JPH0341097A

JPH0341097A - 補体系のｄ因子の調製方法

Info

Publication number: JPH0341097A
Application number: JP17679789A
Authority: JP
Inventors: Osamu Oda; 小田　治; Toshio Miyata; 敏男宮田
Original assignee: MEDEKUSU KK
Current assignee: MEDEKUSU KK
Priority date: 1989-07-07
Filing date: 1989-07-07
Publication date: 1991-02-21

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（技術分野）本発明は、補体系のＤ因子（Ｆａｃｔｏｒ　Ｄ）・の調
製方法に係り、特に補体系のプロテアーゼの一つである
、かかるＤ因子を、高収量で且つ容易に得ることの出来
る方法に関するものである。

（背景技術）補体系活性化因子の一つであるＤ因子（通常、葛と略称
される）は、Ｐ、１１゜リザブル（Ｌｅｓａｖｒｅ）　
＋ｅｔ　ａｌ　（ｒＪ、ｆｍｏ＋ｕｎｏｌｏｇｙＪ　１
２３．５２９　（１９７９）　）や＾、［！、デービス
（Ｄａｖｉｓ）、　ｅｔ　ａｌ　　（ｒＢｉｏｃｈｅｍ
、Ｊ、　Ｊ旦７．８６３　（１９８０）　）等によって
、既に、血漿中より採取され、アミノ酸配列（ｒＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ２３２４８２〜２４８６　（１９
８４）　）等が決定されている蛋白である。しかしなが
ら、かかるＤ因子は、血漿中において１〜２μｇ　／　
ｍ　１と低濃度であるため、般に、その採取は困難なも
のであった。また、正常人尿にもＤ因子が存在すること
は認められているものの、その濃度はｌｎｇ／ｍｊ！以
下と低く、列置、採取のための材料として用いられ得る
ものではなかったのである。

一方、ファンコニ症候群（Ｆａｎｃｏｎｉ’ｓ　ｓｙｎ
ｄｒｏｍｅ）の患者の尿中には、Ｄ因子が多量（１０μ
ｇ／ｍＩりに存在し、それより分離を行なうことが提案
されている（　’Ａｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ　１
６３．２４２−　（１９８７）〕が、かかるファンコニ
症候群は稀な疾患であるところから、一般に、袖体研究
者がＤ因子の採取材料としてファンコニ症候群患者の尿
を得るのは困難であり、やはり採取のための材料として
は不適当なものであった。

このようなことから、現在までのところ、補体系の他の
因子に比して、Ｄ因子に関する生理的な意義等の解明が
必ずしも明確にされているとは言えない状態であり、そ
れ故に、かかるＤ因子の多量調製技術並びにＤ因子の安
定供給が強く望まれているのである。

（解決課題）ここにおいて、本発明は、かかる事情を背景にして為さ
れたものであって、その課題とするところは、従来から
入手が困難であった補体系のＤ因子を高収量で且つ容易
に得る手法を、提供することにある。

（解決手段）そして、本発明は、かかる課題解決のために、腎不全患
者から排泄された尿を採取し、かかる尿から、目的とす
るＤ因子を分取することを特徴とする補体系のＤ因子の
調製方法を、その要旨とするものである。

また、かかる本発明方法にあっては、前記り因子の分取
に際して、有利には、採取された尿をノ悦塩処理した後
、イオン交換クロマトグラフィ及びゲルクロマトグラフ
ィにて分画して、Ｄ因子を取得する手法が採用されるこ
ととなる。

（作用）要するに、かかる本発明は、以下の如き知見に基づいて
充放されたものである。

すなわち、本発明者らは、先ず、多数の腎不全患者及び
他の疾患患者、健康な正常人の床をそれぞれ採取し、そ
れらを二次元電気泳動（蛋白質変性剤を用いない系、以
下同様）手法によって分析した結果、腎不全患者の尿中
に、等電点（ｐｌ）ニア、１〜７．２、アルブミンの移
動度を１．０とした時の移動度（Ｒｆ　）　　：　０．
５０〜０．５５を示すスポットが高レベルに見い出され
得、またそのレヘルがタレアチニンレベルと相関してい
ることを見い出し、そこでそのスポットを分離、精製し
て分析を試みた結果、かかるスポットが活性を有するＤ
因子であり、腎不全患者の尿、特に慢性腎不全患者の尿
が、Ｄ因子調製における良い材料になることを知見し、
本発明を充放するに至ったのである。

そして、そのようなり因子は、採取された尿を脱塩した
後、イオン交換クロマトグラフィ及びゲルクロマトグラ
フィ手法にて分画することによって、従来では列置考え
られ得なかった５　ｍ　ｇ　／　１或いはそれ以上の多
量の割合において得られたのである。

（具体的構成）ところで、かかる本発明に従う腎不全患者の尿を用いた
Ｄ因子の調製には、かかる尿中に存在するＤ因子を取り
出し得ることとなるならば、如何なる手法をも採用可能
であるが、本発明にあっては、以下に述べるようなりロ
マトグラフィ的手法によって、目的とするＤ因子を分取
する方法が、好適に採用されることとなる。

すなわち、そのようなりロマトグラフィ的手法において
は、先ず、腎不全患者、望ましくは慢性腎不全患者から
排泄される尿を集め、透析膜等を用いる通常の脱塩手法
によって脱塩処理を施し、かかる尿中に存在する各種塩
類が除去せしめられる。また、この脱塩処理された尿に
は、凍結乾燥等の濃縮操作が施され、取り扱うべき尿量
を低減して、後の分離操作の操作性が高められる。

次いで、この濃縮された尿に対して、Ｄ因子の分離を行
ない易くするために、例えばセファクリル（Ｓｅｐｈａ
ｃｒｙｌ　Ｓ−２００（スウェーデン：ファルマシア社
製）〕等の如きゲル濾過カラムを用いて、ゲルクロマト
グラフィを行ない、分子量が２３０００とされるＤ因子
を含んで、その近傍の領域の分子量のもの、例えば分子
量が１００００〜４００００の分画が回収されるのであ
る。

そして、このようにして回収された分画を用いて、ＤＥ
ＡＥ　・セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　・Ａ−
５０（スウェーデン：ファルマシア社製）等のような陰
イオン交換ゲルによるイオン交換クロマトグラフィを行
ない、例えば塩化ナトリウム濃度がＯＭより０．５Ｍと
変化するグラジエン目容離液により蛋白質を溶出せしめ
、二次元電気泳動によるＤ因子の移動度により、Ｄ因子
の溶出分画を回収する。更に、この回収された溶出分画
に対して、セファクリル・Ｓ−２００等のゲル濾過カラ
ムを用いて、ゲルクロマトグラフィを再び行ない、二次
元電気泳動によるＤ因子の移動度を指標として、Ｄ因子
の溶出分画を集めるのである。そして、その分画が、最
終的に精製されたＤ因子として得られることとなるので
ある。なお、必要ならば、かかるイオン交換クロマトグ
ラフィ及びゲル（濾過）クロマトグラフィを繰り返すこ
とにより、分離されるＤ因子の精製の度合を更に高める
ことが出来る。

このようにして得られたＤ因子は、例えばポリアクリル
アミド・ゲル等の電気泳動支持体を用いて、電気泳動し
、その後、コマジー・ブリリアント・ブルー（Ｃｏｍａ
ｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅ）等の蛋白質
染色剤によって染色、脱色した支持体を、デンシトメー
ター等によって測定した時、純度：９０％以上となるも
のであり、またモルモット赤血球を用いた溶血反応によ
る活性測定によっても、文献値に示される活性と略同等
の活性を示し、更に回収されたＤ因子は４〜１０　ｍ　
ｇ　／　ｌ・尿程度に達し、従来からの報告に比べて極
めて多量に得ることが出来るのである。なお、活性より
の回収率は約１５％程度である。

かくして、従来からのＤ因子の調製は、通常、ウサギ又
はモルモットの赤血球を用いた溶血反応による活性測定
系を利用して行なわれているが、上述のように、本発明
にあっては、二次元電気泳動によるＤ因子スポットの泳
動位置（ｐｉニア、１〜７．２．　　Ｒｆ　：　０．５
０−０．５５　（アルブミンのＲ「を１．０として）〕
を指標として、Ｄ因子を腎不全患者の尿より多量に分離
、精製することが出来ることとなったのである。

（実施例）以下に、本発明の代表的な実施例を示し、本発明を更に
具体的に明らかにすることとするが、本発明が、そのよ
うな実施例の記載によって、何等の制約をも受けるもの
でないことは、言うまでもないところである。

また、本発明には、以下の実施例の他にも、更には上記
の具体的記述以外にも、本発明の趣旨を逸脱しない限り
において、当業者の知識に基づいて種々なる変更、修正
、改良等を加え得るものであることが、理解されるべき
である。

先ず、二次元電気泳動においてｐ　Ｉ　：　７．１〜７
゜２、Ｒｆ＝０．５０〜０．５５（アルブミンのＲｆを
１．０として）を示すスポットを有する慢性腎不全患者
の尿を集め、直ちにセロファン膜（米国：ビスキング・
カンパニー製）により、透析脱塩した後、通常の凍結乾
燥手法により濃縮、保存することによって、尿約５１分
の乾燥物を集めた。

次いで、この得られた乾燥物を２０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ＝７．５）に溶解し、生じた沈澱を８０
００Ｇ、２０分の遠心分離操作により除去した。その後
、この遠心分離液に対して、予め０．３ＭＮａＣ１を含
む０．０２　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）で平衡化
したセファクリル・Ｓ−２００（カラムサイズ：　５．
　ＯｃｍφＸ５０ｃ＋ａ・ｆｆ１）を用いて、ゲルクロ
マトグラフィを行ない、分子量が１００００〜４０００
０の分画を集めて、二次元電気泳動によってスポットの
確認を行なった。回収量は６０ｍｆｆ、Ａｂ２８０で７
３５．５　ｍ　ｇであった。

その後、０．０２　Ｍリン酸緩衝液で平衡化したＤＥＡ
Ｅ・セファデックス・Ａ−５０（カラムサイズ：２．６
ｃｍφＸ５０ｃｍ−１）を用いて、上記で得た分子量１
００００〜４００００の分画物に対して、イオン交換ク
ロマトグラフィを行なった。溶離液として、濃度０．０
　Ｍより０．５　Ｍと変化するＮａ　Ｃ１，を含む０．
０２　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）を用いることに
よって、蛋白質を溶出せしめ、そして二次元電気泳動に
よりＤ因子を検出し、このＤ因子を含む分画を回収した
。回収量は５．０ｍｊ２．Ａｂ２８０で９３．６　ｍ　
ｇであった。

さらに、その後、かかるイオン交換クロマトグラフィに
て回収されたＤ因子を含む分画に対して、再び０．３Ｍ
ＮａＣ１を含むセファクリル・Ｓ−２００（カラムサイ
ズ：　２．６　ｃｍφＸ８８ｃｍ・ｆｆ）を用いてゲル
クロマトグラフィを行なった。そして、その分画を二次
元電気泳動で分析し、Ｄ因子に相当するスボｙトを含む
分画を回収し、最終的に精製り因子とした。このとき得
られたＤ因子は２２．０ｍｇであった。

このようにして分離、精製されたＤ因子を検体として、
以下の如くして二次元電気泳動を行なった。精製り因子
の１０　ｇｌ　（１，０ｍｇ／ｍｆｆ１）をアンフオラ
イン［Ａａｐｈｏｌｉｎｅ　　：スウェーデン、）７／
Ｌ／７シア社製、６．２５Ｖ／Ｖ％（（ＰＨ３，５〜５
）：　　（ｐＨ３，５〜１０）＝１４）］を含むポリア
クリルアミド・ゲル・カラム（０，３ｃｔａφ×６．０
ｃｍ−ｆ）上で、０．０１Ｍリン酸緩衝液と０．０４Ｎ
水酸化ナトリウム水溶液を用いて、最初は一定電流（２
ｍＡ）で電気泳動せしめ、電圧が２゜ＯＶに達した後、
２００Ｖの定電圧で３時間電気泳動を行なった。次いで
、この泳動ゲルを３％〜１７％の濃度勾配を持つポリア
クリルアミド・スラブ・ゲル上において一定電流（３０
ｍＡ）で約２．５時間電気泳動した。泳動液は、０．０
５　Ｍ　ｔｒｉｓ−０，３８４Ｍグルシン緩衝液を用い
た。

そして、かかる二次元電気泳動を行なった後、ゲルを０
．０２５％コマジー・ブリリアント・ブルー　（Ｃｏｍ
ａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅ　Ｒ２５０
，牛丼化学。

京都）、５０Ｖ／Ｖ％メタノール、７　Ｖ／Ｖ％酢酸で
１５時時間色し、１０　Ｖ　／　Ｖ　％酢酸、ＩＯＶ／
Ｖ％メタノール溶液で３日間、４回液を交換して脱色し
、観察した。その泳動像を第１図に示すこととする。

かくして得られた泳動像は、等電点（ｐｌ：蛋白の泳動
位置に相当するｐＨを、その蛋白の等電点とした）７．
１〜７．２、移動度（Ｒｆ：アルブ実ンの先端部の移動
度を１．０として）０．５０〜０．５５の範囲内に、単
一のスポットとして得られ、またそのスポットのＮ−末
端より２２番目までのアミノ酸配列を調べ、その結果を
以下に示すが、それは、文献によるＤ因子のアミノ酸配
列と略−敗することが認められたことにより、上記で分
離した蛋白質はＤ因子であることを確認した。

実測値：　ｒｌｅ−Ｌｅｕ−（Ｌ（）−Ａｒｇ−Ｇｌｕ
−Ａｌａ−ＧｌｕＡｌａ−（）−（）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
−（Ｌ（）−Ａｌａ（）−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａ
ｓｎ−Ｇｌｙ但し、（）は、不明部分である。

文献値：　１ｉｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−八ｒｇ−
Ｇｌｕ−＾１ａ−Ｇｌｕ−ＡｌａＨ４ｓ−Ａｌａ−Ａｒ
ｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−＾１ａ−５ｅｒＶａｌ−
Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙなお、参考までに、慢
性腎不全患者の尿及び健康な正常人の尿の、それぞれの
二次元電気泳動像を、第２図及び第３図に示すが、第２
図から明らかなように、慢性人手全患者の尿の二次元電
気泳動像ニハ、ｐ　ｌ　：　７．１〜７．２、Ｒｒ：０
．５０〜０．５５にＤ因子に相当する蛋白スボ・シトが
見い出される一方、健康な正常人尿の二次元電気泳動像
（第３図）では、同しような範囲にＤ因子と思われる明
確な蛋白スポットは見い出され得ないのである。

また、上記の如くして分離、精製して得られたＤ因子の
活性について、美白らの手法（ｒＢＩにＥＮＪＯＵＲＮ
ＡＬ　Ｊ　ＶＯｌ、１８．　Ｐ、１９３〜２０４　（１
９７５））に準じて、測定した。即ち、コブラベノム・
ファクターとＢ因子（ｆａｃｔｏｒ　Ｂ）を混合した後
、モルモット赤血球を加え、その後、Ｄ因子及びヒト血
清を加えて、瀉血反応を観察した。その結果、約半数の
赤血球が溶血するのに必要なり因子は２０ｎｇＴ：あり
、文献値と略一致した。このことから、慢性腎不全患者
の尿より分離、精製したＤ因子は、正常ヒト血漿中のＤ
因子と略同程度の活性を有することをｌｉＩ認した。

（発明の効果）以上の説明から明らかなように、本発明は、腎不全患者
から排泄された尿を用い、それより目的とするＤ因子を
分取するものであるところから、稀な病気でない腎不全
の患者からの尿は手に入れ易く、またＤ因子の濃度も５
〜１０μｇ　／　ｍ　Ｅと、ファンコニ症候群と比して
も問題なく、高収量にて且つ容易にＤ因子を得ることが
出来ることとなったのであり、これによってＤ因子の研
究が更に展開され得て、その診断薬としての使用、更に
は医薬としての使用が拓けたのである。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図及び第３図は、それぞれ、実施例におい
て分離、精製した蛋白質成分（Ｄ因子）、慢性腎不全患
者の尿及び健康な正常人の尿の二次元電気泳動像を示す
図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）腎不全患者から排泄された尿を採取し、かかる尿
から、目的とするＤ因子を分取することを特徴とする補
体系のＤ因子の調製方法。
（２）前記採取された尿を脱塩処理した後、イオン交換
クロマトグラフィ及びゲルクロマトグラフィにて分画し
て、前記Ｄ因子を取得することを特徴とする請求項（１
）記載の調製方法。