JPH03505726A - Method for preparing metal-radioisotope-labeled protein - Google Patents

Method for preparing metal-radioisotope-labeled protein

Info

Publication number
JPH03505726A
JPH03505726A JP50426289A JP50426289A JPH03505726A JP H03505726 A JPH03505726 A JP H03505726A JP 50426289 A JP50426289 A JP 50426289A JP 50426289 A JP50426289 A JP 50426289A JP H03505726 A JPH03505726 A JP H03505726A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
protein
coupling agent
iminothiolane
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP50426289A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
ゴードマンズ,ウイルヘルムス・セオドーラス
パネク,カレル・ジャン
Original Assignee
マリンクロッド・インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by マリンクロッド・インコーポレイテッド filed Critical マリンクロッド・インコーポレイテッド
Publication of JPH03505726A publication Critical patent/JPH03505726A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 金属−放射性同位体−ラベル蛋白質の調製方法本発明は診断用または治療用のた めに用いられる金属−放射性同位体−ラベル(標識付け)蛋白質または蛋白質系 物質の調製方法に関する。本発明はこの方法に用いられる新規化合物にも係る。[Detailed description of the invention] Method for preparing metal-radioisotope-labeled proteins The present invention is suitable for use in diagnostic or therapeutic purposes. metal-radioisotope-labeled protein or protein system used for Concerning methods for preparing substances. The invention also relates to novel compounds for use in this method.

放射性同位体−ラベル化合物は診断のための検査、例えば内蔵器官の形態や機能 の異変や体内に病変が存在するか否かを調べるのに用いられる。この目的で、放 射性物質を含有する組成物が、例えば注射液の形で患者に投与される。T−線カ メラなど適当な検出器を用い、放射性物質がインコーホレートされた器官の像あ るいは病変を、放射能の記録すなわちスキャンニング(走査)により作り出す。Radioisotope-labeled compounds are used for diagnostic tests, such as the morphology and function of internal organs. It is used to investigate whether there are abnormalities or lesions in the body. For this purpose, A composition containing a radioactive substance is administered to a patient, for example in the form of an injection solution. T-line power Using a suitable detector such as a camera, an image of the organ in which the radioactive material has been incorporated is obtained. or lesions are created by recording or scanning radioactivity.

放射性ラベルされた生体高分子、特に蛋白質ならびに蛋白質系物質、例えば血液 細胞、免疫グロブリン、糖ペプチド、モノクローナル抗体例えばアンチミオシン や腫瘍抗原のモノクローナル抗体、局在化目的に適した他の蛍白質例えば単鎖一 または二重鎖ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミンその 他のプラスミン誘導物例えばミニプラスミンは診断用として将来有望な物質であ る。蛋白質によっては器官特異性が広範な標的を有するものがあり、患者の体内 に投与されたのち体内に存在する生体高分子と強い選択性をもって反応すること ができる。このような反応のよい例としては体内の抗原と抗体または抗体フラグ メントとの選択的反応が挙げられる。Radioactively labeled biological macromolecules, especially proteins and protein-based substances, e.g. blood cells, immunoglobulins, glycopeptides, monoclonal antibodies such as antimyosin or monoclonal antibodies against tumor antigens, other fluorescent antibodies suitable for localization purposes, e.g. or double-chain urokinase, tissue plasminogen activator, plasmin, etc. Other plasmin derivatives, such as miniplasmin, are promising substances for diagnostic use. Ru. Some proteins have broad organ-specific targets and are Reacts with strong selectivity with biopolymers present in the body after being administered to Can be done. A good example of such a reaction is between an antigen and an antibody in the body or an antibody flag. selective reaction with ment.

各種の金属−放射性同位体は、腫瘍−選択性生体高分子例えば糖ペプチドプレオ マイシンと結合させれば腫瘍の抑制にうまく用いることができ、放射線治療での 強力な道具となる。Various metal-radioactive isotopes can be used with tumor-selective biopolymers such as glycopeptides. Combined with mycin, it can be used successfully to suppress tumors and is useful in radiotherapy. It becomes a powerful tool.

このような高分子は放射線を当てようとする腫瘍に必要量の線量すなわち金属− 放射性同位体を輸送するためのキャリアーとして役立つものでる。These polymers deliver the necessary amount of radiation to the tumor, i.e. metal- It serves as a carrier for transporting radioactive isotopes.

蛋白質または蛋白質系物質を金属−放射性同位体で直接ラベルする方法には不利 な点が二つある。先ず第一に、良好な標的器官特異性もしくは選択性に必要とさ れる、蛋白質の生物学的活性部位がこの反応で簡単にブロックされて生体高分子 の正常な働きが妨害されることである。加えて、放射性同位体と高分子との間の 親和性には不充分な場合が多く、その結果結合が形成されても、それは生理的条 件下で安定性が低く、完全性を失いやすい、そのため投与されても診断用として も有用性を失うしく体内での蛋白質の作動が追跡できなくなる)、さらに治療用 としても役に立たなくなる(目的とする部位に放射線量が送り込まれずにかえっ て別の部位に望ましからざる放射線の負担をかけろことになる)。Disadvantages of direct labeling of proteins or protein-based substances with metal-radioisotopes There are two points. First of all, the The biologically active sites of proteins are easily blocked by this reaction and biopolymers The normal functioning of the body is disrupted. In addition, the relationship between radioactive isotopes and polymers Affinity is often insufficient, and even if a binding is formed, it is limited by physiological conditions. It has low stability under conditions and tends to lose its integrity, so even if administered, it cannot be used for diagnostic purposes. (the protein's action in the body can no longer be tracked), and even therapeutic use. (If the radiation dose is not delivered to the target area and is returned to the target area, it becomes useless) (This would put an undesirable radiation burden on other parts of the body.)

このような不利益を緩和させるために、ヨーロッパ特許出願第237150号で は、ジスルフィド結合を有する蛋白質系物質を先ずジスルフィド還元剤例えばジ チオトレイトールで処理し、次いで、そのメルカプト基が遊離された還元状態の 蛋白質系物質と放射性同位体例えばTc−99m−タルトレートまたはTc−9 9m−グルコヘプトネートとを特異的に反応させる方法が提案されている。この 方法の欠点は、所望のメルカプト基を得るためにジスルフィド結合の切断で蛋白 質が“開裂”するような還元処理を行なう点にある。蛋白質の分子の損傷が起こ りやすくなる。In order to alleviate this disadvantage, European Patent Application No. 237150 In this method, a protein substance having disulfide bonds is first treated with a disulfide reducing agent such as disulfide. treatment with thiothreitol and then the reduced state in which the mercapto group is liberated. Protein-based substances and radioactive isotopes such as Tc-99m-tartrate or Tc-9 A method of specifically reacting with 9m-glucoheptonate has been proposed. this The disadvantage of the method is that the protein requires cleavage of the disulfide bond to obtain the desired mercapto group. The point is that a reduction process is performed that "cleaves" the quality. Damage to protein molecules occurs. It becomes easier to

所望の金属−放射性同位体、と結合できるキレート基が付与された生体高分子( 通常、蛋白質または蛋白質系物質)についての報告がこの数年多く出されている 。この分野における最近の特許としてはアメリカ特許第4479930号、第4 511550号、第4652440号および第4678667号、ヨーロッパ特 許出願第83129号、第173629号および第188256号、オランダ特 許出願第8204108号、およびPCT出i問85103231およびWO3 6103010がある。A biopolymer ( In recent years, many reports have been published regarding proteins (usually proteins or protein-based substances). . Recent patents in this field include U.S. Pat. No. 511550, No. 4652440 and No. 4678667, European Special Patent Application No. 83129, No. 173629 and No. 188256, Netherlands Patent Application No. Patent Application No. 8204108, PCT Question 85103231 and WO3 There is 6103010.

このような改変方法によっても、原高分子の生物学的作動はできるだけ保存され なくてはならいことは勿論である。このことは、金属−放射性同位体が蛋白質と 結合するのに用いられるキレータ−またはカップリング剤はあまり大きいもので あってはならず、特に比較的低分子の蛋白質に対する場合はそうであるというこ とを意味するものである。さらに、感受性の極めて高いことが多い蛋白質または 蛋白質系物質はラベル工程特にキレータ−またはカップリング剤とのカンプリン グ反応において、高分子の性状に悪い影響を与える損傷的な条件にはできるだけ 露出させないようにしなくてはならない。長いインキュベーション、高温での処 理、有機溶剤または生理的pHと著しく違うpH条件への露出、酸化剤または還 元剤の存在下での反応などはすべてできるだけ避けなければならないものである 。上記の通り、カップリング剤としては一つには蛋白質または蛋白質系物質と強 固に結合し、二つには金属−放射性同位体とも強固に結合し得るものでなくては ならない。Even with such modification methods, the biological operation of the original polymer is preserved as much as possible. Of course, it is indispensable. This means that metal-radioactive isotopes interact with proteins. The chelator or coupling agent used for binding is not very bulky. This should not be the case, especially for relatively low-molecular proteins. It means that. In addition, proteins that are often highly sensitive or Protein-based substances can be used during the labeling process, especially when combined with chelators or coupling agents. In the chemical reaction, damage conditions that adversely affect the properties of the polymer should be avoided as much as possible. must be kept from being exposed. Long incubation, high temperature treatment exposure to organic solvents or pH conditions significantly different from physiological pH, oxidizing agents or reducing All reactions in the presence of base agents must be avoided as much as possible. . As mentioned above, one type of coupling agent is to combine proteins or protein-based substances with strong It must be able to bind firmly, and it must also be able to bind firmly to metals and radioactive isotopes. No.

生理的条件下でその結合が完全に維持されない場合、すなわち放射性同位体が血 流中で脱会合し、血液の別の粒子によって体内の非目的部位に輸送されるとその 部位の組織に対して放射性物質が好ましくない放射線の負荷を与え、その量が治 療上の有効量であってもそこの組織に重い損傷を生ずる。If the binding is not fully maintained under physiological conditions, i.e. the radioactive isotope When it disassociates in the flow and is transported by other blood particles to non-target parts of the body, Radioactive substances impose an undesirable radiation load on the tissues of the site, and the amount Even therapeutically effective doses cause severe tissue damage.

ラベルした高分子の保存安定性が低く、金属−放射性同位体の半減期も短いこと が多いので、使用者がそのまま直ぐに使用できるようなラベル蛋白質または蛋白 質系物質を手もとに保持することは不可能な場合が多い、このような場合、その 使用者がクリニックまたはクリニック研究室において放射性同位体を用いてラベ ル化反応を行なうことになるので、そのために“キット(Kit)″と呼ばれる 形で色々な反応用成分が使用者に提供されることになる。使用者が提供されたキ ットから通常の手法で放射性ラベル蛋白質または蛋白質系物質を得ることができ るようにするためには、これらの操作は面倒な分離、精製工程を不必要とする、 できるだけ簡単なものでなければならないことは当然である。ラベル(標識)効 率またはラベル(標り率も重要な働きをする。高価な材料物質の損失ということ のほかに、ラベルが不完全な場合には、転換しなかった原料物質は生成物から取 り除かなくてはならないので、使用者は通常、無菌条件下で放射性生成物を入念 に精製しなくてはならない。The storage stability of the labeled polymer is low, and the half-life of the metal-radioactive isotope is also short. Label proteins or proteins that can be used immediately by the user. In such cases, where it is often impossible to keep quality materials on hand, If the user performs labeling with radioisotopes in the clinic or clinic laboratory, This is why the kit is called a “kit”. In this way, various reaction components are provided to the user. The user can use the key provided Radioactively labeled proteins or protein-based substances can be obtained from These operations eliminate the need for tedious separation and purification steps. It goes without saying that it must be as simple as possible. Label effect rate or label (label rate also plays an important role. Loss of expensive materials) In addition, unconverted feedstock may be removed from the product if the label is incomplete. Users usually carefully dispose of radioactive products under sterile conditions, as they must be thoroughly removed. must be refined into

上述した特許文献に記載されたキレータ−またはカップリング剤には上記の要件 についてまだまだ望み得る多くの点を残している。例えばアメリカ特許第447 9930号、第4511550号、第4678667号およびヨーロッパ特許出 願第188256号で用いているキレータ−のかさは比較的大きなものである。The chelators or coupling agents described in the above-mentioned patent documents meet the above requirements. There is still much to be desired. For example, US Patent No. 447 No. 9930, No. 4511550, No. 4678667 and European Patent Publication No. The bulk of the chelator used in Application No. 188256 is relatively large.

アメリカ特許第4652440号、ヨーロッパ特許出願第173629号、PC T出願−085103231および11o86103010に記載された方法で は、蛋白質にキレータ−をカップリングさせるためのカップリング反応工程にお いて蛋白質を損傷させるような条件が用いられている。アメリカ特許第4479 930号およびPCT出願−085103231によってラベルされた蛋白質で の蛋白質と金属−放射性同位体との結合の強度は充分とはいえない。ラベル化方 法は多くの場合面倒なものであって、ラベルした蛋白質の精製が後で必要である (アメリカ特許第4652440号、ヨーロッパ出願第83129号、ヨーロッ パ特許出願188256号、オランダ特許出願第8204108号、PCT出@  WO36103010がそのことを示している)。ラベル化が不完全なために 精製工程をさらに追加しなくてはならないこともある(アメリカ特許第4479 930号、アメリカ特許第4652440号、PCT出@85103231およ びPCT出1!186103010がそのことを示している)。US Patent No. 4,652,440, European Patent Application No. 173,629, PC In the manner described in T-Applications-085103231 and 11o86103010 is used in the coupling reaction process for coupling a chelator to a protein. conditions are used that damage the protein. US Patent No. 4479 No. 930 and PCT Application No. 085103231. The strength of the bond between the protein and the metal-radioactive isotope is not sufficient. How to label The method is often laborious and requires subsequent purification of the labeled protein. (U.S. Patent No. 4,652,440, European Application No. 83129, Patent Application No. 188256, Netherlands Patent Application No. 8204108, PCT Issue @ WO36103010 shows this). Due to incomplete labeling Additional purification steps may be required (U.S. Patent No. 4479). No. 930, U.S. Patent No. 4,652,440, PCT Issue @ 8,510,3231 and and PCT entry 1!186103010 indicate this).

本発明の目的は診断または治療用に使用する金属−放射性同位体−ラベル蛋白質 または蛋白質系物質を調製する方法を提供することにあるが、その方法は蛋白質 または蛋白質系物質に放射性同位体をカップリングさせるカップリング剤と蛋白 質または蛋白質系物質とを反応させて、蛋白質複合体をつくり、次いでこの複合 体と放射性同位体とを反応させて放射性同位体コンプレックスとすることを内容 とするものであるが、この方法では上述の特許文献に記載された調製方法でみら れた不利益な点はまったく生じないか、生じたとしてもその程度ははるかに低い ものである。The object of the present invention is to produce metal-radioisotope-labeled proteins for use in diagnosis or therapy. or to provide a method for preparing protein-based substances; Alternatively, a coupling agent that couples a radioactive isotope to a protein-based substance and a protein A protein complex is created by reacting with a substance or a protein-based substance, and then this complex is The content involves reacting the body with radioactive isotopes to form a radioactive isotope complex. However, in this method, the preparation method described in the above-mentioned patent document does not These disadvantages may not occur at all, or may be of much lesser magnitude. It is something.

本目的は、その調製において、少なくとも実質的に次の一般式(1) %式%(1) Xは水素原子または適当な保護基を、 Rは炭素原子数が1〜10ケ好ましくは1〜4ケの、置換されていてもよい分枝 状もしくは非分枝状の炭化水素ラジカル(より好ましくは1ケまたは複数ケのへ テロ原子を有してもよいアルキル基準)を、 Yは蛋白質または蛋白質系物質の官能基と反応し得る少くとも−ケの末端反応基 を示す〕 で表わされるチオ化合物、または 環原子数5〜7ケの、式(I)(ここでXとYは一緒になって蛋白質または蛋白 質系物質の官能基と反応する反応基を形成)で表わされるチオ化合物の環状縮合 生成物、またはこの縮合生成物の水溶性塩から成るカップリング剤を用いること により達成される。The object is to provide at least substantially the following general formula (1) in its preparation: % formula % (1) X is a hydrogen atom or a suitable protecting group, R is an optionally substituted branch having 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms. or unbranched hydrocarbon radicals (more preferably one or more alkyl standards which may have a terror atom), Y is at least a terminal reactive group capable of reacting with a functional group of a protein or proteinaceous substance. ] a thio compound represented by, or having 5 to 7 ring atoms, having the formula (I) (where X and Y together represent a protein or Cyclic condensation of thio compounds (forming a reactive group that reacts with the functional group of a substance) using a coupling agent consisting of the product or a water-soluble salt of this condensation product. This is achieved by

メルカプト基に対する適当な保護基Xの例としてはアセチル基、トリフルオロア セチル基、ヒドロキシアセチル基、カルボキシアセチル基、アセトアミドメチル 基、ベンゾ・イル基。Examples of suitable protecting groups X for mercapto groups include acetyl, trifluoro Cetyl group, hydroxyacetyl group, carboxyacetyl group, acetamidomethyl group, benzoyl group.

ベンジル基、ベンゾイルアミノメチル基、その他硫黄原子の酸化されるのを防護 するのに適した基が挙げられる。Protects benzyl groups, benzoylaminomethyl groups, and other sulfur atoms from being oxidized Examples include groups suitable for

本発明の方法において、放射性ラベル化量すなわち診断または治療のための量で 使用するのに適した金属−放射性同位体の例としては、Tc−99m、Re−1 86,Re−188゜Cu−67、Pb−203,Pb−212,Ga−67、 Ga−68,B1−212.As−72,As−77、In−111、In−1 13,RL!−97,Y−90,Ag  111゜Pd−109,Sm153. ”y’b−175,Lu−177゜およびGd−159が挙げられる。これらの 放射性同位体のうちTc−99m、Pb−203,Ga−67、Ga−68゜A s−72,In−111,In−113およびRu−97は診断用として用いら れる。これら以外の放射性同位体は治療用活性組成物に特に有用である。In the method of the invention, in a radiolabeled amount, i.e. a diagnostic or therapeutic amount. Examples of metal-radioisotopes suitable for use include Tc-99m, Re-1 86, Re-188°Cu-67, Pb-203, Pb-212, Ga-67, Ga-68, B1-212. As-72, As-77, In-111, In-1 13,RL! -97, Y-90, Ag 111°Pd-109, Sm153. "y'b-175, Lu-177° and Gd-159. These Among radioactive isotopes, Tc-99m, Pb-203, Ga-67, Ga-68°A s-72, In-111, In-113 and Ru-97 are not used for diagnostic purposes. It will be done. Radioisotopes other than these are particularly useful in therapeutically active compositions.

コンプレックス形成反応において所望の放射性同位体は塩の形、好ましくは比較 的弱いキレータ−例えばピロリン酸塩。In the complex-forming reaction, the desired radioactive isotope is in salt form, preferably compared to Weak chelators - e.g. pyrophosphate.

ホスホネート、またはポリホスホネート、オキシネート、カルボキシレート、ヒ ドロキシカルボキシレート、アミノカルボキシレート、エノラートまたはそれら の混合物に結合したキレートの形で、さらに中性媒体に入れて、蛋白質複合体に 添加する。後者の場合、所望のコンプレックスは、チオ化合物の硫黄原子が金属 −放射性同位体と強いキレート結合を形成する配位子交換の原理により形成され る。Phosphonates, or polyphosphonates, oxynates, carboxylates, Droxycarboxylate, aminocarboxylate, enolate or the like in the form of a chelate bound to a mixture of Added. In the latter case, the desired complex is such that the sulfur atom of the thio compound is metal - Formed by the principle of ligand exchange to form a strong chelate bond with radioactive isotopes. Ru.

蛋白質または蛋白質系物質の誘導体形成、すなわちカップリング剤との反応は広 い条件下で実施できる。これらの条件は選定されたカップリング剤とラベルの対 象となる蛋白質もしくは蛍白質系物質の種類によって適宜変更させる。反応媒体 のpHは好ましくは6.5と9の間、より好ましくは7と8.5の間とする。イ ンキュベーショ〉′の温度は蛋白質または蛋白質系物質の物理的構造に悪影響を 及ぼさない温度ならよい。好ましい温度は室温である。インキュベーションの時 間は数分から数時間の範囲の幅をもつが、好ましいのは20分から2時間である 。Derivatization of proteins or protein-based substances, i.e., reaction with coupling agents, is a widespread process. It can be carried out under suitable conditions. These conditions apply to the selected coupling agent and label pair. The amount may be changed as appropriate depending on the type of protein or fluorescent substance to be detected. reaction medium The pH of is preferably between 6.5 and 9, more preferably between 7 and 8.5. stomach Incubation temperature has a negative effect on the physical structure of proteins or proteinaceous materials. It is fine as long as it does not exceed the temperature. The preferred temperature is room temperature. time of incubation The time ranges from a few minutes to a few hours, but the preferred time is 20 minutes to 2 hours. .

カップリング剤と蛋白質または蒼白質系物質により、ポリペプチド分子1ヶ当り 1ケまたは複数ケのカップリング分子からなる複合体が形成される。ポリペプチ ドの分子が大きい程潜在的にその反応部位は多くなるので、それに結合(con j uga te)するカップリング分子数も多くなる。例えば、免疫グロブリ ンでは蛋白質1モルに対してカップリング剤5モルが好ましい比率であり、アル ブミンでは2.5〜1が好ましい比率である。より大きな蛋白質については、こ の比率は通常、蛋白質1モル当たりカップリング剤約0.5〜約20モルである 。しかし、小さい蛋白質または蛋白質系物質の場合は、ポリペプチドに対するカ ップリング剤の比率を低くして接触させ、ペプチド鎖の集合(aggregat ton)を抑制するようにする。例えばソマトスタチンについてのこの比率は0 .1〜・1が好ましい。小さい蛋白質または蛋白質フラグメントについては、蛋 白質または蛋白質系物質1モル当りカップリング剤を約0.01モル〜約2モ1 しとする。Coupling agent and protein or pallor substance, each polypeptide molecule A complex consisting of one or more coupling molecules is formed. Polypepti The larger the molecule, the more potentially reactive sites it has, so it is possible to bind to it. The number of coupled molecules also increases. For example, immunoglobulin The preferred ratio is 5 moles of coupling agent to 1 mole of protein; For Bumin, the preferred ratio is 2.5 to 1. For larger proteins, The ratio of coupling agent typically ranges from about 0.5 to about 20 moles of coupling agent per mole of protein. . However, in the case of small proteins or protein-based substances, the Aggregation of peptide chains is achieved by contacting the coupling agent at a low ratio. ton). For example, this ratio for somatostatin is 0 .. 1 to 1 is preferable. For small proteins or protein fragments, About 0.01 mole to about 2 moles of coupling agent per mole of white matter or proteinaceous material. Let's do it.

本発明方法での好ましいカップリング剤は次の一般式(Ir)Y’ −R’ − −3’ −X        (II ’J(ここで Xは前に規定の通りであり、2 R′は炭素原子数が1−10ケの置換されていてもよい分岐枝または非分岐状の 炭化水素ラジカル(0,NおよびSから選ばれた1ケまたは複数ケのへテロ原子 および/または1ケ又は複数ケのNH基を有してもよい)を、Y′はイソシアナ ート基、ホルミル基、オルトハローニトロフェニル基、ジアゾニウム基、イソチ オシアナート基。A preferred coupling agent in the method of the present invention has the following general formula (Ir)Y'-R'- -3' -X (II 'J (here X is as specified before, and 2 R' is an optionally substituted branched or unbranched group having 1 to 10 carbon atoms. Hydrocarbon radical (one or more heteroatoms selected from 0, N and S) and/or may have one or more NH groups), Y' is an isocyanate atom group, formyl group, orthohalonitrophenyl group, diazonium group, isothi Oceanate group.

エポキシ基、トリクロロ−3−)リアジニル基、エチレンイミノ基、クロロスル ホニル基、アルコキシカルビミドイル基、置換または非置換のアルキルカルボニ ルオキシカルボニル基、置換または非置換のアルキルカルボニルイミダゾリル基 、またはスルホン化または非スルホン化N−ヒドロキシースクシニミドエステル 基(スクシニミドオキシカルポニル基)を示す)で表わされるチオ化合物、5ま たは環原子数5〜7ケの、式(■)(ここでXとYは一緒になって次の基;カル ボニル基、カルビミドイル基、N−アルキルカルビミドイル基、N−ヒドロキシ 力ルビミドイル基またはN−アルコキシ力ルビミドイル基の一つを形成)で表わ されるチオ化合物の環状縮合生成物、またはこの縮合生成物の水溶性塩である。Epoxy group, trichloro-3-)riazinyl group, ethyleneimino group, chlorosulfate Honyl group, alkoxycarbimidoyl group, substituted or unsubstituted alkylcarbonyl group carbonyl group, substituted or unsubstituted alkylcarbonylimidazolyl group , or sulfonated or non-sulfonated N-hydroxy-succinimide ester A thio compound represented by a group (succinimidoxycarponyl group), 5 or or a formula (■) having 5 to 7 ring atoms (where X and Y together represent the following group; Bonyl group, carbimidoyl group, N-alkylcarbimidoyl group, N-hydroxy N-alkoxy-rubimidoyl group or N-alkoxy-rubimidoyl group) or a water-soluble salt of this condensation product.

R′が置換された炭化水素ラジカルである場合は、この置換基としては、金属− 放射性同位体とキレート化反応することができ、金属−放射性同位体のためのポ リデンタート配位子(多座配位子)を形成する基の中から選定する。これらの基 の例は保護された、または保埠されないメルカプト基、カルキシル基、ヒドロキ シル基、アミノ基などでる。When R' is a substituted hydrocarbon radical, the substituent may include a metal- Can chelate with radioisotopes, metal-polymerization for radioisotopes Select from groups that form redentate ligands (polydentate ligands). These groups Examples of protected or unprotected mercapto groups, carxyl groups, hydroxyl groups, etc. There are syl groups, amino groups, etc.

上記の規定において、アルキル基としては炭素原子数が1から4ケのものが好ま しい。In the above definition, the alkyl group preferably has 1 to 4 carbon atoms. Yes.

水溶性塩としては各種の酸との塩、例えば塩酸、硫酸、リン酸、過塩素酸、有機 酸(例えばクエン酸、酒石酸)などとの塩が挙げられる。Water-soluble salts include salts with various acids, such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, perchloric acid, organic Examples include salts with acids (for example, citric acid and tartaric acid).

環状カップリング剤としては次の一般式(I[[)Xは前に規定の通りであり、 R#は非置換の、または1ケまたは複数ケのXS基で置換された分校状または非 分枝状のアルキル基(炭素原子数1〜10ケ)を、 R″は炭素原子数が1〜4ケのアルキル基を示す〕で表わされる化合物、または その水溶性塩が適する。As a cyclic coupling agent, the following general formula (I[[)X is as defined above, R# is unsubstituted or branched or unsubstituted with one or more XS groups. A branched alkyl group (1 to 10 carbon atoms), R'' represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms], or Its water-soluble salts are suitable.

式(I[[)で表わされる化合物の好ましい例は聞 である。Preferred examples of the compound represented by the formula (I[[) are It is.

特に好ましいものとして次の一般式(■);Rz、Rz’、R3,R:l’、R 4,R−’、R5およびR5’は同一であるか、またはそれぞれに独立して水素 原子、アアルキル5.xs−アルキル基、アルキルチオアルキル基。Particularly preferred are the following general formula (■): Rz, Rz', R3, R:l', R 4, R-', R5 and R5' are the same or each independently hydrogen Atom, aalkyl5. xs-alkyl group, alkylthioalkyl group.

アルキルカルボニルチオアルキル基、アミノアルキル基。Alkylcarbonylthioalkyl group, aminoalkyl group.

N−アルキルアミノアルキル基、N−アルキルカルボニル−アミノアルキル基ま たはN、 −N−ジアルキルアミノアルキル基(Xは前記と同意義であり、アル キル基の炭素数は1〜4ケ)であり、 nは0または1であり、 R6は水素原子またはアルキル基(炭素原子数1〜6ケ)である〕で表わされる 新規化合物、またはその水溶性塩が挙げられる。N-alkylaminoalkyl group, N-alkylcarbonyl-aminoalkyl group or or N, -N-dialkylaminoalkyl group (X has the same meaning as above, The number of carbon atoms in the kill group is 1 to 4), n is 0 or 1, R6 is a hydrogen atom or an alkyl group (1 to 6 carbon atoms) Examples include novel compounds or water-soluble salts thereof.

その安定性、取扱いやすさ、蛋白質の遊離NH,基に対する選択性、カップリン グ反応が好ましからざる副成物を生ずることなく容易に進行することからみて、 次の一般式(V)R1とnは前に規定の通りであり、 Pは0または1であり、 qはOまたは1であり、 Zは水素原子、C=Caアルキル基、メルカプト基、C8−04アルキルチオ基 、またはc、−CSアルカノイルチオ基である〕で表わされるカップリング剤、 またはその水溶性塩が好ましい。Its stability, ease of handling, selectivity for protein free NH groups, coupling In view of the fact that the reaction proceeds easily without producing undesirable by-products, The following general formula (V) R1 and n are as defined above, P is 0 or 1, q is O or 1, Z is a hydrogen atom, C=Ca alkyl group, mercapto group, C8-04 alkylthio group , or c, -CS alkanoylthio group], or a water-soluble salt thereof is preferred.

このカップリング剤を用いて形成される蛋白質複合体(conj uga te )は金属−放射性同位体、特にTc−99mとのコンプレックス形成に適してい る。非置換の2−イミノチオランおよび2−イミノチアシクロヘキサン以外のす ぐれた2−イミノチオ化合物の例としては、アルキル−置換2−イミノチオラン (例えば2−N−メチルイミノチオラン、4−メチル−2−イミノチオラン、2 −N−tert−ブチルイミノチオランおよび4,4−ジメチル−2−イミノチ オラン)、およびチオまたはアミノ官能基を有するイミノチオラン(例えば4− メルカプトメチル−2−イミノチオラン、4−アセチルチオメチル−2−イミノ チオラン、4−エチルチオメチル−2−イミノチオランおよび4−メチルアミノ メチル−2−イミノチオラン)が挙げられる。A protein complex (conj uga te) formed using this coupling agent ) is suitable for complex formation with metal-radioisotopes, especially Tc-99m. Ru. All other than unsubstituted 2-iminothiolane and 2-iminothiacyclohexane Examples of 2-iminothio compounds include alkyl-substituted 2-iminothiolanes. (e.g. 2-N-methyliminothiolane, 4-methyl-2-iminothiolane, 2-N-methyliminothiolane, -N-tert-butyliminothiolane and 4,4-dimethyl-2-iminothi orane), and iminothiolane with thio or amino functionality (e.g. 4- Mercaptomethyl-2-iminothiolane, 4-acetylthiomethyl-2-imino Thiolane, 4-ethylthiomethyl-2-iminothiolane and 4-methylamino methyl-2-iminothiolane).

実施例から明らかな通り、カップリング剤として4−アセチルチオメチル−2− イミノチオランを用いるとテクネチウム−99mにより100%の収率で蛋白質 がラベルされる。As is clear from the examples, 4-acetylthiomethyl-2- When iminothiolane is used, protein can be obtained with 100% yield by technetium-99m. is labeled.

Jue他は1978年に2−イミノチオランを使用しての蛋白質の改変(o+o dification)について報告している(BiochemistryVo l、 1?、 No、 25.1978.5399〜5406)。In 1978, Jue et al. used 2-iminothiolane to modify proteins (o+o (BiochemistryVo) l, 1? , No. 25.1978.5399-5406).

Perham  とThomasは同様の方法で改変した蛋白質をさらに水銀化 合物と反応させて蛋白質の構造を解明したと報告している(J、 Mo1. B iol、 (1971) 62.415〜418)。この方法で改変した蛋白質 を用いての金属−放射性同位体でラベルされた蛋白質の調製、このようにして得 られたラベル蛋白質のもつ優れた生物学的性質については、これまで報告がなか った。Perham and Thomas further mercurylated proteins modified in a similar manner. reported that the structure of the protein was elucidated by reacting it with a compound (J, Mo1. B iol, (1971) 62.415-418). Proteins modified using this method Preparation of metal-radioisotope labeled proteins using Until now, there have been no reports on the excellent biological properties of labeled proteins. It was.

ラベルした蛋白質または蛋白質系物質の調製にカップリング剤として用いられる 置換2−イミノチオランおよび2−イミノチアシクロヘキサンは新規化合物であ る。従って本発明は前記の一般式(■)(各記号は前記の意義を有するが、すべ ての置換基、Rz、Rz’、Rs、Rx’、Ra、R4’、Rs。Used as a coupling agent in the preparation of labeled proteins or protein-based substances Substituted 2-iminothiolane and 2-iminothiacyclohexane are new compounds. Ru. Therefore, the present invention is based on the above general formula (■) (each symbol has the above meaning, but all All substituents, Rz, Rz', Rs, Rx', Ra, R4', Rs.

R、rおよびR6が水素である場合は除く)で表わされる化合物にも係るもので ある。(excluding cases where R, r and R6 are hydrogen) be.

さらに具体的には、これらの新規化合物は前記の一般式(V)(各記号は前記の 意義を有するが、Pとqがともに0のときはR6はC,−C,アルキル基である )で表わされるものである。More specifically, these new compounds have the general formula (V) above (each symbol represents the above formula (V)). It has significance, but when P and q are both 0, R6 is a C, -C, alkyl group ).

本発明は、上記の新規化合物をカップリング剤として用い、蛋白質または蛍白質 系物質と反応させて得られる蛋白質複合体にも係るものである。The present invention uses the above-mentioned novel compound as a coupling agent to produce proteins or fluorescent proteins. It also relates to a protein complex obtained by reacting with a system substance.

本発明はさらに、上述の方法により得られる金属−放射性同位体でラベルした蛋 白質または蛋白質系物質;ならびに薬理学的に許容し得るキャリアー物質と金属 −放射性同位体でラベルした蛋白質または蛋白質系物質を含有する放射性薬剤組 成物にも係る。ラベルされた蛋白質または蛋白質系物質の溶液は放射性薬剤組成 物として1、そのまま使用される。必要により、この溶液をさらに精製するか、 あるいは薬理学的に許容し得るキャリアー物質、好まし、くは生理的食塩水を添 加して、静脈内または皮下の注射にさらに適した形へと調製する。このような処 理を受けても蛋白質に損傷が生じないという保証が必要であることばもぢろんで ある。The present invention further provides metal-radioisotope-labeled proteins obtained by the above-described method. White matter or proteinaceous substances; as well as pharmacologically acceptable carrier substances and metals. - radiopharmaceutical combinations containing radioisotope-labeled proteins or protein-based substances; It also applies to products. Solutions of labeled proteins or protein-based substances are radiopharmaceutical compositions. 1. Used as is. If necessary, purify this solution further or or added with a pharmacologically acceptable carrier substance, preferably physiological saline. Additionally, it is prepared into a form more suitable for intravenous or subcutaneous injection. Places like this It is necessary to guarantee that the protein will not be damaged even when subjected to treatment. be.

静脈内または皮下に投与されるとき、この溶液が無菌でなければならないことも 当然である。It is also important that this solution be sterile when administered intravenously or subcutaneously. Of course.

放射線診断法の実施に当っては、前述の組成物は必要により薬理学的に許容し得 る液体、好ましくは生理的食塩水により稀釈してから、温血動物に対して100 μCiから30m Ciの量にて投与し、次いで体内より放射される放射線を記 録(測定)する。In carrying out radiodiagnostic procedures, the above-mentioned compositions may be used, if necessary, in a pharmacologically acceptable manner. 100% for warm-blooded animals after dilution with a liquid, preferably physiological saline. Administer at a dose of μCi to 30 mCi, then record the radiation emitted from the body. Record (measure).

本組成物を放射線治療に使用する場合には、前述の通り、ラベル反応に適した金 属−放射性同位体を選定する。必要により薬理学的に許容し得る液体で稀釈して 、温血動物に対して、腫瘍抑制に有効な量にて投与する。When using this composition for radiotherapy, as mentioned above, it is necessary to use a suitable metal for the label reaction. Select genus-radioisotope. Dilute with pharmacologically acceptable liquid if necessary. , administered to warm-blooded animals in an amount effective for tumor suppression.

本発明の放射性薬剤組成物は容易かつ簡単に調製できるので、それらは使用者み ずからたやすく調製し得る。従って本発明は前述の通り、いわゆる“キット″に も係るが、本キットは(1)前記のごとく少なくとも、実質的に、チオ化合物ま たはそれからの環状縮合生成物からなるカップリング剤と蛋白質または蛋白質系 物質との反応で得られる蛋白質複合体調製品(乾燥状態でもよい)、(2)金属 −放射性同位体の塩またはキレートの溶液、ならびに(3)必要により(1)と (2)を反応させるときの処方を付けた使用説明書から構成される。Because the radiopharmaceutical compositions of the present invention are easy and simple to prepare, they can be easily and conveniently prepared by users. It can be easily prepared. Therefore, as mentioned above, the present invention is applied to a so-called "kit". However, this kit contains (1) at least substantially a thio compound or or a cyclic condensation product thereof and a protein or protein system. Protein complex preparations obtained by reaction with substances (dry state may also be used), (2) Metals - a solution of a salt or chelate of a radioactive isotope, and (3) optionally (1); It consists of instructions for use with prescriptions for reacting (2).

前述の通り、このコンプレックス形成反応では、所望の放射性同位体は蛋白質複 合体に対して、好ましくは比較的弱いキレータ−例えばビロリン酸塩、ホスホナ ートまたはポリホスホナート、オキシナート、カルボキシラード ビトロキシカ ルボキシラート、アミノカルポキシラートエノラートまたはこれらの混合物に結 合したキレートとして添加される(反応は中性媒体中で行われる)。放射性同位 体溶液のキレータ−として適しているのは8−ヒドロキシキノリンまたはその誘 導体ニジカルボン酸、ポリカルボン酸またはヒドロキシカルボン酸例えば蓚酸、 マロン酸、コハク酸、マレイン酸。As mentioned above, in this complex formation reaction, the desired radioactive isotope is For coalescence, preferably relatively weak chelators such as birophosphates, phosphonates, etc. or polyphosphonates, oxynates, carboxylates, vitroxica Ruboxylates, aminocarpoxylate enolates or mixtures thereof. It is added as a combined chelate (the reaction is carried out in a neutral medium). radioisotope 8-Hydroxyquinoline or its derivatives are suitable as chelators for body solutions. Conductor dicarboxylic, polycarboxylic or hydroxycarboxylic acids such as oxalic acid, Malonic acid, succinic acid, maleic acid.

オルトーフター弗酸。リンゴ酸、乳酸、酒石酸、クエン酸。Orthofter hydrofluoric acid. Malic acid, lactic acid, tartaric acid, citric acid.

アスコルビン酸、サリチル酸またはこれらの酸の誘導体;ビロリン酸塩;ホスホ ナートまたはポリホスホナート、例えばメチレンジホスホナート、ヒドロキシエ チレンジホスホナートまたはヒドロキシメチレンジホスホナート;またはエノラ ート例えばβ−ジケトン(アセチルアセトン、フロイルアセトン、テノイルアセ トン2 ベンゾイルアセ1−ン、ジベンゾイルメタン、トロボロンなど)または これらのジケトンの誘導体のエノラートである。8−ヒドロキシキノリン。クエ ン酸。Ascorbic acid, salicylic acid or derivatives of these acids; birophosphate; phosphoric acid nates or polyphosphonates, such as methylene diphosphonate, hydroxyethyl tylene diphosphonate or hydroxymethylene diphosphonate; or enola For example, β-diketones (acetylacetone, furoylacetone, thenoylacetone) (benzoyl aceone, dibenzoylmethane, trobolone, etc.) or These are the enolates of diketone derivatives. 8-Hydroxyquinoline. quest acid.

酒石酸、アスコルビン酸、グルコヘプトン酸またはこれらの誘導体またはアセチ ルアセトンは特に適したものとみられる、その理由はインジウム−IIIまたは 鉛−203などの放射性同位体とこれらのキレータ−とのキレートは適当な媒体 、好ましくは水性緩衝液中、生理的pHのもとて前記の蛋白質複合体と容易に反 応し2て、配位子交換により、所望の放射性同位体コンプレックスを高収率、高 純度に形成するからである。この目的のために通したインジうム〜lll1ロ、 ボロナ・−トの水性緩衝溶液(所望のコンプレックスの形成に用いるれる)がヨ ーロッパ特許出願第131327号(参考文献とし、て採用)に記載されている 。キ・ノ1−としては前記(1)の構成分と使用説明書をセットにして供給して もよいが、(2)の金属−放射性同位体の溶液は寿命期間に制限があるので別途 供給される。Tartaric acid, ascorbic acid, glucoheptonic acid or their derivatives or acetate Ruacetone appears to be particularly suitable because indium-III or Chelation of these chelators with radioactive isotopes such as lead-203 can be carried out in a suitable medium. , preferably in an aqueous buffer and at physiological pH, readily reacts with said protein complex. Accordingly, the desired radioisotope complex can be produced in high yield and with high efficiency by ligand exchange. This is because it forms with high purity. Injimu~llll1ro passed for this purpose, An aqueous buffered solution of boronate (used to form the desired complex) is added to the iodine solution. -Loppa Patent Application No. 131327 (incorporated as a reference) . As for Ki No. 1-, the components mentioned in (1) above and the instruction manual are supplied as a set. However, since the metal-radioactive isotope solution in (2) has a limited lifespan, it must be purchased separately. Supplied.

もう一つ別の、しかし同じ(掻めて好ましい態様として、本発明のキットには次 のような構成分をもって構成される(1)前記のチオ化合物またはそれらの環状 縮合生成物からなるカップリング剤と蛋白質または蛋白質系物質とを反応させて 得られる蛋白質複合体調製品(乾燥状態でもよい)、(2)前記のキレータ−と 還元剤、さらに(3)所望により(1)と(2)をペルテクネテート溶液とした テクネチウム−99mと反応させるときの処方を付けた使用説明書。この組成物 にはペルテクネテートを還元するための還元剤例えば亜ジチオン酸、または第一 スズイオンを含有させる。このキットはTc−99m−ラベル薬剤組成物の調製 を意図するものである。Another, but same, (and highly preferred embodiment) kit of the invention includes: (1) The above-mentioned thio compound or a cyclic form thereof By reacting a coupling agent consisting of a condensation product with a protein or protein-based substance. The obtained protein complex preparation (which may be in a dry state), (2) the above chelator and reducing agent, and (3) optionally (1) and (2) in pertechnetate solution. Instructions for use with prescription for reacting with technetium-99m. This composition A reducing agent such as dithionite or primary dithionite is used to reduce pertechnetate. Contains tin ions. This kit is used for the preparation of Tc-99m-labeled drug compositions. It is intended that

ペルテクネテート溶液は入手可能のモリブデン−テクネチウム生成元(ジェネレ ーター)から使用者によって簡単に得られる。Re−186又はRe−188で ラベルした薬剤組成物の調製に同様のキットが用いられるが、そこでも過レニウ ム酸塩(ベルレネート)fJ液が適当な還元剤、例えば亜ジチオン酸または第一 スズイオンによって還元される。必要によっては、上記(1)と(2)に規定し た構成分はそれらが互いに反溌するものでなければ一緒(コンビネーシヨン)に してもよい、蛋白質複合体は(2)に規定した各成分のいずれによっても悪影響 を受けないからである。Pertechnetate solutions are available from molybdenum-technetium generators. can be easily obtained by the user from With Re-186 or Re-188 Similar kits are used to prepare labeled drug compositions, but they also Berurenate fJ solution is mixed with a suitable reducing agent, such as dithionite or primary Reduced by tin ions. If necessary, as specified in (1) and (2) above. The components together are a combination unless they repel each other. The protein complex may be adversely affected by any of the components specified in (2). This is because they do not receive it.

この種の単成分(モノコンボーネンt−>キットでは、合併(コンバイン)され た各成分は凍結乾燥するのがよいが、この単成分キットは使用者が簡単な方法で 放射性同位体溶液を用いて反応させるのに非常に適したものである。In this type of single component (monocomponent t->kit), the combined It is best to lyophilize each component, but this single-component kit allows the user to easily freeze-dry the components. It is very suitable for reactions using radioactive isotope solutions.

さらにもう一つ別の、極めて好ましい態様として、本発明のキットは次の各構成 分をも′って製られる;(1)少なくとも、実質的に、前記のチオ化合物と、前 記のキレータ−および還元剤、(2)所望により、(1)に記載の成分(これら は1ケのバイアルに入れておくのがよい)と、蛋白質(別途使用者に供給される )およびペルテクネテート溶液としてのテクネチウム−99mまたは過レニウム 酸溶液としてのレニウム−186もしくはレニウム−188とを反応させる処方 を付けた使用説明書。この所謂“多目的キット”を用いることで、使用者は所望 の蛋白質のいずれについても放射性テクネチウムまたはレニウムでラベルするこ と(所望の蛋白質複合体を形成させて)ができる。In yet another highly preferred embodiment, the kit of the present invention comprises the following components: (1) at least substantially the aforementioned thio compound; (2) Optionally, the components described in (1) (these (preferably kept in one vial) and protein (supplied separately to the user). ) and technetium-99m or perrhenium as pertechnetate solution Reaction formulation with rhenium-186 or rhenium-188 as an acid solution Instructions for use with . By using this so-called “multi-purpose kit”, users can Labeling any of the proteins with radioactive technetium or rhenium is not possible. (by forming the desired protein complex).

この最後のキットと関連した態様として、本発明のキットは次の各構成分をもっ て構成される; (1)前記のカップリング剤、(2)金属−放射性同位体の塩またはキレートの 溶液および(3)所望により(1)と(2)の反応処方性の使用説明書。In a related aspect to this last kit, the kit of the invention comprises the following components: consists of; (1) the above coupling agent; (2) a metal-radioisotope salt or chelate; Instructions for use of the solution and (3) optionally the reaction formulation of (1) and (2).

金属還元剤、例えばSn (TI)、Fe (II)、Cu (I)、Ti ( HI)またはSb (III)は前記のキットに対する還元剤として好ましいが 、Sn (II)が最適である。還元剤の量はその結果に対して影響を及ぼさな いとするのが一般に知られた事実である(PCT出願WO37104164、出 願記録中7ページ参照)。Metal reducing agents, such as Sn (TI), Fe (II), Cu (I), Ti ( HI) or Sb(III) are preferred as reducing agents for the above kits. , Sn (II) is optimal. The amount of reducing agent has no effect on the results. It is a generally known fact that (PCT application WO37104164, (See page 7 of the application record).

驚くべきことであるが、金属還元剤は非常に少量すなわち蛋白質複合体または蛋 白質1■に対して0.1〜10μgの金属、好ましくは1〜4μgといった少量 でも充分であるということだけでなく、このように少量の還元剤を用いることで ラベル生成物のラベル化効率と安定性がかなり改善されることを認めた。これに ついては実施例により詳細に説明する。Surprisingly, metal reducing agents are present in very small quantities, i.e. in protein complexes or protein complexes. 0.1 to 10 μg of metal per square inch of white matter, preferably a small amount of 1 to 4 μg However, not only is it sufficient, but using such a small amount of reducing agent It was observed that the labeling efficiency and stability of labeled products were significantly improved. to this This will be explained in detail with reference to Examples.

前記のキットの構成分(1)は溶液として、例えば生理的食塩水または緩衝溶液 として供給できるが、好ましいのは乾燥状態例えば凍結乾燥状態である。注射用 の成分として用いるときは無菌化しなくてはならない。従って、構成分が乾燥状 態にあるときは、溶剤として無菌の生理的食塩水を用いる。Component (1) of the kit may be in solution, for example in physiological saline or in a buffered solution. However, it is preferably supplied in a dry state, for example in a freeze-dried state. for injection When used as an ingredient, it must be sterilized. Therefore, the components are in a dry state. If the condition is present, use sterile physiological saline as the solvent.

所望により、これらの構成分はアコルピン参照、ゲンチシン酸、またはこれらの 酸の塩などの安定化剤を用いて安定化してもよいし、他の補助剤、例えばグルコ ース、ラクトース。Optionally, these components include acolpine reference, gentisic acid, or their derivatives. Stabilization may be achieved using stabilizing agents such as salts of acids, or with other adjuvants, such as glucose. -s, lactose.

マンニットなどの填料を加えてもよい。Fillers such as mannitol may also be added.

次に示す実施例により本発明の詳細な説明する。The present invention will be explained in detail with reference to the following examples.

皇旌斑上 −ミノ オー7に る ルブミンの ゛濃度5tag/Iliのヒトアルブミン 溶液(0,0M)リエタノールアミジーHCf中)(pH8,0)0.51dを 原料物質とじて使用。この溶液に、0.5Mの2−イミノチオラン溶液(1Mト リエタノールアミン−HCl中)(pH8,0)25μ尼を添加した。室温下で 1時間インキュベートした。蛋白質のりジンNH,基に2−イミノチオランがう まくカップリングすると1ヶ余分の一3H基を生ずる。2−イミノチオランとの 反応の前、後におけるーSH基の数を求めることにより反応の進行を測定した。Kogyo Madarajo -Human albumin at a concentration of 5 tag/Ili of rubumin in Mino-O7 Solution (0,0M) in HCf) (pH 8,0) 0.51d Used as raw material. Add 0.5M 2-iminothiolane solution (1M to this solution) 25μ of ethanolamine (in HCl) (pH 8,0) was added. at room temperature Incubated for 1 hour. Protein paste NH, 2-iminothiolane is attached to the base Multiple coupling yields one extra 13H group. with 2-iminothiolane The progress of the reaction was measured by determining the number of -SH groups before and after the reaction.

−3H基の算定はGrassetti他(“TheDeter+m1natio n of Th1ols and of Total Glutathione  inHuman Blood Using 6.6’−Dithiodini cotintc Ac1d (CPOS)’in Biochen+1cal  Medicin; pp、 149453 (1975)。)の方法に従って行 った。この測定の原理は以下の通りである一CPDSがチオール(SH−基)と 反応し、6−メルカプトニコチン酸(6−MNA)とジスルフィドが生成する。-3H group was calculated by Grassetti et al. (“The Deter+m1natio n of Th1ols and of Total Glutathione inHuman Blood Using 6.6’-Dithiodini cotintc Ac1d (CPOS)’in Biochen+1cal Medicine; pp, 149453 (1975). ) according to the method It was. The principle of this measurement is as follows.One CPDS is a thiol (SH- group). The reaction produces 6-mercaptonicotinic acid (6-MNA) and disulfide.

6−MNAを分光光度計により344 nmで測定してから、原料物質について のチオールのモル濃度を算定する。蛋白質の一3H基の数は2−イミノチオラン 改変の前で1゜57であり、改変後は25.92である。6-MNA was measured by a spectrophotometer at 344 nm, and then about the raw material. Calculate the molar concentration of thiol. The number of 3H groups in proteins is 2-iminothiolane It is 1°57 before the modification and 25.92 after the modification.

1玉側1 2−−仁えノー士とあ玉1土」とTc7エーエ久四コヘブトネ二旦二少進− 濃度5B/dのヒトアルブミン溶液(0,0Mトリエタノールアミン−HC#! 中)(pH8,0)2.5dを2.5−を原料物質として使用。この溶液に0. 5 M 2−イミノチオラン溶液(1Mトリエタノールアミン−H(l中)(p H8,0)を添加した。室温下で1.5時間インキュベートした0反応液lli をゲルクロマトグラフィー(5ephadex G 25 )で精製したさらに 1−の試料は精製しないで残した。1 ball side 1 2--Nienoshi and Atamichichi'' and Tc7 Ae Kushi Kohebutone Nidan Nishoshin- Human albumin solution at a concentration of 5 B/d (0.0 M triethanolamine-HC#! Medium) (pH 8,0) 2.5d was used as the raw material. This solution contains 0. 5M 2-iminothiolane solution (1M triethanolamine-H in l) (p H8,0) was added. 0 reaction lli incubated for 1.5 hours at room temperature was purified by gel chromatography (5 ephadex G 25) and further Sample 1- was left unpurified.

改変アルブミンの精製品と非精製品のそれぞれをTc−99mグルコヘプトネー ト0.2d(4,5mC1に相当)と接触させた。室温で20分間インキュベー トした時点および2時間インキュベートした時点で両試料のTc−99mラベル を分析した。分析は5ephadex G 25を用いたゲルクロマトグラフィ ーで行った。Both purified and unpurified modified albumin were treated with Tc-99m glucoheptonate. 0.2 d (corresponding to 4.5 mC1). Incubate for 20 minutes at room temperature Tc-99m labeling of both samples at the time of incubation and after 2 hours of incubation. was analyzed. Analysis was performed using gel chromatography using 5ephadex G25. I went there.

改変アルブミンの精製品のラベル化率はインキュベート20分で40.8%、イ ンキュベート2時間で85.6%である。The labeling rate of purified modified albumin was 40.8% after 20 minutes of incubation. It is 85.6% after 2 hours of incubation.

改変アルブミンの非精製品のラベル化率はインキュベート20分で88,7%、 インキュベート2時間で93.2%である。The labeling rate of unpurified modified albumin was 88.7% after 20 minutes of incubation. It is 93.2% after 2 hours of incubation.

n匠l に血主ffl因Z二改支乙色A主lズユヱーC−、llL文さlkp玉淀五91 1LL回J」ノd紀枦払ル実施例2で得られたTc−99mラベル試料の精製品 に過剰のDTPA、(ジエチレントリアミンペンタ酢酸)を加えた。n master To the blood Lord ffl Cause Z two changes otsuiro A Lord lzuyu C-, llL sentence lkp Tamayodo 591 Purified product of Tc-99m label sample obtained in Example 2 Excess DTPA, (diethylenetriaminepentaacetic acid) was added to.

DTPAと蛋白質の比(重量単位)は5etsとした。DTPAとT c−99 m−ラベルアルブミンの混合試料を室温で48時間インキュベートした。アルブ ミンに対するTc−99mの結合度を5ephadex G 25を用いたゲル クロマトグラフイーで測定した。結合度はもとのTc  99mラベルの97. 3%(放射性崩壊について修正)であった。このことはアルブミンのラベルの消 失はわずか2.7%であることを示している。The ratio of DTPA to protein (weight unit) was 5ets. DTPA and Tc-99 The mixed sample of m-labeled albumin was incubated for 48 hours at room temperature. albu The degree of binding of Tc-99m to min was measured using a gel using 5ephadex G25. Measured by chromatography. The degree of binding is 97. 3% (corrected for radioactive decay). This means that the albumin label will disappear. This shows that the loss is only 2.7%.

1!1l− )二盃主J土オニ尺よ−4」」−CuLf11ユy工艮政変とT c−99mグ ルコヘア”)2−止x孟五旦丘止濃度10mg/−のヒトIg溶液(0,06M )リエタノールアミ7−HCp、中)(pH8,0)2.5adを原料物質とし て使用。この溶液に0.5 M 2−イミノチオラン溶液(IM)リエタ/−) Li7ミ7−HCj!中)(pH8,0)25.crfを添加した。室温下で1 時間インキュベートした。次いでTc−99mグルコヘプトネート2d (22 4mC1に相当)を反応混合液2.51dに加え30分間インキュベートした。1!1l- ) Two Sakakushi J Sat Onishakuyo-4” - CuLf11 Yuy Industrial Coupling and Tc-99m Gu Human Ig solution (0.06M ) reethanolamide 7-HCp, medium) (pH 8,0) 2.5ad as the raw material. Used. Add 0.5M 2-iminothiolane solution (IM) to this solution/-) Li7mi7-HCj! Medium) (pH 8,0) 25. crf was added. 1 at room temperature Incubated for hours. Then Tc-99m glucoheptonate 2d (22 4mC1) was added to reaction mixture 2.51d and incubated for 30 minutes.

ゲルクロマトグラフィーを用いた分析によるとラベル比率は73.6%である。According to analysis using gel chromatography, the label ratio is 73.6%.

実施■旦 2−イミノチオランによるI    グロブリン の ・シニしSユニ旦」L更 ゛     に   −さ」6−j二i:二鎖9mjンとコごΣブトネートとの   ・ 濃度10+wg/at?7)!: トTg溶液(0,06M ト+J xり、/  −ルアミジーHCJ2中)(pH8,0)ldを原料物質として使用。Implementation day 2-Iminothiolane's production of globulin ゛              -sa” 6-j2i: Two-chain 9mj-on and the combination of Σbutonate ・ Concentration 10+wg/at? 7)! : ToTg solution (0.06M To + J x Ri, / - in Rumidy HCJ2) (pH 8,0) ld was used as the raw material.

この溶液に0.18M2−イミノチオラン溶液(1Mトリエタノールアミン−H Ci!、中)(pH8−0)5ulを添加シタ。Add 0.18M 2-iminothiolane solution (1M triethanolamine-H Ci! , medium) (pH 8-0).

室温で1時間インキュベートし”ζがら、反応混合液を5dずつの2つの試料に 分けた。一方の試料に”rc  99+uグルコヘプトネ一ト1m(10mCi に相当)を加え、他方の試料にはTc−99m酒石酸塩1 戚(10m Ciに 相当)を加えた。45分間インキュベートしてから反応液をゲルクロマトグラフ ィー(5ephadex G 25 )を用いて分析した。Tc−99mグルコ ヘプトネートでのラベル化率はわずか17%でであったが、Tc−99m酒石酸 塩の場合はかなり高く、58%であった。After incubating for 1 hour at room temperature, divide the reaction mixture into two samples of 5 d each. divided. Add 1 m (10 mCi) of rc 99+u glucoheptone to one sample. To the other sample, Tc-99m tartrate 1 relative (corresponding to 10m Ci) was added. equivalent) was added. Incubate for 45 minutes and then gel chromatograph the reaction. It was analyzed using 5ephadex G25. Tc-99m gluco The labeling rate with heptonate was only 17%, but with Tc-99m tartaric acid. In the case of salt, it was quite high, at 58%.

改変しない1g試料について行った対照試験ではラベル化することができなかっ た。Control tests performed on unmodified 1g samples did not allow for labeling. Ta.

実施班旦 2−イミノチオランー I    グロブ1ンー1旦Tc−m−ベルの   の  定1血孟主L1mgのIgを含有する溶液(0,06M)リエタノールアミジ ーHCjE中)(pH8,0)0.1dに0.07M2−イミノチオラン溶液( 1Mトリエタノールアミン−HCl中)(pH8,0)5μiを加えた。室温下 、1時間反応させた。Tc−99m酒石酸塩0.5d (42,7mC1)を加 え、混合液を室温下で1時間インキュベートした。分析の結果、ラベル比率は7 2.7%であった。2時間後、反応混合物を未精製のまま、0、 l dずつの 2ケの試料として採取し、一方の試料(0,1d)にはヒト血清095dを添加 し、他の資料(0,1d)には生理的食塩水0.5−を添加した。改変されてい ないがTc−99m酒石酸塩を含む1g試料にヒト血清0.5 dを添加、ブラ ンクテストとした。室温で24時間インキュベート後、各試料についてゲルクロ マトグラフィーを用いてIgへのTc −99mの結合度を分析した。Tc−9 9m2−イミノチオラン改変Igでの結合度は91%であったが、生理的食塩水 でインキュベートしたときもやはり91%と同じ値を示した。Implementation team day 2-Iminothiolane-I Glob 1-1Tc-m-Bell's A solution containing 1mg of Ig per blood sample (0.06M) reethanolamide - in HCjE) (pH 8,0) 0.1d to 0.07M 2-iminothiolane solution ( 5 μi of 1 M triethanolamine in HCl (pH 8,0) was added. At room temperature , and reacted for 1 hour. Add Tc-99m tartrate 0.5d (42,7mC1) Then, the mixture was incubated for 1 hour at room temperature. As a result of the analysis, the label ratio is 7. It was 2.7%. After 2 hours, the unpurified reaction mixture was diluted with 0 and 1 d each. Two samples were collected, and human serum 095d was added to one sample (0, 1d). However, 0.5 - of physiological saline was added to other samples (0, 1d). has been modified However, 0.5 d of human serum was added to 1 g sample containing Tc-99m tartrate. It was used as a link test. After 24 hours of incubation at room temperature, gel clot was applied to each sample. The degree of binding of Tc-99m to Ig was analyzed using matography. Tc-9 The degree of binding with 9m2-iminothiolane modified Ig was 91%, but with physiological saline The same value of 91% was also shown when incubated with .

改変しないIgでは血清中で45%の非特異的結合度(血清蛋白への結合)を示 した。血清中でインキュベートしても蛋白質からのTc−99mの分離は起こら ないと結論できる。Unmodified Ig shows a degree of non-specific binding (binding to serum proteins) of 45% in serum. did. Incubation in serum does not result in separation of Tc-99m from proteins. We can conclude that there is no.

災1阻1 2−(S/−Pf’−7”rlffiし、Tc−99m1     およTc− m  ルコヘート衣二 ′−ベル たり、、工免グロブリン の  1 の唾足 免疫活性はアクニティクロマトグラフィーにより測定、そのために、先ずやぎか ら得られた抗ヒトIgのIgフラクシゴンを臭化シアン活性化架橋(クロスリン ク)アガロース(小球状)に共有結合させた。結合物を用い’l rnlの注射 器(Syringe)内に小さいカラムを作成した。二〇カラムは、中性のpH 値下で約0.6■のヒト1gを結合する。カラムを天然(未処理)のIg、なら びにアルブミンのPBS (リン酸緩衝溶液で溶離して活性化し、た。Igの場 合、カラム保持率は最適な値(60〜80%)を示したが、アルブミンではほと んど保持(retention)がみられなかった(5%)、0.1Mグルシン 溶液(0,15M  NaC1,pH2,4中)でカラムを洗滌処理した。免疫 活性はTc−99m−ラベルIg試料のパーセンテージとして次の式により算定 される。Disaster 1 hindrance 1 2-(S/-Pf'-7"rlffi, Tc-99m1 and Tc- M Rukoheto Iji'-Bell Tari,, Komen Globlin's 1 spit foot Immune activity is measured by actinic chromatography, and for this purpose, goats are first Ig fluxigon, an anti-human Ig obtained from h) Covalently bonded to agarose (small spheres). Injection of rnl using conjugate A small column was created in a syringe. Twenty columns are at neutral pH It binds approximately 0.6 μg of human 1 g. If the column is natural (untreated) Ig, In addition, albumin was eluted with PBS (phosphate buffer solution) and activated. For albumin, the column retention rate showed an optimal value (60-80%), but for albumin, it showed an optimal value (60-80%). No retention was observed (5%) with 0.1M glucine. The column was washed with a solution (0.15M NaCl in pH 2.4). immunity Activity was calculated as a percentage of Tc-99m-labeled Ig sample by the following formula: be done.

2−イミノチオランで改変し、Tc−99m酒石酸塩でラベルした実施例5のI g(1:10の比率)では、もとのIgに対して99.4%の免疫活性を示した 。Tc−99mグルコヘプトネートによるラベルの場合はその値は94.9%で あった。I of Example 5 modified with 2-iminothiolane and labeled with Tc-99m tartrate. g (1:10 ratio) showed 99.4% immunoactivity against the original Ig. . In the case of labeling with Tc-99m glucoheptonate, the value is 94.9%. there were.

皇族孤主 に(3/−F−t−ンによるモノクロ−ル  の ・とTc−99m?     によるーベル止モノクローナル抗体としては、マウスから得られ、ヒトCEA( ガン胎児性抗原)に対するものを使用。これはラベルし結腸腫瘍の検出に用いら れるものである。本抗体はPariai4と呼ばれる。1mgのParlas+ を含有する溶液CPBSニリン酸緩衝液中(pH7,6)O,Idに0.077 M2−イミ)fオラン溶液(1Mトリエタノ−・ルアミジーHCf中)(pH8 ,0)5μlを添加した。室温で1時間反応させた。71゜99m酒石酸塩溶液 0,511N(8mCiに相当)を加え、室温下で1.5時間インキュベートし た。ゲルクロマトグラフィーによる分析の結果、ラベル化率は79.5%であっ た。royal family lonely ( Monochrome by 3/-Ft-ton and Tc-99m? A bell-stopping monoclonal antibody obtained from mice and human CEA ( used against carcinoembryonic antigen). This is labeled and used to detect colon tumors. It is something that can be done. This antibody is called Pariai4. 1mg Parlas+ A solution containing CPBS in diphosphate buffer (pH 7,6) O, Id 0.077 M2-im) f orane solution (in 1M triethanolamine HCf) (pH 8 ,0) 5 μl was added. The reaction was allowed to proceed at room temperature for 1 hour. 71°99m tartrate solution Add 0,511 N (equivalent to 8 mCi) and incubate for 1.5 hours at room temperature. Ta. As a result of gel chromatography analysis, the labeling rate was 79.5%. Ta.

夫施土豆 2−イミノ−f−f−7−ITc−99m’     T−<ル −モ  ロー  ル  の  2  の゛免疫活性の測定には抗原としてCEA(ガン胎児性抗 原)を用いるエリザ(Elisa)テストを使用。測定手順についてはLam5 drop他の報告がある(J、 lm5uno1. Methods 39+  293−405(1980)+”Tmnunoper−oxidase pro cedure to detect monoclonaiantibodie s against cell 5urface ar+tigen、 Qua nt+、tationof binding and staining of  1ndioidual cells’ )。リン酸緩衝液P B S (Ph oshate−buffered 5aline)に入れたCEAを工%BSA (ウシ血清アルブミン)と−緒にして96−ウェル(Well)−微量滴定プレ ート(Microtiter plate)のウェルに添加し、室温下でインキ ュベートした。Parlam 4抗体(PBS中)を1%BSA(1/100に 稀釈)と−緒にして加え、段階的に稀釈した。インキュベート後、ウェルをPB S(0,05%Tween■20)で3回洗滌してから、うさぎの抗マウスIg   (1/400に稀釈)で処理し、ペルオキシダーゼでラヘルした。インキュ ベートし、PBS(0,05%Tseen 20 )で3回洗滌してから、基質 (0−フェニレンジアミン1 mg/ 0.1 M酢酸1−1pH5,0)を加 え、呈色反応が生じたら分光光度計により482n*で吸光度を測定した。Hushidomame 2-Imino-f-f-7-ITc-99m' T-<le-mo-low Rule 2: ``CEA (carcinoembryonic anti-inflammatory agent) is used as an antigen for measuring immune activity. The Elisa test is used. For the measurement procedure, please refer to Lam5 There are reports of drop and others (J, lm5uno1. Methods 39+ 293-405 (1980) + “Tmnunoper-oxidase pro cedure to detect monoclonal antibody s against cell 5 surface ar+tigen, Qua nt+, tation of binding and staining of 1ndioidual cells’). Phosphate buffer P B S (Ph CEA in oshate-buffered 5aline) (bovine serum albumin) in a 96-well microtiter plate. Add the ink to the wells of a Microtiter plate at room temperature. It was incubated. Parlam 4 antibody (in PBS) was diluted with 1% BSA (1/100 dilution) and diluted stepwise. After incubation, the wells are PB After washing three times with S (0,05% Tween 20), rabbit anti-mouse Ig (diluted to 1/400) and treated with peroxidase. incu After washing 3 times with PBS (0.05% Tseen 20), the substrate (0-phenylenediamine 1 mg/0.1 M acetic acid 1-1 pH 5,0) was added. After a color reaction occurred, absorbance was measured at 482n* using a spectrophotometer.

次の試料について比較した; (1)実施例8の改変Parlas+4 (PM4) 、(2) Tc  99 m酒石酸塩でラベルした改変PM4 (実施例8)、(3)未改変のParla m 4 (シかしTc99m酒石酸塩を存在させる)、(4)腹水(ascit es 1iquid)中のParlam 4 。The following samples were compared; (1) Modified Parlas+4 (PM4) of Example 8, (2) Tc 99 Modified PM4 labeled with m-tartrate (Example 8), (3) Unmodified Parla m4 (presence of Shikashi Tc99m tartrate), (4) ascites (ascit Parlam 4 in es 1iquid).

図1のグラフからみて、2−イミノチオラン改変とTc−99m酒石酸塩による ラベルが免疫活性に与える影響は検出し得るものでないことが判る。グラフ中、 “ABS”は吸光度を、“v、f”は稀釈因子を示す。From the graph in Figure 1, it can be seen that 2-iminothiolane modification and Tc-99m tartrate It can be seen that the label has no detectable effect on immune activity. In the graph, "ABS" indicates absorbance, and "v, f" indicates dilution factor.

カーブと試料との関係は次の通り; (1)  ’−−−−−’   Pbarmacon 4  (P M 4 )  、2−イミノチオランで改変 (2)0−、−−−、OPM4.2−イミノチオランで改変、Tc−99m酒石 酸塩でラベル (3)→−−−−−+  PM4+Tc−99m酒石酸塩(4) x−”−x   PM4  腹水!嵐九ユ )ニイノ  オーフに″ 乙火ヱ亙2辺致且2」、、b二LL3−クエン 普に よるーベル 濃度5mg/dのアルブミン溶液(0,06M)リエタノールアミジーHCI! 、中)(pH8,0)2.5dを原料物質として使用。この溶液に0.5 M  2−イミノチオラン溶液(1Mトリエタノールアミン−HCl中)(pH8,0 )10μβを添加した。The relationship between the curve and the sample is as follows; (1) '------' Pbarmacon 4 (P M 4) , modified with 2-iminothiolane (2) 0-, ---, modified with OPM4.2-iminothiolane, Tc-99m tartar Label with acid salt (3)→−−−−−+ PM4+Tc-99m tartrate (4) x-”-x PM4 Ascites! Arashi Kuyu ) Niino Aufu ``Otohie 2 sides and 2'',,b2LL3-Quen commonly Yorubell Albumin solution (0.06M) at a concentration of 5 mg/d Reethanolamizy HCI! , medium) (pH 8,0) 2.5d was used as the raw material. 0.5M in this solution 2-iminothiolane solution (in 1M triethanolamine-HCl) (pH 8.0 ) 10μβ was added.

室温下で65分間インキュベートした。反応溶液1dを採りゲルクロマトグラフ ィー(5ephadex G 25 )により精製した。かくて、濃度3.3  vag / dの改変アルブミン1.5 dが得られる。P b−203ク工ン 酸塩1m(0,5mC1に相当)を加え、室温下で45時間インキュベートした 。ゲルクロマトグラフィーによる分析によれば、ラベル化率は75%である。Incubate for 65 minutes at room temperature. Take 1d of the reaction solution and apply gel chromatography It was purified by 5ephadex G25. Thus, the concentration is 3.3 1.5 d of modified albumin of vag/d is obtained. P b-203 Kukon 1 m of acid salt (equivalent to 0.5 mC1) was added and incubated for 45 hours at room temperature. . According to analysis by gel chromatography, the labeling rate is 75%.

非改変アルブミンの場合は、同じラベル条件で、まったくラベル化率を示さなか った。Unmodified albumin showed no labeling rate under the same labeling conditions. It was.

叉扇■上上 ヱニ遼主左土尤因り交、LLLg二」1ン1ブ」l工二盈変とIn−111トロ ポ三主二上様≦旦 濃度10mg/dのIg溶液(0,06M)リエタ、ノールアミ7− HCI中 )(pH8,0)3dを原料物質トシテ使用。この溶液に0.5 M 2−イミ ノチオラン溶液(1Mトリエタノールアミン−HCf中)(pH8,0)25μ 2を添加した。室温で1時間反応させた。反応混合液0.5 dをとり、ゲルフ ィルトレージョン(5ephadex G 25 )で精製した。かくて、約5 tagの改変蛋白質を含有する改変Tgm。5dを得た。これに、In、−11 1トoポロネートQ、 3 m (0,3m Ciに相当)を加えた。未精製の 改変1g0.5yJに対しても同様にI n −111トロポロネート0.3− を別えた。室温で30分間インキュベー1・後、ゲルクロマ)・グラフィーにて ラベル化率を測定した。精製、非精製の改変Igのいずれについてもこの率は1 00%の値を示した。同条件下で非改変Igのラベル化率は41%であった。Upper folding fan In-111 Toro Posanju Nijo≦dan Ig solution (0.06M) at a concentration of 10 mg/d in Lieta, Norami 7-HCI ) (pH 8,0) 3d was used as a raw material. Add 0.5M 2-imide to this solution. Notiolane solution (1M triethanolamine in HCf) (pH 8,0) 25μ 2 was added. The reaction was allowed to proceed at room temperature for 1 hour. Take 0.5 d of the reaction mixture and transfer it to Guelph. It was purified by filtration (5 ephadex G 25). Thus, about 5 A modified Tgm containing a modified protein of tag. I got 5d. To this, In, -11 1 toporonate Q, 3 m (equivalent to 0.3 m Ci) was added. unrefined Similarly, for the modified 1g0.5yJ, In-111 Tropolonate 0.3- We broke up. After incubation for 30 minutes at room temperature, gel chroma) The labeling rate was measured. This rate is 1 for both purified and unpurified modified Ig. It showed a value of 00%. Under the same conditions, the labeling rate of unmodified Ig was 41%.

犬施土11 iJAJ!LLムL曵」製 2−イミノチオラン200μgと5n(n)  (酒石酸スズとして)5ggを 一緒にしてバイアルに入れ、両槽成分を凍結乾燥した。Inu Shido 11 iJAJ! Made by LLmu 200 μg of 2-iminothiolane and 5 mg of 5n (n) (as tin tartrate) Combined and placed in a vial, both bath components were lyophilized.

この多目的キットはあらゆる種類の蛋白質をラベルするのに用いられうる。例え ば、2001I1gのヒト■gを含有する食塩水2dをこれに加えて、全体を混 合してから、10mCt(370MBq )のペルテクネテート(生理的食塩水 0.5−中)を用いてラベルする。室温下で10分間インキュベートしでから5 ephadex G 25カラムを用いて溶離することによりラベル化率を測定 する。その値は91゜9%である。This versatile kit can be used to label all types of proteins. example For example, add 2 d of saline containing 1 g of 2001I to this and mix the whole thing. pertechnetate (physiological saline) at 10 mCt (370 MBq). 0.5-medium). Incubate for 10 minutes at room temperature, then Measure the labeling rate by elution using an ephadex G 25 column do. Its value is 91°9%.

実施団ユ」、 圭成分」天ムL乳を二主y止1」Jユ迎11(上1)」王里公工往す皇1皿戒生 ヒトIgを実施例5と同様にし、て、2−イミノチオランで改変した。改変蛋白 質11g、酒石酸5■、および5n(If)(塩化物として)2ttgを−・緒 でしてバイアルに入れた。Implementation Team Yu”, Kei Ingredients ``Tenmu L Milk 2 Main Y Stop 1'' J Yu Ying 11 (1st 1)'' Oli Gongko Goes Emperor 1 Plate Precept Human Ig was modified with 2-iminothiolane in the same manner as in Example 5. modified protein 11g of tartaric acid, 5g of tartaric acid, and 2ttg of 5n(If) (as chloride). I put it in a vial.

このキラi・をテクネチウム99rnを用いラベルした;すなわち、モルブデジ ーテクネチウム生成元(ジェネレーター)から得たペルテクネテート0.5d  (0,5mC1)をバイアルに入れ、室温下で、20分間インキュベートした。This Kira i was labeled using technetium-99rn; -0.5d of pertechnetate obtained from a technetium generator (0.5mC1) was placed in a vial and incubated at room temperature for 20 minutes.

ラベル化率は99.2%であった。The labeling rate was 99.2%.

このラベル化生成物は担腫瘍マウスの感染プロセスの部位を決めるのに用いられ る。そのために、生成物(すなわちRad iopharmacon )をマウ ス(16時間前に5taphyloccus aureus8−12 (100 万単位)を右のももの筋肉に感染させておく)に静脈内投与する。静注後、1. 6,24時間の時点でシンチグラムをとり左の非感染ももの対応部のそれと比較 した。結果(Re L比、すなわち感染した右のももと感染してない左のももの 比)を以下に示した。This labeled product was used to localize the infection process in tumor-bearing mice. Ru. For this purpose, the product (i.e. Radiopharmacon) is (5 taphyloccus aureus 8-12 (100 10,000 units) intravenously into the infected right thigh muscle. After intravenous injection, 1. At 6 and 24 hours, a scintigram was taken and compared with that of the corresponding part of the left non-infected thigh. did. Results (Re L ratio, infected right thigh and uninfected left thigh) ratio) is shown below.

比較として、同じ目的によく使われるradiophar*acon、すなわち ガリウム−67サイトレートを用いて、同様にテストした。結果は試験動物4匹 についての平均値である。As a comparison, radiophar*acon, which is often used for the same purpose, i.e. A similar test was conducted using gallium-67 citrate. The results are from 4 test animals. This is the average value for

両物質の間の差異は明白である。The difference between both substances is obvious.

皇施■土土 一ベル  るキ・・トのスズ4  の 2−イミノチオランで改変し、かつ実施例5と同様に調製したIg 1■を5n (II)(酒石酸スズとして)133ggとバイアル中で混合した。ペルテクネ テート(5mCi  ;185MBq )(0,5dの生理的食塩水中)をバイ アルに加え、混合物を室温下で20分間インキュベートした。5ephadex  G25カラムでの溶出によりラベル化率を測定、93.8%の値を得た。imperial donation ■earth 4 bells of tin Ig 1■ modified with 2-iminothiolane and prepared in the same manner as in Example 5 was mixed with 5n (II) (as tin tartrate) in a vial. Pertechne Tate (5 mCi; 185 MBq) (0.5 d in physiological saline) by The mixture was incubated at room temperature for 20 minutes. 5ephadex The labeling rate was measured by elution with a G25 column, and a value of 93.8% was obtained.

5n(II)(酒石酸スズとして)12.5μgの存在下で同様に試験したが、 その場合のラベル化率は74゜9%にすぎなかった。Similarly tested in the presence of 12.5 μg of 5n(II) (as tin tartrate), In that case, the labeling rate was only 74.9%.

実m 2  キ・ 炉       ′ ゛ る   q仇里2ヶのバイアルのうち一 方には2−イミノチオランを用い、実施例5の方法で調製した改変Ig 1++ +gを入れ、他方には酒石酸25■と5n(If)(塩化スズとして)20dg を入れる。Real m 2 Ki Furnace One of the two vials For the latter, modified Ig 1++ prepared by the method of Example 5 using 2-iminothiolane. +g of tartaric acid and 20dg of tartaric acid and 5n (If) (as tin chloride) on the other side. Put in.

両成分は凍結乾燥の状態とする。Both components are in a freeze-dried state.

次のようにしてキットをラベル化した;すなわち、酒石酸と5n(II)を有す るバイアルに生理的食塩水5dを加える。The kit was labeled as follows; i.e. with tartaric acid and 5n(II). Add 5 d of saline to the vial.

得られる溶液lidを改変Igを有するバイアルに入れ、全体を混合する0次い でペルテクネテートを加え、実施例13と同様にインキユベートする。Place the resulting solution into a vial with modified Ig and mix the entire solution. Add pertechnetate and incubate as in Example 13.

このPharmaconにつき、マウスを使い実施例13とまったく同じ方法で ガリウム−67サイトレートとの比較を行った。For this Pharmacon, use a mouse in exactly the same manner as in Example 13. A comparison was made with gallium-67 citrate.

結果(R: L比)は下表の通りである。The results (R:L ratio) are shown in the table below.

結果は4匹の動物についての平均値である。Results are average values for 4 animals.

この試験でも、既知の製品との差が明白である。Even in this test, the differences with known products are clear.

実施±1旦 −々 −−ル オーフのi  アルブミン ゛遺鷹工蓋ヒシy化 a)画情したメチルアリルクロライド9.28 gにCaC1t−管を経由して 空気を90分間通した。次いで、冷却しなからHBrを3時間通した。生成する 1−ブロモ−3−クロロ−2−メチルプロパンを水、K z COs−溶液、さ らに水の順序で洗滌してから減圧画情し、NMRスペクトルで同定した。収率1 5.5g。Implementation ±1 day −−−−Le Ouf's I Albumin a) 9.28 g of refined methylallyl chloride via CaC1t-tube Air was passed through for 90 minutes. Then HBr was passed through it for 3 hours while cooling. generate 1-Bromo-3-chloro-2-methylpropane in water, KzCOs-solution, After washing with water, the product was imaged under reduced pressure and identified by NMR spectrum. Yield 1 5.5g.

b)NaCN1.43 gを水2.5dに溶かし、それにエタノール10dとa )で得られた化合物5gを添加した。反応混合液を約85°Cで20時間還流し てから次の通り処理した;エタノールの蒸発、メチレンクロライドの添加とNa Brの濾過、乾燥、減圧画情。目的物質すなわち3−クロロ−2−メチルプロピ ルシアニド(NMRスペクトルで同定)を1.75gの収率で得た。b) Dissolve 1.43 g of NaCN in 2.5 d of water, add 10 d of ethanol and a 5 g of the compound obtained in ) was added. Reflux the reaction mixture at approximately 85°C for 20 hours. and then treated as follows; evaporation of ethanol, addition of methylene chloride and Na Br filtration, drying, and vacuum image. Target substance i.e. 3-chloro-2-methylpropyl Lucyanide (identified by NMR spectrum) was obtained in a yield of 1.75 g.

c)0.534gのチオ酢酸カリウム(KSAC)を無水ジメチルスルホキサイ ド(DMSO>0.7dに溶かした溶液中にb)で得られた化合物0.5gを攪 拌しながら加えた。室温で1時間攪拌してから、反応混合物に水を加え、ジエチ ルエーテルで抽出し、エーテル層を濃NaC1液で洗滌して乾燥した。ジエチル エーテルを蒸発除去し、生成物を減圧画情した。c) Add 0.534 g of potassium thioacetate (KSAC) to anhydrous dimethyl sulfoxide. Stir 0.5 g of the compound obtained in b) in a solution dissolved in DMSO>0.7d. Added while stirring. After stirring at room temperature for 1 hour, water was added to the reaction mixture and diethyl The ether layer was washed with concentrated NaCl solution and dried. diethyl The ether was removed by evaporation and the product was imaged under reduced pressure.

3−アセチルチオ−2−メチルプロピルシアニド(NMR−スペクトルとIR− スペクトルで同定)が0.365 gの収率で得られた。3-Acetylthio-2-methylpropyl cyanide (NMR-spectrum and IR- Spectral identification) was obtained in a yield of 0.365 g.

d)  c)での生成物0.77 gを無水メタノール2.14dと7、6 N  HCf /メタノール2.95 d中で48時間攪拌して、環化させた。メタ ノール/HCIを蒸発除去し、冷却してからジエチルエーテルを添加した。3− イミノ−4−メチルチオランの結晶を濾別し、ジエチルエーテルで洗滌した。融 点175〜177℃。d) 0.77 g of the product in c) was mixed with 2.14 d of anhydrous methanol and 7,6 N The mixture was stirred for 48 hours in 2.95 d of HCf/methanol for cyclization. meta The nol/HCI was evaporated off and diethyl ether was added after cooling. 3- Imino-4-methylthiolane crystals were filtered off and washed with diethyl ether. Melt Point 175-177°C.

得られた2−イミノ−4−メチルチオランを用い、実施例1で2−イミノチオラ ンについて述べた方法と同様にしてヒトアルブミンを改変し、続いて、5n(n )2μgと酒石酸ナトリウム5■(生理的食塩水中)を加えてからTc−99m ペルテクネテート0.5d(生理的食塩水中)(はぼ5mCi(185MBq) に相当)を加えて処理しTc−99mでラベルした。ラベル化率は96,9%。Using the obtained 2-imino-4-methylthiolane, 2-iminothiolane was prepared in Example 1. Human albumin was modified in a manner similar to that described for 5n (n ) and 5 μg of sodium tartrate (in physiological saline), then Tc-99m. Pertechnetate 0.5d (in physiological saline) (Habo 5mCi (185MBq) ) and labeled with Tc-99m. The labeling rate was 96.9%.

スILLエ ーイ々   シ ロへキ ン ω−ブロモブチルシアニドを原料物質とし、実施例16と同様にして取得した。SILLE -Ishirohekin It was obtained in the same manner as in Example 16 using ω-bromobutyl cyanide as a raw material.

融点182℃、ヒトアルブミンを2−イミノチアシクロヘキサンを用い実施例1 と同様にして改変し、Tc−99mを用い実施例16と同様にしてラベルした。Example 1 Using 2-iminothiacyclohexane with human albumin having a melting point of 182°C was modified in the same manner as in Example 16, and labeled using Tc-99m in the same manner as in Example 16.

ラベル化率は83.4%。The labeling rate was 83.4%.

夫五班上工 2  N−tert−ブチに4 ’;< / ++ −y 7(7)” 鼾番便 里a)tert−ブチルアミン19gとトリエチルアミン28gを400dのジ エチルエーテルに溶かした溶液中に4−クロロブチルクロライド35gを100 rdのジエチルエーテルに溶かした溶液を攪拌しながら滴下した。1時間還流後 、混合物を水に注加し、有機層を分別し、水層をジエチルエーテルで抽出した。Hugoban construction worker 2 N-tert-buti ni 4’;< / ++ -y 7 (7)” snoring number a) Add 19 g of tert-butylamine and 28 g of triethylamine to 400 d of dichloromethane. 100 g of 4-chlorobutyl chloride in a solution dissolved in ethyl ether A solution of rd in diethyl ether was added dropwise with stirring. After refluxing for 1 hour The mixture was poured into water, the organic layer was separated, and the aqueous layer was extracted with diethyl ether.

有機層を合併し、水と飽和NaC1液で順次洗滌し、乾燥した。溶媒を蒸発除去 すると、4−クロロ−N−tert−ブチル酪酸アミドが40.8 gの収量で 得られた。メタノール中から再結晶させて精製、装填62.5〜64°C0b) 上記のアミド7.1gを300−のトルエンに溶かした溶液を攪拌、還流し、こ れにP、S、。17.8 gを少しずつ加えた。60時間還流し、冷却してから 混合物を飽和NaHCO3溶液に注加した。有機層を分別し、飽和NaHCOs 液(2回)次いで飽和NaC1液で洗滌し、乾燥した。溶媒を漏失すると、標題 化合物、2−N−tert−ブチルイミノチオランが黄色の液体として得られた 。沸点:115〜117°C/40mmHg、生成物はTRスペクトル、NMR スペクトル、マススペクトルで同定した。The organic layers were combined, washed sequentially with water and saturated NaCl, and dried. Evaporate the solvent Then, the yield of 4-chloro-N-tert-butylbutyric acid amide was 40.8 g. Obtained. Purification by recrystallization from methanol, loading 62.5-64°C0b) A solution of 7.1 g of the above amide dissolved in 300 g of toluene was stirred and refluxed. Reni P, S,. 17.8 g was added little by little. After refluxing for 60 hours and cooling The mixture was poured into saturated NaHCO3 solution. Separate the organic layer and add saturated NaHCOs The solution was washed twice with 1 solution of saturated NaCl and dried. When solvent leaks, the title The compound, 2-N-tert-butyliminothiolane, was obtained as a yellow liquid. . Boiling point: 115-117°C/40mmHg, product is TR spectrum, NMR Identified by spectrum and mass spectrum.

元素分析値:C60,81%(計算値61.09)、H9,73%(計算値9. 61)、320.20%(計算値20.39)C)この2−N−tert−ブチ ルイミノチオランを用い実施例1と同様にしてヒトアルブミンを改変し、実施例 16と同様にしてTc−99mによりラベルした。ラベル化率91.2%。Elemental analysis values: C60, 81% (calculated value 61.09), H9, 73% (calculated value 9. 61), 320.20% (calculated value 20.39) C) This 2-N-tert-butyl Human albumin was modified using luminothiolane in the same manner as in Example 1, and Example It was labeled with Tc-99m in the same manner as No. 16. Labeling rate 91.2%.

実施■エエ 土二ム上次ム11工丑二」二」」−蓋ト(乞乙ξLニアセチルチオメチル−2− イミノチ杜乙9恩裂エエ扛丘■化金立立使里 a)356gのトリフェニルホスフィンを12の四塩化炭素に溶かした溶液を7 0℃に加温し、これに、217gの2−・イソプロピル−5−ヒドロキシメチル −1,3−ジオキサンを11の四塩化炭素に溶かした溶液を滴下した。この混合 物を還流し、約1時間後冷却(水浴中)し、濾過し、蒸溜した。残留物をジエチ ルエーテルで処理してから濾過した。濾液を漏失した後、残留物を画情精製した 。Implementation■ee Earth Nim Upper Next Mu 11 Engineering 2 "2" Iminochi Mori Otsu 9 Onriku Ee Hibikiku ■ Kakin Risshiri a) A solution of 356 g of triphenylphosphine dissolved in 12 parts of carbon tetrachloride is dissolved in 7 parts of carbon tetrachloride. 217 g of 2-isopropyl-5-hydroxymethyl A solution of -1,3-dioxane dissolved in 11 carbon tetrachloride was added dropwise. This mixture The material was refluxed and after about 1 hour cooled (in a water bath), filtered and distilled. Dilute the residue ether and then filtered. After leaking the filtrate, the residue was image-purified. .

目的物!、2−イソプロピル−5−クロロメチル−1,3−ジオキサンが無色の 液体として得られた。沸点84−94”C(シス−トランス体の混合物、NMR で同定)。Objective! , 2-isopropyl-5-chloromethyl-1,3-dioxane is a colorless Obtained as a liquid. Boiling point 84-94"C (mixture of cis-trans isomers, NMR ).

b)2−イソプロピル−5−クロロメチル−1,3−ジオキサン183g、水2 5g、濃塩酸5dとからなる混合物を一夜還流した。冷却してジエチルエーテル を添加後、2−クロロメチル−1,3−プロパンジオールを水で抽出した。水層 をジエチルエーテルで洗滌し、蒸発させた。残留物をアセトンに溶かし、脱水し 、蒸発させた。生成物として無色の液体(IRとNMRで同定)が得られた。b) 2-isopropyl-5-chloromethyl-1,3-dioxane 183g, water 2 A mixture of 5 g and 5 d of concentrated hydrochloric acid was refluxed overnight. Cool and diethyl ether After adding 2-chloromethyl-1,3-propanediol was extracted with water. water layer was washed with diethyl ether and evaporated. Dissolve the residue in acetone and dehydrate. , evaporated. A colorless liquid (identified by IR and NMR) was obtained as a product.

C)粉末のNaCN16.2gを100−〇〇MSOに入れ、140°Cに加熱 し、これに上記の2−クロロメチル−1,3−プロパンジオール32.8g(等 量のDMSOに溶解させて)を添加した。添加の過程で温度は約160〜170 ℃に上昇。C) Put 16.2g of powdered NaCN into 100-〇〇MSO and heat it to 140°C. To this was added 32.8 g of the above 2-chloromethyl-1,3-propanediol (etc. of DMSO) was added. During the addition process the temperature is about 160-170℃ Rise to ℃.

室温に冷却してから、混合物を2〜3倍量(容積)のアセトンで稀釈し、Naz SOaで濾過した。濾液を減圧画情し、DMSOを漏失した。残留物を400− アセトンで2回抽出し、目的とする2−シアノメチル−1,3−プロパンディオ ーJしを得た。脱水し、溶媒を漏失すると、目的物質が23gの収量で得られた 。沸点;200°C10,005薗Hg、IRとNMRで同定。After cooling to room temperature, the mixture was diluted with 2-3 volumes (volume) of acetone and Filtered with SOa. The filtrate was subjected to vacuum extraction and the DMSO leaked out. 400- Extract twice with acetone to obtain the desired 2-cyanomethyl-1,3-propanediol. - I got J. After dehydration and leakage of solvent, the desired substance was obtained in a yield of 23 g. . Boiling point: 200°C 10,005 Hg, identified by IR and NMR.

d)2−シアノメチル−1,3−プロパンジオール17゜5g2 トリエチルベ ンジルアンモニウムクロライド1.3gおよびNaOH水溶液(30重景%)1 50dからなる混合物を攪拌、冷却し、これに60gのトシルクロライドをベン ゼン400dに溶かした溶液を添加した。この混合物を一夜攪拌した。有機層と 水層を分別し、水層をジエチルエーテルで洗滌した。有機層を合併し水で中性に なるまで洗滌し、脱水し、蒸発させた。2−シアノメチル−J、3−ビス(トシ ルオキシ)プロパンが62g(液体として)得られた。IR,NMRおよびマス スペクトルで同定。d) 2-cyanomethyl-1,3-propanediol 17°5g2 Triethyl bene 1.3 g of ammonium chloride and aqueous NaOH solution (30%) 1 A mixture consisting of 50d was stirred and cooled, and 60g of tosyl chloride was added to it. A solution dissolved in Zen 400d was added. This mixture was stirred overnight. organic layer and The aqueous layer was separated and washed with diethyl ether. Combine organic layers and make neutral with water Washed, dried and evaporated until dry. 2-cyanomethyl-J,3-bis(toshi) 62 g (as a liquid) of fluoroxypropane were obtained. IR, NMR and mass Identified by spectrum.

e)  2−シアノメチル−1,3−ビス(トシルオキシ)プロパン62gをD MSO250d!に溶かした溶液を、36gのチオ酢酸カリを200dのDMS Oを溶かした溶液に、攪拌しながら滴下した。1時間攪拌し、さらにDMSOを 追加してから、混合物を氷水中に注入した。ジエチルエーテルで抽出して着色し た有機層を得て、これをNaOH水溶液、水および飽和NaCj2液で洗滌(中 性になるまで)した。脱水し、蒸溜すると、目的物質2−シアノメチル−・1. 3−ビス(アセチルチオ)プロパンが淡黄色の液体(沸点;146〜150”C 10,50,1力Hg)として20gの収量で得られた。IRとNMRで同定。e) 62 g of 2-cyanomethyl-1,3-bis(tosyloxy)propane in D MSO250d! Add 36g of potassium thioacetate to 200d of DMS. It was added dropwise to a solution containing O while stirring. Stir for 1 hour, then add DMSO. After addition, the mixture was poured into ice water. Extract with diethyl ether and color The organic layer was washed with NaOH aqueous solution, water and 2 saturated NaCj solutions (in medium). until it became sexual). After dehydration and distillation, the target substance 2-cyanomethyl-1. 3-Bis(acetylthio)propane is a pale yellow liquid (boiling point: 146-150"C) 10,50,1 force Hg) in a yield of 20 g. Identified by IR and NMR.

f)6.3gの2−シアノメチル−1,3−ビス(アセチルチオ)プロパンを無 水メタノール15−に溶かした溶液に20gのHCfをメタノールに溶かした溶 液(Igの溶媒に対してHCf2.1ミリモル)を添加した。1.5時間の還流 後、溶液を蒸散させた。標題化合物、4−メルカプトメチル−2−イミノチオラ ン(HCff塩)が4.9gの収量で得られた。この液状化合物をIR,’HN MR,および宜’CNMRにより同定した。f) 6.3 g of 2-cyanomethyl-1,3-bis(acetylthio)propane A solution of 20g of HCf dissolved in methanol is added to a solution of water and methanol. solution (2.1 mmol of HCf relative to the solvent of Ig) was added. Reflux for 1.5 hours Afterwards, the solution was evaporated. Title compound, 4-mercaptomethyl-2-iminothiola (HCff salt) was obtained in a yield of 4.9 g. This liquid compound is IR,’HN It was identified by MR and CNMR.

I3CNMR(75,4MHz)”δ: 26.9 (CH,SH)。I3CNMR (75.4MHz)"δ: 26.9 (CH, SH).

4 i、9 (CHzS)、45.0 (CHz)、46.1 (CH)。4 i, 9 (CHzS), 45.0 (CHz), 46.1 (CH).

205.9(C=N)。205.9 (C=N).

塩酸塩を塩基で処理すると、容易に遊離のイミノチオラン化合物に変換される。When the hydrochloride salt is treated with a base, it is easily converted to the free iminothiolane compound.

g)3gの2−シアノメチル−1,3−ビス(アセチルチオ)プロパン(実施例 19、(e)により取得)と1.8gのメタノール(307のテトラヒドロフラ ン中)とからなる溶液(温度40〜55°C)にHCfガスを0.5時間通した 。この溶液を蒸発させ、残留物にジエチルエーテルを加えた。沈澱を吸引濾過し 、ジエチルエーテルで洗滌し、乾燥した。第2の目的物質、4−アセチルチオメ チル−2−いみのチオラン(塩酸塩)融点:186〜188℃(分解))が60 0■の収量で得られた。’HNMRと”CNMRで同定。この化合物も遊離塩基 に変換できる。g) 3 g of 2-cyanomethyl-1,3-bis(acetylthio)propane (Example 19, (e)) and 1.8 g of methanol (obtained by Tetrahydrofurane of 307 HCf gas was passed for 0.5 hour through a solution (temperature 40-55°C) consisting of . The solution was evaporated and diethyl ether was added to the residue. Suction filter the precipitate , washed with diethyl ether and dried. Second target substance, 4-acetylthiome Chill-2-iminothiolane (hydrochloride) Melting point: 186-188℃ (decomposition)) is 60 A yield of 0.0 cm was obtained. Identified by 'HNMR and 'CNMR. This compound is also a free base. It can be converted to .

h)実施例1と同様にして、4−メルカプトメチル−2−イミノチオランおよび 4−アセチルチオメチル−2−イミノチオランでヒトアルブミンを改変し、実施 例16と同様にしてTc−99mでラベルした。h) 4-mercaptomethyl-2-iminothiolane and Modification of human albumin with 4-acetylthiomethyl-2-iminothiolane and implementation Labeled with Tc-99m as in Example 16.

ラベル化率はそれぞれ82.8%と100%である。The labeling rates are 82.8% and 100%, respectively.

実11tt1 2−イミノチオーンによるFcフーグメント少改皇立工且−m゛    に   −ベル Fcフラグメントを0.06 M トリエタノールアミンHc2中10a+g/ d(7)濃度にしたも0:)(pH8,0)laltを原料物質として使用。こ の溶液に、0.18 M 2−イミノチオラン溶液(1Mトリエタノールアミン HCl2中)(pH8,0)5uitを加えた。室温下で1時間インキュベート してから、ゲルクロマトグラフィー(5ephadex G 25 )を用いて 未反応の2−イミノチオランを分離した。Tc−99m酒石酸塩0.5 d(1 0mCiに相当)を加え、室温下で0.5時間インキユベートシた。ゲルクロマ トグラフィー分析によるとラベル化率は91.5%である。Fruit 11tt1 2- Fc fugument by iminothione small reformed imperial engineering and -m゛    -Bell Fc fragment in 0.06 M triethanolamine Hc2 at 10a+g/ d(7) concentration: 0:) (pH 8,0) used as a raw material. child 0.18M 2-iminothiolane solution (1M triethanolamine 5 units of HCl2) (pH 8,0) were added. Incubate for 1 hour at room temperature Then, using gel chromatography (5ephadex G25) Unreacted 2-iminothiolane was separated. Tc-99m tartrate 0.5 d(1 (equivalent to 0 mCi) was added and incubated at room temperature for 0.5 hours. gel chroma According to topography analysis, the labeling rate was 91.5%.

実施、1土 2−イミノチオーンによるF ab′)フーグメン のkTc −99m ’     による−ベル濃度10mg/d(0,06M)’J−1−タ/−)Li7 ミ7HCI!中)のF(ab’)zフラグメント溶液(pH8,0)を原料物質 として使用した。この溶液に0.18 M 2−イミノチオラン溶液(IMトリ エタノールアミンHcI!中)(pH8,0)5uEを加えた。室温下に1時間 インキュベートした後、ゲルクロマトグラフィー(5ephadex G 25  )により未反応の2−イミノチオランを分離した。Tc−99m酒石酸塩0. 5 d(10mCiに相当)を加え、室温下、0.5時間インキュベートした。Conducted on 1st Saturday kTc of F ab') Fugumen by 2-iminothione -99m' - Bell concentration 10mg/d (0,06M)'J-1-ta/-)Li7 Mi7HCI! The F(ab’)z fragment solution (pH 8,0) of used as. Add 0.18M 2-iminothiolane solution (IM trichloride) to this solution. Ethanolamine HcI! Medium) (pH 8,0) 5 uE was added. 1 hour at room temperature After incubation, gel chromatography (5ephadex G 25 ) to separate unreacted 2-iminothiolane. Tc-99m tartrate 0. 5 d (equivalent to 10 mCi) was added and incubated at room temperature for 0.5 hours.

ゲルクロマトグラフィー分析によればラベル化率は92.8%である。According to gel chromatography analysis, the labeling rate is 92.8%.

1/]                へ手続補正a(方式)1/] Procedural amendment a (method) to

Claims (1)

【特許請求の範囲】 1.次の一般式で表わされる化合物 ▲数式、化学式、表等があります▼ (ここで、 R2,R2′,R3,R3′,R4,R4′,R5およびR5′は同一であるか 、またはそれぞれに独立して水素原子,アルキル基,XS−アルキル基,アルキ ルチオアルキル基,アルキルカルボニルチオアルキル基,アミノアルキル基,N −アルキルアミノアルキル基,N−アルキルカルボニルアミノアルキル基または N,N−ジアルキルアミノアルキル基を示し、 Xは水素原子または炭素原子数1〜6ケのアルキル基を、nは0または1を、 R6は水素原子炭素原子数1〜6ケのアルキル基を示す、但しR2,R2′,R 3,R3′,R4,R4′,R5およびR5′のすべてが水素原子である場合は 除く)2.請求項1の化合物の水溶性塩 3.次の式で表わされる請求項1の化合物;▲数式、化学式、表等があります▼ (ここで、 R6とnは請求項1の規定と同じであり、Pは0または1を、 qは0または1を、 Zは水素原子,C1−C4アルキル基,メルカプト基,C2−C4アルキルチオ 基,またはC2−C5アルカノイルチオ基を示す、但しPとqが0のときはR6 は炭素原子数が1〜6ケのアルキル基である) 4.請求項3の化合物の水溶性塩 5.請求項1〜4に記載の化合物と反応した蛋白質または蛋白質系物質を含有す る蛋白質複合体 6.放射性同位体を蛋白質または蛋白質系物質にカップリングさせるカップリン グ剤を蛋白質または蛋白質系物質に反応させ、蛋白質複合体を形成し、この蛋白 質複合体と放射性同位体とでコンプレックスを形成させて放射性同位体コンプレ ックスをつくることを内容とする、診断用または治療用の金属一放射性同位体ラ ベル蛋白質または蛋白質系物質の製造方法において、該カップリング剤が次の一 般式;Y−R−S−X 〔ここで、 Xは水素原子または適当な保護基を、 Rは炭素原子数が1〜10ケの置換されていてもよい分枝状もしくは非分枝状の 炭化水素ラジカル(1ケまたは複数ケのヘテロ原子を有してもよい)を、 Yは蛋白質または蛋白質系物質の官能基と反応し得る少くとも一ケの末端反応基 を示す〕で表わされるチオ化合物、または 環原子数5〜7ケの、式1(ここで、XとYが一緒になって蛋白質または蛋白質 系物質の官能基と反応し得る反応基を形成している)で表わされるチオ化合物の 環状縮合生成物、またはこの縮合生成物の水溶性塩からなる群より選ばれた化合 物であることを特徴とする、診断用または治療用の金属−放射性同位体−ラベル 蛋白質または蛋白質系物質の製造方法 7.カップリング剤が次の一般式; Y′−R′−S′−X 〔ここで、 Xは水素原子または適当な保護基を、 R′は炭素原子数が1〜10ケの、置換されていてもよい分枝状または非分枝状 の炭化水素ラジカル(0,NおよびSから選ばれた1ケまたは複数ケのヘテロ原 子および/または1ケまたは複数ケのNH基を有してもよい)を、Y′はイソシ アナート基,ホルミル基,オルトハロニトロフェニル基,ジアゾニウム基,イソ チオシアナート基,エポキシ基,トリクロロ−S−トリアジニル基,エチレンイ ミノ基,クロロスルホニル基,アルコキシカルビミドイル基,置換または非置換 のアルキルカルボニルオキシカルボニル基,置換または非置換のアルキルカルボ ニルイミダゾリル基,またはスルホン化または非スルホン化N−ヒドロキシスク シニミドエステル基(スクシニミド−オキシカルボニル基)を示す〕で表わされ るチオ化合物、または環原子数5〜7ケの、式(II)(ここでXとYは一緒に なって次の基;カルボニル基,カルビミドイル基,N−アルキルカルビミドイル 基,N−ヒドロキシカルビミドイル基またはN−アルコキシカルビミドイル基の 一つを形成)で表わされるチオ化合物の環状縮合生成物、またはこの縮合生成物 の水溶性塩であることを特徴とする請求項6記載の方法。 8.カップリング剤が次の一般式; ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔ここで、 Xは水素原子または適当な保護基を、 R′′は非置換の、または1ケまたは複数ケのXS基で置換された分枝状または 非分枝状のアルキル基(炭素原子数1〜10ケ)を、 R′′′は炭素原子数が1〜4ケのアルキル基を示す〕で表わされる化合物、ま たはその水溶性塩であることを特徴とする請求項7記載の方法。 9.カップリング剤が次の式; ▲数式、化学式、表等があります▼ (ここでXは水素原子または適当な保護基を示す)で表わされる化合物である請 求項8記載の方法。 10.カップリング剤が次の式; ▲数式、化学式、表等があります▼ (ここでR3,R4,R5は請求項1と同じ)で表わされる請求項6記載の方法 11.カップリング剤が2−イミノチオランまたはその水溶性塩である請求項1 0記載の方法 12.カップリング剤が2−イミノチアシクロヘキサンまたはその水溶性塩であ る請求項6記載の方法 13.カップリング剤が請求項1の化合物から選ばれた化合物である請求項6記 載の方法 14.カップリング剤が4−メチル−2−イミノチオラン,2−N−tert− ブチルイミノチオラン,4−メルカプトーメチル−2−イミノチオランおよび4 −アセチルチオメチル−2−イミノチオランからなる群から選ばれた化合物であ る請求項13記載の方法 15.請求項6〜14に記載の方法を用いて得られる金属−放射性同位体−ラベ ル蛋白質または蛋白質系物質16.薬学的に許容し得る液体キャリアー物質と、 金属−放射性同位体−ラベル蛋白質または蛋白質系物質を含有する放射性薬剤組 成物において、該組成物が請求項6〜14に記載の方法を用いて得られた金属− 放射性同位体−ラベル蛋白質または蛋白質系物質を含有することを特徴とする放 射性薬剤組成物 17.請求項16に記載の組成物を薬学的に許容し得る液体で稀釈後、温血動物 に対して体重70kg当り100μCiから30mCi、好ましくは0.5mC iから10mCiの量で投与し、体内から放射される放射線を測定することを特 徴とする、放射線診断検査方法 18.請求項16に記載の組成物を、所望により、薬学的に許容し得る液体で稀 釈後、動物体に対して腫瘍またはその他の病変の抑制に有効な量投与することを 特徴とする温血動物を放射線治療する方法 19.次の構成分からなる放射性薬剤組成物調製用キット;(1)請求項6のカ ップリング剤を蛋白質または蛋白質系物質と反応させて得られる蛋白質複合体調 製品(乾燥状態でもよい)、 (2)金属−放射性同位体の塩またはキレートの溶液、(3)所望により、(1 )と(2)との反応処方付きの使用説明書20.次の構成分からなる放射性薬剤 組成物調製用キット;(1)請求項6のカップリング剤を蛋白質または蛋白質系 物質と反応させて得られる蛋白質複合体調製品(乾燥状態でもよい)、 (2)キレーターと還元剤(一緒になっていてもよい)、(3)所望により、テ クネチウム99m(ペルテクネテート溶液)、またはレニウム−188またはレ ニウム−186(共にペルレネート溶液)と構成分(1)と(2)とを反応させ る処方付きの使用説明書、 21.次の構成分からなる放射性薬剤組成物調製用キット;(1)請求項6のカ ップリング剤(乾燥状態でもよい)、キレーターおよび還元剤、 (2)所望により(1)の構成分と、蛋白質およびテクネチウム−99m(ペル テクネテート溶液)、またはレニウム−186またはレニウム−188(共にペ ルレネート溶液)とを反応させる処方付きの使用説明書、22.カップリング剤 が2−イミノチオラン,2−イミノチアシクロヘキサン,およびその水溶性塩か ら選ばれたものである、請求項19〜21記載のキット、 23.カップリング剤が請求項1に記載の化合物である請求項19〜21記載の キット、 24.カップリング剤が4−メチル−2−イミノチオラン,2−N−tert− ブチルイミノチオラン,4−メルカプトメチル−2−イミノチオランおよび4− アセチルチオメチル−2−イミノチオランからなる群から選ばれたものである請 求項23記載のキット。[Claims] 1. A compound represented by the following general formula ▲Contains mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼ (here, Are R2, R2', R3, R3', R4, R4', R5 and R5' the same? , or each independently a hydrogen atom, an alkyl group, an XS-alkyl group, an alkyl ruthioalkyl group, alkylcarbonylthioalkyl group, aminoalkyl group, N -alkylaminoalkyl group, N-alkylcarbonylaminoalkyl group, or represents an N,N-dialkylaminoalkyl group, X is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, n is 0 or 1, R6 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, provided that R2, R2', R 3. If R3', R4, R4', R5 and R5' are all hydrogen atoms, (excluding) 2. Water-soluble salt of the compound of claim 1 3. The compound of claim 1 represented by the following formula; ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼ (here, R6 and n are the same as defined in claim 1, P is 0 or 1, q is 0 or 1, Z is a hydrogen atom, C1-C4 alkyl group, mercapto group, C2-C4 alkylthio group, or a C2-C5 alkanoylthio group, provided that when P and q are 0, R6 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms) 4. A water-soluble salt of the compound of claim 3 5. A protein containing a protein or protein-based substance that has reacted with the compound according to claims 1 to 4. protein complex 6. Coupling that couples a radioactive isotope to a protein or protein-based substance The binding agent reacts with proteins or protein-based substances to form a protein complex, and this protein A radioactive isotope complex is formed by forming a complex with a radioactive isotope and a radioactive isotope. diagnostic or therapeutic metal-radioisotope radioisotope In the method for producing Bell protein or protein-based substance, the coupling agent is one of the following: General formula: Y-R-S-X 〔here, X is a hydrogen atom or a suitable protecting group, R is an optionally substituted branched or unbranched group having 1 to 10 carbon atoms. A hydrocarbon radical (which may have one or more heteroatoms), Y is at least one terminal reactive group that can react with a functional group of a protein or protein-based substance thio compound represented by ], or Formula 1 (where X and Y together form a protein or protein) having 5 to 7 ring atoms. of thio compounds (forming reactive groups that can react with functional groups of system substances) A compound selected from the group consisting of a cyclic condensation product or a water-soluble salt of this condensation product diagnostic or therapeutic metal-radioisotope-label characterized in that it is Method for producing proteins or protein-based substances 7. The coupling agent has the following general formula; Y'-R'-S'-X 〔here, X is a hydrogen atom or a suitable protecting group, R' is an optionally substituted branched or unbranched group having 1 to 10 carbon atoms. hydrocarbon radical (one or more hetero radicals selected from 0, N and S) and/or one or more NH groups), Y' is an isosyl Anato group, formyl group, orthohalonitrophenyl group, diazonium group, iso Thiocyanate group, epoxy group, trichloro-S-triazinyl group, ethylene Mino group, chlorosulfonyl group, alkoxycarbimidoyl group, substituted or unsubstituted alkylcarbonyloxycarbonyl group, substituted or unsubstituted alkylcarboxylate Nylimidazolyl group, or sulfonated or non-sulfonated N-hydroxysulfonate succinimide ester group (succinimide-oxycarbonyl group)] or a thio compound of formula (II) having 5 to 7 ring atoms, where X and Y together becomes the following group; carbonyl group, carbimidoyl group, N-alkylcarbimidoyl group, N-hydroxycarbimidoyl group or N-alkoxycarbimidoyl group a cyclic condensation product of thio compounds represented by 7. The method according to claim 6, wherein the method is a water-soluble salt of. 8. The coupling agent has the following general formula; ▲Contains mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼ 〔here, X is a hydrogen atom or a suitable protecting group, R'' is unsubstituted or branched or substituted with one or more XS groups; An unbranched alkyl group (1 to 10 carbon atoms), R''' represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms], or or a water-soluble salt thereof. 9. The coupling agent has the following formula; ▲Contains mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼ (where X represents a hydrogen atom or an appropriate protecting group) The method described in claim 8. 10. The coupling agent has the following formula; ▲Contains mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼ (Here, R3, R4, R5 are the same as in claim 1) The method according to claim 6 11. Claim 1 wherein the coupling agent is 2-iminothiolane or a water-soluble salt thereof. Method described in 0 12. The coupling agent is 2-iminothiacyclohexane or a water-soluble salt thereof. The method according to claim 6 13. Claim 6, wherein the coupling agent is a compound selected from the compounds of Claim 1. How to write 14. The coupling agent is 4-methyl-2-iminothiolane, 2-N-tert- Butyliminothiolane, 4-mercaptomethyl-2-iminothiolane and 4 -A compound selected from the group consisting of acetylthiomethyl-2-iminothiolane. The method according to claim 13, 15. Metal-radioisotope-label obtained using the method according to claims 6 to 14 protein or proteinaceous substance 16. a pharmaceutically acceptable liquid carrier material; Radiopharmaceutical combinations containing metal-radioisotope-labeled proteins or protein-based substances In the composition, the composition comprises metal- Radioactive isotope-labeled protein or protein-based substance radiopharmaceutical composition 17. After diluting the composition according to claim 16 with a pharmaceutically acceptable liquid, warm-blooded animals 100μCi to 30mCi per 70kg body weight, preferably 0.5mC It is specially designed to administer at a dose of 10 mCi from i to 10 mCi and measure the radiation emitted from the body. Radiological diagnostic testing method 18. The composition of claim 16 is optionally diluted with a pharmaceutically acceptable liquid. After treatment, the drug should be administered to the animal in an amount effective to inhibit tumors or other pathologies. Method of radiotherapy for characteristic warm-blooded animals 19. A kit for preparing a radiopharmaceutical composition comprising the following components; (1) the method of claim 6; A protein complex obtained by reacting a coupling agent with a protein or protein-based substance. product (can be dried), (2) a solution of metal-radioisotope salt or chelate; (3) optionally, (1) Instructions for use with reaction prescription for ) and (2) 20. Radiopharmaceuticals consisting of: Composition preparation kit; (1) The coupling agent of claim 6 is added to a protein or protein-based Protein complex preparations obtained by reacting with substances (dry state may also be used), (2) a chelator and a reducing agent (which may be together); (3) optionally a chelator and a reducing agent; Cunetium-99m (pertechnetate solution), or rhenium-188 or rhenium Reacting Ni-186 (both perurenate solutions) with components (1) and (2) instructions for use with prescription; 21. A kit for preparing a radiopharmaceutical composition comprising the following components; (1) the method of claim 6; coupling agents (which may be in dry form), chelators and reducing agents, (2) If desired, the components of (1) and protein and technetium-99m (pel technetate solution), or rhenium-186 or rhenium-188 (both petroleum 22. Instructions for use with a prescription for reacting with renate solution); 22. coupling agent Is 2-iminothiolane, 2-iminothiacyclohexane, and its water-soluble salts? The kit according to claims 19 to 21, which is selected from 23. Claims 19 to 21, wherein the coupling agent is a compound according to Claim 1. kit, 24. The coupling agent is 4-methyl-2-iminothiolane, 2-N-tert- Butyliminothiolane, 4-mercaptomethyl-2-iminothiolane and 4- It is selected from the group consisting of acetylthiomethyl-2-iminothiolane. The kit according to claim 23.
JP50426289A 1988-07-08 1989-02-08 Method for preparing metal-radioisotope-labeled protein Pending JPH03505726A (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL8801728 1988-07-08
NL8801728 1988-07-08
NL8802408 1988-09-30
NL8802408 1988-09-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH03505726A true JPH03505726A (en) 1991-12-12

Family

ID=26646399

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP50426289A Pending JPH03505726A (en) 1988-07-08 1989-02-08 Method for preparing metal-radioisotope-labeled protein

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPH03505726A (en)
ES (1) ES2013046A6 (en)

Also Published As

Publication number Publication date
ES2013046A6 (en) 1990-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111491668B (en) Complex containing PSMA targeting compound connected with lead or thorium radionuclide
AU658959B2 (en) Novel compounds and method of preparing a metal-radionuclide-labelled protein
JP3036602B2 (en) Technetium-99m labeled peptide for imaging
JP2555391B2 (en) Main chain polysubstituted chelates for forming metal chelate-protein complexes
US5711931A (en) Technetium-99m labelled peptides for imaging inflammation
US5202451A (en) Anchimeric radiometal chelating compounds
CA2164707C (en) Technetium-99m labeled peptides for imaging inflammation
US5130118A (en) Methods and materials for the preparation of metal labelled antibody solutions
JPH10501531A (en) Monoamine, diamide, thiol-containing metal chelating agent
JP7109627B2 (en) Methods and kits for preparing radionuclide complexes
JPS62104801A (en) Diphosphonate-derived high polymers
EP0345723B1 (en) Diethylenetriamine pentaacetic acid derivatives
JPS58126817A (en) Manufacture of radioactive nuclide mark protein, particularly, antibody or antibody piece
US5217704A (en) Methods and materials for the preparation of metal labelled antibody solutions
Liu 6-Hydrazinonicotinamide derivatives as bifunctional coupling agents for 99m Tc-labeling of small biomolecules
EP0315188B1 (en) Methods and materials for the preparation of metal labelled antibody solutions
Linder et al. Technetium labeling of monoclonal antibodies with functionalized BATOs. 1. TcCl (DMG) 3PITC [phenyl isothiocyanate].
CA2066031C (en) Methods for reducing non-target retention of immunoconjugates and metabolites thereof
US5395946A (en) Bifunctional chelating agents
JPH03505726A (en) Method for preparing metal-radioisotope-labeled protein
JP2005047821A (en) Diagnostic or therapeutic medicine using cyclopentadienyl carbonyl group-containing radiactive compound
JPH0285239A (en) Diethylenetriaminepentaacetic acid derivative and use thereof
JPH05502219A (en) Stable therapeutic radionuclides and methods of preparing them
WO2022080481A1 (en) Radioactive complexes of anti-her2 antibody, and radiopharmaceutical
RU2795398C2 (en) Complex containing a psma-targeting compound bound to a lead or thorium radionuclide