JPH03502240A - 有機溶媒中での生体電気化学反応 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 有機溶媒中での生体電気化学反応 技術分野 本発明は、非水性または微水性溶媒中で行われる生体電気化学反応に関する。微 水性溶媒は、非水性溶媒への少量の水の添加により形成されるものであり（Ｙａ ｍａｎｅら、１９８８）　、そして本明細書で使用する時この用語は、水で飽和 された水不混和性溶媒を含む。

特に、本発明は、非水性または微水性溶媒中で生体電気化学反応を行う方法、分 析物の測定へのそのような方法の利用、並びにそのような方法を行うための電気 化学セルおよび酵素電極に関する。

背景技術 水溶液中で生体電気化学反応を行いそしてモニターするために酵素電極を使用す ることは周知である。例えば、グルコースオキシダーゼを伴う酵素電極を用いて グルコースの酸化を行い、その結果水溶液中のグルコースの濃度をモニターする ことができる（例えば１ｕｒｎｅｒら、１９８５参照）。そのような電極におい ては、酵素は従来共有結合により電極に固定化され、そして酵素の酸化還元中心 と電極表面との間の電子伝達はフヱロセンのような媒介分子により行われる（Ｃ ａｓｓら、１９８４）。

水溶液中で酵素電極を使用すると、広範な準備なしで試料中の化学物質の濃度を 測定することが可能である。酵素が生化学反応の特異性を提供し、そして電極が 高感度の方法で反応の程度または経過をモニターする（Ｔｕｒｎｅｒら、１９８ ７）。

しかしながら、現在使用されている方法は幾つかの欠点を有する。例えば、該方 法は比較的水溶性である種の測定に限定され、電極材料は水性溶媒中で安定で且 つ操作可能であるものでなければならず、そして多くの酵素が水性環境中で温度 安定性に乏しいため、該方法は高温での使用に適当でない。

本発明者らは、有機溶媒または微水性溶媒中で生体電気化学反応を行うことが可 能であることを発見した。有機溶媒または微水性溶媒中での酵素反応は報告され ている（Ｋｌ　１ｂａｎｏｖ。

１９８６　；　）ｆａｌｌｉｎｇ、　１９８７　；　Ｋａｚａｎｄｉｊａｎら、 １９８５）が、生体電気化学において酵素電極を使用する可能性は以前には探究 されていない。

発明の開示 本発明の１つの観点によれば、非水性または微水性溶媒中で生体電気化学反応を 行う方法が提供される。該方法は、酵素基質の非水性または微水性溶液を、前記 酵素が保持されている電極と接触せしめ、そして前記酵素の作用下で基質を電極 と反応させることを含んで成る。１つの可能性は、酵素が基質から生成物への変 換を触媒し、次いで生成物が電極の所で直接電気化学反応を行うというものであ る。別の可能性は、おそらく媒介物質の介在により酵素が基質の酸化または還元 を行うことができ、従って基質と電極との間の電子伝達を伴うものである。酵素 は、細胞全体、細胞膜もしくは細胞小器官の成分として、または精製物質として 存在することができる。

非水性または微水性溶媒中で生体電気化学反応を行うことにより、酵素特異性を 水溶液中でのそれと異なるようにすることができ、そして適当な非水性溶媒を選 択することにより特定の選択性を選べる可能性がある。更に、酵素基質または生 成物を安定化し、従って他の方法では困難な電気化学現象を観察できるように溶 媒を選択することができる。酵素の熱安定性はしばしば非水性溶媒中で増加され るので、より高温で反応を行うこともできる。

該方法は、分析物について分析しようとする非水性または微水性溶液を電気化学 セル中に入れ、ここで前記セルは酵素が保持されている電極を有し；そして前記 セルの電気的応答を測定することにより、非水性または微水性溶液中の分析物の 測定において使用することができる。

検出できる可能性のある様々な分析物がある。それらは、理論上は、酵素基質も しくは補因子；酵素基質もしくは補因子に変換できる物質：または電極の酵素と の電子伝達を媒介することができる酸化還元種である。水溶性の低い分析物は、 例えば向流クロマトグラフィーにより、多量の水から少量の非水性溶媒中への分 析物を濃縮することにより、測定することができる。従って、例えば、水中に低 濃度で存在することのできるフェノールのような有機物質は、クロロホルム中へ の抽出により容易に測定することができる。

酵素が非水性または微水性溶液中で作用するためには、ごく低濃度の水が酵素の 表面上に分布すべきであると考えられる。酵素の周りの水分子の役割は十分に解 明されてないが、酵素の構造の保持に水が必要なのであろう。これは、生体電気 化学反応を行う時に使用することができる非水性溶媒に幾つかの制限を与える。

該溶媒は、酵素から必要な水を取り去るほど極性であってはならない。通常、該 溶媒は有機および疎水性溶媒であり、例えば炭化水素が特に好ましい。より親水 性であるがまだ水不混和性である他の有機溶媒、例えば有機ハロゲン化物（その 中でクロロホルムは好ましい例である）、エーテルおよびエステルを使用しても よいが、好ましくは水で飽和される。酵素を溶解できる非水性溶媒は最も避けら れる。

本発明の更なる観点は、上述の方法のいずれかを行うための電気化学セルであり 、該セルは酵素が保持された電極を含んで成り、そして非水性または微水性溶媒 を含有する。

上述の方法および電池において使用される電極は、当業界で常用であるように共 有結合により固定化された酵素を有することができる。しかしながら、本発明は 、非水性または微水性溶媒中で使用される酵素電極を提供し、前記電極は、導体 、前記導体と合体した親水性支持体、および前記支持体に保持された酵素を含ん で成る。好ましくは、酵素は支持体と共有結合しているのではなく、酵素と支持 体の共通の親水性によってその付近に保持される。従って、従来の酵素固定化、 例えば共有結合的付着の必要が回避される。そのような電極は、好ましくは微水 性溶媒と共に使われる。というのは、非水性溶媒への少量の水の添加が酵素の保 持および安定性を確実にするため酵素電極を適当な条件下で数回にわたり再使用 することができるからである。

親水性支持体と合体された導体は、例えば、グラファイトブロックにより提供さ れるか、または微小構造の電極〔その例についてはＭｕｒｒａｙら（１９８７） を参照のこと〕のものであってもよい。

親水性支持体は、極性残基を含む高分子化合物の膜であることができる。高分子 化合物は、酵素電極と一緒に使用することになっている有機溶媒中で安定なまま であるものでなければならない。可能なポリマーはニトロセルロース、酢酸セル ロース、ポリアクリルアミドおよびナイロンを含む。ナイロンが好ましい材料で ある。

あるいは、親水性支持体は、親水性表面を有する無機の膜であってもよい。例え ば陽極酸化アルミニウム膜、例えばＡｎｏｔｅｃｈ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　 Ｌｔｄにより商品名Ａｎｏｐｏｒｅのもとに市販されているものである。そのよ うな膜に導体を合体させて酵素電極を作ることができる。別の可能性は、例えば 導体がアルミニウムでありそしてそれに陽極酸化表面が与えられている場合、導 体の表面上に親水性支持体を形成することができる。

本発明の別の観点は、有機または微水性溶媒中で使用される酵素電極を含んで成 る電気化学セルであり、前記電極は導体、前記導体と合体した親水性支持体およ び前記支持体に保持された酵素を含んで成る。

本発明の成る態様においては、分析物としてのフェノールを検出するために、電 極に固定されたポリフェノールオキシダーゼ酵素が使われる。しかしながら、他 の可能な酵素および分析物も期待され得る。

図面の簡単な説明 本発明の酵素電極の態様およびその利用を添付図面に関して説明する。

第１ａおよびｌｂ図は、電極の構造および電極構造に必要なワイヤーの形態をそ れぞれ示す。

第２図は適所に第１図の酵素電極を有する電気化学セルを示す。

第３図は、ｐ−クレゾールについての酵素電極の検量線である。

第４図は、１６回の連続アッセイにわたるｐ−クレゾール（ＩＯＭ）に対する電 極の応答を示す。

発明を実施する最良の形式 次の記載において、ポリフェノールオキシダーゼ酵素を使ってクロロホルム中で フェノールの酸化を行う。フェノールは多量の水から少量の有機溶媒中に分配さ れ得、そこでそれらは酵素電極との反応を通して迅速に検出され得る。これは、 水中の低濃度のフェノールの測定方法を提供する。

電極の作製 ポリフェノールオキシダーゼ（チロシナーゼ１．７■、　Ｓｉｇｍａ。

Ｐｏｏｌｅ、　Ｄｏｒｓｅｔ　ＧＢ）をリン酸ナトリウム緩衝液（１５４、５０ ｍＭ。

ｐＨ７，０）に溶かした。この溶液を長方形４　（５ｘ１４ｍｍ）の’Ｈｙｂｏ ｎｄ−Ｎ’ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌ ｃ、　ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ、　Ｂｕｃｋｓ　ＧＯ）中に浸透させ、そ して室温で１時間放置して乾燥させた。膜４は、第１ａ図に部分的に切り取られ て示されている。ある長さのニッケルークロム裸線を第１ｂ図に示されるように 折り曲げた。乾燥ナイロン膜４の一端を特定の長さのワイヤーの折り目１の中に 入れ圧締めした。

ＨＰＬＣ用クロロりルム中のトルエン−４−スルホン酸テトラブチルアンモニウ ム（ＴＢＡＴＳ）　Ｃ０，Ｉ　Ｍ、　Ｆｌｕｋａ、　ＦｌｕｏｒｏｃｈｅｍＬｔ ｄ、、　Ｇｌｏｓｓｏｐ、口ｅｒｂｙｓｈｉｒｅ　（ＧＢ））の溶液に少なくと も１時間浸漬されたグラファイトホイル５　［５Ｘ６Ｘ１ｍｍ、　ＬｅＣａｒｂ ｏｎｅ、　Ｐｏｒｔｓｌａｄｅ、　５ｕｓｓｅｘ　（ＧＢ）　］ブブロクの周り に膜４を折り曲げた。この操作で使用した全てのクロロホルムは、リン酸ナトリ ウム緩衝液（５０ｍＭ、　ｐＦ１７．０　）で予め飽和しておいた。グラファイ トホイルブロック５の短い方の縁の一方およびナイロン膜４の圧締めされていな い端をワイヤーの折り目２の中に圧締めした。ある長さく１０ｍｍ）のニッケル ークロム線６をグラファイトブロック５および膜４の周囲に圧締めし、膜４をグ ラファイト５き密着させた。酵素電極は第１ａ図に示される。

電気化学電池の作製 第１ａ図の酵素電極を含む電気化学セルを第２図に示す。

該酵素電極を使う全ての操作に三電極系を使用した。電位を精密ポテンショスタ ット［Ｍｉｎｉｓｔａｔ、　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ａｎｄ　Ａｓ５ｏｃｉ−ａｔｅ ｓ、　Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　ｕｐｏｎ　Ｔｙｎｅ　（ＧＢ）］により維持し、そ して抵抗ボード［Ｊ、Ｊ、Ｊｕｎｉｏｒ、　Ｊ、Ｊ、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、 　Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ。

）１ｅｒｔｓ　（ＧＢ）］を経てｘ−ｔチャートレコーダー［Ｇａｌｌｅｎｋａ ｍｐ。

Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、　Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ　（ＧＢ）　：ｌ 上で電流を記録した。

バックグラウンドノイズを除去するために、チャートレコーダーの入力端子にコ ンデンサー（４７μＦ）を交差接続した。第２図にはポテンショスタット、チャ ートレコーダー、抵抗ボード右よびコンデンサーは示されていない。

飽和カロメル電極？　（Ｒｕｓｓｅｌ　ｐＨＬｔｄ、、　Ａｕｃｈｔｅｒｍｕｃ ｈｔｙ。

Ｆｉｆｅ、　５ｃｏｔｌａｎｄ）を参照電極として使い、そして補助電極８は白 金線（直径０．４ｍｍ）であった。上部を切り取った試験管９に入れられたクロ ロホルム（５ｍｌ、　０．１　Ｍ　ＴＢＡＴＳ）中に電極を浸した。酵素電極は 飽和カロメル電極７に対してクロロホルム中−２７５ｍＶに安定化し、そしてク ロロホルム（０，１ＭＴＢＡＴＳ）中のｐ−クレゾールのストック（９０ｍＭ） を電気化学セルの蓋の小穴１０から少量添加した。

酵素電極の検量線の作成 ５本の異なる電極に関して成る範囲のｐ−クレゾール濃度（０〜２６７声）に渡 り９つの別々のアッセイを行った。各アッセイの前に、酵素電極の各側面にリン 酸ナトリウム緩衝液（２４，５０ｍＭ、　ｐＨ７，０）を置き、ポリフェノール オキシダーゼを再水和させた。電極を上述のセル中に入れ、そしてクロロホルム 中の標準カロメル電極７に対して一２７５ｍＶに安定化させた。２５分後、電流 が一定になり、ｐ−クレゾールを添加した。次いで、電流の増加を観察した。こ れは典型的には３〜５分後に定常値に達した。各アッセイの間中、セルを撹拌し た。各アッセイ後、電極をセルから取り出し、そしてクロロホルム中で約６０秒 間洗浄した後、風乾しそして次のアッセイを行った。ｐ−クレゾールに対する電 極の応答はθ〜１００声の濃度範囲で直線であった（第３図）。標準誤差のバー は、電極間の優れた再現性を表わす。

操作安定性 上記に概説したアッセイ手順を、一連の１６のアッセイについて１００−の最終 ｐ−クレゾール濃度を用いて繰返した。電極の応答は、最初の３回のアッセイに おいては１．９μＡから４．０μ八まで増加し、次の１１回のアッセイの間は一 定に保持され、アッセイ数１４以降は下がり始めた（第４図）。

貯蔵安定性 ８本の電極を乾燥グラファイトブロックを用いて作製し、モしてｐ−クレゾール （２００−）に対するそれらの応答を記録した。次いでその半分は室温でそして 残りの半分は５℃で貯蔵した。各温度で２本の電極はシリカゲルの入った容器中 で乾燥貯蔵し、そして２本はクロロホルム中で貯蔵した。数日後および７週間後 にｐ−クレゾールに対するそれらの応答を再びテストした。室温で貯蔵した電極 は、３日後の応答の３０％の平均活性低下を示し、一方５℃で貯蔵したものは、 ｐ−クレゾール（２０ｈＭ　）に対するそれらの応答に全く有意な減少を示さな かった（第１表）。

第１表 乾　　燥　　　　５．２　　　　　６．８　　　　３．６室　　温　　　　　　 　　　　　　４．８　　　　　５，４　　　　２．８（２０℃）Ｃ，ＨＣｌ１３ 中　　　４．０　　　　７．０　　　５．５４．２　　　７，２　　６．５ 乾　　燥　　　　４，３　　　　　４．４　　　　４．７５　　℃　　　　　　 　３．７　　　４．５　　３．５ＣＨＣ＃、中　　　　４．８　　　　８．１　 　　１０．０３．８　　　９．５　　７．６ 標準濃度（１００ｍ　）のフェノール、カテコール、４−メチルカテコール、ｍ −およびｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド、ｍ−、ｐ−および０−クレゾール、 ｐ−アミノフェノール並びに４−クロロフェノールに対する単一電極の応答を記 録した。該電極は、０−クレゾール並びにｐ−およびｍ−ヒドロキシベンズアル デヒドを除くテストされた全てのフェノールに対して応答しく第２表）、フェノ ールセンサーとしての該電極の利用可能性を示す。

第２表：１０種のフェノール（１００Ｊ＝１１　）に対する酵素電極の応答ｐ− クレゾール　　　　　　　　　　　　　　５．６ｍ−クレゾール　　　　　　　 　　　　　　　４．７０−クレゾール　　　　　　　　　　　　　　０．０フエ ノール　　　　　　　　　　　　　　６．４カテコール　　　　　　　　　　　 　　　８．６４−メチルカテコール　　　　　　　　　　６．７ｐ−ヒドロキシ ベンズアルデヒド　　　　　０．０ｍ−ヒドロキシベンズアルデヒド　　　　　 ０．０ｐ−アミノフェノール　　　　　　　　　　２．４参考文献 Ｌ　　Ｙａｍａｎｅ、　Ｔ、、　Ｋｏｊｉｍａ、　Ｙ、、　Ｉｃｈｉｒｙｕ、　 Ｔ、およびＳｈｉｍｉｚｕ。

Ｓ、（１９８Ｂ）　Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ｍ１ｃｒｏａｑｕｅｏｕ ｓ　ｏｒｇａｎｉｃ　５ｏｌｖｅｎｔｓ。

Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｂｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　２．　Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｙｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ。

２、　　Ｔｕｒｎｅｒ、　Ａ、Ｐ、Ｆ、、およびＰｉｃｋｕｐ、　Ｊ、Ｃ，（１ ９８５）、　Ｂｉｏｓｅｎ−ｓｏｒｓ　１．８５゜ ３、　　　Ｃａ５ｓ、　　Ａ、Ｅ、Ｇ、、　　ロａｖｉｓ　　Ｇ、、　　Ｆｒａ ｎｃｉｓ、　　Ｇ、Ｉ）、、　　Ｈｉｌｌ、　　Ｈ，Ａ。

００．　Ａｓｈｔｏｎ、　Ｗ、Ｊ、、旧ｇｇｉｎｓ、　１．Ｊ、、　Ｐｌｏｔｋ ｉｎ、　Ｅ、Ｖ、、　５ｃｏｔｔ。

Ｌ、　Ｄ、Ｌ、およびＴｕｒｎｅｒ、　Ａ、Ｐ、Ｆ、　　（１９８４）、　Ａｎ ａｌ、　Ｃｈｅｍ、、　５６．６６７−７１゜ ４、　　Ｔｕｒｎｅｒ、　Ａ、Ｐ、Ｆ、、　Ｋａｒｕｂｅ、　１．およびＷｉｌ ｓｏｎ、　Ｇ、Ｓ。

（１９８７）　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ、　Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ　ａｎｄ　 Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　０ｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ 。

５、　　Ｋ１１ｂａｎｏｖ、　　（１９８６年６月）　Ｃｈｅｍｔｅｃｈ、　ｐ ３５４゜４７゜ ７、　　Ｋａｚａｎｄｉｊａｎ、　ＲｌＺ、およびＫ１１ｂａｎｏｖ、　Ａ、Ｍ 、　　（１９８５）　Ｊｏｕｒ−ｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、　１０７．５４４ｇ。

８、　　Ｍｕｒｒａｙ、　Ｒ６Ｗ、、　Ｅｗｉｎｇ、　Ａ、Ｇ、、およびＤｕｒ ｓｔ　Ｒ，Ａ、、　　（１９８７）浄書（内容に変更なし） ［ｐ−クレゾール］／ＰＭ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 平成２年５月　１’）日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １　特許出願の表示 ＰＣＴ／Ｃ；Ｂ８Ｂ１００９７０ ２　発明の名称 有機溶媒中での生体電気化学反応 ３　特許出願人 住　所　イギリス国、ベッドフォード　エムグー４３０ニーエル、クランフィー ルド（番地なし）名称　　クランフィールド　インステイテエートオブ　テクノ ロジー ４代理人 浄書（内容に変更なし） 請求の範囲 １、非水性または微水性溶媒中で使用される酵素電極であって、導体（５）、前 記導体（５）と合体した親水性支持体（４）および前記支持体（４）に保持され た酵素を含んで成り、前記溶媒中への前記電極の挿入により、前記溶媒が前記酵 素と接触しそして生体電気化学反応が前記溶媒中で行われ得るような配置である ことを特徴とする酵素電極。

２、前記酵素が、共通な親水性により前記支持体（４）に保持されており、共有 結合により保持されているのではない、請求項１に記載の酵素電極。

３、前記酵素が細胞全体、細胞膜または細胞小器官の成分として存在する、請求 項１または２に記載の酵素電極。

４、前記支持体（４）が、極性残基を含む高分子化合物の膜であるかまたは表面 に極性基を有する無機膜である、請求項２に記載の酵素電極。

５、前記膜がナイロン膜である、請求項４に記載の酵素電極。

６、前記固定化酵素がポリフェノールオキシダーゼである、請求項１に記載の酵 素電極。

７、非水性または微水性溶媒中で生体電気化学反応を行うための方法であって、 酵素基質の非水性または微水性溶液を前記酵素が保持された電極と接触せしめ、 その結果前記溶液が前記酵素と接触し、そして前記酵素の作用下で前記基質を反 応させることを特徴とする特許 ８、非水性または微水性溶媒中の分析物の測定方法であって、 前記分析物について分析しようとする非水性または微水性溶液を電気化学セル中 に入れ、ここで前記セルは、前記非水性または微水性溶液と接触するように酵素 が保持された電極を有し；そして 前記セルの電気的応答を測定し、前記応答は前記分析物の濃度に関係づけること ができる、 ことを含んで成る方法。

９、前記電極が請求項１の酵素電極である、請求項８に記載の方法。

１０、前記分析物が、前記酵素の基質もしくは補因子、前記酵素の基質もしくは 補因子に変換できる物質、前記電極の酵素との電子伝達を媒介することができる 酸化還元種、または前記電極の酵素との電子伝達を媒介することができる酸化還 元種に変換できる物質である、請求項８に記載の方法。

１１、前記分析物がフェノールであり、そして前記酵素がポリフェノールオキシ ダーゼである、請求項１０に記載の方法。

１２、前記溶媒が有機溶媒である、請求項７または請求項８に記載の方法。

１３、前記溶媒が実質上水と不混和である、請求項７または請求項８に記載の方 法。

１４、前記溶媒が炭化水素、有機ハロゲン化物、エーテル、エステルおよびそれ らの混合物から選択される、請求項１３に記載の方法。

特表平３−５０２２４０　（５） １５、前記溶媒が水で飽和される、請求項１３に記載の方法。

１６、酵素が保持された電極を含んで成りそして酵素と接触しそれにより非水性 または微水性溶媒中で生体電気化学反応を行うことができる前記溶媒を含有する 電気化学セル。

１７、前記電極が、導体（５）、前記導体（５）と合体された親水性支持体（４ ）および前記支持体（４）に保持された酵素を含んで成る酵素電極であって、前 記溶媒中への電極の挿入により、前記溶媒が酵素と接触しそして前記溶媒中で生 体電気化学反応を行うことができるような配置である、請求項１６に記載の電気 化学セル。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成２年５月　１Ｌｌ−日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 ｌ　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ８Ｂ１００９７０ ２　発明の名称 有Ｉｌ溶媒中での生体電気化学反応 ３　特許出願人 住　所　イギリス国、ベッドフォード　エムグー４３０ニーエル、クランフィー ルド（番地なし）名　称　クランフィールド　インスティテエートオプ　テクノ ロジー ４代理人 浄書（内容に変更なし） く低濃度の水が酵素の表面上に分布すべきであると考えられる。酵素の周りの水 分子の役割は十分に解明されてないが、酵素の構造の保持に水が必要なのであろ う。これは、生体電気化学反応を行う時に使用することができる非水性溶媒に幾 つかの制限を与える。該溶媒は、酵素から必要な水を取り去るほど極性であって はならない。通常、該溶媒は有機および疎水性溶媒であり、例えば炭化水素が特 に好ましい。より親水性であるがまだ水不混和性である他の有機溶媒、例えば有 機ハロゲン化物（その中でクロロホルムは好ましい例である）、エーテルおよび エステルを使用してもよいが、好ましくは水で飽和される。上記のいずれかの混 合物を使用してもよい。

酵素を溶解できる非水性溶媒は最も避けられる。

本発明の更なる観点は、上述の方法のいずれかを行うための電気化学セルであり 、該セルは酵素が保持された電極を含んで成り、そして非水性または微水性溶媒 を含有する。

手続補正書（方式） １．事件の表示 ＰＣＴ／ＧＢ８８１００９７０ ２、発明の名称 有機溶媒中での生体電気化学反応 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　クランフィールド　インスティテユートオブ　テクノロジー ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」 の欄 （２）明細書及び請求の範囲の翻訳文 （３）図面の翻訳文 （４）委任状 ７、補正の内容 （１）（４）　　別紙の通り （２）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） （３）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の５ 第１項の規定による書面　　　　　　１通（２）明細書及び請求の範囲の翻訳文 　　各１通（３）図面の翻訳文　　　　　　　　　　　１通（４）委任状及びそ の翻訳文　　　　　　各１通手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＧＢ８８１００９７０ ２゜発明の名称 有機溶媒中での生体電気化学反応 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　クランフィールド　インスティテユートオブ　テクノロジー ４、代理人 一住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１ｏ号６、補正の対象 特許法第１８４条の８の規定による補正書の翻訳文 ７、補正の内容 補正書の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 補正書の翻訳文の浄書　　　　　　　１通手続補正書（方式） 通 平成３年２月７１　日 特許庁長官　植　松　　　敏　殿 １、　事件の表示 ＰＣＴ／ＧＢ８Ｂ１００９７０ ２、発明の名称 有機溶媒中での生体電気化学反応 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　クランフィールド　インスティテユートオブ　テクノロジー ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号特表千３−５０２２４０　（ Ｂ） ６、補正の対象 特許法第１８４条の７第１項の規定による補正書の翻訳文 ７、補正の内容 補正書の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 補正書の翻訳文の浄書　　　　　　　１通国際調査報告 ｍ−ｍ５＋＋ａ１４＠６６ｄ１ｍｌｌｓ、　　　ＰＣＴ／ＧＢ　８８１００９７ ０国際調査報告 ＧＢ　８８００９７０ ＳＡ　　　　２５１６５

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．非水性または微水性溶媒中で使用される酵素電極であって、導体（５）、前 記導体（５）と合体した親水性支持体（４）および前記支持体（４）に保持され た酵素を含んで成る酵素電極。
2. ２．前記酵素が細胞全体、細胞膜または細胞小器官の成分として存在する、請求 項１に記載の酵素電極。
3. ３．前記支持体（４）が、極性残基を含む高分子化合物の膜であるかまたは表面 に極性基を有する無機膜である、請求項１または２に記載の酵素電極。
4. ４．前記膜がナイロン膜である、請求項３に記載の酵素電極。
5. ５．前記固定化酵素がポリフェノールオキシダーゼである、請求項１に記載の酵 素電極。
6. ６．非水性または微水性溶媒中で生体電気化学反応を行う方法であって、酵素基 質の非水性または微水性溶液を、前記酵素が保持された電極と接触せしめ、そし て前記酵素の作用下で前記基質を電極と反応させることを含んで成る方法。
7. ７．非水性または微水性溶媒中の分析物の測定方法であって、 前記分析物について分析しようとする非水性または微水性溶液を電気化学セル中 に入れ、ここで前記セルは酵素が保持された電極を有し；そして 前記セルの電気的応答を測定し、前記応答を前記分析物の濃度に関係づけること ができる； ことを含んで成る方法。
8. ８．前記電極が請求項１の酵素電極である、請求項７に記載の方法。
9. ９．前記分析物が、前記酵素の基質もしくは補因子、前記酵素の基質もしくは補 因子に変換できる物質、前記電極の酵素との電子伝達を媒介することができる酸 化還元種、または前記電極の酵素との電子伝達を媒介することができる酸化還元 種に変換できる物質である、請求項７に記載の方法。
10. １０．前記分析物がフェノールであり、そして前記酵素がポリフェノールオキシ ダーゼである、請求項９に記載の方法。
11. １１．前記溶媒が有機溶媒である、請求項６または請求項７に記載の方法。
12. １２．前記溶媒が水と実質上不混和である、請求項６または請求項７に記載の方 法。
13. １３．前記溶媒が炭化水素、有機ハロゲン化物、エーテル、エステルおよびそれ らの混合物から選択される、請求項６または請求項７に記載の方法。
14. １４．前記溶媒が水で飽和される、請求項６または請求項７のいずれか一項に記 載の方法。
15. １５．請求項６または請求項７のいずれか一項の方法を実施するための電気化学 セルであって、酵素が保持された電極を含んで成りそして非水性または微水性溶 媒を含有する電気化学セル。
16. １６．請求項１に記載の酵素電極を含んで成る電気化学セル。