JPH04104793A - 部位特異的エンドヌクレアーゼＳｃｅＩの小サブユニットの遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、部位特異的エンドヌクレアーセ５ｅｅＩの小
サブユニットをコードする遺伝子に関する。

本発明の遺伝子によれば、部位特異的エントヌクレアー
セ５ｃｅｌの小サブユニットを複製することかでき、得
られた小サブユニットによって部位特異的エンドヌクレ
アーゼＳ　ｃｅ　Ｉを大量に製造することかできる。

（従来の技術及び解決すべき課題） 各種微生物のうち真核生物に属する各種酵母類由来の部
位特異的エンドヌクレアーセＳ　ｃｅ　Ｉは、７５ＫＤ
ａと５０ＫＤａのサブユニットからなるヘテロニ量体で
あることが知られており、遺伝子ＤＮＡの構造と機能を
研究するための生化学的試薬として用いられる他、生物
の育種改良を目的とする遺伝子の人工変換に広く利用さ
れることが期待されている。

この酵母由来の部位特異的エンドヌクレアーゼＳｃｅＩ
（以下″５ＣｅＩ」と略称する）とその製造法に関して
は、すてに本出願人によって特許出願かなされている（
特公昭５９−４１１５）。

また、上記の７５ＫＤａサブユニツトをコードする遺伝
子（ＥＮＳＩ）は、本発明者らによって既に単離され、
その塩基配列か決定されている（中圧らによる、「酵母
由来部位特異的エンドヌクレアーセＳ　ｃｅ　Ｉの７５
ＫＤａサブユニツトはＨ３Ｐ７０フアミリーに属するｒ
、１９９０年７月、酵母遺伝学集談会）。

ところが、上記５０ＫＤａサブユニツトをコードする遺
伝子については、未だその構造か明らかにされていない
。

（課題を解決するための手段） 従って、本発明者らは、部位特異的エンドヌクレアーセ
Ｓ　ｃｅ　Ｉの上記５０ＫＤａサブユニツト（以下「小
サブユニット、と略称する。）をコードする遺伝子の構
造を明らかにするべく研究を行なった結果、上記小サブ
ユニットをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を
決定することに成功し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、酵母由来の部位特異的エンドヌクレア
ーゼ５ｃａｌの小サブユニットをコードする遺伝子（Ｅ
ＮＳ２）を提供することを目的とする。

本発明は、第１図に示す塩基配列を有する部位特異的エ
ンドヌクレアーゼＳ　ｃｅ　Ｉの小サブユニットの遺伝
子（ＥＮＳ２）に関する。

以下、実施例により、本発明の部位特異的エンドヌクレ
アーセＳ　ｃｅ　Ｉの小サブユニットの遺伝子（ＥＮＳ
２）について詳細に説明する。

（実施例） 実施例１ （小サブユニットの精製） 特公昭５９−４１１５号公報に記載された方法によって
、部位特異的エンドヌクレアーゼ５ｃｅＩ（上記公報の
「エンドヌクレアーセ型新核酸分解酵素Ａ」と同じ）を
製造した。次いで、この部位特異的エンドヌクレアーゼ
ＳｃｅＩを用いて、１）ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を蛋白質変性剤の存在下で行う（Ｕ、に、　　レムリ
ー（Ｌａｅｍｍｌｉ）、Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０
−６８５に記載の方法に従う）か、または、 ２）ホスホセルロースカラムクロマトグラフィー（渡辺
ら、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９５：１６７７−１６９
０に記載の方法に従う）を行うことにより、小サブユニ
ットを精製した。

この小サブユニットは下記の理化学的性質を有する。

小サブユニットは、分子量的５０．０００の塩基性蛋白
質であり、ＤＮＡ結合性を有する。このＤＮＡ結合性は
、塩基配列に特異的であり、５ｃｅＩか切断する塩基配
列を認識し、結合する。

（部分アミノ酸配列の決定） Ｒ，Ｈ，アーバーソルト（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ　）ら、
Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４：６９７０
−６９７４に記載の方法に従って、小サブユニットをニ
トロセルロース膜に固定したまま蛋白質分解酵素を用い
て断片化した。

得られたペプチド断片混合物を膜より溶出した後、逆相
液体クロマトグラフィに供し、８種類のペプチドを精製
した。それぞれのペプチドの部分アミノ酸配列を気相式
プロテインンークエンサー４７７Ａ（アブライドハイオ
システムズ社製）を用いて決定した。

〔関連アミノ酸配列の検索〕

Ｗ、Ｊ、ウィルバーとり、Ｊ、リップマン（Ｗｉｌｂｕ
ｒ　ａｎｄＬｉｐｍａｎ）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０ニア２６−７３０に記載
の方法に従って、米国ナショナルバイオメディカルリサ
ーチファウンデーション（ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅ
ｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ
）の蛋白質データベース（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｄｅｎｔ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅ）に登録されて
いる蛋白質を対象として、上記の小サブユニットの部分
アミノ酸配列と関連する配列を検索した。

〔ササンプロット解析〕

Ｗ、　Ｅ、　Ｓ、ヒュドスペス（Ｈｕｄｏｓｐｅｔｈ）
ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　６１０：２２１−２２８に
記載の方法に従って、Ｓ　ｃｅ　Ｉ産生酵母菌ＩＡＭ４
２７４のミトコンドリアＤＮＡを調製し、それを制限酵
素ＥｃｏＲＩ（宝酒造製）によって切断した。得られた
ＤＮＡ断片を１．２％アガロースゲルによる電気泳動に
付し、Ｅ、Ｍ、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ、Ｍｏ
１．Ｂｉｏｌ、９８：５０３−５１７に記載の方法に従
ってマグナグラフナイロン膜（マイクロンセパレーンヨ
ンズ（Ｍｉｃｒｏｎ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）社製）
上に転写した。このナイロン膜上のＤＮＡを上記小サブ
ユニットの部分アミノ酸配列のひとっである、 Ｘ−Ｇｌｕ−ＭｅｉＡｓ　−、Ａｓｎ−Ｔ　ｒ−Ａｓｎ
−、Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎに相当する合成オリゴヌク
レオチドとハイブリダイズさせた。

〔塩基配列の決定〕

ＥＮＳ　２遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＵｃ１１８にク
ローン化した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｄｒａ
Ｉ（宝酒造製）による部分切断、またはＳ、ヘニコフ（
）ｌｅｎｉｋｏｆｆ）Ｇｅｎｅ　２８：３５１−３５９
に記載の方法に従って部分欠失させて得られるサブクロ
ーンを用いて塩基配列の決定を行った。配列の分析は、
Ｆ。

サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らＰｒｏｃ、　Ｎａ目、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７４　：５４６３−５４６
７及びＪ、メノング（ＭｅｓｓｉＢ）ら、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　９：３０９−３２１に記載の
方法に従ってジデオキンヌクレオチド鎖ターミネータ−
法により（ただしｄＧＴＰの代わりに７−デアザｄＧＴ
Ｐを用いた）行った。

（ＥＮＳ２遺伝子の同定） 本発明のＥＮＳ　２遺伝子関連の遺伝子を蛋白質データ
ベースにおいて上述の方法により検索した結果、サツカ
ロミセス酵母の幾つかの株において、そのミトコンドリ
アＤＮＡ中に小サブユニットの部分アミノ酸配列と同一
のアミノ酸配列をコードし得る塩基配列を見出した。

５ｃｅＩ産生酵母菌ＩＡＭ４２７４においては、ミトコ
ンドリアのＤＮＡのサザンプロット解析により、１．７
ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片が陽性であった。この１．７ｋｂ
断片をクローニングし、塩基配列を上記の方法によって
決定した結果、１４２８塩基からなる読み枠が見出され
、その中に小サブユニットにおいて決定したすべての部
分アミノ酸配列がコードされていることを確認した。

結果を第１図に示す。

（発明の効果） 本発明によれば、部位特異的エンドヌクレアーゼＳ　ｃ
ｅ　Ｉの小サブユニットの遺伝子（ＥＮＳ２）が提供さ
れる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の部位特異的エンドヌクレアーゼＳ　
ｃｅ　Ｉの小サブユニットの遺伝子の塩基配列を示す図
である。 枠で囲った８個の領域は、決定した部分アミノ酸配列と
一致したものを示す。 影付けをした２個の領域は、ＲＮＡマチュレース等、核
酸関連蛋白質に見られる保存配列を示す。 下線で示した塩基は、サツカロミセス・ラバラム属の類
似遺伝子の配列と異なるものを示す。 同様に星印は、サツカロミセス・ラバラム属の類似遺伝
子においては一塩基の挿入が見られる場所を示す。 尚、図に示した制限酵素断片には、小サブユニット遺伝
子の５′上流側に隣接する他の遺伝子（Ａａｐ　１）の
３′部分領域が含まれている。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の塩基配列を有する部位特異的エンドヌクレ
   アーゼＳｃｅＩの小サブユニットをコードする遺伝子。 【塩基配列があります】 【塩基配列があります】