JPH0359710B2

JPH0359710B2 -

Info

Publication number: JPH0359710B2
Application number: JP58127382A
Authority: JP
Inventors: Yoshiatsu Miura; Mitsuo Okazaki; Yoshihiro Ikeda
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1983-07-12
Filing date: 1983-07-12
Publication date: 1991-09-11
Also published as: JPS6018179A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、人工肝臓用材料に関し、更に詳しく
は単離肝細胞を固定化材料に包括固定した人工肝
臓材料に関する。人工肝臓とは、肝機能の一部または全てを一時
的に代行させ、生体機能を維持および補充をはか
る体外代謝装置である。急性肝不全の発症は、全国集計で年間15〜20万
人といわれ、そのうち2000〜3000例が劇症化す
る。末期症状の肝性昏睡に陥つた場合、早くこの
状態を脱しなければ死に至る。食事療法および薬
物療法などのいわゆる保存的療法のみでは、死亡
率は80〜90％に達する。肝臓が非可逆変化をきた
していない場合、患者に人工肝臓を用いることに
より、肝性昏睡起因物質の処理促進、体内減少物
質の補充、代謝異常の改善などを行わせ、失われ
た肝機能を代償させて昏睡からの回復および延命
をはかり、その間に再生能力の強い肝臓の機能を
回復させて救命することができる。人工肝臓には、血中の有害物質の物理的除去、
すなわち解毒能を代行することを目的とした非生
物学的人工肝臓と、代謝合成まで含めた肝機能の
ほとんど全部を代行することを目的とした生物学
的人工肝臓がある。非生物学的人工肝臓には、PAN膜による血液
透析、活性炭による吸着などがある。これらは緊
急時に使用できるという利点はあるものの、除去
物質が非選択的であるため、血液の正常成分まで
除去する、代謝や合成ができないという様な欠点
がある。肝臓のほとんどすべての機能を代行しうる人工
肝臓を求めるならば、素材を生物材料に求めなけ
ればならない。しかし、生物材料を用いると、免
疫学的問題、機能維持、装置の開発などの問題が
生ずる。免疫学的問題については、凍結保存可能
なヒトの肝細胞を用いることが有効であるが、ま
た肝細胞を包括することにより免疫学的問題を排
除出来る。機能維持については、肝細胞は接着す
ることにより安定性が増大するから長期機能維持
は可能である。さらに、装置については、生物学
的人工肝臓の目的からみて透析効果のみにならな
いよう高密度肝細胞が要求される。そこで、単離肝細胞に注目し、肝細胞の安定
化、細胞密度の上昇をはかるべく鋭意研究を行つ
た結果、肝細胞を固定化材料に包括固定すること
により細胞密度が上昇し、細胞が安定化されるこ
とを見い出し本発明を完成するに至つた。すなわち、本発明の要旨は、単離肝細胞を固定
化材料に包括固定して成る人工肝臓用材料に存す
る。肝細胞は、既知の方法で調製されたものが用い
られ、凍結肝細胞も用いることができる（たとえ
ば水戸廸郎ら、人工臓器９(2)、390（1980）参照）。単離肝細胞は、他の細胞に比べて非常に弱いた
め、固定化に伴い細胞が損傷されやすい。従つて
固定化材料としては、比較的穏やかな条件で細胞
を固定化できる材料を用いる必要がある。好まし
い固定化材料の例として、コラーゲン、フイブリ
ン、アルギン酸Ca、Ｋ、カラギーナン、寒天お
よび低融点アガロースが挙げられるが、これらに
限定されるものではない。就中、フイブリンおよ
びアルギン酸Caが、アンモニア除去能およびウ
レア合成能の点で優れているので、特に好まし
い。包括固定化方法は、一般に固定化材料と細胞懸
濁液を混合し、適当な条件で培養することから成
るが、詳細な手順および条件は、固定化材料の種
類により異なるので後記実施例に詳述してある。
包括固定に用いる器具、材料等は、すべて減菌し
たものを用い、固定化も無菌的に行う。本発明の人工肝臓材料は、単離肝細胞を固定化
材料に包括固定しているため、細胞の安定性が増
大し、細胞密度も高くなる。そして、細胞を接着
させる必要がないから緊急時の使用が可能とな
り、また機械的強度が得られ、リアクターの作成
が容易になる。さらに、高密度および大量培養が
可能となる、など多くの利点を有している。次に参考例、実施例および試験例を示し、本発
明を具体的に説明する。参考例単離肝細胞の調製：− 単離肝細胞は、BerryとFriendのコラゲナーゼ
潅流法を主体として調整した（Berry，M.W.，
Friend，D.S.，J.Cell.Biol.，43，506（1969）参
照）。 SD系雄性ラツト（200〜350ｇ）に、50mg／Kg
のペントバルビタールNaを腹腔内注射し、麻酔
下で開腹した。門脈に糸のループをかけ、門脈の
下部を鉗子で止め、眼科用ハサミで門脈を切り、
カニユーレ（Hibiki polyethylene tubing
size7）を入れ、modified HANKS Ca²⁺free
solution（組成は第１表参照）を約20ml／minで流
し込むと同時に下大動脈を切断し脱血させた。カ
ニユーレを糸で縛り、その状態でラツトから肝臓
を取り出し循環装置にのせ、その後チユーブ内液
量を含めて最終濃度が0.05％コラゲナーゼ
（sigmaType1）、5mM塩化カルシウムになるよ
うに液を加えた。HAHKS液を25ml／minで15分
から20分潅流させ、肝臓表面から液が浸出した
時、潅流を中止した。なお、HANKS液は肝臓
が37℃に保温できるように適当な温度（42〜45
℃）に保ち、PH増加を避け、酸素供給をするため
に、CO₂5％、O₂95％の混合ガスでバブリングし
た。消化した肝臓を100mlのビーカーに移し、残
つている酸素液を入れ、ハサミで大きく切り、
500mlのマイヤーに移し、HANKS液を入れ全量
を約100mlにし、37℃で10分間約100 oscillation
で、O₂95％、CO₂5％の混合ガスを通気しながら
インキユベーシヨンし、その後、氷で充分冷した
後、150メツシユのふるいで過し、600rpmで30
秒間０℃で遠心した。沈澱にHANKS液を加え
遠心洗浄を行い、最後にWE培地（William′s
Madium Ｅ、組成は第２表参照）で遠心洗浄し、
細胞を100mlのWE培地に懸濁し単離肝細胞液と
した。なお、600rpm、30秒の遠心条件では実質
細胞のみが下におちる。顕微鏡観察では、ほとんどが１個ずつの細胞に
なつており、実質細胞であつた。

【表】

【表】実施例１単離細胞の包括固定：参考例で調整した肝細胞を、コラーゲン、フイ
ブリン、アルギン酸Ca、Ｋ−カラギーナン、寒
天および低融点アガロースに包括固定した。器具、材料等はすべて減菌して用い、固定化は
無菌的に行つた。以下の各分量はシヤーレ（直径
3.5cm）１枚あたりの量を示し、肝細胞は1.28×
10⁶個ずつとなるように予め細胞濃度を調節して
用いた。コラーゲンへの固定 0.3％コラーゲン溶液（高研株式会社）0.9mlお
よび0.2MNaHPO₄／1.3MNaCl0.076mlを４℃に
冷却しながら混合した。混合物に肝細胞懸濁液
0.1mlを加え、穏やかに手早く混合した。フイブリンへの固定５％フイブリノーゲン（sigma fraction Ｉ）
（5mMCaCl₂、PBS（−）注）溶液）0.5mlおよび
肝細胞懸濁液0.5mlを４℃に冷却しながら混合し、
次いで25IU／mlトロンビン0.09mlを加え、放置し
た。アルギン酸Caへの固定３％アルギン酸NaのPBS（−）注）溶液0.5ml
および肝細胞懸濁液0.5mlを４℃に冷却しながら
混合し、注射器を用いて20Gの針から等張CaCl₂
溶液中に１滴ずつおとした。Ｋ−カラギーナンへの固定 2.5％Ｋ−カラギーナン１mlおよび肝細胞懸濁
液0.25mlを37℃付近で混合し、すみやかに氷冷し
た。寒天への固定 2.5％寒天0.75mlおよび肝細胞懸濁液0.25mlを37
℃付近で混合し、すみやかに氷冷した。低融点アガロースへの固定 2.5％低融点アガロース（BRL Inc）0.75mlお
よび肝細胞懸濁液0.25mlを35℃付近で混合し、す
みやかに氷冷した。注）PBS（−）の組成は次の通りである：成分 mg／ NaCl 8000.0 KCl 200.0 Na₂HPO₄ 115.0 KH₂PO₄ 200.0 なお、対照の為、肝細胞懸濁液１mlのみをシヤ
ーレに入れ、接着培養した。培養はいずれも、添加物（2.5ｍＭ NH₄Cl）
入りWE培地１mlを入れたシヤーレに上記の肝細
胞と固定化材料の混合物を加え、37℃でCO₂イン
キユベータ内で行つた。サンプリング毎に培地交
換した。培養物のアンモニア除去能は、アンモニアを奥
田−藤井の直接法（奥田拓道ら、最新医学、
21622（1966））に準じ、生成したインドフエノー
ルを620nｍで比色定量して評価した。尿素合成能は、ジアセチルモノオキシム法を用
い、黄色の発色を480nmで比色定量した。結果を第３表に示す。

【表】なお、第３表の数値は、３回の実験の結果の平
均であり、シヤーレ接着培養の結果を100％とし
て相対的に示したものである。実施例２長期安定性試験：− 直径６cmのシヤーレを用い、肝細胞量（ゲル）
および培地量をともに３mlとする以外は実施例１
と同様の手順により肝細胞をアルギン酸Caに包
括固定した。固定化後、添加物（2.5ｍMNH₄Cl、2.5μｇ／
dlインドール）入りWE培地で洗浄し、同培地３
mlずつを入れて37℃においてCO₂インキユベータ
内で培養した。サンプリングは、添加物入りWE
培地置換直後と３、６、９および12時間後に行
い、サンプリング後は、添加物なしWE培地で培
養した。なお、アンモニア、インドールの解毒能
は、添加物入りWE培地で０、１、２、４及び６
日目に置換して、置換直後と３、６、９および12
時間後にサンプリングして測定した。対照として、直径６cmのシヤーレに細胞懸濁液
（1.28×10⁶cells／ml）３mlをまき、37℃において
CO₂インキユベータ内で24時間接着させた後、固
定化の場合と同様にサンプリングした。アンモニア除去量は実施例１に記載の方法によ
り定量した。結果を第１図に示す。アルギン酸Ca包括固定培養およびシヤーレ接
着培養ともに全培養期間にわたりアンモニア除去
活性が維持されていた。ウレア合成能は実施例１に記載の方法により測
定した。結果を第２図に示す。両培養系ともに全培養期間にわたりウレア合成
能が維持されていた。インドール除去能は、トルエンにより抽出した
後、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドとイン
ドールが縮合して呈する赤色を570nｍで比色定
量した（神前五郎、人工臓器6466（1977）参照）。
結果を第３図に示す。インドキシル硫酸抱合能は、obermayer試薬を
加え、クロロホルムで抽出し、生じた青色のイン
ジゴを595nｍで比色定量した（分析化学便覧
（日本分析化学学会編）第３版1379頁参照）。結果
を第４図に示す。生成量はインドール減少量の約
50％で文献値（佐藤了、薬物代謝（講談社）209
頁参照）とよく一致していた。実施例３細胞密度を1.28×10⁶cells／mggellの３倍および
10倍密度とする以外は実施例１と同様の手順によ
り肝細胞をアルギン酸Caに包括固定した。培養は、シリコナイズした18φ試験管にゲル１
mlと添加物（2.5ｍＭ NH₄C）入りWE倍値１
mlを入れ、シリコン栓をして、37℃の恒温堅内で
100oscillation／〓で振とう培養した。結果を第４表に示す。

【表】 10倍での活性が10倍まで上らないのはO₂不足
によるものと考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１〜４図は、実施例２におけるアンモニア除
去量、ウレア合成量、インドール除去およびイン
ドキシル硫酸抱合能をそれぞれ示すグラフであ
る。

Claims

【特許請求の範囲】１単離肝細胞を固定化材料に包括固定して成る
ことを特徴とする人工肝臓用材料。２固定化材料が、コラーゲン、フイブリン、ア
ルギン酸Ca、Ｋ−カラギーナン、寒天または低
融点アガロースである特許請求の範囲第１項記載
の人工肝臓用材料。３固定化材料が、フイブリンまたはアルギン酸
Caである特許請求の範囲第２項記載の人工肝臓
用材料。４単離肝細胞が、コラゲナーゼ処理直後のもの
である特許請求の範囲第１項記載の人工肝臓用材
料。