JPH04115159A - 過酸化物の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、化合物クラスレベルでヒドロペルオキシド型
過酸化物例えば過酸化脂質を検出するための方法に関す
る。

［従来の技術］ 特開昭６３−２３３３７４号公報に、脂質ヒドロペルオ
キシドを脂質クラスレベルで検出する方法が開示されて
いる。この公報記載の検出方法は、脂質類を含有する試
料を液体クロマトグラフィーに供して脂質類を個々の脂
質クラスに分離し、この分離された脂質クラスに特定の
発光試薬を作用させることからなる。使用される発光試
薬は、ヒドロペルオキシド型過酸化脂質に作用して活性
酸素、酸素ラジカル等の活性酸素種を生成させる触媒（
例えば、ヘム蛋白質、ペルオキシダーゼ等）と、活性酸
素種と反応して発光する発光剤との組合せからなる。

［発明が解決しようとする課題］ 上記公報に記載された方法は、過酸化脂質を脂質クラス
レベルで高感度に検出できるものであるが、さらに高感
度で過酸化脂質を検圧できる方法が要望されている。ま
た、上記公報記載の方法に使用されている触媒は、有機
溶媒に比較的溶けに＜＜、使用する装置のフローセル部
や、ミキシングジヨイント部に付着する傾向にあり、感
度低下をもたらしていた。

なお、過酸化脂質に限らず、一般にヒドロペルオキシド
型過酸化物を化合物クラスレベルで検出することは、有
意義である。

従って、本発明の目的は、上記従来の問題点を解決した
過酸化物の検出方法を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 上記課題を解決するために、本発明では、ヒドロペルオ
キシド型過酸化物に作用して活性酸素種を生しさせる物
質として、特開昭６３−２３３３７４号公報記載の触媒
の代わりに、有機溶媒に容易に溶解する強アルカリを用
いている。

すなわち、本発明は、化合物類を含む試料中のヒドロペ
ルオキシド型過酸化物を検出するための方法であって、 （ａ）該試料を液体クロマトグラフィーに供して該化合
物類を個々の化合物クラスに分離する工程、 （ｂ）分離した各化合物クラス成分を強アルカリ、およ
び活性酸素種と反応して発光する発光剤と接触させる工
程、および （ｃ）該強アルカリの作用により該過酸化物が分解して
生じる活性酸素種と該発光剤との作用により発生する光
を光検出手段で光学的に検出する工程 を包含する過酸化物の検出方法を提供する。

上記強アルカリは、通常、アルカリアルコラートまたは
コリンである。

［作用］ 本発明において、液体クロマトグラフィーにより分離さ
れた化合物クラスは、強アルカリと接触すると、そこに
含まれ得るヒドロペルオキシ型過酸化物が分解して対応
量の活性酸素種を生しる。

この活性酸素種は、発光剤と反応して発光する。

この光を光検出器により検出することにより、当該ヒド
ロペルオキシド型過酸化物を定量的に検圧できる。アル
カリアルコラートおよびコリン等の強アルカリは、脂溶
性有機ヒドロペルオキシド等との反応性が高く、種々の
過酸化物を高感度に検出することを可能とする。また、
アルカリアルコラートおよびコリンは、有機溶剤に溶は
易いので、付着による感度低下が生じにくい。

［実施例コ 以下、図面を参照して、本発明をより具体的に説明する
。

第１図は、本発明を実施するために用いられる検出用装
置の一例を示すものであり、その基本構成は、特開昭６
３−２３３３７４号公報に記載の装置と同様である。第
１図に示す装置は、液体クロマトグラフィー好ましくは
高速液体クロマトグラフィーＨＰＬＣを備えている。こ
のクロマトグラフィーＨＰＬＣは、カラム移動相すなわ
ち、溶出用溶媒（例えば、メタノール、メタノール−水
混合物等）１を送出する液送出ポンプ２、この送出され
た溶媒に、有機化合物類その他の化合物類を含有する試
料３を注入するインジェクター４、およびインジェクタ
ー４によって送出される使用が混和した溶媒を受容する
カラム５によって構成されている。カラム５には、吸着
剤（図示せず）が充填されている。カラム５からは、吸
着剤の吸着能に応じて、試料３に含まれる有機化合物類
その他の化合物類が、各化合物クラスに分離されて溶出
する。

カラム５の溶出部には、カラム５から分離・溶出する各
化合物クラス成分の紫外吸収を検出する紫外吸収検出器
６が設けられている（この紫外吸収検出器６は、特に設
けなくともよい）。この検出器６を通った各化合物クラ
ス成分に、液送出ポンプ７により発光剤８が、および液
送出ポンプ９により強アルカリ１０が、それぞれ注入さ
れる。

強アルカリおよび発光剤が注入された試料成分は、フロ
ーセル１１に導かれる。フローセル１１の近傍には、例
えば、単一光電子計数方式による微弱光検出器（ｃｈｅ
ｍｊｌｕｍｉｎｅｓｅｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ）　
１２が、その光電子増倍管がフローセル１１と対向する
ように設置されている。フローセル１１内を通過する各
成分から発生する光は、微弱光検出器１２によって検出
される。この微弱光検出器１２および紫外吸収検出器６
の検出結果は、例えばペンレコーダーからなる記録器１
３によって記録される。

高速液体クロマトグラフィーＨＰＬＣのカラム５に充填
される吸着剤としては、分離すべき化合物種に応じて種
々のものか使用できる。その−例を挙げると、ポリメタ
クリレート粒子である。

強アルカリとしては、アルカリアルコラートまたはコリ
ンを好ましく使用することができる。アルカリアルコラ
ートの好ましい例を挙げると、ナトリウムメチラート、
カリウムブチラード（カリウムブトキシド）等、炭素数
１ないし１０個のアルカリアルコラートである。これら
強アルカリは、溶出用溶媒に使用するものと同種の有機
溶媒例えばメタノールに溶かして注入することが好まし
い。

強アルカリは、通常、溶媒中０．０１〜１％の濃度で使
用することかできる。

発光剤は、上記強アルカリの作用によりヒドロペルオキ
シド型過酸化物が分解して生成する活性酸素、酸素ラジ
カルなどの活性酸素種と反応して発光する試薬である。

そのような発光剤の例を挙げると、ポリヒドロキシフェ
ノール類、フタラジン誘導体、アクリジン誘導体、シュ
ウ酸誘導体、１．２−ジオキサ−４，５−アジン誘導体
などである。特にルミノールか好ましい。発光剤は、例
えばルミノールのように、ジメチルスルホキシド（Ｄ　
Ｍ　Ｓ　Ｏ）に溶かし、これをメタノール等の有機溶媒
に分散させて注入することができる。発光剤は、通常、
溶媒中０．０１〜１％の濃度で使用できる。

なお、過酸化物クラスと強アルカリとの接触は、ｐＨ９
以上の強アルカリ条件下で行なうことが好ましい。

本発明の方法により、特開昭６３−２３３３７４号公報
に示されているα−トコフェロール、ホスファチジルコ
リン等の脂質のヒドロペルオキシドの外、脂肪酸ヒドロ
ペルオキシド、クメンヒドロペルオキシドなど他の有機
過酸化物、過酸化水素も検出することができる。

［実施例］ 以下、本発明の実施例を記す。

実施例　１ 第１図に示す構成の装置を用いてヒドロペルオキシド型
有機過酸化物の検出試験を行なった。

試料として、メチレンブルーを用いた光増感酸かで一重
項酸素を発生させこれにα−トコフエロルを反応させて
生成したトコフェロールヒドロペルオキシジエン（Ｔ　
ｏ　ｃ−００Ｈ）を７９６ピコモル含むメタノール溶液
であり、２０μｍ用いた。

溶出用溶媒１は、メタノール−水（容量比９５：１）で
あり、流量１．１ｍｌ／分で流した。

装置の使用は、以下の通りであった。

送出ポンプ２： 日本分光社製８８０−ＰＵ型水ポン プ試料インジェクター４ ＝村計器製作所製ＶＭＤ−ＥＩＥサンプルインジェクタ
ー カラム５： 日本分光社製バイオファインＲＰ（、−ＰＯ（ポリメチ
ルメタクリレート充填） 紫外吸収検出器６： 日本分光社製ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＩＩＩＵＶ検出器
（但し、この検出器による測定データはとらなかった） 送出ポンプ７．９゜ 協和精密社製ＫＨＤ−５２型ポンプ 微弱光検出器１２： 東北電子産業社製ケミルミネッセンスアナライザＣＬＩ
）−１００型 記録器１３： ５ＥＫＯＮＩＫ　　５Ｓ−２５０Ｆ型ペンレコーダー なお、強アルカリの溶液として、ナトリウムアルコラー
ドの２８％メタノール溶液１ｍｌまたは５ｍｌをメタノ
ール２００ｍ　ｌに加えたものをそれぞれ用い（これら
を、それぞれ、アルカリ１、２という）、それぞれ０．
５ｍｌ／分の流速で流した。また、発光剤としては、ル
ミノールを用い、その１ｍｇ　％　５　ｍ　ｇまたは１
０ｍｇを１ｍｌのＤＭＳＯに溶解したものを、それぞれ
メタノール５００ｍ１に加え（これらを、それぞれ、発
光剤溶液１．２．３という）、それぞれ０．５ｍｌ／分
の流速で流した。

この測定で得られたＴｏｃ−００Ｈのピーク面積のイン
チグレーター値を以下の表１に示す。

表　　１ インチグレーター値 アルカリ１　　　アルカリ２ 発光剤溶液１　　４３１６０１　　　　　２４６０４３
８発光剤溶液２　　９３４８５５　　　　　６９１４３
１１発光剤溶液３　　１０５９７４８　　　　　９８７
０５２Ｂ実施例　２ 強アルカリ溶液として、カリウムｔ−ブトキシド２．５
ミリモルまたは１２．５ミリモルをそれぞれメタノール
２００ｍ１に溶解したもの（これらをそれぞれアルカリ
３．４という）を用いた以外は、実施例１と同様の操作
を行なった。

この測定で得られたＴｏｃ−００Ｈのピーク面積のイン
チグレーター値を以下の表２に示す。

表　　２ インチグレーター値 アルカリ３　　　アルカリ４ 発光剤溶液１　　３８１４１３　　　　　１７２５４７
０発光剤溶液２　　４８３０６８　　　　　４９３９１
３８発光剤溶液３　　４３８０６８　　　　　７７９８
３１０比較実施例 試料として、実施例１で調製したＴ　ｏ　ｃ−００Ｈ含
有メタノール溶液を用い、実施例１と同様の条件下で、
従来のチトクロームＣ−ルミノール系発光試薬と、本発
明のナトリウムメチラート−ルミノール系発光試薬とを
比較した。結果を第２Ａ図（従来例）および第２Ｂ図（
本発明）に示す。

なお、第２Ａ図および第２Ｂ図は、同一スケールである
。これら結果かられかるように、本発明の方法によれば
、従来法に比較して、感度が約２倍向上する。また、第
２Ａ図に見られる未酸化トコフェロールによる消光テー
リングは、第２Ｂ図には見られない。このことは、試料
中に混在する未酸化トコフェロールのセル付着による消
光テーリング（トコフェロールは抗酸化剤であるため、
消光作用がある）が、本発明により防止でき、テーリン
グを生じさせないことを示している。

［発明の効果コ 以上述べたように、本発明によれば、ヒドロペルオキシ
ド型過酸化物を高感度で検出できる。用いる強アルカリ
は、有機溶媒に溶解し易いので、付着の問題も生じない
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明を実施するために用いて好適な装置の
一例を示す構成図、第２Ａ図は、従来の方法によるトコ
フェロールヒドロペルオキシドの検出結果を示すグラフ
図、第２Ｂ図は、本発明の方法によるトコフェロールヒ
ドロペルオキシドの検出結果を示すグラフ図。 ＨＰＬＣ・・・高速液体クロマトゲラフィート・・溶出
用溶媒、３・・・試料、５・・・カラム、８・・・発光
剤、１０・・・強アルカリ、１２・・・微弱光検出器 出願人代理人　弁理士　鈴　江　武　彦第 図 保持時間（分） 第２Ａ図 保持時間（分） 第２Ｂ図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）化合物類を含む試料中のヒドロペルオキシド型過
   酸化物を検出するための方法であって、（ａ）該試料を
   液体クロマトグラフィーに 供して該化合物類を個々の化合物クラスに分離する工程
   、 （ｂ）分離した各化合物クラス成分を強ア ルカリ、および活性酸素種と反応して発光する発光剤と
   接触させる工程、および （ｃ）該強アルカリの作用により該過酸化 物が分解して生じる活性酸素種と該発光剤との作用によ
   り発生する光を光検出手段で光学的に検出する工程 を包含する過酸化物の検出方法。
2. （２）該強アルカリが、アルカリアルコラートまたはコ
   リンである請求項１記載の検出方法。