【発明の詳細な説明】
本発明は組織プラスミノーゲンアクチベーター
（以下「TPA」と称する）の製造法に関する。更
に詳細には、アルブミンを添加することによつて
TPAの安定化をはかり、TPAを有利に製造する
方法を提供するものである。
従来、プラスミノーゲンアクチベーターとして
は、人尿又は腎臓細胞の組織培養液より抽出精製
したウロキナーゼが使用されている。しかし、ウ
ロキナーゼは、そのプラスミノーゲンアクチベー
ター活用によつて血栓溶解作用を示す以外に、血
中のフイブリノーゲン、α2−プラスミンインヒビ
ター、プラスミノーゲンを低下させるために、こ
れを血中に投与すると、出血や過耐性
（tachyphylaxis）を起す欠点がある。
近年、ウロキナーゼの斯る欠点を有さないプラ
スミノーゲンアクチベーターとして、人又は動物
の臓器、血管壁、体液、更にこれら細胞又は癌細
胞の組織培養液中に存在するTPAが見出され、
これの医薬品としての開発が期待されている。
TPAは免疫学的活性及びフイブリンに対する
親和性の点でウロキナーゼと相違している。そし
て、TPAはウロキナーゼに対する抗体とは反応
せず、フイブリンと強固に結合し、また血中にお
いてフイブリンの存在下でアクチベーターとして
の強い活性を発現するものである。従つて、
TPAはウロキナーゼと異なり、上述の如き副作
用がなく、少量で充分な血栓溶解活性を有する、
ウロキナーゼに代わる医薬品としての期待が大き
いものである。
現在、TPAは人又は動物の細胞等から分離す
る方法によつて製造されており、その分離精製法
としては、塩析、イオン交換、ゲル過、疎水性
クロマト、アフイニテイクロマト等による方法が
報告されている。就中、アフイニテイクロマト法
が優れており、このリガンドとしては、フイブリ
ン〔Biochimica Biophysica Acta.621、241
（1980）〕、アルギニン〔Throbosis
Haemostasis、42、414（1979）〕あるいはリジン
〔Arch.Biochem.and Biophys.、189、185
（1978）〕等が使用されている。
しかしながら、TPAは精製が進むにつれて活
性が低下し、高度に精製されたものの活性低下は
特に著しい。従つて、これを防止するための安定
化剤の研究が行われており、アルギン〔J.B.C.
254、1998（1979）〕、ゼラチン〔Biochemistry、
８、79（1969）〕あるいはフイブリン〔Thrombas
Haemostas、45、43、（1981）〕等が報告されて
いる。
しかし、アルギニン及びゼラチンはその効果が
不充分であり、またフイブリンは安定化効果は優
れているが、医薬品に添加できないという理由
で、何れも実用に供されていない。
斯かる実情において、本発明者は、TPAを安
定に保持する方法について鋭意研究を行つた。す
なわち、TPAは高純度では不安定であるが、純
度の低い粗酵素液中では安定である。ことに着目
し、血管潅流液より分離したTPA含有粗酵素液
中でTPAの安定化に寄与している粉質を検討し
た結果、これが血清アルブミンであることを見出
した。そして、更にアルブミンのTPAに対する
安定化効果について検討を行つたところ、これの
当該効果はフイブリンのそれと同程度であり、従
来ウロキナーゼの優れた安定化剤として知られて
いるゼラチン、プロタミン硫酸に比較し100倍以
上であることを見出し、本発明を完成した。
従つて、本発明は、TPAの精製工程又は粉末
化工程の任意の段階においてアルブミンを添加す
るTPAの製造方法を提供するものである。
本発明において安定化剤として使用されるアル
ブミンとしては種々のものが用いられるが、人血
清あるいは胎盤由来のアルブミンが特に好まし
い。
本発明は種々の原料から調製される粗酵素液か
らTPAを分離精製する何れの方法にも適用する
ことができる。一般に分離精製には上記手段及び
透析、限外過等の操作を単独あるいは組合せて
使用されるが、特にアフイニテイクロマト法が好
ましい。アルブミンの添加は当該粗酵素液は勿
論、何れの段階で行つてもよい。
また、TPAの由来が正常細胞及び癌細胞の組
織培養液、ブタ等の臓器抽出液等である場合に
は、脱ウイルス処理のために60℃で約10時間加熱
する必要があるが、これによつてTPAが失活さ
れるので、この処理前にアルブミンを添加するの
が好ましく、アルブミンを添加するとこの処理に
よつてもTPA活性は殆んど損われない。
以上のような精製工程で添加されるアルブミン
の量は、その処理によつても異なるが、一般には
粗酵素液を基準として、その0.001〜10％（ｗ／
ｖ）の範囲が好ましい。
斯くして分離精製されたTPAは凍結乾燥、噴
霧乾燥等によつて粉末化して製品とされるが、こ
の工程においてもTPAは失活する。この場合に
おいても、アルブミンを添加しておくと当該活性
の低下は殆んどみられない。この場合のアルブミ
ンの添加量は、最終製品へ混入を考慮して選択さ
れるが、通常0.003〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
なお精製工程において添加したアルブミンが過
剰に製品中に混入するような場合には、公知の方
法によつて除去して至適濃度に調整した後粉末化
する。
更にまた、高純度に精製されたTPAは長期間
保存するとその活性が低下する。しかし、これに
アルブミンを添加配合しておくと活性の低下は殆
んどみられない。この場合のアルブミンの量は
0.003〜１％（ｗ／ｖ）で充分であり、これは、
上記精製工程又は粉末化工程で添加する量により
調節される。
叙上の如くして得られたTPAとアルブミンを
含有する組成物は、他の安定化剤を添加したもの
に比較し極めて安定であり、アルブミンの添加量
も極めて少ないので医薬品として特に優れたもの
である。
次に実施例を挙げて説明する。
実施例 １
TPAの安定性試験
(i) 溶液中の安定性
TPAの生理食塩水溶液（60U／ml）に第１
表の安定化剤を添加し、室温にて１日又は２日
放置した後、TPAの残存活性を測定した。尚
力価測定は次の方法で行つた（以下の実験につ
いても同じ）。
75％凝固フイブリノーゲン（Miles社製：プ
ラスミノーゲン含量約140カゼイン単位／ｇ凝
固蛋白）を原料として、作製した寒天加フイブ
リン平面を用い、ウロキナーゼを標準品とする
プレート法で測定した。組織アクチベーター溶
液を１％ゼラチン、0.1M塩化ナトリウム及び
0.1％窒化ナトリウムを含む0.067Mトリス塩酸
緩衝液（PH8.0）で希釈し、フイブリン平板上
で1.5IU／mlのウロキナーゼと同じ溶解窓を示
す組織アクチベーター溶液の濃度を1.5U／ml
とした。
その結果を第１表に示す。
【表】
(ii) 凍結乾燥時の安定性
TPAの生理食塩水溶液（60U／ml）に第２
表の安定化剤を添加し、PHを7.0に調整する。
これを−40〜−50℃で３時間予備凍結し、−40
〜＋30℃、真空度0.4×10-3〜0.6×10-3mmHgで
20時間一次乾燥し、次いで30℃、真空度0.1×
10-3〜0.2×10-3mmHgで３時間二次乾燥する。
得られた粉末の残存活性により安定化作用を比
較した。
結果を第２表に示す。
【表】
【表】
(iii) 脱ウイルス処理時の安定性
TPAの生理食塩水溶液（60U／ml）に第３
表の安定化剤を添加し、PHを7.0に調整する。
これをを60℃で10時間加熱処理し、残存活性を
測定し安定化作用を比較した。
結果を第３表に示す。
【表】
実施例 ２
ブタの耳をタイロイド液で潅流し、アセチルコ
リン（約1μｇ）を間欠的に加えて、血管壁アク
チベーターを遊離させる。潅流液はフラクシヨン
コレクーターで分画し、線溶活性の高い画分を集
める。ブタの耳１個当り500ml程度の溶液が得ら
れる。
ブタの耳100個（平均400ｇ／個）を潅流して、
約50（3U／ml）溶液を得、これに硫酸アンモ
ニウムを300ｇ／の割合で加え、PHを7.0に調整
して、一晩放置する。生じた沈澱をセライトで
過した後、セライトごとカラム（４×25cm）に充
填する。2M硫酸アンモニウム、1M塩化ナトリウ
ムを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）でカラム
で洗浄した後、同緩衝液から1M塩化ナトリウム
を含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）までの濃度
勾配でアクチベーターを溶出させる。得られた溶
出液は液量２、活性50U／ml、比較性125U／
A280であつた。この液をオクチルセフアロース
のカラム（2.5×10cm）に吸着させた後、エチレ
ングリコールを50％程度まで濃度勾配法で増加さ
せ、アクチベーターを溶出する。溶出液は液量３
、活性25U／ml、比活性900U／A280であつた。
得られた溶液１を用い、これにヒト血清アル
ブミンを100μｇ／ml（0.01％）の割合で加え、フ
イブリンセフアロースカラム（２×20cm）に吸着
させた後、1M塩化ナトリウム溶液で充分洗浄し、
0.01％ヒト血清アルブミン、0.5Mアルギニンを
含む0.005Mリン酸緩衝液（PH7.2）で溶出した。
この溶量は液量230ml、活性110IU／mlであつた。
これをダイアフイルターＡ−15Tで濃縮後、
1.5M塩化ナトリウム、0.01MEDTA、0.01％ヒト
血清アルブミンを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH
7.0）で平衡化したセフアデツクスＧ−150のカラ
ム（３×100cm）でゲル過して得られるアクチ
ベーター活性画分を集め生理食塩液に対して透析
した。この溶液は溶量70ml、活性300IU／mlであ
つた。尚、添加したアルブミンを除いた時の比活
性は17000U／A280（収率42％）であつた。
同様に、溶液１を用いアルブミン無添加で処
理した場合には、液量130ml、活性80U／ml、比
活性12000U／A280（収率21％）であつた。
実施例 ３
ブタ心臓５Kgを肉挽器でミンチにし、アセトン
（−20℃）を２／Kgの割合で加え、ブレンダー
で攪拌した後、過をする。この脱脂操作を数回
繰り返してアセトン処理粉末700ｇを得る。この
粉末100ｇ当り800mlの0.3M酢酸カリウム溶液
（PH4.2）を加え、ブレンダーで攪拌後４℃下で３
時間組織アクチベーターを抽出する。この抽出液
を遠心分離で集め、残渣には0.3M酢酸カリウム
溶液（PH4.2）400ml／100ｇを加えて再抽出する。
これらの抽出液に硫酸アンモニウムを300ｇ／
の割合で加えた後、PHを7.0に調整し、４℃下で
一晩放置する。生じた沈澱を遠心して集め、
0.3M酢酸カリウム溶液（PH4.2）に溶解した後、
PHを7.0に調整し、粗酵素液を得る。この液は液
量２、活性300U／mlであつた。これを実施例
２に従つてアルブミンを添加し、フイブリンセフ
アロースのアフイニテイーカラムクロマトグラフ
イーで精製し0.9％塩化ナトリウムを含む0.001N
塩酸溶液で透析した後、水酸化ナトリウム水溶液
で中和し、液量１、活性350U／ml、比較性
8000U／A280の溶液を得た。
実施例 ４
血圧計を用いた血管圧迫処置直後の健康人ボラ
ンテイアから、抗凝固剤としてクエン酸ナトリウ
ム溶液を用いて採血し、直ちに3000rpm、10分間
遠心して、血漿を合計１調整した。この血漿に
ベンツアミジン及びEDTAを各々５ｍＭとなる
よう加えた後、３回に分けてリジンセフアロース
カラム（３×25cm）に吸着させる。カラム0.6M
塩化ナトリウムを含む0.005Mリン酸緩衝液（PH
7.4）で充分洗浄後、1.5M塩化ナトリウムを含む
0.005Mリン酸緩衝液（PH7.4）で溶出する。これ
らの溶出液を水で３倍に希釈して実施例２に従つ
てアルブミンを添加し、フイブリンセフアロース
のアフイニテイーカラムクロマトグラフイーで精
製した後、限外過で濃縮する。この溶液は液量
４ml、活性30U／ml、比活性3000U／A280であつ
た。
実施例 ５
人腫瘍細胞より分離した細胞を、ペニシリン−
G100U／ml及びストレプトマイシン100γ／mlを
添加したDME培地に、更にFCSを20％添加した
培地で十分発育させた後、培養液をFCS無添加の
培地で更に37℃で30時間培養した。この時の組織
アクチベーター活性は、約10U／mlであつた。得
られた培養液１を5000rpmで20分間遠心分離し
て得られる上清を用い、以下実施例２と同様に処
理して、液量80ml、活性50U／mlの組織アクチベ
ーターを得た。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing tissue plasminogen activator (hereinafter referred to as "TPA"). More specifically, by adding albumin
The present invention aims to stabilize TPA and provide a method for producing TPA advantageously. Conventionally, urokinase extracted and purified from human urine or tissue culture fluid of kidney cells has been used as a plasminogen activator. However, urokinase not only exhibits a thrombolytic effect by utilizing its plasminogen activator, but also has the ability to reduce fibrinogen, α 2 -plasmin inhibitor, and plasminogen in the blood when administered into the blood. However, it has the disadvantage of causing bleeding and hypertolerance (tachyphylaxis). In recent years, TPA, which is present in human or animal organs, blood vessel walls, body fluids, and tissue culture fluids of these cells or cancer cells, has been discovered as a plasminogen activator that does not have the drawbacks of urokinase.
It is hoped that this will be developed as a drug. TPA differs from urokinase in its immunological activity and affinity for fibrin. TPA does not react with antibodies against urokinase, binds tightly to fibrin, and exhibits strong activator activity in the presence of fibrin in the blood. Therefore,
Unlike urokinase, TPA does not have the above-mentioned side effects and has sufficient thrombolytic activity in small amounts.
It has high expectations as a drug that can replace urokinase. Currently, TPA is produced by separating it from human or animal cells, etc., and the separation and purification methods include salting out, ion exchange, gel filtration, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, etc. It has been reported. Among these, the affinity chromatography method is excellent, and the ligand used for this method is fibrin [Biochimica Biophysica Acta. 621 , 241
(1980)], Arginine [Throbosis
Haemostasis, 42 , 414 (1979)] or lysine [Arch.Biochem.and Biophys., 189 , 185
(1978)] etc. are used. However, the activity of TPA decreases as it is purified, and the decrease in activity of highly purified TPA is particularly significant. Therefore, research is being conducted on stabilizers to prevent this, and algin [JBC
254, 1998 (1979)], gelatin [Biochemistry,
8, 79 (1969)] or fibrin [Thrombas
Haemostas, 45 , 43, (1981)] etc. have been reported. However, arginine and gelatin have insufficient effects, and although fibrin has an excellent stabilizing effect, neither of them has been put to practical use because they cannot be added to pharmaceuticals. Under these circumstances, the present inventor conducted extensive research on a method for stably retaining TPA. That is, TPA is unstable at high purity, but stable in crude enzyme solution with low purity. Focusing on this, we investigated the powder that contributed to the stabilization of TPA in TPA-containing crude enzyme solution separated from vascular perfusate and found that it was serum albumin. Furthermore, we investigated the stabilizing effect of albumin on TPA and found that its effect was on the same level as that of fibrin, and compared to gelatin and protamine sulfate, which are conventionally known as excellent stabilizers for urokinase. They found that it is more than 100 times as large, and completed the present invention. Therefore, the present invention provides a method for producing TPA in which albumin is added at any stage of the TPA purification process or powdering process. Various types of albumin can be used as the stabilizer in the present invention, but albumin derived from human serum or placenta is particularly preferred. The present invention can be applied to any method for separating and purifying TPA from crude enzyme solutions prepared from various raw materials. Generally, the above-mentioned means and operations such as dialysis and ultrafiltration are used alone or in combination for separation and purification, and Affinity chromatography is particularly preferred. Albumin may be added not only to the crude enzyme solution but also at any stage. In addition, if TPA is derived from tissue culture fluids of normal cells and cancer cells, or extracts from organs such as pigs, it is necessary to heat it at 60°C for about 10 hours to remove viruses. Since TPA is thus deactivated, it is preferable to add albumin before this treatment, and when albumin is added, TPA activity is hardly impaired even by this treatment. The amount of albumin added in the above purification process varies depending on the process, but is generally 0.001 to 10% (w/w) of the crude enzyme solution.
The range of v) is preferred. The thus separated and purified TPA is powdered into a product by freeze-drying, spray-drying, etc., but TPA is also deactivated during this process. Even in this case, when albumin is added, there is almost no decrease in the activity. The amount of albumin added in this case is selected in consideration of contamination with the final product, but is usually preferably 0.003 to 5% (w/v). If albumin added in the purification process is mixed into the product in excess, it is removed by a known method and adjusted to an optimum concentration, followed by powdering. Furthermore, the activity of highly purified TPA decreases when stored for a long period of time. However, when albumin is added and blended, there is almost no decrease in activity. In this case, the amount of albumin is
0.003-1% (w/v) is sufficient, which is
It is adjusted by the amount added in the purification step or powdering step. The composition containing TPA and albumin obtained as described above is extremely stable compared to those containing other stabilizers, and the amount of albumin added is extremely small, making it particularly excellent as a pharmaceutical product. It is. Next, an example will be given and explained. Example 1 Stability test of TPA (i) Stability in solution
After adding the stabilizer shown in the table and leaving it for 1 or 2 days at room temperature, the residual activity of TPA was measured. The titer was measured by the following method (the same applies to the following experiments). Using agar-added fibrin plane prepared from 75% coagulated fibrinogen (manufactured by Miles; plasminogen content: approximately 140 casein units/g coagulated protein) as a raw material, measurement was performed by a plate method using urokinase as a standard product. Tissue activator solution was mixed with 1% gelatin, 0.1M sodium chloride and
Dilute in 0.067 M Tris-HCl buffer (PH 8.0) containing 0.1% sodium nitride to give a concentration of 1.5 U/ml of tissue activator solution that shows the same lysis window as 1.5 IU/ml urokinase on fibrin plates.
And so. The results are shown in Table 1. [Table] (ii) Stability during freeze-drying A second solution of TPA in physiological saline (60U/ml)
Add the stabilizer listed in the table and adjust the pH to 7.0.
Pre-freeze this at -40 to -50℃ for 3 hours,
~+30℃, degree of vacuum 0.4×10 -3 ~0.6×10 -3 mmHg
Primary drying for 20 hours, then 30℃, vacuum degree 0.1×
Secondary drying is performed at 10 -3 to 0.2×10 -3 mmHg for 3 hours.
The stabilizing effects of the obtained powders were compared based on the residual activity. The results are shown in Table 2. [Table] [Table] (iii) Stability during virus removal treatment TPA in physiological saline solution (60U/ml)
Add the stabilizer listed in the table and adjust the pH to 7.0.
This was heat treated at 60°C for 10 hours, residual activity was measured, and stabilizing effects were compared. The results are shown in Table 3. [Table] Example 2 Pig ears are perfused with Tyroid solution, and acetylcholine (approximately 1 μg) is intermittently added to release vascular wall activators. The perfusate is fractionated using a fraction collector, and the fraction with high fibrinolytic activity is collected. Approximately 500 ml of solution is obtained per pig ear. 100 pig ears (average 400g/piece) were perfused,
About 50 (3 U/ml) solution is obtained, ammonium sulfate is added to this at a ratio of 300 g/ml, the pH is adjusted to 7.0, and the solution is left overnight. The resulting precipitate was filtered through Celite, and then packed together with Celite into a column (4 x 25 cm). After washing the column with 0.01M phosphate buffer (PH7.2) containing 2M ammonium sulfate and 1M sodium chloride, a concentration gradient from the same buffer to 0.01M phosphate buffer (PH7.2) containing 1M sodium chloride Elute the activator with The obtained eluate had a volume of 2, an activity of 50 U/ml, and a comparative value of 125 U/ml.
It was A280. After adsorbing this solution on an octyl-sepharose column (2.5 x 10 cm), increase the concentration of ethylene glycol to about 50% using a concentration gradient method to elute the activator. Eluate volume is 3
, activity was 25 U/ml, and specific activity was 900 U/A280. Using the obtained solution 1, add human serum albumin at a rate of 100 μg/ml (0.01%), adsorb it on a fibrin sepharose column (2 x 20 cm), and wash thoroughly with 1M sodium chloride solution.
Elution was performed with 0.005M phosphate buffer (PH7.2) containing 0.01% human serum albumin and 0.5M arginine.
The volume of this solution was 230 ml, and the activity was 110 IU/ml.
After concentrating this with Diafilter A-15T,
0.01M phosphate buffer (PH
The activator active fraction obtained by gel filtration with a Sephadex G-150 column (3 x 100 cm) equilibrated with 7.0) was collected and dialyzed against physiological saline. This solution had a volume of 70 ml and an activity of 300 IU/ml. The specific activity when the added albumin was excluded was 17000 U/A280 (yield 42%). Similarly, when solution 1 was used and treated without adding albumin, the liquid volume was 130 ml, the activity was 80 U/ml, and the specific activity was 12000 U/A280 (yield 21%). Example 3 5 kg of pig heart was minced in a meat grinder, acetone (-20°C) was added at a ratio of 2/Kg, stirred in a blender, and filtered. This degreasing operation is repeated several times to obtain 700 g of acetone-treated powder. Add 800ml of 0.3M potassium acetate solution (PH4.2) per 100g of this powder, stir with a blender, and then heat at 4°C for 30 minutes.
Extract time tissue activators. The extract is collected by centrifugation, and the residue is re-extracted by adding 400 ml/100 g of 0.3M potassium acetate solution (PH4.2).
Add 300g/ammonium sulfate to these extracts.
After adding at a ratio of , adjust the pH to 7.0 and leave it at 4°C overnight. The resulting precipitate is collected by centrifugation,
After dissolving in 0.3M potassium acetate solution (PH4.2),
Adjust the pH to 7.0 and obtain a crude enzyme solution. This solution had a volume of 2 and an activity of 300 U/ml. Albumin was added to this according to Example 2, and the product was purified by affinity column chromatography using fibrin sepharose.
After dialysis with hydrochloric acid solution, neutralized with sodium hydroxide aqueous solution, liquid volume 1, activity 350U/ml, comparative
A solution of 8000U/A280 was obtained. Example 4 Blood was collected from a healthy volunteer immediately after blood vessel compression treatment using a sphygmomanometer using sodium citrate solution as an anticoagulant, and immediately centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to prepare a total of plasma samples. Benzamidine and EDTA were added to the plasma to a concentration of 5 mM each, and the mixture was adsorbed onto a lysine sepharose column (3 x 25 cm) in three portions. Column 0.6M
0.005M phosphate buffer containing sodium chloride (PH
After thorough washing with 7.4), containing 1.5M sodium chloride.
Elute with 0.005M phosphate buffer (PH7.4). These eluates are diluted three times with water, albumin is added according to Example 2, purified by fibrin sepharose affinity column chromatography, and then concentrated by ultrafiltration. This solution had a liquid volume of 4 ml, an activity of 30 U/ml, and a specific activity of 3000 U/A280. Example 5 Cells isolated from human tumor cells were treated with penicillin-
After sufficient growth in a DME medium supplemented with G100U/ml and streptomycin 100γ/ml and a medium supplemented with 20% FCS, the culture was further cultured at 37°C for 30 hours in a medium without FCS. The tissue activator activity at this time was approximately 10 U/ml. The obtained culture solution 1 was centrifuged at 5000 rpm for 20 minutes, and the resulting supernatant was treated in the same manner as in Example 2 to obtain a tissue activator with a volume of 80 ml and an activity of 50 U/ml.