２３８頁（１９８８年）
） 、Ｄ−ｆａｃｔｏｒ（ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー （Ｊ、 Ｂｌｏｌ、 Ｃ
ｈｅｍ、 ）２５９巻、 １０９８７頁（１９８４年
））と、同等の物質であり、これらの因子も本測定法に
より測定することが可能である。これらの物質は、白血
病の分化誘導作用、神経細胞の分化誘導作用を有してい
ることから臨床への応用が示唆されている物質である。
８８年））、未分化細胞系白血病細胞増殖因子（ＭＩＬ
ＤＡ）（ネーチャー （Ｎａｔｕｒｅ）３３６巻、６８
８頁（１９８８年））と、同一もしくは、同等の物質で
ある。また、ＤＩＦは、マウス細胞由来のＬＩＦ（ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ ケ ミ ス ト リ
− （Ｊ、 ＢＩｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
） ２６３巻、９２３８頁（１９８８年）
） 、Ｄ−ｆａｃｔｏｒ（ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー （Ｊ、 Ｂｌｏｌ、 Ｃ
ｈｅｍ、 ）２５９巻、 １０９８７頁（１９８４年
））と、同等の物質であり、これらの因子も本測定法に
より測定することが可能である。これらの物質は、白血
病の分化誘導作用、神経細胞の分化誘導作用を有してい
ることから臨床への応用が示唆されている物質である。
インターロイキン６は、ＢＣＤＦ、ＢＳＦ−２とも同一
であり（ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３２４巻、７３
頁、 （１９８６年））、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分
化誘導作用（プロシーデインゲス・ナチュラル・サイエ
ンス・アカデミ−・アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃ１゜ＵＳＡ）、８２巻、５４９０頁（１９
８５年））が知られ、免疫増強作用薬への応用が期待さ
れている。
であり（ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３２４巻、７３
頁、 （１９８６年））、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分
化誘導作用（プロシーデインゲス・ナチュラル・サイエ
ンス・アカデミ−・アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃ１゜ＵＳＡ）、８２巻、５４９０頁（１９
８５年））が知られ、免疫増強作用薬への応用が期待さ
れている。
インターロイキン１に関し、代謝２５巻４３４頁（１９
８８年）に詳細が記載されている。
８８年）に詳細が記載されている。
（２）生理活性物質産生細胞の選択方法下記に物質産生
細胞選択のための生理活性測定方法の例を示すが、本発
明はそれらに限定されるものではない。
細胞選択のための生理活性測定方法の例を示すが、本発
明はそれらに限定されるものではない。
（ａ）被検体の調製
選択する細胞は、動物細胞に限らず植物、微生物由来の
細胞でも選択可能であり、またそれらの遺伝子組換え体
であっても、その培養上清が、Ｍｌ細胞のテトラゾリウ
ム化合物の還元能を上昇させるならば生理活性物質の目
的にあった生産量の細胞を選択することができる。また
、培養上清の代わりに細胞の抽出液を利用することも可
能である。被検体の例としてヒト黒色腫細胞株５ＥＫＩ
（Ｂｊｏｃｈｅｍ、Ｂｌｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、 Ｃｏｍ
ｍｕｎ、 １６０巻１０８５頁１９８９年）、ＴＰＡ等
で刺激したＴＨＰ−１細胞２分化誘導因子ＤＩＦの遺伝
子を誘導したチャイニーズハムスター卵巣細胞由来ＣＨ
Ｏ細胞（Ｐｒｏｃ。
細胞でも選択可能であり、またそれらの遺伝子組換え体
であっても、その培養上清が、Ｍｌ細胞のテトラゾリウ
ム化合物の還元能を上昇させるならば生理活性物質の目
的にあった生産量の細胞を選択することができる。また
、培養上清の代わりに細胞の抽出液を利用することも可
能である。被検体の例としてヒト黒色腫細胞株５ＥＫＩ
（Ｂｊｏｃｈｅｍ、Ｂｌｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、 Ｃｏｍ
ｍｕｎ、 １６０巻１０８５頁１９８９年）、ＴＰＡ等
で刺激したＴＨＰ−１細胞２分化誘導因子ＤＩＦの遺伝
子を誘導したチャイニーズハムスター卵巣細胞由来ＣＨ
Ｏ細胞（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ＋、ＵＳＡ ７７巻、４２１
６頁（１９８０年））やアフリカミドリザル由来のＣｏ
Ｓ細胞（Ｃｅ１１．２３巻、１７５頁（１９８１年））
など、そのＭ１細胞に対する刺激を施す物質を生産する
細胞の目的に合った生産量の細胞、特に高生産の細胞を
選択することができる。
６頁（１９８０年））やアフリカミドリザル由来のＣｏ
Ｓ細胞（Ｃｅ１１．２３巻、１７５頁（１９８１年））
など、そのＭ１細胞に対する刺激を施す物質を生産する
細胞の目的に合った生産量の細胞、特に高生産の細胞を
選択することができる。
（ｂ）Ｍｌ細胞の調製
マウス白血病細胞Ｍ１は、５％馬血清を含むイーグル基
本培地でＩ Ｘ １０６／ ｍ １以上増殖しないよう
定期的に継代した。培養により得られたＭ１細胞は、通
常目的の細胞上清１検体当り２ｘ１０４個程度が使用さ
れる。培地は、１０％胎児血清を含むイーグル基本培地
などを使用する。培養条件は、３６〜３８℃程度で、５
％のＣＯ２の条件下で６時間から３６時間培養する。Ｍ
１細胞は、市川により樹立されたマウス白血病細胞株で
、その詳細は、ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオ
ロジー（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｐｈｙｓｌｏｌ、７４巻、２２
３頁（１９６９年）に記載されており、本発明には、当
該細胞株もしくは、当該細胞株に由来する細胞を用いる
。
本培地でＩ Ｘ １０６／ ｍ １以上増殖しないよう
定期的に継代した。培養により得られたＭ１細胞は、通
常目的の細胞上清１検体当り２ｘ１０４個程度が使用さ
れる。培地は、１０％胎児血清を含むイーグル基本培地
などを使用する。培養条件は、３６〜３８℃程度で、５
％のＣＯ２の条件下で６時間から３６時間培養する。Ｍ
１細胞は、市川により樹立されたマウス白血病細胞株で
、その詳細は、ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオ
ロジー（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｐｈｙｓｌｏｌ、７４巻、２２
３頁（１９６９年）に記載されており、本発明には、当
該細胞株もしくは、当該細胞株に由来する細胞を用いる
。
（Ｃ）測定方法
測定には、好適に９６穴マイクロプレートが用いられる
。この場合、被検体は二倍段階希釈して培養に供するこ
とができる。
。この場合、被検体は二倍段階希釈して培養に供するこ
とができる。
添加した被検体との培養によって活性化したマウス白血
病細胞Ｍｌにテトラゾリウム化合物を添加する。テトラ
ゾリウム化合物としては、公知なものを用いればよいが
、好適には、３−（４，５ジメチルチアゾール−２−イ
ル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムプロミド（Ｍ
ＴＴ）が挙げられる。
病細胞Ｍｌにテトラゾリウム化合物を添加する。テトラ
ゾリウム化合物としては、公知なものを用いればよいが
、好適には、３−（４，５ジメチルチアゾール−２−イ
ル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムプロミド（Ｍ
ＴＴ）が挙げられる。
テトラゾリウム化合物は、適当な溶媒に溶解して１〜１
０ｍｇ／ｍｌとしておく。活性化したＭ１細胞の溶液に
テトラゾリウム溶液を適宜加えて攪拌した後３６〜３８
℃、５％ＣＯ２の条件下で１〜１０時間インキュベーシ
ョンする。
０ｍｇ／ｍｌとしておく。活性化したＭ１細胞の溶液に
テトラゾリウム溶液を適宜加えて攪拌した後３６〜３８
℃、５％ＣＯ２の条件下で１〜１０時間インキュベーシ
ョンする。
テトラゾリウム化合物は、被検サンプル中に含まれる生
理活性物質の活性量に応じて、細胞中の活性化デヒドロ
ゲナーゼによりホルマザン化合物に変化する。
理活性物質の活性量に応じて、細胞中の活性化デヒドロ
ゲナーゼによりホルマザン化合物に変化する。
次に、沈着色素を細胞から溶出させ、溶解する。
沈着色素の溶出溶媒としては、ジメチルスルホキシド、
塩化カリウム溶液、インプロパツール、ラウリル硫酸ナ
トリウム溶液などが挙げられるが、好適にはイソプロパ
ツール、またはラウリル硫酸ナトリウム溶液が用いられ
る。また、これらの組合せも用いることもできる。
塩化カリウム溶液、インプロパツール、ラウリル硫酸ナ
トリウム溶液などが挙げられるが、好適にはイソプロパ
ツール、またはラウリル硫酸ナトリウム溶液が用いられ
る。また、これらの組合せも用いることもできる。
色素の沈着した細胞に適量の溶出溶媒を加えて、１５分
〜１０時間程度放置し、色素を溶出する。
〜１０時間程度放置し、色素を溶出する。
また、テトラゾリウム化合物からホルマザン化合物への
反応を停止するために塩酸などを用いることが好ましい
が、より好適には、溶出溶媒中に含有させてお（。たと
えば、０．０４Ｎ塩酸含有イソプロパツールなどが例示
される。溶出液の吸光度の測定をする際、波長４６０〜
６３０ｎｍで測定するのが好ましい。約５７０ ｎｍで
吸光度を測定することがより好ましい。測定装置として
９６穴マイクロプレ一ト用分光光度計を用いることが好
ましい。
反応を停止するために塩酸などを用いることが好ましい
が、より好適には、溶出溶媒中に含有させてお（。たと
えば、０．０４Ｎ塩酸含有イソプロパツールなどが例示
される。溶出液の吸光度の測定をする際、波長４６０〜
６３０ｎｍで測定するのが好ましい。約５７０ ｎｍで
吸光度を測定することがより好ましい。測定装置として
９６穴マイクロプレ一ト用分光光度計を用いることが好
ましい。
本操作に際して、コンピューターを用いることができ、
これによって自動的に多検体を測定することが可能とな
る。
これによって自動的に多検体を測定することが可能とな
る。
活性単位は、既知の標準品を用いた相対的な吸光度の度
合により被検体サンプルの生理活性物質の活性を算出す
ることができる。
合により被検体サンプルの生理活性物質の活性を算出す
ることができる。
以上の測定法を用いて測定することにより、培養上清中
の生理活性物質を測定し、生理活性物質の高生産細胞を
容易に選択することが可能である。
の生理活性物質を測定し、生理活性物質の高生産細胞を
容易に選択することが可能である。
実施例
下記に実施例を記するが、それにより請求範囲を限定す
るものではない。
るものではない。
実施例１
ヒト単球白血病細胞Ｔ ＨＰ −１（Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａ
ｎｃｅｒ２６巻１７１頁（１９８０年））、ヒト前骨髄
性白血病細胞ＨＬ −６０（Ｎａｔｕｒｕ ２７０巻
３４７頁（１９７７年））、 ヒト単球性白血病細胞
Ｍ Ｌ −１（Ｌｅｕｋｅｍｉａ １１９頁Ｇｕｎｚ他
編）、ヒト前骨髄性白血病細胞Ｕ９３７（Ｊ。
ｎｃｅｒ２６巻１７１頁（１９８０年））、ヒト前骨髄
性白血病細胞ＨＬ −６０（Ｎａｔｕｒｕ ２７０巻
３４７頁（１９７７年））、 ヒト単球性白血病細胞
Ｍ Ｌ −１（Ｌｅｕｋｅｍｉａ １１９頁Ｇｕｎｚ他
編）、ヒト前骨髄性白血病細胞Ｕ９３７（Ｊ。
Ｅｏ）、Ｍｅｄ、１４３巻１５２８頁、１９７６年）を
それぞれ１１００ｎ／ｍｌ Ｔ Ｐ Ａ 、 １＋ｓｇ
／園ｌレチノイン酸を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で２
ｘｌＯ’／ｍｌの密度とし、３７℃、５％炭酸ガス条件
下で４日間培養した。
それぞれ１１００ｎ／ｍｌ Ｔ Ｐ Ａ 、 １＋ｓｇ
／園ｌレチノイン酸を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で２
ｘｌＯ’／ｍｌの密度とし、３７℃、５％炭酸ガス条件
下で４日間培養した。
それぞれの培養上清の希釈系列の被検体、２×１０ ’
／ ｍ １の密度のＭｌ細胞および、１０％牛脂児血
清を含むイーグル基本培地（ＭＥＭ）１００μｍを９６
穴マイクロプレートの各人に添加した。
／ ｍ １の密度のＭｌ細胞および、１０％牛脂児血
清を含むイーグル基本培地（ＭＥＭ）１００μｍを９６
穴マイクロプレートの各人に添加した。
それらプレートを１２時間３７℃、５％炭酸ガスを含む
空気中で培養した後、それぞれにリン酸生理食塩水で溶
解した５ ｍ ｇ ／ ｍ ｌのＭＴＴ溶液を２０μ！
ずつ添加した。さらに、４時間３７℃で培養した後、０
．０１％塩酸を含む１０％ラウリル硫酸ナトリウムを１
００μ！添加して、３７℃でｌＯ時間インキコベートし
てフォルマザンを溶解した。そのプレートの各人におけ
る溶解したフォルマザンの５７０ｎｍの吸光度を測定し
た。これらの吸光度を、同時に行った分化銹導因子ＤＩ
Ｆ （Ｊ、Ｂｏｉｌ、Ｃｈｅｍ、２６４巻、８９４１頁
（１９１１９年））の希釈系列からの吸光度をＤＩＦ活
性相当量として定量し、それらの値を表−１に示した。
空気中で培養した後、それぞれにリン酸生理食塩水で溶
解した５ ｍ ｇ ／ ｍ ｌのＭＴＴ溶液を２０μ！
ずつ添加した。さらに、４時間３７℃で培養した後、０
．０１％塩酸を含む１０％ラウリル硫酸ナトリウムを１
００μ！添加して、３７℃でｌＯ時間インキコベートし
てフォルマザンを溶解した。そのプレートの各人におけ
る溶解したフォルマザンの５７０ｎｍの吸光度を測定し
た。これらの吸光度を、同時に行った分化銹導因子ＤＩ
Ｆ （Ｊ、Ｂｏｉｌ、Ｃｈｅｍ、２６４巻、８９４１頁
（１９１１９年））の希釈系列からの吸光度をＤＩＦ活
性相当量として定量し、それらの値を表−１に示した。
表−１の結果より、最も高いＤＩＦ活性相当量を示した
ＭＬ−１を生理活性物質高生産細胞として選択した。
ＭＬ−１を生理活性物質高生産細胞として選択した。
表−１
夾１１１主
ヒト黒色細胞Ｓ Ｅ Ｋ Ｉ （Ｂ［ｏｃｈｅｍ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。
ｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。
Ｃｏｍｍｕｎ、 １６０巻１０８５頁１９８９年）を１
０％牛脂児血清含むＲＰＭＩ培地で、５個／ｍｌの密度
に懸濁し、９６穴プレートに１００μｍのずつ分注した
。３７℃。
０％牛脂児血清含むＲＰＭＩ培地で、５個／ｍｌの密度
に懸濁し、９６穴プレートに１００μｍのずつ分注した
。３７℃。
５％炭酸ガス存在下で約２週間培養後、増殖してきた５
ＥＫＩ細胞は、２４穴プレートでさらに増殖させた。増
殖した各細胞群から各々２Ｘ１０’個細胞を２００μｌ
の培地で３日間培養し、その上清ｌＯμｌを新たな９６
穴マイクロプレートの各人に移し２ｘｌＯ５７ｍ墓のＭ
１細胞を含む１００μｍの培地 （１０％牛脂児血清を
含むイーグル基本培地）を添加した。そのプレートを５
％炭酸ガスを含む空気中で３７℃で２４時間培養した後
、リン酸生理食塩水で溶解した５ ｍ ｇ ／ ｍ １
のＭＴＴ溶液を２０μｌずつ添加し、さらに４時間培養
を続けた。その後、０．０１％塩酸を含む１０％ラウリ
ル硫酸ナトリウムを１００μ！添加して、３７℃でｌＯ
時間インキニベートしてフォルマザンを溶解した。その
プレートにおける溶解したフォルマザンの５７０ｎｍの
吸光度を測定した。表−２に細胞上清を添加した吸光度
から添加しなかった吸光度を引いた相対吸光度を分類し
、その相対吸光度に対応したクローンの数を示した。
ＥＫＩ細胞は、２４穴プレートでさらに増殖させた。増
殖した各細胞群から各々２Ｘ１０’個細胞を２００μｌ
の培地で３日間培養し、その上清ｌＯμｌを新たな９６
穴マイクロプレートの各人に移し２ｘｌＯ５７ｍ墓のＭ
１細胞を含む１００μｍの培地 （１０％牛脂児血清を
含むイーグル基本培地）を添加した。そのプレートを５
％炭酸ガスを含む空気中で３７℃で２４時間培養した後
、リン酸生理食塩水で溶解した５ ｍ ｇ ／ ｍ １
のＭＴＴ溶液を２０μｌずつ添加し、さらに４時間培養
を続けた。その後、０．０１％塩酸を含む１０％ラウリ
ル硫酸ナトリウムを１００μ！添加して、３７℃でｌＯ
時間インキニベートしてフォルマザンを溶解した。その
プレートにおける溶解したフォルマザンの５７０ｎｍの
吸光度を測定した。表−２に細胞上清を添加した吸光度
から添加しなかった吸光度を引いた相対吸光度を分類し
、その相対吸光度に対応したクローンの数を示した。
多検体の中から相対吸光度を０．３以上を与える生理活
性物質を産生ずる５ＥＫＩ細胞を生理活性物質産生細胞
として７クロ一ン株化した。
性物質を産生ずる５ＥＫＩ細胞を生理活性物質産生細胞
として７クロ一ン株化した。
尖ＪＪＬ主
ＳＶ４０ウィルス初期プロモーター下で発現しうるＤＩ
ＦのｃＤ Ｎ Ａ遺伝子およびジヒドロ葉１１ｆｆｉ元
酵素遺伝子（Ｄ ＨＦ Ｒ）を含むプラスミド２０μｇ
とハムスター由来ＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ。
ＦのｃＤ Ｎ Ａ遺伝子およびジヒドロ葉１１ｆｆｉ元
酵素遺伝子（Ｄ ＨＦ Ｒ）を含むプラスミド２０μｇ
とハムスター由来ＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ。
Ｓｅｉ、Ａｃａｄ、ＵＳＡ ７７巻４２１６頁（１９８
０年））１ｘ１０ａ個を１００μｍのリン酸生理食塩水
中に懸濁し８００ｖ４０μ秒のパルスを３回与えＣＨＯ
細胞にＤＩＦおよびＤＨＦＲ遺伝子を導入した細胞を、
ｌＯ％牛脂児血清を含むＦ１２培地で２日間培養後２０
ｎＭメソトレキセート、１５０ｍｇ／ｍ１Ｌ−プロリン
、１０％牛脂児血清を含むダルベツコ基本培地２００ｍ
１を使い９６穴プレ一ト２０枚に分注した。
０年））１ｘ１０ａ個を１００μｍのリン酸生理食塩水
中に懸濁し８００ｖ４０μ秒のパルスを３回与えＣＨＯ
細胞にＤＩＦおよびＤＨＦＲ遺伝子を導入した細胞を、
ｌＯ％牛脂児血清を含むＦ１２培地で２日間培養後２０
ｎＭメソトレキセート、１５０ｍｇ／ｍ１Ｌ−プロリン
、１０％牛脂児血清を含むダルベツコ基本培地２００ｍ
１を使い９６穴プレ一ト２０枚に分注した。
培地は週に１回交換した。約１月後細胞の増殖した穴の
上清１０μ＋を２ｘｌＯ５／ｍｌのＭｌ細胞を含む１０
０μｌの培地（１０％牛脂児血清を含むイーグル基本培
地）を分注した新たな９６穴マイクロプレートの各式に
添加した。そのプレートを２４時間５％炭酸ガスを含む
空気中で３７℃で２４時間培養した後、リン酸生理食塩
水で溶解した５ ｍ ｇ ／ ｍ ＩのＭＴＴ溶液を２
０μｍずつ添加し、さらに４時間培養を続けた。その後
、０．０１％塩酸を含むインプロパツールを１００μ！
添加して、室温で１０分間放置しフォルマザンを溶解し
た。そのプレートにおける溶解したフォルマザンの５７
０ｎｍの吸光度を測定した。表−３にＤＩＦを添加した
吸光度から添加しなかった吸光度を引いた相対吸光度に
分類されるクローンの数を示した。約１６００のクロー
ンから生理活性物質の高生産細胞を８クロ一ン選択した
。
上清１０μ＋を２ｘｌＯ５／ｍｌのＭｌ細胞を含む１０
０μｌの培地（１０％牛脂児血清を含むイーグル基本培
地）を分注した新たな９６穴マイクロプレートの各式に
添加した。そのプレートを２４時間５％炭酸ガスを含む
空気中で３７℃で２４時間培養した後、リン酸生理食塩
水で溶解した５ ｍ ｇ ／ ｍ ＩのＭＴＴ溶液を２
０μｍずつ添加し、さらに４時間培養を続けた。その後
、０．０１％塩酸を含むインプロパツールを１００μ！
添加して、室温で１０分間放置しフォルマザンを溶解し
た。そのプレートにおける溶解したフォルマザンの５７
０ｎｍの吸光度を測定した。表−３にＤＩＦを添加した
吸光度から添加しなかった吸光度を引いた相対吸光度に
分類されるクローンの数を示した。約１６００のクロー
ンから生理活性物質の高生産細胞を８クロ一ン選択した
。
（以下余白）
〔作用効果〕
本発明によって、白血病治療薬や、免疫増強の薬として
臨床応用に期待される細胞刺激能を有するＤＩＦやＩ
Ｌ−６などの生理活性物質を生産する細胞を短時間かつ
簡便に選択できる。したがって、本発明は、臨床検査ま
たは診断に有効な生理活性物質の産生細胞を迅速に選択
できるきわめて有用な方法である。
臨床応用に期待される細胞刺激能を有するＤＩＦやＩ
Ｌ−６などの生理活性物質を生産する細胞を短時間かつ
簡便に選択できる。したがって、本発明は、臨床検査ま
たは診断に有効な生理活性物質の産生細胞を迅速に選択
できるきわめて有用な方法である。
特許出願人 旭化成工業株式会社
Claims (1)
- 細胞の培養上清をマウス白血病細胞Ｍ１に作用させる
ことにより、添加したテトラゾリウム化合物に対するＭ
１細胞の還元能を上昇させ、かくして生成したホルマザ
ン化合物の吸光度を測定することを特徴とする生理活性
物質生産細胞の選択方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2272338A JPH04148680A (ja) | 1990-10-12 | 1990-10-12 | 生理活性物質生産細胞の選択方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2272338A JPH04148680A (ja) | 1990-10-12 | 1990-10-12 | 生理活性物質生産細胞の選択方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04148680A true JPH04148680A (ja) | 1992-05-21 |
Family
ID=17512502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2272338A Pending JPH04148680A (ja) | 1990-10-12 | 1990-10-12 | 生理活性物質生産細胞の選択方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04148680A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009028011A (ja) * | 2007-07-30 | 2009-02-12 | Kao Corp | 細胞呼吸活性の測定方法及びそのキット、タンパク質生産性向上株のスクリーニング方法及びそのキット |
-
1990
- 1990-10-12 JP JP2272338A patent/JPH04148680A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009028011A (ja) * | 2007-07-30 | 2009-02-12 | Kao Corp | 細胞呼吸活性の測定方法及びそのキット、タンパク質生産性向上株のスクリーニング方法及びそのキット |
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