JPH03503172A - 流体からの抗原物質の分離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 流体からの抗原物質の分離 本発明は、流体からの抗原物質の分離方法に関する。本明細書で使用するところ の抗原物質の語は、抗体が産生されうる物質と広義に用いる。

固定化抗体を使用して生物学的流体から抗原物質を選択的に分離する親和性分離 および精製法は知られている。例えば、英国特許出願第２１３５６７６号は抗体 アフィニティークロマトグラフィーで高純度エリトロポエチンを生産するための 方法を記載する。

細胞サブタイプの分離精製は、抗体アフィニティークロマトグラフィー法を用い て実施されてきた。このような方法では、抗原物質が分離せしめられる細胞の表 層成分である。

従来方法に随伴する課題は、それぞれ特定の分離に各種抗体の固定化を要するこ とである。このことは、各抗体について最適固定化条件が変動するので使用者な らびに分離装置および分離材料の供給者に明らかな困難をもたらす。さらに、少 量の抗体の固定化は、固定化効率が使用される抗体濃度に通常依存するので経費 がかかる。

本発明は、一連の適用に必要な単一抗体のみを固定化するので単位原価を低減し そして最適化を可能にする方法を提供することによって上記課題を解決する目的 で設計されている。

特に、分離材料および分離装置の単一型が一連の免疫アフィニティー分離に使用 されうる。

本発明は、方法が （１）　（ａ）抗原物質、 （１））に頷を含みそして前記抗原物質と結合する第一抗体、および （ｃ）第一抗体のに鎖に結合する第二抗体であって、この第二抗体が固相担体上 に固定化されているもの、の相互作用によって三重複合体を形成する工程、なら びに（２）前記固相担体から流体を分離する工程、を含んでなる流体からの抗原 物質の分離方法を提供する。

本発明の好ましい態様では、抗原物質との抗体：抗原二重複合体を形成するため に流体が第一抗体と接触され、次いで前記三重複合体を形成するために固定化さ れた第二抗体と接触される。

第一抗体はマウス抗体であり、第二抗体は抗マウスに鎖抗体であることが特に好 ましい、この固定化抗体はマウス抗体のに鎖と特異的に結合するので、それが高 い割合のマウス抗体（マウス抗体的９５％が共通のに鎖を有する）と相互作用す る。これは、市販されているモノクローナル抗体の大部分がマウス起源であるの で特に有用である。

好ましくは、第一抗体および／または第二抗体はモノクローナル抗体である。

本発明の方法は、多種多様な抗原物質に関して使用することができる。このよう な物質の具体例としては、ハブテン、ホルモン、アレルゲン、ウィルス、細菌、 毒素、ある種の薬剤およびタンパク賞が挙げられる。

本発明の特定の用途は、細胞サブタイプ、例えばＴ細胞の分離精製である。例え ば、目的細胞の亜集団（ｓｕｂ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を含有する細胞集団が 、その亜集団にのみ存在する特定の細胞表層タンパク質について特異的なに鎖含 有マウスモノクローナル抗体の大過剰にさらされる。過剰なマウス抗体を含む懸 濁液から前記細胞を分離した後、これらの細胞は固相担体上に固定化された抗マ ウスに鎖抗体と接触される。その特異的マウス抗体に結合する細胞だけが固相担 体上に残存する。

細胞タイプ別の殆どのモノクローナル抗体が入手可能であるので、この方法は広 範囲の適用性を有する。

本発明の方法で液体から分離された抗原物質は、固相担体から溶離することによ って回収されうる０例えば、結合した細胞はをフリーアフィニティータンパク質 との競合によって放出されうる、渦巻、撹拌または再懸濁による結合細胞の機械 的剥離もまた通するかも知れない。

本発明の方法を実施するのに使用される固相担体および装置は常用のものでよい 。例えば、担体はポリマー粒子、クロマトグラフィーカラムに入れられる例えば 、市販の「セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　Ｊ　　（商標）ビーズ（２５ ０〜３５０ｕ）のようなビーズ状アガロースであってよい。

好ましくは、本発明を実施するのに使用される固相担体および装置としては、同 時係属ヨーロッパ特許出願第８９３０６７６６．０号明細書に記載されるような ものが挙げられる。

従って、好ましい態様では、第二抗体を受容するのに適する不浸透性支持シート であって、それに対し、ポリマー表面にその第二抗体と直接または間接的に反応 する官能基を有するポリマーを付着した支持シートを含んでなる固相担体要素と の反応によって第二抗体が固定化される。

前記固相担体要素は、室で仕切られているハウジングであって、そのハウジング が流体の流入手段と排出手段を有しており、その室がその上に固定化された第二 抗体を有する要素少なくとも一種を担持しており、その要素または要素類は、装 置が使用されているときに前記流入口を通って室に入る流体がその要素またはそ れらの要素類の表面上を通過した後、前記排出口を通ってその室から放出される ように流路を限定する目的で流入口と排出口に関して位置決めされている前記ハ ウジングを含んでなる、本発明の方法を実施するための装置において使用される かも知れない。

好ましくは、前記流路は、その要素またはそれらの要素類上を通過する流体の深 さが２０から５００−まで、より好ましくは３０から２００μまでであるような ものである。

本発明は、例および添付の略図によって具体的に説明される。

第１図は、本発明の使用に好ましい固相担体要素の横断面図であり、 第２図は、本発明を実施しろる装置外観の遠近図であり、第３図は、第２図の線 ２−２に沿って切断された縦断面図であり、そして 第４図は、第２図の線３−３に沿って切断された横断面図である。

要素の支持シートは各種材料から作製することができる。

例えば、適する材料として金属、ガラスまたはポリマーを挙げることができる。

シートやフィルムに成形することができる多くのポリマー材料、例えばセルロー スエーテル類もしくはエステル類（例、酢酸セルロース）、ポリエステル類〔例 、ポリ（エチレンテレフタレート）〕、ポリオレフィン類〔例、ポリ（プロピレ ン）〕およびポリ（ビニルクロライド）を初めとするものが適する。

支持体の厚さは、それが作製される材料および要素が使用される態様に応じて非 常に広範囲に変動しうる。携帯用としては、機械的安定性の要件に合致する限り できるだけ薄い支持シートが好ましい０例えば、支持シートの厚さは、０．０１ 〜０、５　ｍ、より好ましくは０．０５〜０．２　ｍであってもよい。

好ましくは、支持シートは柔軟である。また、支持シートは平坦であることが好 ましい。

第二抗体が固定化されるポリマ一層は、活性化ポリマ一層、すなわちその抗体と 直接反応しうる官能基を含有するものとして提供してもよい。また、それは活性 化剤を用いる処理によってその後活性化される活性化可能なポリマ一層として提 供してもよい。活性化剤は、活性化可能なポリマーの官能基を抗体と反応しうる 官能基に転化しうるか、あるいはそれが活性化可能なポリマーの官能基との反応 によってそのポリマーに結合性となるカプリング剤であってもよい。

活性化剤の具体例としては、ジビニルスルホン、シアノゲンブロマイドおよびゲ ルタールアルデヒドが挙げられる。

適当なポリマー類は、エチレン系不飽和の水酸基含有モノマー類〔例えば、ヒド ロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）　）、エチレン系不飽和のオキシラン 基含有モノマー類（例えば、グリシジルアクリレート）およびエチレン系不飽和 のアミド基含有モノマー類（例えば、アクリルアミド）のようなモノマー類から 誘導されうる。

好ましくは、活性化または活性化可能なポリマーは、本質的に親水性である。ポ リマーに親水性を付与する特に適切な化学基としては、水酸基、アミノ基、カル ボキシル基およびチオール基が挙げられる。

多孔質材料の使用に伴う課題を極小化するには、活性化または活性化可能なポリ マ一層は、実質的に非孔質であるかも知れない。活性化または活性化可能なポリ マ一層が多孔質である場合には、細孔は第二抗体と分離される抗原物質がその層 中に入ることを避けるほど十分に小さなものであることが好ましい、好ましくは 、活性化ポリマ一層は実質的に非膨潤性である。

製造の容易さのためには、活性化可能または活性化ポリマーは溶媒塗布可能、例 えば水および／または有機溶媒の溶液から塗布可能であることが好ましい。この 方法では、例えば、スライドホッパーまたは押出しホッパーを初めとする通常の 塗布機械を使用して非常に多量の塗布製品を製造することができる。

好ましくは、活性化可能または活性化ポリマーを支持体上の連続層として構成す る。

活性化ポリマ一層の厚さは、使用される個々のポリマーなとの要因に依存するで あろう。好ましい態様では、第二抗体と分離される標識された抗原物質との相互 作用がその層の表面で優先的に行われるので、単に、支持シートへのりガントの 適切な付着を提供するのに必要な厚さとして十分であればよい。例の態様によれ ば、活性化ポリマ一層の乾燥厚さは、５〜１００．ｎ、より好ましくは１０〜５ ０ｉｔｍであることができる。

活性化ポリマ一層と支持シートの間の十分な付着は、関連する２種の材料の適当 な選択によって達成することができる。

また、付着は、ポリマ一層を適用する前に下塗り層の使用のような他の手段また は支持シートをコロナ放電もしくはＲＦプラズマ処理にかけることによって促進 することができる。

活性化ポリマ一層は支持シートのいずれかの側面に提供することができる。

支持シートの表面積に対応して活性化または活性化可能なポリマ一層の表面積を 極大化するためにいろいろな方法を使用することができる。このような方法の一 つでは、隣接する各粒子によって層の表面積を上昇させる不活性な微粒子材料を 含む。この微粒子材料はビーズ状であってもよい。これらの粒子が形成される適 当な材料にはポリマー類およびガラスを挙げることができる。

活性化または活性化可能なポリマ一層は、スペーサ一手段として機能する微粒子 材料を含むことができ、すなわち、この微粒子材料が前記手段を提供することに よって、ある要素が他の要素またはそれに対して保持される同一の要素の他の部 分からそれぞれ間隔をもうけることができる。この微粒子材料はポリマー塗膜上 またはその内部に化学的に保持することができる。好ましくは、この微粒子材料 はほぼ均一な形状と寸法の粒子を含んでなる。殆どの用途にとって、個々の粒子 は隣接要素間でほぼ均一な分離距離を提供するように層中で分布していることが 好ましい。

前述のように、微粒子材料は、例えばポリマービーズまたはガラスピーズを初め とする多様な形状をとりうる。それらが提供する間隔の程度を決定する粒子寸法 は、隣接要素間に要する分離距離および活性化ポリマ一層の厚さような因子よっ て左右されるであろう。２０〜５００．ｎ、好ましくは２０〜２００趨の範囲内 にあるほぼ同一の直径をすべてが有する不活性材料の実質的に球状のビーズが適 切な微粒子材料の例を提供する。

前述した粒子スペーサーの特に有利な点は、ポリマ一層で粒子材料を被覆するこ とが可能であることである。この態様では、一体スペーサ一手段を有する要素が 作製される。ポリマ一層が形成されるポリマーまたはモノマー類と粒子材料を含 んでなる均質な塗膜組成物を単純に調製することによって、これらの粒子は塗膜 形成層上に均一に分布されるであろうし、こうして均一な分離がもたらされる。

前述の装置では、固相担体要素は多種多様な態様の形状となりうる。

例えば、装置は、各要素がスペーサ一手段を介して隣接する要素から分離されて いて、向い合った形状にある多数の要素を含んでなることができる。

好ましい態様の装置では、要素がコイル状であって、そのコイルの渦巻がスペー サ一手段によって分離されており、そして限定流路がコイルの軸線に対して軸方 向にある。

もう一つの好ましい態様では、要素がコイル状であって、そのコイルの渦巻がス ペーサ一手段によって分離されており、そして限定流路がその渦巻を通過する円 周方向にある。

好ましくは、前記それぞれのスペーサ一手段が要素または要素類の隣接表面間に 実質的に一定の分離距離を提供する。

この分離距離は、２０〜５００趨、好ましくは３０〜２００趨であるかも知れな い。

前述のように、分離手段は要素と一体であってよい。また、分離手段は、装置を 通過する流体の流れを可能にする、例えば、テープ、ロンドまたはメツシュ様の 構造体を分離する形状であってもよい。

実質的に均一な分離を提供することがスペーサ一手段にとって重要でない場合、 スペーサ一手段は要素それ自体であることがでる。例えば、要素が波形であって 、それかまたは隣接分離要素の隣接部分が、要素または要素類のほんの一部で接 触するように配置されていてもよい。

前述の装置を使用することによる利点としては、微粒状物（例、細胞）を含有す る流体を取り扱うことが可能になることが挙げられ、こうしてクロマトグラフィ ー〇カラムのような入手可能な装置に比し前記のような微粒状物による目詰り傾 向を大幅に低減する。さらに、本発明の装置は自蔵式であり、所望であればただ １回限りの使用に適するようにそれを使用しそして廃棄することが都合よい。こ れは、処理物質が病原体、ウィルスまたはＤＮＡ産物のような物質を含む場合や 処理流体が患者に再注入される場合（例、骨髄浄化）に主に考慮すべき事柄であ る。さらに、この装置は事前包装が容易であり、そして必要により事前滅菌が容 易である。

本発明は、第１図〜第４図（縮尺でない）の具体的な略図を引用して説明する。

第１図は、本発明で使用するのに適する固相担体要素の横断面図を示す。この要 素は、その表面に共有結合した第二抗体（示していない）を有するポリマー１１ の層で被覆した支持シート１０を含んでなる。層１１に組み込まれたビーズ１２ は前記支持体１０に付着している。

第２図は、本発明を実施することができる装置外観の遠近図である。示されてい るハウジング２０は、プラスチック材料（例、ポリプロピレン）から成形するこ とができる。このハウジング２０は、蓋２２付きの円筒体２１を含んでなる。こ の蓋には流体流入管２３が備えられており、そして前記円筒体部分には流体排出 管２４が備えられている。

第３および４図は、それぞれ第２図の線２−２および３−３に沿って切断された 断面図である。

蓋２２は、それを通過して流体がハウジング２０によって限定される室に流入す ることができる軸方向の通路２５を含む。蓋２２の内部表面は、流体が室に入る に従ってその流れが拡散するように通路２５から放射状に拡がる溝２６を備えて いる。室は、第・１図に示される要素のコイル２７を含む。この要素は円筒心２ ８上に螺旋状に巻きつけられる。このコイルの巻取りの外側は、コイルの外表面 を同時に拡張しそしてコイルとハウジング２０の内表面との間の流体を密封する ことを提供する粘着テープ２９によってコイル本体に付着される。

このコイルは、一端において蓋２２と他端において室の円筒壁に対して保持され たポリプロピレン円板３０との間の室に充填する。このコイルに面する円板の表 面は、その円板を通して軸方向に伸びる中心通路から放射状に拡がる溝３１を備 えている。この通路は、ハウジングの端壁と排出管２４を通過する通路３２と連 絡する。

装置が使用される場合には、流入口を通って室に流入する流体がコイル渦巻部を 軸方向に通過した後、排出口を通って室から放出される。図面および、特にコイ ルの表示は略図であることを強調しておく。実際上は、要素の全体的な厚さは約 ２００−であるかも知れない。このような要素から作製されるコイルは、幅３５ 鵬でそして約１２震の直径を有する中央円筒心上に螺旋状に巻き取られた長さｌ １ｍのストリ・ンプ状である。

表示した型の装置では全長８０ａｍで外径７０薗を有するようなコイルを含んで いた。明らかに、このコイルは多数の接近した間隔の渦巻きからなるので、尺度 図で適切に表示することは不可能であろう。

本発明を以下の例によってさらに説明する。

■ 冷却器および窒素入口を固定した１２の三つ日丸底フラスコに次のものを充填し た。

２−ヒドロキシエチルメタクリレート（０，４８モル）　６２．４５ｇメチルメ タクリレート（０，０３モル）　　　　　　　　　３．００ｇメタクリル酸（０ ，０３モル）　　　　　　　　　　　　　２．５５ｇｐ−トルエンスルホン酸・ １　水和物２．１０　ｇエタノール／メチルセロソルブ（９：１　ν／ｖ）　　 　２５０ｄ前記溶液を５０°Ｃで１７時間撹拌した。この期間中溶液を通して窒 素を吹込んだ。ポリマーは過剰のジエチルエーテル中に沈殿させて回収し、次い でデシケータ−中で乾燥した（収量１００％のジメチルホルムアミド中前記ポリ マー１０重量／重量％と水酸化テトラブチルアンモニウム／ポリマーの１０重重 量型量％とからなる塗布溶液を調製した。スペーサービーズとして１００趨シリ カ被覆スチレンビーズを前記溶液中に懸濁状態で組み入れた。

湿式堆積厚が１００−になるまでコロナ放電処理ポリエチレンテレフタレートシ ートの一側面に前記溶液を塗布した。この塗膜を９０°Ｃで約２０分間乾燥した 。シートのもう一方の面は、塗布溶液がスペーサービーズを含まない以外は同様 に塗布しノこ。

有効に架橋が起こったことを示すそれらの塗膜は、水、塩溶液、エタノール、ア セトンおよびジメチルホルムアミドに安定であった。

３、　クロマトグラフィー・な 前記塗布ポリマー試料を、０．５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ１ｌ）中４％ジビニル スルホン溶液で処理して活性化した。０．８■／−のラット抗マウスに鎖モノク ローナル抗体を、０．　Ｉ　Ｍ炭酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液（ ｐＨ８）中で前記活性化ポリマー塗膜に結合させた。このラット抗マウスに鎖抗 体は、５ｅｒａ−１ａｂ　（クローン０Ｘ−２０、コードＭＡＳ　２０２Ｇ）か ら得た腹水から精製した。

５％ウシ胎児血清が補強されたＲＰＭＩ　１６４０培地（どちらもＦｌｏｗ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ由来で）生育したジューカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、 ヒト白血病子細胞（Ｊ、Ｅｘｐｅｒｉｓｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　　１５ ２：１７０９＋１９８０　ｓ　Ｇ１１ｌｉｓ、　Ｓ、、およびＷａ　ｔｓｏｎ　 、　Ｊ）を、洗浄して培地を取り除き、次いでリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ組成：０ ．１５ＭＮａＣｌ１　　、　２．７ｓＭ　　ＫＣｊ！　　、　８　ａ＋Ｍ　　Ｎ ａｚＨＰＯａ、　１．５＋ａＭ　　ＫＨｚＰＯｎ　　、　ｐＨ７，２）に再懸濁 した。トリバンブルー排除によって評価したところ細胞生存率は８５％を越えて いた。

総３．ｌＸ１０’個のＪｕｒｋａｔ細胞（５，２Ｘ１０ｂ個細胞／ｄ）をＴ細胞 表層抗原ＣＤ２に対するマウスモノクローナル抗体で標識した。この抗体は、Ｂ ｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｌｔｄ、（＾ｎｔｉ−Ｌａｕ−５ｂ　。

カタログＮ１１７５９０）から得た。この抗体を０．５■抗体／１０’個細胞の 割合で前記細胞に加えた。細胞と抗体を一緒にインキュベートし、過剰の抗体を 遠心で除去し、次いでこれらの標識された細胞をＰＢＳに再懸濁した。

０Ｘ−２０を結合させたポリマー塗膜を、前記標識された細胞懸濁液とインキュ ベートした。次いで、塗膜をＰＢＳで洗浄した後、顕微鏡で検査した。この塗膜 は高密度の結合細胞の良好な均等付着量を示した。

比較の目的で、塗膜試料を非抗体標識細胞とインキュベートした。その後の顕微 鏡検査は、細胞がポリマーに実質的に全く結合しなかったことを明らかにした。

国際調査報告　　　　　　　− −″′“１ゝ“−９”　ＰＣＴ／田９０１０００１２　　　］国際調査報告　　 　ＰＣ丁／ＧＢ　９０１０００１２

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．（１）（ａ）抗原物質、 （ｂ）κ鎖を含みそして前記抗原物質と結合する第一抗体、および （ｃ）第一抗体のκ鎖に結合する第二抗体であって、この第二抗体が固相担体上 に固定化されているもの、の相互作用によって三重複合体を形成する工程、なら びに（２）前記固相担体から流体を分離する工程、を含んでなる流体からの抗原 物質の分離方法。
2. ２．流体を第一抗体と接触させて抗原物質との抗体：抗原二重複合体を形成し、 次いで固定化された第二抗体と接触させて前記三重複合体を形成する請求項１記 載の方法。
3. ３．第一抗体がマウス抗体であり、そして第二抗体が抗マウスκ鎖抗体である請 求項１または２記載の方法。
4. ４．第一抗体がモノクローナル抗体である前記請求項いずれか一に記載の方法。
5. ５．第二抗体がモノクローナル抗体である前記請求項いずれか一に記載の方法。
6. ６．抗原物質が細胞の表層成分である前記請求項いずれか一に記載の方法。
7. ７．流体から分離される細胞が流体中に含まれる細胞の亜集団を表わす請求項６ 記載の方法。
8. ８．抗原物質が固相担体から溶離によって回収される前記請求項いずれか一に記 載の方法。
9. ９．固相担体が、不浸透性の支持シートであって、第二抗体と直接または間接的 に反応する官能基をその表面に有するポリマーを含んでなる層を付着したシート を含んでなる要素である前記請求項いずれか一に記載の方法。