JPH03501924A

JPH03501924A - ヒトインシュリン様成長因子２をコードする合成ｄｎａ配列

Info

Publication number: JPH03501924A
Application number: JP50816788A
Authority: JP
Inventors: エドワーズ，リチャード，マーク
Original assignee: ブリティッシュ　バイオテクノロジー　リミテッド
Priority date: 1987-10-08
Filing date: 1988-10-07
Publication date: 1991-05-09
Also published as: DK88190A; WO1989003423A1; GB8723660D0; EP0380550A1; DK88190D0; FI901764A0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトインシュリン様成長因子■をコードする合成りＮＡ配列本発明は、ＩＧＦ、ＩＩをコードする合成遺伝子に関する。

ヒト血清には、少なくとも２種類のインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、即ち、インシュリンで相同が限定されるためにのように称される、が含まれる。ＩＧＦまたはソマトメジンＣは、主に幼年時代および青春期を通して、成長ホルモンの成長効能を仲介するマイトジェンである。関連するタンパク質Ｉ　ＧＦ−ＩＩの役割は、ｉｎ　５ｉｔｕ　ノｚイブリッド形成法がＩＧＦ−ＩとＩ　ＧＦ−ＩＩｍＲＮＡの双方は間葉起源細胞中で主に産生されることを明らかにしたけれども、不明瞭である。このことは、双方のＩＧＦがそれ自体の標的範囲を打する各ＩＧＦによる発展を通してバラクリン作かつ、１９のアミノ酸シグナルペプチドおよび８９のアミノ酸Ｃ末端エクステンション・を含む先駆細胞由来である。

その上、成熟タンパク質において余分の３個のアミノ酸を有するＩＧＦ−ｎの変異型も記載されている。天然プレプロＩＧＦ−Ｈの構成は、第１図に示される。

ＩＧＦ−Ｉｆのアミノ酸配列は記載されている。（Ｒｉｎｄｃｒｋｎｅｅｈｔ　ａｎｄ　Ｉｌｕｇｏｂｅｌ、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、８９．２８３−２８６＜１９７８））。

酵母中のＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ｍをエンコードする天然配列を含むｃＤＮＡのクローニングおよび発現が、記載されている（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　ＷＯ−Ａ−８６００６１９）。Ｉ　ＧＦ−■変化型を含むＩＧＦ−ＩＩのｃＤＮＡクローニングおよび配列分析が記載されている（Ｊａｎｓｅｎ、　Ｍ、、　Ｖａｎ　５ｃｈａｉｋ、　Ｆ、Ｍ、Ａ、、　Ｖａｎ　Ｔｏｌ、　Ｈ，、Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒａｎｄｅ、　Ｊ、Ｌ、とＪ、Ｓ、　５ｕｓｓｅｎｂａｃｈ、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１７９．２４３−２４６＜１９８５））　Ｉ　Ｇ　Ｆ　−ＩＩの他の変異型の同定法も記載されている（Ｚｕｍｓｔｅｉｎ、　Ｐ、Ｐ、、　Ｌｕｔｈｔ、　ｃ、とＨｕｉｂｅｌ、　Ｒ，Ｐ、Ｎ、Ａ、８８２．３１６９−３１７２（１９８５））。

ヒトＩＧＦ−ＩＩの構造／機能関連の詳細な解明、発現ベクターへのその取り込みおよびＩＧＦ−ＩＩ機能を含有する新しい全く想像を超えるような（キメラ）タンパク質の産生を促進するために、ヒトＩＧＦ−ｎの改良新規合成遺伝子がめられている。

あるＤＮＡ配列の発現性を決定する因子についてはまだ充分にわかっていないので、改良ＩＧＦ−ＩＩ遺伝子設計を予測することは決して容易ではない。さらに、種々の応用における前記遺伝子の有用性は、コドン使用法および制限部位のようなものの考慮の影響を受ける。本発明は、公表された合成ＩＧＦ−ｎから区別される合成ＩＧＦ−ＩＩ遺伝子に関し、有用な制限部位が存在していることでこれは容易に修飾可能であるという利点を有している。

遺伝子を合成し横築する際において、遺伝子配列中に塩基８個以上の長さの逆方向反復塩基配列または直接反復塩基配列がある時間題が生じる。さらに、Ｇ／ＣまたはＡｌ１が多い領域またはポリプリン／ポリピリミジン系のような不均衡塩基組成領域は非効率的発現を導くことがわかっている。本発明は、こうした問題を克服するかまたは少なくとも緩和することを意図している。

本発明の第１の態様によれば、ＩＧＦ−ＩＩをコードし、かつ、下記酵素の制限部位を有するＤＮＡが提供される：５ｐｈｌ、Ｎ５ｉｌ、Ｎｄｅｌ、５ａｃｌ、ＰｓｔＩ。

ＢｓｔＥＩＩ、ＮｈｅＩ、ＸｂａＩ、ＰｖｕｌＩ。

ＦｓｐＩおよびＢａｍＨＩ。

本発明の第２の態様によれば、次配列を含むＤＮＡが提供される：ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＴＡＣＣＧＣＣＣＧ　ＡＧＣＧＡＧ　ＡＣＣＣＴＧ　ＴＧＣＧＧＴ　ＧＧＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＴＡ　ＧＡＣＡＣＴ　ＣＴＧＣＡＧ　ＴＴＣＧＴＴ　ＴＧＴ　ＧＧＴ　ＧＡＣＣＧＴ　ＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＣＴＣＧＴ　ＣＣＴ　ＧＣＴ　ＡＧＣＣＧＴ　ＧＴＡＴＣＴ　ＣＧＣＣＧＴ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＧＧＣＡＴＣＧＴＴ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＴＧＴ　ＧＡＴ　ＣＴＧＧＣＡ　ＣＴＧ　ＣＴＣＧＡＡ　ＡＣＴ　ＴＡＣＴＧＣＧＣＡ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＡＡＡＴＣＣＧＡＡ　ＴＡＡｏ上記で述べた合成ＩＧＦ−１１遺伝子はひんばんに有用な制限部位を取り込んでおり、選択領域のカセ・ノド突然変異を促進する。また好適な実施例には、遺伝子のあらゆる所望の発現システムへの取り込みを単純化するフランク（ｆｌａｎｋｌｎｇ）制限部位が含まれている。

コドン類はイー、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）に好適なものであるが、このＤＮＡが酵母および咄乳類細胞を念む他の有機体中における発現に適切であることが期待される。

本発明の第３の態様によれば、第１または第２の態様によりＤＮＡまたはその断片から成る遺伝的構築体が提供される。本断片は、少なくとも１０，２０．３０．４０また構築体は、プラスミド、コスミドまたはファージのようなベクターである。

本発明の第４の態様によれば、第１または第２の態様によるＤＮＡまたは第３の態様により遺伝的構築体を調製するプロセスが提供され、このプロセスは連続ヌクレオチドの結合および／または適当なオリゴマーの連結から成る。

本発明はまた、第１または第２の態様によるＤＮＡに対応するかまたはこのＤＮＡに相補的であるかのいずれかである他の核酸（ＲＮＡを含む）に関する。

本発明の好適な実施態様および実施例を次に述べる。以下の記載では、いくつかの図に対し説明が付されている。

第１図は、ＩＧＦ−ＩＩ　ｍＲＮＡＤ−ド領域山来ｃＤＮＡ配列を示している。

第２図は、天然ＩＧＦ−Ｕコード配列（２ａ）と本発明のＩＧＦ−ＩＩ合成遺伝子配列（２ｂ）との比較、有用な制限部位の概説を示している。

第３図は、オリゴヌクレオチドに分割した本発明の合成ＩＧＦ−Ｕ遺伝子の配列を示している。

第４図は、使用した組立て操作法をまとめて示したものである実施例遺伝子の構成所望の遺伝子配列は、第３図に示すように１０個のオリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴマー）に分割した。

この分割によって、オリゴマーの相補対をに一ルした後の５個の塩基接着端が付与された。このオリゴマーの末端は、組み立て段階におけるオリゴマーの不適切な連結可能性を最小とするように選択した。

オリゴマーは、自動固体ホスホルアミダイ）・（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｉｆｉｄｉｔｅ）化学で合成しまた。ブロックをはずし調節した多孔性ガラス支持体から除去後のオリゴマーを変性ポリアクリルアミドゲルで精製し、さらに、エタノール沈澱で精製、最終的に水に溶解後それらの濃度測定を行った。

５゛末端オリゴマーＢＢ５６およびＢＢ６５を除く全てのオリゴマーを次にキナーゼ処理し、連結段階で必要とされる５′−リン酸塩を給与した。相補オリゴマーを次にアニールし、５対のオリゴマーを第４図に示すようにＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。連結生成物は２％の低ゲル化温度（ＬＧＴ）ゲルで分離し、２１１／２１９　ｂｐ　ＩＧＦ−ｎ遺伝子複製に対応するバンドを切り取り、ゲルから抽出した。精製した断片を、５ｐｈＩ／Ｂａｍ　Ｈｌで切断したベクターＭ１３ｍｐ１８の複製型（ＲＦ’）ＤＮＡに連結した（Ｙａｎｉｓｅｈ　Ｐｅｒｒｏｎ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ、　３３１０＆−１１９（１プレートに接種した。組換えファージは、白色の産生プラークによって識別された。多くの白色プラークは選択され、配列分析用に一本鎖（ｓ　５）ＤＮＡを調製するために使用された。組換え体をジデオキシ配列分析すると、Ｍ　１３　ｍｐ１８の普遍的プライ−領域に相補的な１７塩基プライマーを用いて正確なりローンの識別が可能であった。

方法本遺伝子の製造に用いられた遺伝子操作の全ての技術は、遺伝子工学技術の当業者に周知である。当技術のほとんどの記載は、下記の実験マニュアルのひとつで見い出すことができる。モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ）、　Ｔ、　マニアチス（Ｍａｎｉａｔｌｓ、）　Ｅ、Ｆ、フリッブ（ｔｒｉｔｓｅｈ）およびＪ、サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）著、コールド・スプリング１１ハーバ−・ラボラトリ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｊｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｌ　ｏｒｙ）出版、ボックス１００．＝ユ　Ｅ３−夕、米国。

追加改変方法を下記に述べる。

１）オリゴヌクレオチド合成オリゴヌクレオチドは、シアノエチルホスホルアミタイドを用いる自動化ホスホルアミダイト化学によって合成した。この法は現在法（用いられており、記載されたきた（ビューケージ（１３ｃａｕｅａｇｃ）、Ｓ、Ｌ、およびカルーサーｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２４．２４５（１９８１））。

２）オリゴヌクレオチドの精製オリゴヌクレオチドは、濃縮ＮＨ３中でインキュベーションすることによって脱保護し、ＣＰＧ支持体から脱１１ｉＩＬ。

た。典型的には、１マイクロモルのオリゴヌクレオチドを有するＣＰＧ５０ｍｇは濃縮ＮＨ）（６００ｍｃｌ　）中で７０℃で５時＋１１インキユベーシヨンすることによって脱保護された。この上清を新しい試験管に移し、オリゴマーを３倍容量のエタノールで沈澱させた。遠心分離後、沈渣（ｐｃｌｌｅｔ）を乾燥し、水１ｍｌに再懸濁した。その後、粗オリゴマー濃度を２６０ｎｍの吸光度測定によってめた。

ゲル精製のため、この粗オリゴヌクレオチド〕０吸光度単位を乾燥させ、マーカー色素１５ｍｅｌ　（９０％脱イオンホルムアミド、１０ｒｒｘＭ）リス、１．０ｍＭホウ酸塩、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ブロモフェノールブルー）に再懸濁した。試料を９０℃で１分間加熱後、１．６ｍｍ幅のスロットを有し１．２ｍｍ厚の変性ポリアクリルアミドゲルにのせた。このゲルは、等量のＴＢＥ中で１５％アクリルアミド、０．６％ビスアクリルアミドおよび７Ｍ尿素のストックから調製し、０．１％過硫酸アンモニアムおよび０．０２５％ＴＥＭＥＤで高分子化した。ゲルを１時間にわたり予備展開した。試料は１５００Ｖで４−５時間展開した。

バンドはＵＶ照射によって視見化し、完全な長さの生成物に対応するバンドを切り取ってミクロ試験管に移した。オリゴマーは、ＡＧＥＢ　（０，５Ｍ酢酸アンモニウム、０゜０１Ｍ酢酸マグネシウムおよび０．１％５ＤＳ）に−晩浸漬してゲル切片から溶出させた。このＡＧＥＢバッファを次いで新しい試験管に移し、このオリゴマーを３倍容量のエタノールで一７０℃において１５分間沈澱させた。沈澱物は、エッペンドルフ試験管で１０分間遠心分離することによって採取し、沈渣（ｐｅｌｌｅｔ）を８０％エタノールで洗浄後、精製オリゴマーを乾燥し、水１ｍｌに再溶解後、最終的に０．４５ミクロンのミクロフィルターでろ過した。精製生成物の濃度は、２６０ｎｍにおける吸光度をめることによって測定した。

３）オリゴマーのキナーゼ処理オリゴマー２５０ｐｍｏ　ｌ　ｅを乾燥後、２０ｍｃｌのキナーゼバッフｙ（７０ｍＭトリス１）Ｈ７，６，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ　２．１．ｍ、Ｍ　ＡＴＰ、０．２ｍＭスペルミジン、０．５ｒｎＭジチオスレイトール）に再懸濁した。Ｔ４ボリヌクレオチドキナーゼ１０Ｕ（ユニット）を添加後、混合物を３７℃で３０分子。１インキユベートした。このキナーゼは、８５℃で１５分間加熱することによって不活性化した。

４）アニーリング各オリゴマー８ｍｃｌを混合し、９０℃に加熱後１時間にわたり室温までゆっ、くりと冷却した。

５）連結オリゴマーの各アニール対５ｍｃｊを混合後、１０倍容量のリガーゼバッファを添加して最終りガーゼ反応混合液を作成した（５０ｍＭ　）リスｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　．２０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ　ＡＴＰ）。反応液５０■ｃ１に対し１００Ｕの割合で’ｒ４ＤＮＡリガーゼを添加し、連結を１５℃で４時間行った。

６）アガロースゲル電気泳動連結生成物は、エチジウムプロミド０　、　５　ｍｃｇ／ｍｌ含有ＴＢＥバッフ γ（０，０９４Ｍ）リスｐＨ８，３，０，０８ル化温度アガロースゲルを用いて分離した。

７）連結生成物の単離所望のＩＧＦ−ＩＩ迫伝子連結生成物に対応するバンドは、長波長ＵＶ照射下でサイズマーカーを参照することによって同定した。バンドをゲルから切り取り下記の如くしてＤＮＡを抽出した。

重量からゲル切片の容積を推定し、その後６５℃で１０分間インキュベーションして溶解した。切片の容積を次にＴＥ（１０ｍＭトリスｐＨ３，ｏ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で４００ｍ１とし、酢酸ナトリウムを添加後置終濃度を０．３Ｍとした。酵Ｎ　ｔ　ＲＮＡ　１０ｍｃｇもまた担体として添加した。このＤＮＡを等量のＴＥ平衡フェノールで３回抽出した後、水で飽和したエーテルで３回抽出した。このＤＮＡを２倍容量のエタノールで沈澱させ、ミクロ分離管中で１０分間遠心分離後、沈渣を７０％エタノールで洗浄して最終的に乾燥した。このＤＮＡをＴＥ２０■Ｃ！に取り、その２ｍｃｉを２％アガロースゲル上で展開させて、ＤＮＡの回収を測定した。

８）断片のクローニングＭ１３ｍｐ１８　ＲＦ　ＤＮＡ（０，５＋ｅｇ）を、供給者の助言通りにｓｐｈ　ＩおよびＢａｍＨＩで切断して調製した。消化ＤＮＡを０．８％ＬＧＴゲル１ −に展開し、上述の如くベクターバンドを精製した。

切断ベクターＤＮＡ２０ｎｇを、上述の連結バッファを用いて、次に２から２０ｎＨの範囲の種々のペルオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡに４時間連結した。この連結生成物を用いて、既述の如くコンピテントＪＭ１０３を形質転換した。

組換えファージは、ＪＭ１０３０−ンでｌａｃ指示プレートに接種した際に白色プラークを生成するファージであると同定された。

９）単鎖ファージＤ　Ｎ　Ａの単離ｓｓ（単ｊｊ’１）ＤＮＡは、既知の方法を用いて白色プラークを生成するファージから調製した。

１０）ジデオキシ配列決定用いたプロトコールは、本質的に既述のものであった（ビギン（Ｂｉｇｇｉｎ）、Ｍ、Ｄ、、ギプソン（Ｇｉｂｓｏｎ）、　Ｔ、Ｊ。

ホンダ（Ｉｌｏｎｇ）、Ｇ、Ｆ、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　８０３９６３−３９６５（１９８３））。

１１）形質転換形質転換は、標準操作を用いて行なった。クローニングで受容体として用いた株 °は、ＪＭ１０３であった。

ＨＢＩＯＩのようなその他の標準的なりローニング受容体も全て適切である。

Ｔｘσπ！１ｒＩ：ｒｐ工ｒ　ＣＤＮＡ　、Ｉ＃Ｊ＋Ｊ＋）５ミＬ４１ｊｎＣツシ！＋　１７　！ノー１ｓｔ−ン（３−ム＾１１−）妄θｍ）＋−ｔ、Ｔ　博で＝−へ（＝ｈ、−，％ス１ツイス（Ｑｂｃ；−））１興ｊヒｔ’Ｒ％。

九】史１Ｌ工崎ｆＫり　スーム弓ンく多ｌシ（Ｚψ−４ム）ＪＦＣＩ櫂話】ち亀寥ｖしタシ４つ埴りｇｋ１呪１（−ｃ４＋Ｑｊヒ’、＝Ｊｂｒｅ−、ＩＱ４’ａ、＊＊Ｔｌｒｔ　２１　ｒ＝Ｊｆ４．、ＣｊＯｌｘｂＸ７ｎ；Ｍ＞ε耳Ｃ１ｒ１匡コロ２ａＡ　Ｔ　Ｐ’Ａ’ｌＣＳ　Ｅ α＝　“　− 乃０　２ｏ０ ’Ｅ’ＸＧ＝ε２ｂＴ工απの３Ｂ６２Ｅ６３Ｂ６５ ’；ｆＬＰｒＥｗ＊Ａ’Ｆイ？ｂｆｊｗと請求づ°て″Ｔニー代／（σ−卿ドｉ −ｔゴメ嘔ヂ配ジ「リフ”２＋。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成２年４月　９日特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１、事件の表示　ＰＣＴ／ＧＢ８８１００８３２２、発明の名称　ヒトインシュリン様成長因子■をコードする合成りＮＡ配列３、特許出願人住　所　イギリス国、オックスフォード　オーエックス４５エルワイ、コーレイ、ワトリングトン　ロード、プルツク　ハウス名　称　ブリティッシュ　バイオテクノロジー　リミテッド４、代理人住　所　東京都千代田区二番町１１番地９ダイアパレス二番町氏名（７２３４）弁理士　へ田幹雄１銘舌　０３−３２３０−４７６６番５、補正書の提出年耳日１９９０年１月２３日６、添付書類の目録（１）補正書の写しく翻訳文）請求の範囲１．１ＧＦ−ＩＩをコードし、下記酵素に対する制限部位を有する合成または組換えＤＮＡ：５ａｃｌ、Ｐｓｔｌ、ＢｓｔＥＩＩ、ＮｈｅＩ、Ｘｂａｌ。

Ｐｖｕｌｌ、およびＦｓｐｌｏ２、請求項第１頁に記載され、さらに下記酵素に対するフランク制限部位を有するＤＮＡ：Ｓｐｈ’Ｉ、　Ｎｓ　ｉ　Ｉ、　Ｎｄｅ　ＩおよびＢａｍＨＩ。

３、次の配列を含むＤＮＡ：ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＴＡＣＣＧＣＣＣＧ　ＡＧＣＧＡＧ　ＡＣＣＣＴＧ　ＴＧＣＧＧＴ　ＧＧＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＴＡ　ＧＡＣＡＣＴ　ＣＴＧＣＡＧ　ＴＴＣＧＴＴ　ＴＧＴ　ＧＧＴ　ＧＡＣＣＧＴ　ＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＣＴＣＧＴ　ＣＣＴ　ＧＣ，Ｔ　ＡＧＣＣＧＴ　ＧＴＡＴＣＴ　ＣＧＣＣＧＴ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＧＧＣＡＴＣＧＴＴ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＴＧＴ　ＧＡＴ　ＣＴＧＧＣＡ　ＣＴＧ　ＣＴＣＧＡＡ　ＡＣＴ　ＴＡＣＴＧＣＧＣＡ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＡＡＡＴＣＣＧＡＡ　ＴＡＡｏ４、請求項第１，２または３項に記載のＤＮＡまたは少なくとも１０個のヌクレオチドを含むその断片を含んでなる遺伝的構築物。

５、断片は少なくとも２０個のヌクレオチドを含む請求項第４項に記載の構築物。

６、断片は少なくとも３０個のヌクレオチドを含む請求項第４項に記載の構築物。

７、断片は少なくとも４０個のヌクレオチドを含む請求項第４項に記載の構築物。

８、断片は少なくとも５０個のヌクレオチドを含む請求項第４項に記載の構築物。

９、ベクターである請求項第４項に記載の構築物。

１０、連続ヌクレオチド類を結合させることおよび／または適当なオリゴマー類を連結さ会ることから成る請求項第１．２または３項に記載のＤＮＡまたは請求項第４項に記載の遺伝的構築体の調製方法。

１１、第２ｂ図を参照とし本文で実質的に記載のＤＮＡ０宝陥調査報告１４１Ｍ１１１１＋８−＾１１ｕｌｌｌｌｓ内Ｍ、ｐ（丁／ＧＢ　８８／Ｉ］０８３２国際調査報告　−ＰＣ丁／ＣＢ　８８１００８３２

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＩＧＦ−ＩＩをコードし、下記酵素に対する制限部位を有するＤＮＡ：ＳｐｈＩ，ＮｓｉＩ，ＮｄｅＩ，ＳａｃＩ，ＰｓｔＩ，ＢｓｔＥＩＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＰｖｕＩＩ，ＦｓｐＩおよびＢａｍＨＩ。
２．次の配列を含むＤＮＡ：【配列があります】
３．請求項第１項または第２項に記載のＤＮＡまたはその断片を含む遺伝的構築物。
４．断片は少なくとも１０個のヌクレオチドを含む請求項第３項に記載の構築物。
５．断片は少なくとも２０個のヌクレオチドを含む請求項第３項に記載の構築物。
６．断片は少なくとも３０個のヌクレオチドを含む請求項第３項に記載の構築物。
７．断片は少なくとも４０個のヌクレオチドを含む請求項第３項に記載の構築物。
８．断片は少なくとも５０個のヌクレオチドを含む請求項第３項に記載の構築物。
９．ベクターである請求項第３項に記載の構築物。
１０．連続ヌクレオチド類を結合させることおよび／または適当なオリゴマー類を連結させることから成る請求項第１または２項に記載のＤＮＡまたは請求項第３項に記載の遺伝的構築体の調製方法。
１１．第２ｂ図を参照とし本文で実質的に記載のＤＮＡ。