JPH03505457A

JPH03505457A - サイトメガロウイルス由来のフラグメントの抗体認識

Info

Publication number: JPH03505457A
Application number: JP1507360A
Authority: JP
Inventors: ケイリ，ブルース・イー; ゲルツ，リチャード・シィー
Original assignee: ザ・チルドレンズ・ホスピタル，インコーポレイテッド
Priority date: 1988-07-01
Filing date: 1989-06-15
Publication date: 1991-11-28
Also published as: IL90833A0; AU3849989A; EP0429470A1; WO1990000062A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】サイトメガロウィルス由来の７ラグメントの抗体認識発明の背景ヒトサイトメガロウィルスは、幾つかのジスルフィド架橋部タンパク質複合体を含有している［ブリット（Ｂｒｉｔｔ）、　１９８４、ラスムラセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）ら、　１９８５ｂ、ファラル（）’ａｒｒａｒ）およびグリーンウェイ（Ｇｒｅｅｎｖａｙ）、　１９８６、カリ（Ｋａｒｉ）ら、　１９８６、グレッチ（Ｇｒｅｔｃｈ）ら、　１９８ｇ］。

これら複合体のうちの１つは、ＨＳＶ糖タンパク質ｇＢに類する糖タンパク質を含有しているしクラナゲ（Ｃｒａｎａｇｅ）ら、　１９８６］。この複合体はｐｉ　：３０１５５またはｇＣ−１と命名され［ラスムラセン（ＲａｓＩＩｌｕｓｇｅｎ）ら、　１９８５ｂ、ルッセンホップ（Ｌｕｓｓｅｎｈｏｐ）ら、　１９８８］、ＨＣＭＶに見いだされる複合体の中で最も十分に特性化されているものである。

全細胞または細胞外ウィルスから単離される複合体ｇＣ−Ｉは、分子量１６０− １３０，０００．９２−９３，０００および５０−５５．０００を有する３つの糖タンパク質をすべて含有していると報告されている［ブリット（Ｂｒｉｔ）、　１９８４、ファール（Ｆａｒｒｅｒ）およびグリーンウェイ（Ｇｒｅｅｒ＋＋ｖａｙ）、　１９８６、カリ（Ｋａｒｉ）ら、　１９８６、ラスムノセン、１９１！８１゜これら糖タンパク質はジスルフィド結合によって共に保持されており、大量のＮ一連結オリゴサツカライドを含有している［ラスムラセンら。

１９８８］、　ｇＣ−１複合体はＨＣＭＶ陽性のヒト血清によって免疫沈降され得、さらにヒトＴ細胞を刺激するものでもある［リウ（Ｌｉｕ）ら、１９８８コ。

ｇＣ−１を認識するネズミモノクローナル抗体が幾つか開示されている。同時ニー抗体−結合検定法に基づけば、これらの抗体は３つのドメインによってグループ分けされ得よう［ルッセンホノプら、　１９８ｇ］。ドメイン■および■は、ＨＣＭＶタウン株（Ｔｏｗｎｅ　５ｔｒａｉｎ）をインビトロにおいて中和することができる抗体によって認識される。単一のドメイン内に属される抗体は、互いの結合性を阻害した。さらに、ＥＬＩＳＡ検定によって証明されるように、ドメインＩの抗体はドメインＨの抗体の結合性を増大させ、またその逆もあることが見いだされた。この増大活性はプラーク還元検定においても認められた［ルソセンホソプら、１９８ｇ］。ただ１つの抗体（１１Ｂ４）Ｌか３番目のドメイン（ドメインＩＩＩ）内には位置しておらず、これは試験した他のすべての抗体の結合性を阻害するその独特の阻害能に基づくものである。抗体１１Ｂ４はさらに、非−中相性であることが確認され、ブラークー還元検定において他の抗体の中和活性を阻害することができた。これらｇＣ−１特異的ネズミモノクロ一ナル抗体は、免疫蛍光法によって証明されるようにＨＣＭＶの数種の臨床学的単離物を認識することが見いだされた。このことは、これら抗体によって認識されるエピトープが保存されていることを示している［ルッセンホップら、　１９８８］。

本発明者らが始めに特性化したネズミモノクローナル抗体はすべである種の相互作用、すなわち増大または阻害を示したので、これらの抗体によって認識されるエピトープを含有する３つのドメインは物理学的にｇＣ−１に近似しているのではないかという可能性が考えられた。タンパク分解法は、これらウィルス糖タンパク質のエピトープが近似しているか、または相違しているかを決定するために使用される１つの方法である。例えば、ダニ媒介脳炎ウィルス［ヘインツ（Ｈｅｉｎｚ）ら、１９８３コ、ネズミ白血病ウィルス［ビンター（Ｐｉｎｔｅｒ）ら、　１９ｇ２］およびＨ３Ｖ由来の糖タンパク質Ｄ［アイゼンバーブ（Ｅｉｓｅｎｇｅｒｇ）ら、　１９８２］由来の糖タンパク質における抗原性決定基の位置決めを行うために、タンパク分解法が使用されている。

発明の要約本発明は、ｇＣ−１の３つの免疫反応性ドメインをすべて含有する、ｇＣ−１の免疫原性タンパク分解フラグメントを提供するものである。

トリプシンまたはキモトリプシンのいずれかを使用して、３つすべてのドメインから得られる抗体によって認識される１組のフラグメントを生成させることができた。これらのフラグメントは、ＨＣＭＶ陽性の幾つかのヒト血清によっても認識された。トリプシンおよびキモトリプシンフラグメントをＴ細胞反応性に関しても調査した。

全ｇＣ−１と強く反応するが、トリプシンフラグメントによりさらに高い程度の応答が一貫して得られる個体の場合、上記いずれかの酵素によって調製されたフラグメントにより、リンパ球の増殖応答が検出された。全ｇＣ−Ｉに対する低い応答を示す個体から得た細胞は、同様にそのフラグメントに対する応答性も低かった。しかし、この個体由来のＴ細胞クローンは、トリプシンフラグメントとは反応するが、キモトリプシンフラグメントとは反応しないことが認められた。

より詳細には、ＨＣＭＶエンベロープの糖タンパク質複合体ｇＣ−■をキモトリプシンで消化し、得られたフラグメントを免疫アフィニティーにより精製した。

非−還元条件下において、分子量（ＭＷ）が３４．０００および４３，０００である２つの主要なグリフシル化ペプチドを得た。還元後では、分子ｊ１３４，０００の１つの主要なグリコジル化フラグメントの他に、分子量３０，０００および２８゜０００の少なくとも２つの別のペプチドが観察された。非−還元条件下では、ｇＣ−１の３つすべてのドメインと結合するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）が３４．０００および４３．０００の分子量のフラグメントを免疫沈降し、ウェスターンプロットにおいてそれらと反応した。還元後では、ドメイン■に帰属されるモノクローナル抗体およびドメイン■の１つのモノクローナル抗体は、ウェスターンプロットにおいて非反応性であったが、他のすべてのモノクローナル抗体は上記３４，０００．３０，０００および２８，０００の分子量のペプチドと反応した。

５つの陽性ヒト血清は、非−還元条件下でのウェスターンプロットにおいて全精製ｇＣ−ｉと反応した。還元後では、９つのモノクローナル抗体および１つの血清が分子量１３０，０００および５２，０００のタンパク質と反応し、４つの血清がこれらに加えて９３，０００分子量のタンパク質と反応した。この５つの血清は、非−還元条件下でのウェスターンプロットにおいてキモトワブシンフラグメントとも反応した。還元後は、４つの血清が分子量３４，０００．３０．０００および２８，０００のペプチドと強く反応し、１つの血清は弱く反応した。したがって、ネズミモノクローナル抗体によって認識されるｇＣ−Ｉのドメイン群はＨＣＭＶを認識するヒト免疫にとって重要であり得、既述した免疫原性ｇＣ− １サブユニ、トペブチドのすべては本発明の範囲内に包含される。

発明の詳細な説明以下に実施例を記載して本発明をさらに詳細に説明する。

１、タウンおよびＡＤ１６９ＨＣＭＶ株の調製ＨＣＭＶのこの２つの株を、カリ（Ｋａｒｉ）ら（１９８６）に記載のようにしてヒト皮膚線維芽細胞において増殖させ、採取して精製した。ウィルスは、［３Ｈ］−アルギニペ［”Ｃ］Ｇ１ｃＮまたは［”Ｈ］ＧｌｃＮ（アメルシャン）のいずれかと共に増殖させることにより標識した。

モノクローナル抗体の生成、特性化および精製ルッセンホップら（１９８ｇ）に記載のようにしてモノクローナル抗体を生成させ、特性化した。ヨーレッッーサリナス（Ｊｕａｒｅｚ−Ｓａｌｉｎａｓ）ら（１９８４）に記載されているように、ヒドロキシアパタイトカラム［バイオ・ラド（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）］を使用した高速液体クロマトグラフィーによってモノクローナル抗体をマウスの腹水から精製した。

タンパク分解精製したタウン株ＨＣＭＶまたは注射後７から１４日口の全細胞のいずれかを、１５０ｍＭ　ＮａＣ１を含有する５０ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ７，４）中、１．０％ＮＰ−４Ｑで可溶化した。１６．０ＯＯＧ。

３０分の遠心によって不溶性物質を除去した。抽出物を採取し、ＢＣＡタンパク質検定検定法−ス（Ｐｉｅｒｃｅ）］によってタンパク質含量を１１１１　定した。その抽出物をＴＰＣＫ−トリプシン［ワーシングトン（ｆｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）］または］ＴＬＣＫ−キモトリプシンシグマ（Ｓｉｇｍａ）］のいずれかによって、酵素：タンパク質の比率１：５０で２４−４８時間、室温において消化した。フェニルメチル−スルホニル・フルオライド（ＰＭＳＦ）を添加していずれかの酵素によるタンパク分解反応を停止させた。同じ条件により、抽出物をプロナーゼ（シグマ）でも消化した。プロナーゼ消化はＢＳＡの添加により停止させた。

全ｇＣ−Ｉまたはそのタンパク分解フラグメントの精製ビオチン化モノクローナル抗体およびストレプトアビジンアガロースを使用する免疫アフィニティー法の改変法によって、全ｇＣ−Ｉまたはそのフラグメントを単離した［グレッチ（Ｇｒｅｔｃｈ）ら（１９８７）］。

簡単に説明すれば、ビオチン化モノクローナル抗体を、全ｇＣ−１またはそのフラグメントを含有する１、０％ＮＰ−４Ｑ抽出物に加えたのである。ストレプトアビジンアガロースを加える前に、この抗体を抽出物と共に３０分間インキニベートした。この混合物を一定に混合させながら、さらに４５分間反応させた。遠心によってアガロースビーズをペレット化し、次いで０．１％ＮＰ−４Ｑを含有するＰＢＳで２回、さらにＰＢＳで２回洗浄した。トリス緩衝液（４％ＳＤＳを含有する０、２Ｍ　　Ｉ−ルス、ｐＨ６，８）中、１００℃に３分間加熱し、結合抗体からタンパク質およびペプチドを溶出させた。

５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光間接撮影（ｆ　Ｉ　ｕｏｒｏｇｒａｐｈｙ）免疫沈降させた放射活性標識化粧タンパク質または糖ペプチドを、５−１５％ポリアクリルアミドグラジェントゲルの５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させた［ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）　（１９７０）の方法コ。これらゲルの放射活性は、エンハンス［Ｅｎｈａｎｃｅ］を使用する蛍光間接撮影法［ニュー・イングランド・ヌクレアー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）コによって検出した。

ミニ−ゲル装置（バイオ・ラド）をウェスターン・プロットに使用した。垂直１０％ポリアクリルアミドゲルにおいて糖タンパク質を分離した。非消化糖タンパク質を０．４５マイクロン孔サイズを有するニトロセルロース膜にエレクトロプロット（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔ）　した。

タンパク分解によって得られた小さな糖タンパク質を保持させるためには、０．２マイクロン孔サイズのニトロセルロース膜を使用する必要があった。エレクトロブロッティングを行った後、得られたペーパーをトリス緩衝化食塩水（ＴＢＳ、２０ｍＭ　　トリス、５００ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７，５）中、３％ゼラチンを用いてブロック（阻害）した。７８３９１％ゼラチンにより、腹水中のモノクローナル抗体を１１５００に、ヒ１血清を１７３０に希釈した。希釈したモノクローナル抗体またはヒト血清をプロットしたペーパーに室温で一晩結合させた。

得られたペーパーを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳで洗浄した。ＴＢＳ中、１％ゼラチンで１／１０００に希釈したリン酸標識化ヤギ抗−マウスＩｇＧまたはヤギ抗−ヒトＩｇＧ［カークガード（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ）およびべり−（Ｐｅｒｒｙ）］を加え、室温で１時間反応させた。そのペーパーを洗浄し、０，１Ｍ　　トリス緩衝液中の基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル・ホスフェート／テトラゾリウムを加えた［カークガードおよびベリー］。バンドを視覚化した後、そのペーパーを水に浸漬して反応を停止させた。

糖タンパク質の脱グリコジル化キモトリプシンフラグメントを、糖タンパク質由来のアスパラギン連結オリゴサツカライドを加水分解するｔ７ｅ酵素であるＮ−グリカナーゼ［ジエンチーム（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐ、　）、ボストン、ＭＡ］で消化し、遊離のオリゴサツカライドおよびグリコジル化部位にアスパラギン酸を含有するペプチドを得た。キモトリプシンによって得られたフラグメントをストレプトアビジンアガロースアフィニティーカラムから１．０％Ｓ　Ｄ　Ｓ　（ｖ／ｖ）を用いて溶出した。溶出したフラグメントをβ−メルカプトエタノールで還元し、ＳＤＳの終濃度が０．１％になるように１．０％ＮＰ−４Ｑを含有するリン酸塩緩衝化食塩水（ｐＨ８，６）で希釈した。プロテアーゼインヒビターである１、１０−フエナントリン水和物をその製造元の教示にしたがって加えた。その反応を一定混合下に室温で２４時間行った。その終点で、ＳＤＳを加え、ＳＤＳ濃度を１．０％に戻し、得られた反応混合物を０．１％ＳＤＳに対して一晩透析した。５ＤＳ−ＰＡＧＥにかける前に、試料を濃縮した。

リンパ球増殖検定リウ（Ｌｉｕ）ら（１９８ｇ）に記載のようにしてリンパ球の増殖検定を行った。簡単に説明すれば、Ｔ細胞分析で使用するタンパク分解フラグメントをＰＢＳに対して完全に透析し、毒性物質を除去した。分子量１０−１２，０００のものを排除できる透析膜を使用した。そのため、１２，０００よりも分子量が小さなフラグメントが喪失した。

この試験で使用するＴ細胞クローンを生成させ、リウらに開示されているように特性化した。

結　　果ｇＣ−１のトリプシンおよびキモトリプシン消化これらの試験を行い、いずれの酵素が最も効率的にｇＣ−１をより小さなフラグメントに分解するかを調査した。タンパク分解反応の終点を調べるため、動力学的試験を行った。感染後７および１１日目に低速遠心によって培養培地から採取した全感染細胞から、ＮＰ−４０ａ浄剤抽出物を入手した。タンパク質を［３Ｈ］アルギニンで標識し、糖タンパク質を［”Ｃ］ＧＩｃＮで標識した。抽出物の一部をｇＣ−Ｉ特異的モノクローナル抗体（４１Ｃ２、ドメインｌ）と素早（免疫沈降させ、出発物質の性質を充分に調べた。残った抽出物を等量づつ幾つかの試料に分けた。これらの試料をＴＰＣＫ−トリプシンまたはＴＬＣＫ−手モトリプシンのいずれかのタンパク分Ｈ反応に供した。タンパク分解反応をＰＭＳＦを添加して０．５．２および２４時間時点で停止させ、ｇＣ−１７ラグメントを４１０２と免疫沈降させた。さらに、ひとつの試料をタンパク分解に供することなく、室温で２４時間保持させた。４１Ｃ２と免疫沈降するタンパク質および糖タンパク質を、ジスルフィド結合の還元、または非還元条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＥによって調査した。

最初の抽出物または室温２４時間後のそれと同じ抽出物から得られた、４１Ｃ２によって免疫沈降されるｇｃ−ｒ１合体は、使用した標識物に関係なく同一でないとしても類似していた。このことは、トリプシンまたはキモトリプシン不存在下のｇＣ−１が抽出物中で少なくとも２４時間は安定であることを示している。

タンパク分解を行わない場合、分子量が１３０，０００から２００．０００以上である、ｇＣ−１に普通の複合体が得られた。還元後に得られるこれら複合体由来の最も豊富な糖タンパク質は、使用した放射活性標識物に関係無く、分子１ｔ１３０，０００．９３，０００および５０−５２，０００を有していた。さらに、ｇＣ−１を還元せずに調査した場合、分子量３５，０００および２０，０００である２つの［３Ｈコアルギニンー標識化ペプチドが検出された。これらのペプチドはタンパク分解反応を行ったにもかかわらず存在しており、［３Ｈ］アルギニンによってのみ明瞭に検出された。このことは、これらペプチドが炭水化物をほとんど、または全く含んでいないことを示唆している。

両酵素によるタンパク分解反応の３０分から２４時間の間に、分子量１０６，０００から１３０．０００の複合体がいずれかの放射活性標識物によって検出された。これらの複合体を還元した場合、分子量３５，０００から９３，０００の範囲内の糖タンパク質が最も豊富であった。分子量１０６，０００から１３０，０００の範囲の複合体の分解は、無傷のｇＣ−Ｔの最初のタンパク分解と比較して遅いように思われる。

キモトリプシンを使用したタンパク分解の２４時間後に、非還元条件下で１つの主要な［３Ｈ］アルギニン−標識化ペプチドが、さらに分子量４３．０００から３４，０００のペプチドおよび２０．　ＯＯＯのペプチドが少ないながらも検出された。［”Ｃ］Ｇ１ｃＮ標識物を用いた場合は、分子量４３，０００および３４，０００のペプチドしか明瞭に検出されないであろう。ジスルフィド結合を還元した後では、これらのキモトリプシンフラグメントにより１つの主要な分子量３４．０００の糖ペプチドが得られたが、それよりも豊富でない低分子量のペプチドも多く観察された。

トリプシンを用いた場合、同一でないが、類似した結果が得られた。分子ｊ１４４，０００の主要なグリコジル化フラグメントが得られた。しかし、何らかの１０６，０００分子量糖ペプチドは２４時間後もそのままであり、分子量４４．０００から３４，０００のグリコジル化ペプチドを欠いていた。

トリプシンを使用して得られたペプチドを還元した後では、分子量４７，０００と３５．０００の２つの主要なグリコジル化ペプチドが検出された。さらに、しみ状になった（ｓｍｅａｒ）グリコジル化物質が、分子量４７，０００の糖ペプチドの上に検出された。キモトリプシンを使用した場合に検出されたものに類似した、多くの微量の低分子量ペプチドがここでも存在した。最後に、いずれかの酵素を使用した場合に観察される結合パターンは、反応時間を４８時間に延長しても、またはさらに酵素を追加しても変化しなかった。

キモトリプシン、トリプシンおよびプロナーゼフラグメントのドメインＬ　ＩＩおよび■由来の抗体との免疫沈降これらの実験のため、精製した細胞外ウィルスからｇＣ−１を入手した。ドメインＴ（３９Ｅ１１）、ＩＩ（３４Ｇ７）およびＩ［［（１１Ｂ４）から選択したモノクローナル抗体を使用して免疫沈降反応を行い、タンパク分解フラグメントが３つすべてのドメイン由来のエピトープを含有しているか否かの決定を行った。ドメインＩおよび■を示すものとして同定された他の抗体も使用することができる［１９８８年１月１９日出願の米国特許出願第１４４．７６０号、これを引用によって本明細書に包含させる］。

糧胞外ウィルスから単離し九ｇＣ−Ｉから入手されるキモトリプシンおよびトリプシン糖ペプチドフラグメントは、ｇＣ−１を感染細胞から入手した場合に免疫沈降したものと同じものであった。さらに、３つすべてのドメイン由来の抗体は、この同じフラグメントを免疫沈降することができたが、このことはこれらフラグメントが既に開示されている３つのドメインを含有していることを示唆するものである［ルッセンホップら（１９８８）］。同様の実験をプロナーゼ［非−特異的プロテアーゼコを使用して行った。プロナーゼフラグメントはキモトリプシンによって得られるフラグメントに類似していた。しかし、プロナーゼを用いた場合、分子量４３．０００のペプチドは殆ど保持されておらず、得られた糖ペプチドの大半は分子ＩＬ３０−３４．０００のしみ状物質（ｓｍｅａｒ）を形成していた。このことはさらに、ｇＣ−１のこの部分がタンパク分解に耐性であることを示してＬ’ｌる。

モノクローナル抗体およびＨＣＭＶ陽性のヒト血清と反応する全ｇＣ−１およびｇＣ−１のキモトリプシンフラグメントにつ０てのウニスターンプロット分析３つの理由からウェスターンプロ・ノド分析を行った。第１に、免疫沈降を行った場合、数種のペプチドがジスルフィド結合の還元にもかかわらず検出され、これらのうちいずれがモノクローナル抗体によって認識されるかを決定することに興味があったこと。第２に、本発明者らは、さらなるｇＣ−１モノクロ一ナル抗体につ０ての研究に規模を拡大し、それらすべてが生成フラグメントと反応する力１否かを確かめたか６たこと。これに関連し、本発明者らは、異質性が低く、分子量が小さいことを理由に、キモトリプシンフラグメントに焦点を当てた。第３に、ヒト抗体がネズミ抗体と同じフラグメントを認識するか否かを調べるのに興味があったこと。この試験のため、６つのヒト血清を選択した。補体結合および間接免疫蛍光検定法によれば、５つはＨＣＭＶに関して陽性であり、１つは陰性であると決定された（第１表）。

Ａ、１　　　　　　　　　＜４／＜　１０（−）　　　　　　　＜４（−）Ａ、２　　　　　　　３２／４０　　（＋）　　　　　　＜４（−）Ａ、３　　　　　　２５６／１６０（＋）　　　　　　１６（＋）Ａ、４　　　　　　　３２／８０　　（＋）　　　ＥＬＩＳＡ（−）１．１　　　　　　１２８／６４−０（＋）　　　　　　＜４（−）１．２　　　　　　　３２／１６０（＋）　　　　　　＜４（−）＊）ＣＭＶ力価は、ラテックス凝集検定（ＬＡ）または免疫蛍光法（Ｉ　Ｆ）により測定した。初めの数字はＬＡ力価を、次の数字はＩＦ力価を示している。

＊＊）Ｈ３Ｖ力価は免疫蛍光法により測定した。

さらに、ｇＣ−１はＨ３Ｖ由来のｇＢと相同性（ホモロジー）を有する糖タンパク質を含有しているので、Ｈ３Ｖとの反応性についてこれらの血清を免疫蛍光法によって試験した。試験した血清の中では、１つの血清（Ａ、３）のみがＨ３Ｖに対して陽性であった（第１表）。

しかし、この血清の反応性は他のものと類似していた。ウェスターンプロット分析のため、全ｇＣ−１およびキモトリプシンフラグメントの両者を、ｇＣ−Ｉ特異的モノクローナル抗体を使用して免疫アフィニティー精製した。そのため、少量のモノクローナル抗体が調製物を汚染する場合があったが、それはウェスターンプロットではニトロセルロース膜の上端に小さなバンドとして、または重鎮および軽鎖として検出することができた。

非−還元条件下では、２つのモノクローナル抗体（１１Ｂ４および２６Ｂ１１）はウェスターンプロットにおいて全ｇＣ−Ｉと反応しなかった。このことは、これらの抗体がｇＣ−Ｉを免疫沈降できた場合でさえも起こった。全ｇＣ−１の免疫沈降によっても観察される分子量３４．０００および２０．０００のペプチドとの反応性などの、他のすべてのモノクローナル抗体を使用して得られたパターンは陽性ヒト血清で得られた結果と非常に類似していた。ジスルフィド結合の還元の後でも、モノクローナル抗体１１Ｂ４および２６Ｂ　１１は依然として反応しなかった。他のすべてのモノクローナル抗体は分子量１３０，０００および５２．　ＯＯＯのタンパク質と強く反応し、分子量１３０，０００よりも若干小さなタンパク質および分子量５ｏ、ｏｏｏのタンパク質とは弱く反応した。ここでも、ＨＣＭＶに陽性のヒト血清はこれらのタンパク質と反応した。しかし、ヒト血清Ａ、２がそれらモノクローナル抗体と殆ど同一の結果を与えたのに対し、他の陽性血清は種々の程度で分子量９３，０００のタン７＜り質と反応した。さらに、ヒト血清は、モノクローナル抗体によって認識されない分子量２６．　ＯＯＯのタンパク質と弱く反応した。

ヒト血清またはそれらモノクローナル抗体によって認識されるタンパク質は陰性ヒト血清（Ａ、１）または陰性ネズミ抗体の対照物（ＳＦ３）とは反応しなかった。

キモトリプシンフラグメントを非−還元条件下で調査すると、すべてのモノクローナル抗体が分子１１４３，０００および３４．０００のペプチドと反応することが示された。これらモノクローナル抗体には、非−還元条件では全ｇＣ−１と反応できなかった１１Ｂ４および２６Ｂ１１が包含されていた。１１Ｂ４および２６Ｂ１１の反応性は、他のモノクローナル抗体よりも小さかった。見掛けの分子量６３，０００のペプチドとの反応性は比較的弱かった。このことは、少量の不完全な消化ペプチドを反映しているのかもしれない。これらのペプチドは、クーマシー・ブルー染色によって検出することができない＝方で、分子量４３，０００および３４．０００のペプチドは明瞭に視覚化されたので、存在するタンパク質の小さな部分のみを表していると考えられる。ここでも、陰性ネズミ抗体対照物はモノクローナル抗体によって認識されるペプチドと反応しなかった。

非−還元条件下では、すべての陽性ヒト血清より得られる／（ターンは、モノクローナル抗体と同一であり、陰性ヒト血清（Ａ、１）は非反応性であった。

ジスルフィド結合の還元後では、モノクローナル抗体１１Ｂ４および２６Ｂ　１１はｇＣ−１のキモトリプシンフラグメントと反応しなかった。他のすべてのモノクローナル抗体は分子ｆｆ１３４．ＯＯＯおよび３０，０００のペプチドと強く反応し、４１Ｃ２を除いて分子量２８．０００のペプチドと強く反応した。試験したヒト陽性血清の中の４つ（Ａ、２、Ａ、３．１．１およびＩ、２）は分子１ｉ３４，０００．３０．０００および２８，０００のペプチドと強く反応した。ヒト陽性血清Ａ、４はジスルフィド結合の還元後に少しだけ反応した。

モノクローナル抗体、ヒト血清および陰性対照物を使用し、見掛けの分子量５０，０００において比較的弱いバンドがさらに検出された。これらの１つは、そのバンドがＳＰ２陰性対照物においても検出されたので、おそらくフラグメントの精製のために最初に使用した抗体によってもたらされた重鎮であると思われた。

そうであっても、これらのバンドはヒト陰性血清によって検出されたので、それらのウェスターンプロットにおける反応性は特異的でないらしい。

最後に、ヒト血清と全ｇＣ−１糖タンパク質またはｇＣ−Ｉのキモトリプシンフラグメントのいずれかとの反応性は、３２／４０の力価を有する血清（血清Ａ、２）が、１００以上の力価を有する血清（血清Ａ。

３．１．１およびＩ、２）と同様に反応したので、それらのＨＣＭＶ力価に左右されないように思われる。

最後に、比較するため、ＨＣＭＶ株ＡＤ１６９由来のｇＣ−１もさらにキモトリプシンで消化し、フラグメントを免疫アフィニティー精製し、非−還元条件のウェスターンプロ・ノドで調査することにより、そのフラグメントに３つすべてのドメインが存在して０る力１否かを決定した。これを行った場合、すべてのモノクローナル抗体力くウェスターンプロットでフラグメントと反応したので、これらドメインがＡＤ１６９に存在していることが証明された。し力１し、そのパターンは若干異なっていた。弱いノくノドが分子量６３．０ＯＯｉこ検出されたが、それよりも小さな分子量のペプチドはタウン株ＨＣＭＶ由来のペプチドを用いて行った場合よりもより拡散したようであった。３１，０００の７（ノドおよび分子量２３，０００のもう１つの拡散バンドと共に、分子量４０，０００から３５，０ＯＯｉこ広力くる広範なバンドが検出された。

キモトリプシンフラグメントの脱グリコジル化キモトリプシンフラグメントを還元した後では、ウェスターンプロットにおいてモノクローナル抗体は３つのペプチドを認識した。

分子量の不均一性はグリコジル化の程度に由来するものであろう。

この可能性を調査するため、キモトリプシンを使用して得られた糖タンパク質を還元し、Ｎ−グリカナーゼで消化した。［”Ｈ］アルギニンまたは［”Ｃ］ＧｌｃＮのいずれかで標識した糖タンパク質を使用した。Ｎ−グリカナーゼ作用により炭水化物不含のペプチドが生成されるので、炭水化物除去の程度を検定する手段が提供されるように、［１４Ｃ］Ｇ１ｃＮ標識化ペプチドにおけるすべての標識物は喪失させておくべきである。Ｎ−グリカナーゼで消化した後では、分子量３４゜０００の主要な［３Ｈ］アルギニン標識化ペプチドは喪失され、分子量３０．０００および２８，０００のペプチドが観察された。［”Ｃ１０ｌｃＮ標識化ペプチドを消化した場合、匹敵するバンドは観察されなかったが、それは炭水化物が完全に除去されたことを示唆するものである。

非還元トリプシンおよびキモトリプシンフラグメントのＴ細胞認準末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を３人の血清陽性ドナーから入手した。

本発明者らが既に示したように、これらの個体由来の細胞は全ｇＣ−■と反応した（リウら（１９８８））。ＨＣＭＶに対して血清陰性である個体由来の細胞は、精製ｇＣ−１に暴露させた場合、増殖しなかった。

血清陽性の個体からトリプシンまたはキモトリプシンフラグメントを使用して得られたＰＢＭＣにより、増殖応答性が得られた（第２表）。

ＭＮＣ”　　　　　　　　　２．３５９　　１．３０３　　　　６０　　　　：（１４ＭＮＣ＋ＨＣＭＶ”　　　　　　　　　　２３２　　　　４２，４８１　　　　　９，０２０　　　　８１，６１１９ＭＮＣＮｅｇＣｏｎ”　　　　１，１１１　　’　　７，０３９　　　２３１　　１，２７２ＭＮＣＴｒｙ　Ｆｒａｇ、”　　　１，０９９　　７４，６４２　　　５８６　　８４．３２７ＭＮＣＣｈｙ、　　Ｆｒａｇ、”　　　６５４　　２２，２２４　　　２０８　　６．２６０１）ＭＮＣ単核球細胞培養物のみ２）ＭＮＣ十全ウィルス３）ＭＮＣ＋緩衝液を含有するが、ウィルスまたはフラグメントを含有していない陰性対照物４）ＭＮＣ＋）リプシンフラグメント５）ＭＮＣ＋キモトリプシンフラグメントＨＣＭＶ陰性（−）およびＨＣＭＶ陽性（＋）個体から得られた単核球（ＭＭＣ）の増殖応答。各ウェル当たり１０６個の細胞を含有する培養物を６日間抗原に暴露させたが、その前にその培養物を採取する２４時間前に［３Ｈ］チミジンを加えておいた。数字は、１分力たり、３つの培養物から得られた平均カウントである。

しかし、同量のタンパク質が存在する場合、キモトリプシンフラグメントを使用するよりもトリプシンフラグメントを使用するほうが応答性は大きかった。このことは、キモトリプシンを使用した場合、ある種のＴ細胞エピトープはより完全なタンパク分解によって喪失されるものがあったことを示唆するものである。さらに、全ｇＣ−Ｉに対する応答の低い個体（Ａ５）は、いずれかの酵素により得られたフラグメントに対する応答性が非常に低いか、全く無いことが観察された。しかし、この個体から得られたＴ細胞クローンは、トリプシンフラグメントに対する応答性は非常に強く、キモトリプシンフラグメントに対しては応答しないことが認められた。このことはさらに、キモトリプシンフラグメント由来のＴ細胞エピトープの喪失を示唆しており、またトリプシンフラグメントのエピトープを認識するＴ細胞の数がこのクローンが得られた集団内では少ないことを示唆している。

考　　察この試験の第１の目的は、同時ニー抗体−結合検定を使用した本発明者らによる最初の試験で検出された３つのドメインが、ｇＣ−Ｉの小さな部分に含有されている可能性を調査することであった。トリプシン−およびキモトリプシン−フラグメントの両者は３つのすべてのドメイン由来の抗体によって認識され、キモトリプシンは最も小さなフラグメントを生成させることができた。このために、本発明者らはキモトリプシンフラグメントに焦点を当ててさらに研究を行った。［３Ｈ］アルギニン標識化ｇＣ−１をキモトリプシンでタンパク分解した後では、分子量４３，０００を有する、非−還元条件下で存在するただ１つの主要なペプチドが明らかに存在した。クーマシーブルー染色（Ｃｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）によれば、分子量４３，０００のペプチドは依然として最も豊富であるが、分子量３４，０００のペプチドがより明瞭に検出することができた。これらの未反応のペプチドは、［”Ｃ］Ｇ１ｃＮの組込みによって決定されるようにグリコジル化されており、全てのモノクローナル抗体およびＨＣＭＶ陽性のヒト血清によって認識された。ヒト抗体に結合されるｇＣ−Ｉには、他の β細胞エピトープが、例えば分子量９３，０００の糖タンパク質上にあると思われるものが存在するようである。ドメインＩおよびＨのすべての抗体がタウン株ＨＣＭＶを個々にまたは一緒になって中和したことから、キモトリプシンフラグメントはさらに、中和のための部位も含有しているようである。しかし、全モノクローナル抗体について言及すれば、中和のためには補体が必要であった［ルッセンホップら（１９８８）］。キモトリプシンフラグメントはさらに、Ｔヘルパー細胞エピトープを含有していた。しかし、これよりも多くのものがトリプシンフラグメントでは保持されているようである。

Ｔ細胞エピトープがキモトリプシンによって消去されたことが、Ｔ細胞クローンとトリプシンフラグメントとの陽性反応およびそれとキモトリプシンフラグメントとの非反応性によって明瞭に示された。

さらに、単核球細胞培養物を使用した場合、Ｔ細胞クローンを得た個体におけるトリプシンまたはキモトリプシンフラグメントのいずれかに対する応答性は非常に小さかった。したがって、トリプシンフラグメントに存在するＴ細胞エピトープを認識するこの個体由来の単核球細胞培養物に存在するＴ細胞の集団数は、少ないに違いない。

他の興味深い観察事項は、ｇＣ−１由来のキモトリプシンフラグメントが、抗体１１Ｂ４によって認識される、ドメイン■に位置するエピトープを含有していることであった。これは、キモトリプシンフラグメントを免疫沈降できる１１Ｂ４の免疫沈降能、および非−還元条件下のウェスターンプロットにおけるその反応性によって確認された。１ｌＢ４抗体は、中和抗体の結合性を阻害する非−中相性抗体である［ルノセンホノプら（１９８８）］。この展望から、このエピトープに指向した抗体は宿主ではなく、ウィルスにとって有益であろう。１１Ｂ４によって認識されるエピトープは合成ワクチンを調製する上では排除されるべきであるが、キモトリプシンフラグメントは合成ワクチンの一部として使用することができるのではないかと思われる。しかし、１１Ｂ４は、キモトリプシンフラグメントとの反応性がジスルフィド結合を還元した後では喪失されるので、フォ− メーションを有するエピトープを認識すると思われる。１１Ｂ４とは異なり、タウン株ＨＣＭＶを中和する上記の抗体、およびヒト血清はジスルフィド結合の還元後に反応した。さらに、還元後は、本発明のモノクローナル抗体およびヒト血清によって３つのペプチドが検出された。これら３つのペプチド間の主要な相違の１つは、グリフシル化の程度である。分子量３４，０００のペプチドは最もグリコジル化の程度が高いが、Ｎ−グリカナーゼの作用によって少なくとも分子量３０，０００にまで減少され得た。分子量３４゜０００のペプチドにおけるポリサッカライドの存在は、他の糖タンパク質によって証明されているように抗体結合性に対して何らかの影響を与える可能性がある［アレクサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）およびエルグ−（Ｅｌｄｅｒ）、　１９８４、コースト（Ｃａｕｓｔ）ら（１９８７）コ。しかし、本発明者らの予備試験の結果（データは示していない）が示すところによると、炭水化物の除去が中和モノクローナル抗体の結合性を妨害せず、むしろ結合性を増大させたと思われる場合もあった。さらに、分子量２８．０００および３０．０００のペプチドは３４，０００分子量のペプチドと比較してグリコジル化の程度が低く、またはグリコジル化されていないが、ウェスターン・プロットでは抗体を依然として結合した。したがって、合成ワクチンはキモトリプシンフラグメントにおけるペプチドの線状アミノ酸配列のみを含有すればよいのではないかと考えられる。このサブユニットワクチンは本発明の１ｆｆｌ内に包含されるものである。

幾つかの観察事項は、キモトリプシンによる消化によって得られたｇＣ−ＩのフラグメントがｇＣ−Ｉの機能にとって重要であること、を示唆している。第１に、これらフラグメントと反応するモノクローナル抗体はさらにＨＣＭＶの幾つかの実験室型および野生型味をも認識する。実際、コンフォーメーション性および非−コンフォーメーション性エピトープがＨＣＭＶ株ＡＤ１６９およびタウン株に存在していることが示された。これらの結果はこのエピトープが保存されていることを示している。第２に、ドメイン■における阻害性エピトープがこれらのフラグメントに存在していた。このエピトープは、ｇＣ−Ｉ機能にとって重要な部位へ他の抗体が結合することを防ぐことによってウィルスの生存を助けることができる。第３に、ｇＣ−Ｉキモトリプシンフラグメントはグリコジル化されていた。グリコジル化の１つの重要な機能は、プロテアーゼ作用の妨害である（イワセ、　（１９８８））。本発明者らの実験によれば、プロナーゼ（非−特異的プロテアーゼ）さえも、キモトリプシンにより得られるものよりも小さなフラグメントの生成が妨害された。この結果は、ｇＣ−Ｉのこの部分がタンパク分解性から十分に保護されていることを示唆している。最後に、キモトリプシンフラグメントの高次構造はｇＣ−１分子の残りの部分とは無関係に維持され、洗浄剤による変性に対して耐性であるらしい。このことは非常に安定な構造体であることを示している。

引用文献本明細書に引用した文献を以下に記載する。

９８４）。

９８２）。

９８６）。

７、グレッチ（Ｄ、　Ｒ，Ｇｒｅｔｃｈ）ら、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　　１６３．２７０−２７７（１９８７）。

１１、ヨーレノツーサイナスＣＨ，Ｊｕａｒｅｚ−Ｓａｌ　１ｎａｓ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ。

１３、リウ（Ｙ、　−Ｎ、　Ｌｉｕ）、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　６２．１０１０６６−１０７０（１９８゜７２（１９８８）。

８５ｂ）。

種々の科学文献、そして好ましい態様および方法を引用して本発明を説明してきた。しかし、本発明の思想および範囲に包含されている限り、これには多くの変法が存在し得、そして修飾を加えることができるものと理解すべきである。

微生物（寄託機関の名称）イン・ビトロ・インターナショナル、インコーポレイテソド（寄託機関の住所）メリーランド２１０９０　　リンシカムハモンズ・フェリー・ロード６１１（Ｐ）！（寄託臼）　　　　　　　　　（受託番号）１９８８年７月３１日　　　Ｂ１６−１１Ｂ４１９８７年８月７日　　　　　２−２９−３４０７１９８６年９月１０日　　　　ｌ−４８−４１Ｃ２国際調査報失、、、ＩＡ、、ｌｌ□、２Ｐσ／ＩＪＳ　８９１０２６１３国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）ＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質複合体ｇＣ−１をキモトリプシンで消化し、分子量３４，０００および４３，０００のグリコシル化ペプチドフラグメントを得、そして（ｂ）得られたペプチドフラグメントのジスルフィド結合を還元し、分子量２８，０００、３０，０００および３４，０００を有する還元ペプチドを得る、ことを特徴とする方法によって調製される、分子量約２８，０００、３０，０００または３４，０００の免疫原性ペプチド。