JPH04131085A - レーザーを用いる細胞の変異株の取得方法 - Google Patents
レーザーを用いる細胞の変異株の取得方法Info
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- JPH04131085A JPH04131085A JP2247541A JP24754190A JPH04131085A JP H04131085 A JPH04131085 A JP H04131085A JP 2247541 A JP2247541 A JP 2247541A JP 24754190 A JP24754190 A JP 24754190A JP H04131085 A JPH04131085 A JP H04131085A
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は処理する躬の細胞とは形質の異なる細胞を得る
のに好適なレーザーを用いる細胞の変異株の取得方法に
関するものである。
のに好適なレーザーを用いる細胞の変異株の取得方法に
関するものである。
従来、もとの細胞とは形質の異なる細胞を得る方法とし
ては、ＤＮＡの移入、ａｊｌｉｌ融合といった方法があ
る。ＤＮＡの移入には、化学的な方法。
ては、ＤＮＡの移入、ａｊｌｉｌ融合といった方法があ
る。ＤＮＡの移入には、化学的な方法。
電気的な方法、物理的な方法がおのおのある。細胞融合
においても然りである。また、唯単に変異をきたすため
の化学物質や、紫外線の照射等がある。上記の［１者の
方法は、従来より行われてきた方法で、どの方法をとっ
ても煩雑で多大な労力を必要とする。家だ後者の方法は
、人体に有害な試薬を使用したり、有害な紫外線を照射
しなければならない、等不具合な場合が多い。
においても然りである。また、唯単に変異をきたすため
の化学物質や、紫外線の照射等がある。上記の［１者の
方法は、従来より行われてきた方法で、どの方法をとっ
ても煩雑で多大な労力を必要とする。家だ後者の方法は
、人体に有害な試薬を使用したり、有害な紫外線を照射
しなければならない、等不具合な場合が多い。
さらに、本発明に近い公知例として、特開昭６３−２８
３５６８号に記載された「レーザービームな用いる１ｌ
Ｉｌ＃ｌ融合方法」がある。この方法は細胞ｌ保持して
ｉ１１胞同土管接触させ、その接触部にレーザー照射し
、ａｍ融合を起させる方法である。
３５６８号に記載された「レーザービームな用いる１ｌ
Ｉｌ＃ｌ融合方法」がある。この方法は細胞ｌ保持して
ｉ１１胞同土管接触させ、その接触部にレーザー照射し
、ａｍ融合を起させる方法である。
従って、本発明とは目的、レーザーの用い方が異なるも
のである。
のである。
上記従来技術は、機器操作の簡素化や安全性に関して配
慮がされておらず、もとのａｌ！とは形質の異なる細胞
を取得するためには、細胞の融合やＤＮＡの移入といっ
た煩雑な操作が必要であった。
慮がされておらず、もとのａｌ！とは形質の異なる細胞
を取得するためには、細胞の融合やＤＮＡの移入といっ
た煩雑な操作が必要であった。
また変異ｉａｌ胞の取得のためには、ニトロソグアニジ
ンのような人体に大度有害な物質を使用したり、紫外線
照射を行っていた。
ンのような人体に大度有害な物質を使用したり、紫外線
照射を行っていた。
本発明の目的は、上記の煩雑な操作や有害物質の使用を
行わず簡単な方法でもとのａＪｌｉＩとは形質の異なる
細胞を得る二とのできるレーザーを用いる細胞の変異株
の取得方法を提供するこ〔Ｓ題を解法するための手段〕 上記もとの細胞とは形質の異なる細胞を得るためには、
異なる橋の細胞を同じ液中に混合し、顕微鏡下又はＣＲ
Ｔを見ながら１１［以上の同様の細胞をレーザーを用い
て破壊し、ｉＢＩ胞内物質を溶出させる。次に宿主とな
る１ＩＩＩ胞にレーザーを照射してｉａｌ胞ａ、細胞層
を穿孔し、鰐もって溶出した細胞の内部物質を取り込ま
せる。
行わず簡単な方法でもとのａＪｌｉＩとは形質の異なる
細胞を得る二とのできるレーザーを用いる細胞の変異株
の取得方法を提供するこ〔Ｓ題を解法するための手段〕 上記もとの細胞とは形質の異なる細胞を得るためには、
異なる橋の細胞を同じ液中に混合し、顕微鏡下又はＣＲ
Ｔを見ながら１１［以上の同様の細胞をレーザーを用い
て破壊し、ｉＢＩ胞内物質を溶出させる。次に宿主とな
る１ＩＩＩ胞にレーザーを照射してｉａｌ胞ａ、細胞層
を穿孔し、鰐もって溶出した細胞の内部物質を取り込ま
せる。
とにある。
以上の方法でもってもとの細胞とは形質の異なる細胞を
取得するものである。
取得するものである。
顕微鏡下においた同じ溶液内に入っている２１１以上の
異種細胞において、１１ｍ以上の同種の細胞にレーザー
照射を行い細胞の破壊を行う。破壊されたａｊＩｉｌの
内部物質は、溶液中に溶出する。次に宿主とされるｍＪ
！にレーザー照射し、細胞膜、ａ１！！壁に穿孔して、
破壊された細胞の内部物質を取り込ませる。取り込まれ
た物質が宿主にないものであり、それが発現可能な場合
にはもとの１Ｂｌｌ胞とは形質の具なる細胞を得ること
ができる。
異種細胞において、１１ｍ以上の同種の細胞にレーザー
照射を行い細胞の破壊を行う。破壊されたａｊＩｉｌの
内部物質は、溶液中に溶出する。次に宿主とされるｍＪ
！にレーザー照射し、細胞膜、ａ１！！壁に穿孔して、
破壊された細胞の内部物質を取り込ませる。取り込まれ
た物質が宿主にないものであり、それが発現可能な場合
にはもとの１Ｂｌｌ胞とは形質の具なる細胞を得ること
ができる。
以下、本発明の−ｊ！施例を′ｓ１図により説明する。
使用したｇｔｒＩｌは、ＹＡＧレーザーを用い、顕微鏡
の対物レンズを通してレーザー光を生（社）胞に照射す
るレーザー式セルプロセッサである。このときのレーザ
ーのエネルギーな変換することで細胞破壊や細Ｍ＆展へ
の穿孔を行うことができる。
の対物レンズを通してレーザー光を生（社）胞に照射す
るレーザー式セルプロセッサである。このときのレーザ
ーのエネルギーな変換することで細胞破壊や細Ｍ＆展へ
の穿孔を行うことができる。
本装置はもともと宿生細胞へのＤＮＡ移入を目的に作ら
れたｇｌＷＬであるがその応用範囲は広く、例えば、細
胞層を穿孔しＤＮＡを移入することを初めとし、ｓｊ１
破壊やａＪＩｉ！切断等も行う二とができるものである
。
れたｇｌＷＬであるがその応用範囲は広く、例えば、細
胞層を穿孔しＤＮＡを移入することを初めとし、ｓｊ１
破壊やａＪＩｉ！切断等も行う二とができるものである
。
以下、操作（実験）の手順を示す。本操作（実験）は付
着したマウスの８胞に、マウスＥｌｌｌｌの内部物質を
取り込ませ雑１１１［１１１］１！ｂ（もとの細胞とは
形質の異なる細胞）を得るための操作（実験）である。
着したマウスの８胞に、マウスＥｌｌｌｌの内部物質を
取り込ませ雑１１１［１１１］１！ｂ（もとの細胞とは
形質の異なる細胞）を得るための操作（実験）である。
１、 腫瘍１ａｌｊ＠の調製
実際に用いたａＪＩｌｌは、Ｉ）ＮＡ合成系略のサルベ
ージ回路に関係するチミジンキナーゼ欠損株のＰ２Ｏ３
である。つまり、正常な細胞にある二つのＤＮ人合成系
略のうちの一つに支障をきたした細胞である。調整には
、Ｐ２Ｏ３の培１ｔｇから細胞をはがしＩ Ｘ １０７
個程度集め実験に使用する。
ージ回路に関係するチミジンキナーゼ欠損株のＰ２Ｏ３
である。つまり、正常な細胞にある二つのＤＮ人合成系
略のうちの一つに支障をきたした細胞である。調整には
、Ｐ２Ｏ３の培１ｔｇから細胞をはがしＩ Ｘ １０７
個程度集め実験に使用する。
２、 ％臓細胞の調製
免疫したマウスから牌臓を取り出し、１ａｌｊＩｉｌを
ばらばらにしてＢ細胞浮遊液を得る。得たＢｉａｌＪＩ
ｌをＲＰＭＩ−１直ｊｒ目−イ＆１１１ν１１１８拙旭
備する。
ばらばらにしてＢ細胞浮遊液を得る。得たＢｉａｌＪＩ
ｌをＲＰＭＩ−１直ｊｒ目−イ＆１１１ν１１１８拙旭
備する。
３、 レーザー照射
■ Ｐ３０１Ｂ胞を滅菌したレーザー照射用シャーレ（
以下、穴あきシャーレと許す）１に移し、２〜３日培養
し細胞を付着させる。
以下、穴あきシャーレと許す）１に移し、２〜３日培養
し細胞を付着させる。
■ Ｐ３０１Ｍ胞が付着した穴あきシャーレｌの培地を
交換し、マウス牌臓ｉａｌ胞を入れる。
交換し、マウス牌臓ｉａｌ胞を入れる。
■ 両＠ｊｌｌ混合液の入っている穴あきシャーレ１１
ｈ述のレーザー式セルプロセッサ２にセットし、レーザ
ー照射を行う。サンプルＡについては、！ＩＩ＃！ｌＡ
細胞のみレーザーを照射し、細胞層を破壊し細胞内部物
質を溶出させる。サンプルＢについては、付着細胞のみ
破壊しａｊ！内部物質を溶出させる。
ｈ述のレーザー式セルプロセッサ２にセットし、レーザ
ー照射を行う。サンプルＡについては、！ＩＩ＃！ｌＡ
細胞のみレーザーを照射し、細胞層を破壊し細胞内部物
質を溶出させる。サンプルＢについては、付着細胞のみ
破壊しａｊ！内部物質を溶出させる。
■ 次に、レーザー照射を行わなかった細胞のｉｔｉ＋
Ｊｌｉｌ展にレーザーを照射して穿孔する。このとき興
１１ｉｌ］＋胞の細胞内物質が孔部より細胞内に入り込
む。
Ｊｌｉｌ展にレーザーを照射して穿孔する。このとき興
１１ｉｌ］＋胞の細胞内物質が孔部より細胞内に入り込
む。
■ ＲＰＭＩ−１６４０培地で培地交換し、Ｃ４、
ＨＡＴ培地ｃよるａ＃ｌの選択培養開始翌日に、ＨＡＴ
培地を加える。２日。
ＨＡＴ培地ｃよるａ＃ｌの選択培養開始翌日に、ＨＡＴ
培地を加える。２日。
３日、５日、７日、９日、１１日後に、ＨＡＴ培地交換
を行う。ＨＡＴ培地にはアミノプリテンを含んでいるの
で、チミジンキナーゼ欠損株のＰ３Ｕｉｉｔｔ＋胞は生
存できない。つ肇リアミノプリテンはＰ３Ｕ１ｍ胞で働
いている一つのＤＮＡ合成系路を阻害する。家だマウス
ｐｓｍｍ胞は、増殖能を持たない。よって、ＨＡＴ培地
で生存できるのは、ＤＮＡ合成系路のサルベージ回路を
持ち、増殖能を有する雑１ｉｉＩＩｌ胞（もとの細胞と
は形質の異なる細胞）のみとなる。
を行う。ＨＡＴ培地にはアミノプリテンを含んでいるの
で、チミジンキナーゼ欠損株のＰ３Ｕｉｉｔｔ＋胞は生
存できない。つ肇リアミノプリテンはＰ３Ｕ１ｍ胞で働
いている一つのＤＮＡ合成系路を阻害する。家だマウス
ｐｓｍｍ胞は、増殖能を持たない。よって、ＨＡＴ培地
で生存できるのは、ＤＮＡ合成系路のサルベージ回路を
持ち、増殖能を有する雑１ｉｉＩＩｌ胞（もとの細胞と
は形質の異なる細胞）のみとなる。
本実施例によれば、雑１１細胞（もとの細胞とは形質の
異なる細胞）を得るのに容易でかつ安全に行えるという
利点がある。
異なる細胞）を得るのに容易でかつ安全に行えるという
利点がある。
ＨＡＴ培地：ＲＰＭＩ−１６４０（日本製薬）＋１０％
ＦＯ８（牛胎児血清）＋２ＭＢ（５ｘ１０−５ｍａｔ／
ｌ ） ＋Ｉ Ｘ １０−’Ｍ ヒポキサンチン＋４
Ｘ １０−７Ｍ アミノプリテン＋１．６８１０−’
Ｍチミジン＋１５μＷ／ｒｎｌ ８−アザグアニン〔発
明の効果〕 本発明によれば、従来行っていた煩雑で多大な労力のか
かるＤＮＡの精製２人体に有害な試薬な使用すること等
の操作を省略でき、安全かつ容易にもとのｉａ＋ｍとは
形質の異なる細胞（雑種細胞）を得ることができる。
ＦＯ８（牛胎児血清）＋２ＭＢ（５ｘ１０−５ｍａｔ／
ｌ ） ＋Ｉ Ｘ １０−’Ｍ ヒポキサンチン＋４
Ｘ １０−７Ｍ アミノプリテン＋１．６８１０−’
Ｍチミジン＋１５μＷ／ｒｎｌ ８−アザグアニン〔発
明の効果〕 本発明によれば、従来行っていた煩雑で多大な労力のか
かるＤＮＡの精製２人体に有害な試薬な使用すること等
の操作を省略でき、安全かつ容易にもとのｉａ＋ｍとは
形質の異なる細胞（雑種細胞）を得ることができる。
第１図は本発明の一実施例のレーザーを用いる細胞の変
異株の取得方法の説明図である。 ｌ・・・・・・穴アキシャーレ％ ２・・・・・・レー
ザー式セルプロセッサ
異株の取得方法の説明図である。 ｌ・・・・・・穴アキシャーレ％ ２・・・・・・レー
ザー式セルプロセッサ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、形質の異なる細胞を得る方法において、レーザーを
用いて同じ溶液中の細胞の破壊や細胞壁、細胞膜の穿孔
を行い、もとの細胞とは形質の異なる細胞を得ることを
特徴とするレーザーを用いる細胞の変異株の取得方法。 ２、２種以上の細胞を同じ溶液中に入れて、１種類以上
の細胞にレーザーを照射して細胞を破壊し、異なる１種
の細胞の細胞壁、細胞膜にレーザーを照射して穿孔し、
破壊した細胞の内部物質を取り込ませ、もとの細胞とは
形質の異なる細胞を得ることを特徴とするレーザーを用
いる細胞の変異株の取得方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2247541A JPH04131085A (ja) | 1990-09-19 | 1990-09-19 | レーザーを用いる細胞の変異株の取得方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2247541A JPH04131085A (ja) | 1990-09-19 | 1990-09-19 | レーザーを用いる細胞の変異株の取得方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04131085A true JPH04131085A (ja) | 1992-05-01 |
Family
ID=17165033
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2247541A Pending JPH04131085A (ja) | 1990-09-19 | 1990-09-19 | レーザーを用いる細胞の変異株の取得方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04131085A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT406778B (de) * | 1996-04-09 | 2000-09-25 | Immuno Ag | Verfahren zur desintegration von nucleinsäuren und herstellung von qualitätsgesicherten biologischen produkten |
-
1990
- 1990-09-19 JP JP2247541A patent/JPH04131085A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT406778B (de) * | 1996-04-09 | 2000-09-25 | Immuno Ag | Verfahren zur desintegration von nucleinsäuren und herstellung von qualitätsgesicherten biologischen produkten |
| US6165711A (en) * | 1996-04-09 | 2000-12-26 | Baxter Aktiengesellschaft | Process for disintegrating nucleic acids and preparing biological products of guaranteed quality |
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