【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は、新規な生澱粉及び糊化澱粉分解性固
定化アミラーゼに関し、更に詳しくはグルコマン
ナンを担体としてグルコアミラーゼを固定化して
成る生澱粉及び糊化澱粉分解性固定化アミラーゼ
に関する。
近年、酵素の固定化に関する研究報告が数多く
発表されていることは周知の通りである。（例え
ば、Japan Immobilized Enzymes and Cells
with Japan′s Enzymes、海外技術資料研究所、
1979年参照）。
一般に知られているように、酵素が固定化する
ことは、酵素の回収及び再利用が容易にできると
か、反応系の連続化及び省力化ができることなど
に代表される種々の実用的なメリツトがある。
しかしながら、澱粉は高分子化合物であり、生
澱粉の状態では水に不溶性であり、これを糊化し
た場合には、その澱粉液の粘度が非常に高くなる
という澱粉固有の特性を有する。このため、グル
コアミラーゼを従来技術の固定化法である、例え
ばイオン結合法、架橋法又は包括法により固定化
した場合、澱粉と固定化された酵素との接触が極
めて困難であり、このために上記の固定化酵素は
糊化澱粉に対しては活性が弱く、生澱粉に対して
はほとんど作用しないという欠点を有していた。
このため、澱粉を出発原料とし、これを分解し
てグルコースを生成せしめる工程において固定化
酵素を使用しようとする場合、澱粉をまず糊化
し、更にこれを澱粉液化酵素、酸等の澱粉分解剤
により処理して澱粉分子鎖を切断し、少なくとも
オリゴ糖にまで低分子化し、しかる後にこれを固
定化グルコアミラーゼでグルコースにまで分解す
るという複雑な工程を採用しなければならなかつ
た。このため固定化酵素を使用することによる前
記の利点は、糖化工程全体として見た場合、結局
発揮されないという状態にあつた。
このため、低分子化処理が施こされていない糊
化澱粉、好ましくは生澱粉に直接作用してこれを
分解し、グルコースを生成せしめることができる
固定化グルコアミラーゼの開発が望まれていた。
生澱粉分解性固定化グルコアミラーゼについて
は、キチンを担体として調製する方法が報告され
ている〔Shinsaku Hayashida、Agric.Biol.
Chem.、46(6)、1639〜1645、（1982年）〕が、この
方法が適用できるのはアスペルギルス・アワモ
リ・カワチ（Aspergillus awamori
varkawachi）が産生したグルコアミラーゼに対
してのみであり、しかもこの方法により調製した
固定化グルコアミラーゼは非常に狭いPH領域でし
か活性を発現しないという難点があり実用性に乏
しいものであつた。
本発明者らは、かかる技術の現状に鑑み、糊化
澱粉分解活性と共に、生澱粉分解活性をも同時に
保育し、しかも活性の高い固定化アミラーゼを開
発すべく、鋭意研究をすすめた結果、グルコマン
ナンを担体とし、吸着法ともいえる簡便な方法で
グルコアミラーゼを固定した場合に、この固定化
アミラーゼが糊化澱粉及び生澱粉という分子量の
大きい糖質をも高い活性で分解し糖化できること
を見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明に従えば、グルコアミラーゼ
をグルコマンナン担体に固定化せしめて成る糊化
澱粉分解性及び生澱粉分解性固定化アミラーゼが
提供される。
本発明の固定化酵素においては、担体としてグ
ルコマンナンを使用する。このグルコマンナンは
Ｄ−グルコースとＤ−マンノースとを主要構成成
分とする多糖類であつて主としてコンニヤク属植
物に由来するものを意味し、その化学構造を厳密
に限定するのではないが、コンニヤクに由来する
ものが好ましい。本発明においては種々の純度の
グルコマンナンを使用することができる。すなわ
ち高度に精製したグルコマンナンを使用すること
もでき、またコンニヤク芋の乾燥粉末をも使用す
ることができる。
本発明の固定化酵素は、酵素成分としてグルコ
アミラーゼを含有する。ここでグルコアミラーゼ
とは、澱粉を分解してグルコースを生成せしめる
ことができるアミラーゼの総称であつて、酵素の
由来を問わない。すなわち、本発明において使用
するグルコアミラーゼには、従来より最も広く使
用されてきたリゾプス属に由来するもの、アスペ
ルギルス属に由来するもの、その他の微生物に由
来するもの等が含まれる。しかし生澱粉を効率よ
く分解してグルコースを生成せしめる固定化酵素
を製造するためには、未固定の酵素自体が高い生
澱粉分解活性を有する必要があるから、高い生澱
粉分解活性を有するものとして特に選択された、
例えばリゾプス属に由来するグルコアミラーゼを
使用することが望ましい。
本発明に使用するグルコアミラーゼとしては
種々の純度のものを使用することができる。すな
わち、高度に精製したグルコアミラーゼを使用す
ることもでき、またグルコアミラーゼ産生微生物
を培養した後の培養濾液に固定化酵素を製造する
のに十分な濃度のグルコアミラーゼが含まれてい
る場合にはこの濾液をそのまま酵素源として使用
することもできる。そのほか種々の段階まで精製
した各種の酵素剤を使用することができ、これら
の酵素剤には市販されている各種グルコアミラー
ゼ剤も含まれる。
本発明の固定化グルコアミラーゼは、例えば次
の方法により製造することができる。
(a) 糊化澱粉分解性及び生澱粉分解性グルコアミ
ラーゼ含有酵素液にグルコマンナンを浸漬し、
一定時間置いてグルコマンナンへのグルコアミ
ラーゼの固定（又は吸着）を進行せしめ、次に
グルコアミラーゼを吸着したグルコマンナンを
液から分離し、グルコマンナンに付着している
グルコアミラーゼを水洗によつて除去し、そし
て所望により、風乾、凍結乾燥、噴霧乾燥など
公知の方法によつて乾燥し、固定化グルコアミ
ラーゼを得ることができる。
(b) 糊化澱粉分解性及び生澱粉分解性グルコアミ
ラーゼ含有酵素液にグルコマンナンを浸漬し、
これに、グルコアミラーゼの溶解性を減少せし
め、しかもグルコアミラーゼを失活させない水
溶性有機溶剤、例えばエタノール又はアセトン
等を加えることによりグルコアミラーゼを担持
したグルコマンナンを沈澱せしめ、しかる後に
固形部分を液から分離し、所望により、公知の
方法によつてこれを乾燥し固定化グルコアミラ
ーゼを得ることができる。
糊化澱粉分解性及び生澱粉分解性グルコアミラ
ーゼ含有酵素液へのグルコマンナンの浸漬は、予
じめグルコマンナンを適当な媒質（例えば、水又
は所望PH値を有する緩衝液）中へ懸濁せしめ、こ
れにグルコアミラーゼを添加して行なつてもよい
し、逆に予じめグルコアミラーゼ懸濁液を調製
し、これにグルコマンナンを添加して行なつても
よい。しかしながら、酵素をグルコマンナンに均
一に固定せしめるためには、前者の方法が一般に
は好ましい。
グルコマンナンと固定化すべきグルコアミラー
ゼとの使用比率には、特に限定はないが、一般に
は、グルコマンナンに吸着され得る量より過剰の
グルコアミラーゼを用いて、グルコアミラーゼを
グルコマンナンに最大限吸着させることが好まし
く、グルコマンナン浸漬酵素液中のグルコアミラ
ーゼ濃度は約１〜1000単位／mlにするのが好まし
い。必要あれば、グルコマンナン浸漬酵素液中に
残存するグルコアミラーゼを有効に利用するため
に、グルコマンナンを更に添加してグルコアミラ
ーゼを固定化することもできる。
グルコアミラーゼをグルコマンナンに固定化す
る際のグルコアミラーゼ含有液のPH及び温度は、
グルコアミラーゼが失活しない範囲であれば良
く、現在知られるグルコアミラーゼの場合PH3.5
〜6.0及び温度５〜20℃程度に設定することが望
ましい。固定化中のPHを一定に保持するために、
グルコアミラーゼ含有液には、例えば酢酸緩衝液
などの常用の緩衝液を使用するのが好ましい。ま
たグルコマンナンとグルコアミラーゼの接触時間
は、通常30分以上であれば充分である。この期間
中、グルコマンナンとグルコアミラーゼとの接触
を良好にするために、連続的又は間喝的にゆるや
かな撹拌を加えることができる。
本発明の固定化グルコアミラーゼの酵素化学的
性質、例えば反応PH、反応温度、PH耐性、温度耐
性、基質特異性等は使用したグルコアミラーゼの
酵素化学的性質と関連するが、これらの酵素化学
的特性が本発明の固定化によつて変化することは
ない。
本発明の固定化グルコアミラーゼの特徴は第１
に、従来の固定化グルコアミラーゼでは極めて困
難であつた糊化澱粉の糖化を極めて効果的に行う
ことができ、更に従来の固定化グルコアミラーゼ
ではほとんど不可能であつた実用条件下での生澱
粉の糖化を容易に行いうる点にある。本発明の固
定化グルコアミラーゼの第２の特徴は、公知技術
に係る固定化グルコアミラーゼに比べて広いPH領
域で活性を保持し、発揮する点にある。
本発明の固定化グルコアミラーゼが上記のごと
き特徴を有するため、この固定化酵素を使用する
ことにより始めて固定化酵素による工業的規模で
の生澱粉又は糊化澱粉からのグルコースの生成が
可能となつた。すなわち、本発明の固定化グルコ
アミラーゼは、例えばコーンスターチによるグル
コース、グルコース含有製品の工業的生産におい
て使用することができ、またグルコースを含有す
る他の原料、例えば発酵原料の調製にも使用する
ことができる。例えば、本発明の固定化グルコア
ミラーゼを使用すれば生澱粉を直接かつ連続的に
グルコースに分解することができるから、この工
程とアルコール発酵工程とを組み合わせることに
より、例えば併行複発酵によるアルコールの連続
製造が可能となるので少ない工程と少ないエネル
ギー消費の下で、澱粉原料から連続的にアルコー
ルを生産することが可能になる。
以下、実施例によつて本発明を更に詳細に説明
するが、本発明の範囲をこれらの実施例に限定す
るものでないことはいうまでもない。
実施例 １
精製したグルコマンナン５ｇをPH4.5の0.05M
酢酸緩衝液500mlに懸濁させた。この懸濁液を充
分撹拌した後、リゾプス属起源のグルコアミラー
ゼ剤（阪急共栄物産から市販のグルターゼ6000）
600単位（JIS Ｋ−7001による糖化力）を添加し、
５℃で２時間、撹拌しながら放置した。その後、
濾過し、水を用いて充分洗浄し、凍結乾燥するこ
とによつてグルコマンナンを担体とした固定化ア
ミラーゼ4.1ｇを得た。
このようにして得られた固定化アミラーゼの糊
化澱粉及び生澱粉分解活性を求めた。
得られた結果を、公知の方法によつて調製し
た、キチンを担体とした固定化アミラーゼ
〔Agric.Biol.Chem.、46(6)．1639（1982年）〕及び
ブロモアセチルセルロースを担体とした固定化ア
ミラーゼ〔Agric.Biol.Chem.、36(9)、1581（1972
年）〕について求めた結果と対比して以下の第１
表に示す。
The present invention relates to a novel immobilized amylase that decomposes raw starch and gelatinized starch, and more particularly to an immobilized amylase that decomposes raw starch and gelatinized starch, which is obtained by immobilizing glucoamylase using glucomannan as a carrier. It is well known that in recent years, many research reports on enzyme immobilization have been published. (For example, Japan Immobilized Enzymes and Cells
with Japan's Enzymes, Overseas Technical Data Research Institute,
(see 1979). As is generally known, immobilization of enzymes has various practical merits, such as the ability to easily recover and reuse enzymes, and the ability to make the reaction system continuous and save labor. be. However, starch is a polymeric compound, and in its raw state it is insoluble in water, and when it is gelatinized, it has the unique properties of starch that the viscosity of the starch liquid becomes extremely high. For this reason, when glucoamylase is immobilized by conventional immobilization methods, such as ionic bonding, cross-linking, or entrapping methods, it is extremely difficult to bring starch into contact with the immobilized enzyme; The above-mentioned immobilized enzymes had the disadvantage that they had weak activity against gelatinized starch and had almost no effect on raw starch. For this reason, when starch is used as a starting material and an immobilized enzyme is used in the process of decomposing starch to produce glucose, the starch is first gelatinized and then further treated with a starch decomposing agent such as a starch liquefaction enzyme or acid. A complex process had to be adopted in which starch was treated to break the molecular chains, reducing the molecular weight to at least oligosaccharides, which were then broken down into glucose using immobilized glucoamylase. For this reason, the above-mentioned advantages of using an immobilized enzyme were not fully realized in the saccharification process as a whole. For this reason, it has been desired to develop an immobilized glucoamylase that can directly act on gelatinized starch that has not been subjected to a low-molecular-weighting treatment, preferably raw starch, to decompose it and produce glucose. Regarding immobilized glucoamylase capable of decomposing raw starch, a method for preparing it using chitin as a carrier has been reported [Shinsaku Hayashida, Agric.Biol.
Chem., 46(6), 1639-1645, (1982)], but this method is only applicable to Aspergillus awamori.
varkawachi), and the immobilized glucoamylase prepared by this method had the disadvantage of expressing activity only in a very narrow pH range, making it impractical. In view of the current state of the technology, the present inventors conducted intensive research in order to develop an immobilized amylase that has both gelatinized starch decomposition activity and raw starch decomposition activity, and has high activity. We discovered that when glucoamylase is immobilized using mannan as a carrier using a simple method called adsorption, this immobilized amylase can decompose and saccharify carbohydrates with a high molecular weight, such as gelatinized starch and raw starch, with high activity. We have arrived at the present invention. That is, according to the present invention, there is provided an immobilized amylase capable of degrading gelatinized starch and raw starch, which is obtained by immobilizing glucoamylase on a glucomannan carrier. In the immobilized enzyme of the present invention, glucomannan is used as a carrier. This glucomannan is a polysaccharide whose main components are D-glucose and D-mannose, and is mainly derived from plants of the genus Konjac. Although its chemical structure is not strictly limited, it is Preferably, those derived from Glucomannan of various purity can be used in the present invention. That is, highly purified glucomannan can be used, and dried powder of konnyaku yam can also be used. The immobilized enzyme of the present invention contains glucoamylase as an enzyme component. Here, glucoamylase is a general term for amylases that can decompose starch to produce glucose, and the origin of the enzyme does not matter. That is, the glucoamylase used in the present invention includes those derived from the genus Rhizopus, which has been most widely used so far, those derived from the genus Aspergillus, and those derived from other microorganisms. However, in order to produce an immobilized enzyme that efficiently decomposes raw starch to produce glucose, the unimmobilized enzyme itself needs to have high raw starch degrading activity. Especially selected
For example, it is desirable to use glucoamylase derived from the genus Rhizopus. Glucoamylase of various purity can be used in the present invention. That is, highly purified glucoamylase can be used, and if the culture filtrate after culturing the glucoamylase-producing microorganism contains glucoamylase at a sufficient concentration to produce the immobilized enzyme. This filtrate can also be used as it is as an enzyme source. In addition, various enzyme agents purified to various stages can be used, and these enzyme agents include various commercially available glucoamylase agents. The immobilized glucoamylase of the present invention can be produced, for example, by the following method. (a) Glucomannan is immersed in an enzyme solution containing gelatinized starch-degrading glucoamylase and raw starch-degrading glucoamylase,
Allow fixation (or adsorption) of glucoamylase to glucomannan to proceed for a certain period of time, then separate glucomannan with adsorbed glucoamylase from the liquid, and remove glucoamylase attached to glucomannan by washing with water. Then, if desired, the immobilized glucoamylase can be obtained by drying by a known method such as air drying, freeze drying, or spray drying. (b) immersing glucomannan in an enzyme solution containing gelatinized starch-degrading glucoamylase and raw starch-degrading glucoamylase;
Glucomannan carrying glucoamylase is precipitated by adding a water-soluble organic solvent, such as ethanol or acetone, which reduces the solubility of glucoamylase but does not deactivate it, and then the solid portion is liquefied. If desired, this can be dried by a known method to obtain immobilized glucoamylase. When glucomannan is immersed in an enzyme solution containing gelatinized starch-degrading and raw starch-degrading glucoamylase, glucomannan is suspended in an appropriate medium (for example, water or a buffer having a desired pH value) in advance. This may be carried out by adding glucoamylase to this, or conversely, a glucoamylase suspension may be prepared in advance and glucomannan may be added thereto. However, in order to uniformly immobilize the enzyme on glucomannan, the former method is generally preferred. There is no particular limitation on the ratio of glucomannan and glucoamylase to be immobilized, but in general, glucoamylase is used in excess of the amount that can be adsorbed to glucomannan to maximize adsorption of glucoamylase to glucomannan. Preferably, the concentration of glucoamylase in the glucomannan-soaked enzyme solution is about 1 to 1000 units/ml. If necessary, glucomannan can be further added to immobilize glucoamylase in order to effectively utilize the glucoamylase remaining in the glucomannan-soaked enzyme solution. The pH and temperature of the glucoamylase-containing solution when immobilizing glucoamylase on glucomannan are as follows:
It is sufficient as long as the glucoamylase is not inactivated, and in the case of currently known glucoamylase, the pH is 3.5.
It is desirable to set the temperature to about 5 to 20°C. In order to keep the pH constant during immobilization,
As the glucoamylase-containing solution, it is preferable to use a commonly used buffer such as an acetate buffer. Further, it is usually sufficient for the contact time between glucomannan and glucoamylase to be 30 minutes or more. During this period, gentle stirring may be applied continuously or intermittently to improve contact between glucomannan and glucoamylase. The enzymatic chemical properties of the immobilized glucoamylase of the present invention, such as reaction PH, reaction temperature, PH resistance, temperature resistance, substrate specificity, etc., are related to the enzymatic chemical properties of the glucoamylase used. Properties are not changed by the immobilization of the present invention. The first feature of the immobilized glucoamylase of the present invention is
In addition, it is possible to extremely effectively saccharify gelatinized starch, which was extremely difficult with conventional immobilized glucoamylase, and to saccharify raw starch under practical conditions, which was almost impossible with conventional immobilized glucoamylase. The advantage is that it can be easily saccharified. The second feature of the immobilized glucoamylase of the present invention is that it retains and exhibits activity in a wider pH range than immobilized glucoamylases according to known techniques. Since the immobilized glucoamylase of the present invention has the above characteristics, it becomes possible to produce glucose from raw starch or gelatinized starch on an industrial scale using the immobilized enzyme for the first time. Ta. That is, the immobilized glucoamylase of the present invention can be used in the industrial production of glucose, glucose-containing products, for example with corn starch, and can also be used in the preparation of other raw materials containing glucose, such as fermentation raw materials. can. For example, if the immobilized glucoamylase of the present invention is used, it is possible to directly and continuously decompose raw starch into glucose, so by combining this process with an alcohol fermentation process, it is possible to continuously produce alcohol by, for example, parallel multiple fermentation. This makes it possible to continuously produce alcohol from starch raw materials with fewer steps and less energy consumption. EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples, but it goes without saying that the scope of the present invention is not limited to these Examples. Example 1 5g of purified glucomannan was added to 0.05M of pH4.5
It was suspended in 500 ml of acetate buffer. After thoroughly stirring this suspension, use a glucoamylase agent originating from the genus Rhizopus (glutase 6000, commercially available from Hankyu Kyoei Bussan).
Add 600 units (saccharification power according to JIS K-7001),
The mixture was left at 5° C. for 2 hours with stirring. after that,
By filtering, washing thoroughly with water, and freeze-drying, 4.1 g of immobilized amylase using glucomannan as a carrier was obtained. The gelatinized starch and raw starch degrading activities of the immobilized amylase thus obtained were determined. The obtained results were used to produce an immobilized amylase using chitin as a carrier prepared by a known method [Agric.Biol.Chem., 46(6). 1639 (1982)] and immobilized amylase using bromoacetylcellulose as a carrier [Agric.Biol.Chem., 36(9), 1581 (1972)]
2012)]
Shown in the table.
【表】【table】
【表】
第１表の結果から、本発明のグルコマンナンを
担体とした固定化アミラーゼが公知の方法に従つ
た固定化アミラーゼよりも、糊化澱粉分解活性及
び生澱粉分解活性のいずれにおいても著しく高い
活性発現率を示すことが明らかである。
実施例 ２
コンニヤク芋の乾燥粉末10ｇをPH5.0の0.05M
酢酸緩衝液1500mlに懸濁させた。この懸濁液を充
分撹拌した後、実施例１で用いたリゾプス属起源
のグルコアミラーゼ剤1200単位（JIS Ｋ−7001に
よる糖化力）を添加し、20℃で30分間撹拌しなが
ら放置した。その後、濾過し、水で充分洗浄し、
風乾によつて固定化アミラーゼ7.6ｇを得た。
この固定化アミラーゼの糊化澱粉分解活性発現
率は19.4％であり、生澱粉分解活性発現率は16.4
％であつた。
実施例 ３
精製したグルコマンナン３ｇをPH3.5の0.05M
酢酸緩衝液300mlに懸濁させた。この懸濁液を充
分撹拌した後、アスペルギルス属起源のグルコア
ミラーゼ剤（阪急共栄物産から市販のグルターゼ
Ｎ）1000単位（JIT Ｋ−7001による糖化力）を
添加し、20℃で２時間撹拌しながら放置した。そ
の後、濾過し、水で充分洗浄し、噴霧乾燥するこ
とにより、固定化アミラーゼ2.5ｇを得た。
このようにして得られた固定化アミラーゼの糊
化澱粉分解活性発現率は35.0％であり、生澱粉分
解活性発現率は28.5％であつた。
応用例
市販コーンスチーチ１KgをPH4.5の0.05M酢酸
緩衝液2.0に懸濁させた。この懸濁液に実施例
１に準じて調製した固定化アミラーゼ100ｇを添
加し、40℃で１時間反応させた。反応完了後、遠
心分離により固液を分離し、得られたグルコース
含有液を減圧濃縮することによつて、最終的に、
グルコース50重量％含有シラツプ約200mlを得た。
分離された固形部分は、澱粉源及び酵素源として
再利用することができた。[Table] From the results in Table 1, it is clear that the immobilized amylase using glucomannan as a carrier of the present invention has significantly higher gelatinized starch decomposition activity and raw starch decomposition activity than the immobilized amylase prepared according to the known method. It is clear that it shows a high activity expression rate. Example 2 10g of dry powder of konnyaku potato is 0.05M with pH5.0
It was suspended in 1500 ml of acetate buffer. After thoroughly stirring this suspension, 1200 units of the glucoamylase derived from the Rhizopus genus used in Example 1 (saccharification power according to JIS K-7001) was added, and the suspension was left stirring at 20° C. for 30 minutes. Then, filter and wash thoroughly with water.
7.6 g of immobilized amylase was obtained by air drying. The expression rate of gelatinized starch decomposition activity of this immobilized amylase is 19.4%, and the expression rate of raw starch decomposition activity is 16.4%.
It was %. Example 3 3g of purified glucomannan was added to 0.05M of pH3.5
It was suspended in 300 ml of acetate buffer. After thoroughly stirring this suspension, 1000 units of a glucoamylase agent originating from Aspergillus (glutase N, commercially available from Hankyu Kyoei Bussan) (saccharification power according to JIT K-7001) was added, and the mixture was stirred at 20°C for 2 hours. I left it alone. Thereafter, 2.5 g of immobilized amylase was obtained by filtration, thorough washing with water, and spray drying. The expression rate of gelatinized starch decomposition activity of the immobilized amylase thus obtained was 35.0%, and the expression rate of raw starch decomposition activity was 28.5%. Application example 1 kg of commercially available cornstarch was suspended in 0.05M acetate buffer 2.0 at pH 4.5. 100 g of immobilized amylase prepared according to Example 1 was added to this suspension, and the mixture was reacted at 40° C. for 1 hour. After the reaction is completed, the solid and liquid are separated by centrifugation, and the resulting glucose-containing liquid is concentrated under reduced pressure to finally
Approximately 200 ml of syrup containing 50% by weight of glucose was obtained.
The separated solid part could be reused as a starch source and an enzyme source.