JPH04141090A - Preparation of arginic acid lyase - Google Patents
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
皮果上■赳旦公立
アルギン酸リアーゼは、アルギン酸及びその塩に作用し
て、それらを低分子化させる酵素である。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Alginate lyase is an enzyme that acts on alginic acid and its salts to reduce their molecular weight.
本発明は、かかるアルギン酸リアーゼの製造方法に関し
、詳しくは、フラボバクテリウム属に属するアルギン酸
リアーゼ生産菌を培養して、その培養物からアルギン酸
リアーゼを高力価に製造する方法に関する。The present invention relates to a method for producing such alginate lyase, and more particularly, to a method for culturing alginate lyase-producing bacteria belonging to the genus Flavobacterium and producing alginate lyase at a high titer from the culture.
灸来夏技歪
アルギン酸及びその塩は、従来、種々の産業分野で用い
られいるが、その用途又は適用対象物によっては、使用
後、その適用対象物から除去する必要がある。例えば、
繊維産業において、経糸剤や糊剤としてアルギン酸又は
その塩を用いたときは、後に繊維を染色その他の処理を
行なうに際して、アルギン酸又はその塩を繊維から除去
することが必要である。このような場合、従来は、繊維
を加温浴に浸漬して、アルギン酸やその塩を抽出除去し
ているが、かかる方法は長時間を要し、生産性に劣る。Moxibustion-based strained alginic acid and its salts have been conventionally used in various industrial fields, but depending on the use or the object to which it is applied, it is necessary to remove it from the object after use. for example,
In the textile industry, when alginic acid or its salts are used as warp or sizing agents, it is necessary to remove alginic acid or its salts from the fibers when the fibers are subsequently dyed or otherwise processed. In such cases, conventionally, the fibers are immersed in a heating bath to extract and remove alginic acid and its salts, but this method requires a long time and is low in productivity.
また、歯科印象材としてアルギン酸カルシウムを用いた
ときも、その後、得られた義歯からアルギン酸カルシウ
ムを除去することが必要である。Also, when calcium alginate is used as a dental impression material, it is necessary to subsequently remove the calcium alginate from the resulting denture.
従来は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ） を主成
分とする溶解液を用いて、化学的にアルギン酸又はその
塩を可溶化して除去している。しかし、ＥＤＴＡは、金
属を腐食する作用を有し、基材を損傷するおそれがある
ので好ましくない、また、クエン酸やリン酸のような酸
を用いて、アルギン酸又はその塩のゲル除去をする方法
も知られているが、これらはその溶解作用が弱いナーめ
／、−７’ｆｌ的ではない。Conventionally, alginic acid or its salts have been chemically solubilized and removed using a solution containing ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) as a main component. However, EDTA is undesirable because it has the effect of corroding metals and may damage the base material.Alginic acid or its salts may be gel-removed using an acid such as citric acid or phosphoric acid. Methods are also known, but their solubilizing effects are not as strong as that of Name/, -7'fl.
そこで、近年、上述した化学的方法に代わるｊのとして
、例えば、メッッズ・イン・エンジモ［ジー、第８巻第
６４１〜６４４頁（１９６６） ）に言１戦されている
ように、アルギン酸リアーゼを用Ｇて、アルギン酸又は
その塩を分解して除去する井孔学的方法が提案されてい
る。この方法によれはアルギン酸リアーゼは、アルギン
酸及びその塩にのみ作用して、これを低分子量物に分解
するので適用対象物からアルギン酸及びその塩を使用後
に容易に除去することができるのみならず、適用対象物
を損なうことがない。Therefore, in recent years, as an alternative to the above-mentioned chemical method, alginate lyase has been used, for example, as described in Meds in Eng., Vol. 8, pp. 641-644 (1966). For industrial use, a hydrochemical method has been proposed in which alginic acid or its salt is decomposed and removed. According to this method, alginic acid lyase acts only on alginic acid and its salts and decomposes them into low molecular weight substances, so not only can alginic acid and its salts be easily removed from the object after use, but also Does not damage the applicable object.
かかるアルギン酸リアーゼを生産する微生物としては、
従来、シュウトモナス属（ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー、第６６巻第５０３〜５１２頁（１９６９）
） 、エーロモナス属（化学と工業、第４３巻第２１
３〜２１８頁（１９６９） ） 、クレブシェラ属（カ
ーボハイドレート・リサーチ、第１６３〜１７１頁（１
９７７） ） 、バシラス属（アプライド・アンド・エ
ンバイロメンタル・マイクロバイオロジー、第４７巻第
７０４〜７ｏ９頁（１９８４） ）等の微生物が知られ
ている。Microorganisms that produce such alginate lyase include:
Previously, the genus Shutomonas (Journal of Biochemistry, Vol. 66, pp. 503-512 (1969)
), Aeromonas (Chemistry and Industry, Vol. 43, No. 21)
3-218 (1969)), Klebsiella (Carbohydrate Research, pp. 163-171 (1969))
Microorganisms such as the genus Bacillus (Applied and Environmental Microbiology, Vol. 47, pp. 704-7o9 (1984)) are known.
しかし、従来、知られているこれらの微生物のアルギン
酸リアーゼの生産能力は低く、また、菌体内に酵素を蓄
積するので、これらの微生物を用いて、アルギン酸リア
ーゼを工業的に生産することは行なわれていない。However, these microorganisms have been known to have a low production capacity for alginate lyase, and because they accumulate enzymes within their bodies, these microorganisms have not been used to produce alginate lyase industrially. Not yet.
Ｈが”しようと るｉ
本発明は、アルギン酸リアーゼを工業的な規模で容易に
製造することができる方法を提供することを目的とする
。An object of the present invention is to provide a method by which alginate lyase can be easily produced on an industrial scale.
テ を”するための
本発明によるアルギン酸リアーゼの製造方法は、フラボ
バクテリウム属に属するアルギン酸リアーゼ生産菌を培
養し、菌体外にアルギン酸リアーゼを生産させることを
特徴とする。The method for producing alginate lyase according to the present invention is characterized by culturing alginate lyase-producing bacteria belonging to the genus Flavobacterium and producing alginate lyase extracellularly.
本発明において用いる菌株は、フラボバクテリウム属に
属するアルギン酸リアーゼ生産能を有する菌株であれば
、どのような菌株でもよく、また、それらの変異株でも
よいが、具体的には、特に、フラボバクテリウム・マル
チボラム（Ｆｌａｂｏｂａｃ−ｔｅｒｊｕｍ ＋＊ａｌ
ｔｉｖｏｌｕｍ）Ｋ １１を好ましい例として挙げる
ことができる。この菌株は、京都府福知山市内の土壌か
ら分離される。The strain used in the present invention may be any strain as long as it belongs to the genus Flavobacterium and has the ability to produce alginate lyase, or may be a mutant strain thereof. Flabobac-terjum ++al
tivolum) K 11 can be mentioned as a preferred example. This strain was isolated from soil in Fukuchiyama City, Kyoto Prefecture.
この菌株の菌学的性質は以下のとおりである。The mycological properties of this strain are as follows.
亙履攻江ｉ
顕微鏡的観察
（１）細胞の形及び大きさ：憚菌
０、３〜０．５６ ｍ ｘ １．０〜２．０ ｐ ｍ（
２）運動性の有無：なし
く３））胞子の有無：なし
く４））クラム染色：陰性
生理ヱ煎牲１
（１）硝酸塩の還元：陰性
（２）ＶＰテスト：陰性
（３）インドールの生成：陰性
（４）ウレアーゼ：陰性
（５） ＩｈＳの生成：陰性
（６） クエン酸の利用：陰性
（７）オキシダーゼ：陰性
カタラーゼ：陰性
０−Ｆテスト：Ｆ
３７°Ｃでの生育：陰性
酸素に対する態度：
黄色色素の生成：陽性
マツコンキー培地での生育：極く弱い
アルギニンの加水分解：陰性
エスクリンの加水分解：陽性
糖類からの酸の生成
グルコース：陽性
アラビノース：陽性
セロビオース：陽性
ラクトース：陽性
マンニット：陽性
ラフィノース：陽性
サリシン：陽性
スクロース：陽性
キシロース：陽性
グリセロース：陽性
トレハロース：陽性
フラクトース：陽性
マルトース：陽性
ラムノース：陽性
以上の性質を「バーシーズ・マニュアル・オフ・デタミ
ネイティブ、バクテリオロジー」 （第８版、１９７４
）より検索して、フラボバクテリウム・マルチボラムと
判断された。本菌株は、微工研菌寄第１１３３８号とし
て寄託されている。Microscopic observation (1) Cell shape and size: 0.3-0.56 m x 1.0-2.0 p m (
2) Presence or absence of motility: None 3)) Presence or absence of spores: None 4)) Crumb staining: Negative Physiological sacrifice 1 (1) Nitrate reduction: Negative (2) VP test: Negative (3) Indole Production: Negative (4) Urease: Negative (5) IhS Production: Negative (6) Citric Acid Utilization: Negative (7) Oxidase: Negative Catalase: Negative 0-F Test: F Growth at 37°C: Negative Oxygen Attitude towards: Production of yellow pigment: Positive Growth on Pine Conchi medium: Very weak hydrolysis of arginine: Negative Hydrolysis of esculin: Positive Production of acids from sugars Glucose: Positive Arabinose: Positive Cellobiose: Positive Lactose: Positive Mannitol :Positive raffinose:Positive salicin:Positive sucrose:Positive xylose:Positive glycerose:Positive trehalose:Positive fructose:Positive maltose:Positive rhamnose:Positive or higher properties in ``Verse's Manual of Determinative Bacteriology'' (8th edition) , 1974
), it was determined to be Flavobacterium multivorum. This strain has been deposited as Microtechnical Research Institute No. 11338.
本菌株は、微生物の培養に通常用いられる栄養物、例え
ば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、コ
ーンスチープリカー、カザミノ酸等にアルギン酸及び／
又はその塩を０．０１〜５％、好ましくは０．１〜２％
を加えた培地で２０〜３５°Ｃ１好ましくは２５〜３２
°Ｃの好気的条件下で良好に繁殖し、培養５〜６０時間
でアルギン酸リアーゼを生産する。This strain contains alginic acid and/or nutrients commonly used for culturing microorganisms, such as meat extract, peptone, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casamino acids, etc.
or its salt 0.01-5%, preferably 0.1-2%
20-35°C1 preferably 25-32°C in a medium containing
It grows well under aerobic conditions at °C and produces alginate lyase after 5 to 60 hours of culture.
本発明の方法によれば、上記菌株から生産されたアルギ
ン酸リアーゼは菌体外に放出されるので、遠心分離によ
って菌体を除けば、粗酵素液を得ることができる。この
粗酵素液は、必要に応じて、例えば、有機溶媒沈殿、塩
析、クロマトグラフィー等にて精製してもよい。また、
その形態も、乾燥物、固定化物のほか、菌体除去前の細
胞懸濁液として用いることができる。According to the method of the present invention, alginate lyase produced from the above-mentioned bacterial strain is released outside the bacterial cells, so that a crude enzyme solution can be obtained by removing the bacterial cells by centrifugation. This crude enzyme solution may be purified, for example, by organic solvent precipitation, salting out, chromatography, etc., if necessary. Also,
It can be used in the form of a dried product, a fixed product, or a cell suspension before bacterial cell removal.
本発明の方法によって得られるアルギン酸リアーゼの酵
素化学的及び物理化学的性質は、以下のとおりである。The enzymatic chemical and physicochemical properties of alginate lyase obtained by the method of the present invention are as follows.
作朋
アルギン酸を基質として反応させるとき、アルギン酸リ
アーゼの反応生成物である二重結合に由来する２３５ｎ
ｍの特異吸収の増加が認められる。Sakuho: When reacting with alginic acid as a substrate, 235n derived from a double bond, which is a reaction product of alginate lyase,
An increase in the specific absorption of m is observed.
′ ＨびＨ 第１図に示すように、ｐＨ６〜７に至適ｐＨを示す。′ HbiH As shown in FIG. 1, the optimum pH is between 6 and 7.
この至適ｐＨ範囲は、アルギン酸ナトリウムのｐＨと一
致するので、その分解にｐｕｌ！整をする必要がなく、
かくして、本発明によるアルギン酸リアーゼは、アルギ
ン酸ナトリウムの分解に好適に用いることができる。This optimum pH range matches the pH of sodium alginate, so pul! There is no need to prepare,
Thus, the alginate lyase according to the present invention can be suitably used for decomposing sodium alginate.
また、第２図に示すように、ｐＨ５〜７．５の範囲で安
定である。Moreover, as shown in FIG. 2, it is stable in the pH range of 5 to 7.5.
塾ｊジ【仕 第３図に示すように、４０°Ｃ付近まで安定である。Cram school jji As shown in Figure 3, it is stable up to around 40°C.
童１／〕蔦勺λ１響 第１表に４５℃で１時間処理したときの残存率を示す。Children 1/〕Tsutaki λ1 Hibiki Table 1 shows the residual rate when treated at 45° C. for 1 hour.
第１表
Ｍ１貸１１個１贋汰
アルギン酸との反応によって生成した二重結合由来の２
３５ ｎｍの吸光度を測定することによって、アルギン
酸リアーゼの酵素活性を測定することができる。Table 1 M1 11 units 1 counterfeit 2 derived from double bonds generated by reaction with alginic acid
The enzymatic activity of alginate lyase can be measured by measuring the absorbance at 35 nm.
反応液の組成
０．１％アルギン酸ナトリウム（ナカライテクス■製）
０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，３酵素液
０．３１反応条件
３７°Ｃで反応させて、２３５ｎｍの吸光度の変化を経
時的に測定する。Composition of reaction solution 0.1% sodium alginate (manufactured by Nacalai Teks ■)
0.1M phosphate buffer pH6.3 enzyme solution
0.31 Reaction conditions: React at 37°C, and measure changes in absorbance at 235 nm over time.
酵素活性
アルギン酸リアーゼ１単位は、上記条件下で１分間に基
質１１の２３５ｎｍの吸光度を１上昇させる酵素量とす
る。Enzyme activity One unit of alginate lyase is the amount of enzyme that increases the absorbance of substrate 11 at 235 nm by 1 in 1 minute under the above conditions.
ス１１外
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例により何ら限定されるものではない。EXAMPLES The present invention will be described below with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples in any way.
実施例１
ペプトン０．５％、酵母エキス０．１％、アルギン酸ナ
トリウム０．５％及び食塩０６２％からなる培地１０−
１を５０−１容量試験管に入れ、１２０℃で２０分間オ
ートクレーブ殺菌した。Example 1 Medium 10- consisting of 0.5% peptone, 0.1% yeast extract, 0.5% sodium alginate and 062% salt
1 was placed in a 50-1 capacity test tube and sterilized in an autoclave at 120°C for 20 minutes.
この培地にフラボバクテリウム・メガテリウムに−１１
（微工研菌寄第１１３３８号）の１白金耳を接種し、３
０℃で２０時間振盪培養して、種培養液とした。-11 to Flavobacterium megaterium in this medium
Inoculate 1 platinum loop of (Feikoken Bibori No. 11338), and 3
A seed culture solution was obtained by culturing with shaking at 0°C for 20 hours.
同じ条件下で殺菌した培地１！を含む２１容量ミニジャ
ーファーメンタ−へ上記種培養液１０ｍ１を接種し、５
００ｒｐ−１通気量０．５ＶＶＭ、２８℃にて２０時間
培養した。この培養液を遠心分離し、菌体を除去して、
粗酵素液を得た。この粗酵素液におけるアルギン酸リア
ーゼの活性は、培養液１ｍｌ当りに１．２１単位であっ
た。Medium 1 sterilized under the same conditions! Inoculate 10 ml of the above seed culture into a 21-capacity mini jar fermenter containing
00rp-1 The cells were cultured at 28° C. for 20 hours at an aeration rate of 0.5 VVM. This culture solution is centrifuged to remove bacterial cells,
A crude enzyme solution was obtained. The activity of alginate lyase in this crude enzyme solution was 1.21 units per ml of culture solution.
主里少塾果
以上のように、本発明の方法において用いるフラボバク
テリウム属に属する微生物は、アルギン酸リアーゼを培
養液中に高濃度に生産するので、アルギン酸リアーゼを
工業的に有利に得ることができる。As mentioned above, the microorganism belonging to the genus Flavobacterium used in the method of the present invention produces alginate lyase at a high concentration in the culture solution, so it is possible to obtain alginate lyase industrially advantageously. can.
第１図は、本発明の方法によって生産されたアルギン酸
リアーゼの活性とｐＨとの関係を示すグラフ、第２図は
、ｐＨと安定性を示すグラフ、第３図は、耐熱性を示す
グラフである。
第１図
第２図
第３図
（ＰＨ６，３゜
１０仝処理）
手続補正書（自発）
平成２年１１月０６日
２゜
３゜
４゜
平成２年特許願第２６２７２６号
発明の名称
アルギン酸リアーゼの製造方法
補正をする者
事件との関係 特許出願人
住 所 大阪市西区新町−丁目１番１７号名 称 ナガ
セ生化学工業株式会社Figure 1 is a graph showing the relationship between the activity and pH of alginate lyase produced by the method of the present invention, Figure 2 is a graph showing pH and stability, and Figure 3 is a graph showing heat resistance. be. Figure 1 Figure 2 Figure 3 (PH6,3゜10 treatment) Procedural amendment (spontaneous) November 6, 1990 2゜3゜4゜1990 patent application No. 262726 Name of the invention Alginate lyase Relationship with the case of a person amending the manufacturing method of patent applicant Address: 1-17 Shinmachi-chome, Nishi-ku, Osaka Name: Nagase Seikagaku Kogyo Co., Ltd.
Claims (1)
ゼ生産菌を培養し、菌体外にアルギン酸リアーゼを生産
させることを特徴とするアルギン酸リアーゼの製造方法
。(1) A method for producing alginate lyase, which comprises culturing alginate lyase-producing bacteria belonging to the genus Flavobacterium and producing alginate lyase outside the cells.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26272690A JPH04141090A (en) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | Preparation of arginic acid lyase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26272690A JPH04141090A (en) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | Preparation of arginic acid lyase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04141090A true JPH04141090A (en) | 1992-05-14 |
Family
ID=17379742
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26272690A Pending JPH04141090A (en) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | Preparation of arginic acid lyase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04141090A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994019006A1 (en) * | 1993-02-24 | 1994-09-01 | Gunze Limited | Remedy for cystic fibrosis |
| JP2009013082A (en) * | 2007-07-02 | 2009-01-22 | Dainippon Jochugiku Co Ltd | Method for producing shampoo against louse |
-
1990
- 1990-09-28 JP JP26272690A patent/JPH04141090A/en active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994019006A1 (en) * | 1993-02-24 | 1994-09-01 | Gunze Limited | Remedy for cystic fibrosis |
| US5582825A (en) * | 1993-02-24 | 1996-12-10 | Gunze Limited | Therapeutic medicine for cystic fibrosis |
| JP2009013082A (en) * | 2007-07-02 | 2009-01-22 | Dainippon Jochugiku Co Ltd | Method for producing shampoo against louse |
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