【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
【産業上の利用分野】[Industrial application field]
本発明は主に動物胚（受精卵）の凍結保存および移植に
便利な胚の凍結保存方法に関するものである。The present invention mainly relates to an embryo cryopreservation method convenient for cryopreservation and transplantation of animal embryos (fertilized eggs).
【従来の技術］
動物胚を凍結保存する場合、氷晶化による物理的傷害を
軽減するため、植木という操作が必要とされている。現
在市販されている胚凍結機のうち、自動植木装置が装備
されているものもあるが、高価である。近年、植木装置
を持たない胚凍結機が市販され、安価なことから普及が
進んでいる。しかし、この機種の場合、植木を人為的に
行なう必要がある。現在、−船釣に行なわれている植木
方法は、液体窒素等で冷却したピンセット等で凍結保存
容器の一部を挾む方法や、氷晶誘起剤であるヨウ化銀の
水溶液やヨウ化銀をアルギン酸ナトリウムでコーティン
グしドロプレット化したもので行なう方法がある（特開
平１−１０７７５５号、特公昭６２−９３４２号）。
【発明が解決しようとする課題）
しかし、従来の植木方法には次のような不合理な点がみ
られる。
ｌ 液体窒素等で冷却したピンセット等による場合
１）人為的に植氷操作を行なうため、植木に労力と時間
がかかる。
２）冷却槽から凍結保存容器の一部をｎ呂させ、その部
分に植木するため、容器の温度が上昇し植木が不確実と
なりやすい。
３）ストロ−を保存容器として用いる場合、密封するだ
めに熱シールするか、あるいはポリビニルアルコール粉
末等の充填による封入を行なう必要がある。
■ ヨウ化銀の水溶液やドロプレットによる場合１）ヨ
ウ化銀は家畜等の動物には有害であり受胚動物への影響
が考えられ、除去する必要があるため、ストロ−から胚
を取り出すことなく直接、受胚動物に移植する１段階希
釈や無希釈移植が不可能である。
２）ヨウ化銀水溶液を用いる場合には、凍結中に凍結保
存容器内で保存液と混ざりあって保存液の浸透圧が変化
し、胚に悪影響を及ぼす危険性がある。
３）ストロ−を保存容器とする場合、１）の方法と同様
にシーリング又はポリビニルアルコール粉末等による封
入をする必要がある。
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記の各課題を解決するために開発されたも
ので、氷点下の−３，０℃以下で植木作用のある氷晶誘
起剤をポリビニルアルコールやその他の接着剤からなる
担体に混合したもので保存容器の口を封止することによ
り、植木と保存容器を密封する両目的に対応できる方法
と、氷晶誘起剤と接着剤を混合し保存容器の保存液と接
する内側の一部に塗布することにより植木する方法を開
発した。
また、保存容器の口を綿栓で封じる場合、綿栓の中間に
氷晶誘起剤混合物、例えばポリビニルアルコール粉末を
担体として用いたものを層状にサンドインチして封止す
る方法も有効である。
ここで、氷晶誘起剤にはヨウ化銀や硫化銅等の溶液中で
氷晶核となって氷晶形成を誘起する物質を用い、凍結保
存容器にはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビ
ニル等のプラスチックを素材とする人工授精用のストロ
−を用いるのである。
本発明方法の対象とする胚の具体例としては、主として
動物胚であり、例えば牛、馬、豚、山羊、羊、犬、猫等
各種動物の胚が挙げられる。[Prior Art] When cryopreserving animal embryos, an operation called planting is required to reduce physical damage caused by ice crystal formation. Among the embryo freezing machines currently on the market, some are equipped with automatic planting devices, but they are expensive. In recent years, embryo freezing machines without a planting device have become commercially available, and are becoming more popular because they are inexpensive. However, with this model, it is necessary to plant trees manually. Currently, the planting methods used for boat fishing include clamping a part of the cryopreservation container with tweezers cooled with liquid nitrogen, etc., or using an aqueous solution of silver iodide, which is an ice crystal inducer. There is a method in which droplets are coated with sodium alginate (Japanese Patent Application Laid-open No. 1-107755, Japanese Patent Publication No. 62-9342). [Problems to be Solved by the Invention] However, the following irrational points can be seen in the conventional tree planting method. l When using tweezers cooled with liquid nitrogen, etc. 1) Planting the trees is labor-intensive and time-consuming because the ice-planting operation is performed artificially. 2) Because a part of the cryopreservation container is removed from the cooling tank and the plants are planted in that part, the temperature of the container rises and the planting is likely to be unstable. 3) When using a straw as a storage container, it is necessary to heat-seal it or encapsulate it by filling it with polyvinyl alcohol powder or the like. ■ When using an aqueous solution or droplet of silver iodide 1) Silver iodide is harmful to animals such as livestock and may have an effect on the embryo recipient, so it must be removed, so the embryo is not removed from the straw. It is not possible to perform one-step dilution or undiluted transplantation directly into a recipient animal. 2) When using an aqueous silver iodide solution, there is a risk that it will mix with the preservation solution in the cryopreservation container during freezing, changing the osmotic pressure of the preservation solution and having an adverse effect on the embryo. 3) When using a straw as a storage container, it is necessary to seal it or encapsulate it with polyvinyl alcohol powder, etc., in the same way as in method 1). [Means for Solving the Problems] The present invention was developed in order to solve each of the above-mentioned problems. There is a method that can seal both the plant and the storage container by sealing the opening of the storage container with a carrier made of an adhesive, and a method that can seal the storage container with a mixture of an ice crystal inducer and an adhesive. We have developed a method for planting trees by applying it to the inside part that comes into contact with the preservation solution. In addition, when sealing the opening of the storage container with a cotton plug, it is also effective to sandwich a layer of an ice crystal inducing agent mixture, such as polyvinyl alcohol powder as a carrier, in the middle of the cotton plug. Here, as the ice crystal inducer, a substance such as silver iodide or copper sulfide that becomes ice crystal nuclei in a solution and induces ice crystal formation is used, and for the cryopreservation container, polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride, etc. are used. They use artificial insemination straws made of plastic. Specific examples of embryos targeted by the method of the present invention are mainly animal embryos, including embryos of various animals such as cows, horses, pigs, goats, sheep, dogs, and cats.
【作用】[Effect]
氷晶誘起剤を担体により保定化して用いるために、氷晶
誘起剤が凍結保存液中へ移動することがなく、胚に悪影
響を及ぼさない。
また、ポリビニルアルコール粉末と混ぜて保定化したも
ので凍結保存容器をシールすれば、容器を熱シールする
必要がない。他の接着剤を混ぜて保定化し、容器の内壁
へ添着する場合は、熱シールと併用になるが、上記保定
化による作用は同様である。
担体としてのポリビニルアルコール粉末やその他の各種
接着剤による保定化をしても、氷晶誘起剤の性能低下は
ほとんどない。
・（実施例１
以下本発明の方法を具体的に実施例によって説明する。
実施例１；氷晶誘起剤の担体として、ポリビニルアルコ
ール粉末（富士乎工業株式会社製、商品名、人工授精用
ストロ−パウダー）を混合して用いる方法
第１図は凍結保存容器としてストロ−（１）を用いる場
合を示し、ストロ−（１）に培養液（２）を１次いで凍
結保存液（３）とともに胚（４）を空気層（５）を間に
充填し、更に空気層（５）を間に０．２５Ｍショ糖液（
６）を充填し、最後に氷晶誘起剤混合物（７）として氷
晶誘起剤を２０％濃度に混合したストロ−パウダーで封
止する。なお、ストロ−（１）先端には綿栓（８）をし
ておく。
このストロ−（１）をアルコールを冷媒とした単槽式プ
ログラムフリーザーで第４図に示す方法により段階的に
冷却した場合、氷晶誘起剤混合物（７）の存在により−
３，０〜−７，０℃で植木される。更にストロ−（１）
は−４０℃まで冷却され、液体窒素中で凍結保存される
。胚（４）を受胚動物に移植する場合は、 ストロ−（
１）を液体窒素中より取り出し３７℃の温水で融解した
後、 まずショ糖液層（６）と胚（４）が充填されてい
る凍結保存液Ｎ（３）を混合して５分間置き、更に培養
液層（２）と混合する。胚（４）を移植する場合は、氷
晶誘起剤混合物（７）の部分を切落し移植器にストロ−
（１）を装填して行なう。第１表は、このようにして凍
結保存した生肝の融解後の培養結果で、７９％の胚が移
植可能なものであった。
また、これらの胚を受胚牛に移植し受胎かえられたこと
から、本法が胚の凍結保存に有効なことが実証された。
第１表
の冷却中、実施例１と同様に植木されることから、胚の
凍結保存に有効であった。
第２表は実施例１と同様に冷却し、凍結保存した生肝の
融解後の生存性を培養により検討したもので、実験に供
した２０個の胚のうち、１９個の９５％にあたる胚が発
育し、高い生存性が確認された。
第２表
（個２％）
実施例２；氷晶誘起剤と接着剤を混合して用いる方法
実施例１のポリビニルアルコール粉末の氷晶誘起剤混合
物（７）でストロ−を封止する代わりに、第２図に示す
ように、 ストロ−（１）の封止部分に対してシアノア
クリレート系瞬間接着剤に２％濃度に氷晶誘起剤として
硫化銅粉末を混合したものを添着させ乾燥させた氷晶誘
起剤混合物の添着層（９）を形成させ、実施例１と同様
に各液層を充填し最後に熱シール（１０）をし封止した
。ストロ−（１）実施例３；氷晶誘起剤をポリビニルア
ルコールに混合し、綿栓で挾んで用いる方法
第３図に示したように、 ストロ−（１）に培養液（２
）を、次いで凍結保存液（３）とともに胚（４）を空気
層（５）を間に充填し、更に空気層（５）を間に０．２
５Ｍショ糖液（６）を充填し、その端部を熱シール（１
０）をし封止した。他端の容器の口を綿栓で封じるに際
して、綿栓の中間に氷晶誘起剤混合物（１１）としてヨ
ウ化銀をポリビニルアルコール粉末に混合したものを層
状に挾んで保定した。
これを用いて実験した結果、冷却によって実施例１，２
と同様に植木され、胚の凍結保存に有効であった。また
、同様に冷却し、凍結保存した生肝の融解後の生存性を
培養により検討した結果、前記実施例同様に高い確率で
胚が発育し、高い生存性が確認された。
【発明の効果）
以上説明したように、本発明による胚の凍結保存方法は
植木装置を必要としないだけでなく、胚に有害とされる
氷晶誘起剤を移植時に切り捨てられるストロ−の先端部
分にポリビニルアルコール粉末や接着剤等の担体で保定
化して用いることから、胚へ悪影響を及ぼす心配もなく
、また凍結融解後胚を取り出すことなく直接移植する１
段階希釈および無希釈移植法にも有効なことから胚の凍
結保存効果を高め、かつ、受胚動物への移植作業の省力
化に極めて有用である。Since the ice crystal inducing agent is retained in a carrier and used, the ice crystal inducing agent does not migrate into the cryopreservation solution and does not adversely affect the embryo. Furthermore, if the cryopreservation container is sealed with a mixture of polyvinyl alcohol powder for retention, there is no need to heat seal the container. When adhering to the inner wall of the container by mixing other adhesives for retention, heat sealing is used in combination, but the retention effect described above is the same. Even when it is retained using polyvinyl alcohol powder as a carrier or various other adhesives, there is almost no deterioration in the performance of the ice crystal inducer.・(Example 1 The method of the present invention will be specifically explained below with reference to Examples. Example 1: As a carrier for the ice crystal inducing agent, polyvinyl alcohol powder (manufactured by Fuji Kogyo Co., Ltd., trade name, straw for artificial insemination) was used as a carrier for the ice crystal inducing agent. Figure 1 shows a case where a straw (1) is used as a cryopreservation container. Fill (4) with an air layer (5) between them, and further fill the air layer (5) with 0.25M sucrose solution (
6) and finally sealed with straw powder mixed with an ice crystal inducer at a concentration of 20% as an ice crystal inducer mixture (7). A cotton plug (8) is attached to the tip of the straw (1). When this straw (1) is cooled stepwise by the method shown in Fig. 4 in a single tank program freezer using alcohol as a refrigerant, due to the presence of the ice crystal inducer mixture (7) -
Planted at 3,0 to -7,0°C. Furthermore, straw (1)
is cooled to -40°C and stored frozen in liquid nitrogen. When transferring the embryo (4) to a recipient animal, use a straw (
1) was removed from liquid nitrogen and thawed in 37°C warm water. First, the sucrose liquid layer (6) and cryopreservation solution N (3) filled with embryos (4) were mixed and left for 5 minutes. Further, it is mixed with the culture solution layer (2). When transplanting the embryo (4), cut off the ice crystal inducing agent mixture (7) and place the straw in the transplanter.
Load (1) and carry out. Table 1 shows the culture results after thawing of live livers cryopreserved in this way, and 79% of the embryos were transplantable. In addition, these embryos were transplanted into cows and the embryos were successfully conceived, demonstrating that this method is effective for cryopreservation of embryos. During the cooling shown in Table 1, the plants were planted in the same manner as in Example 1, which was effective for cryopreservation of embryos. Table 2 shows the results of culturing the viability of live livers cooled and cryopreserved after thawing in the same manner as in Example 1. Of the 20 embryos used in the experiment, 19 (95%) of the embryos were tested. growth, and high survival was confirmed. Table 2 (2%) Example 2: Method of using a mixture of ice crystal inducer and adhesive Instead of sealing the straw with the ice crystal inducer mixture (7) of polyvinyl alcohol powder in Example 1 As shown in Figure 2, a cyanoacrylate instant adhesive mixed with 2% copper sulfide powder as an ice crystal inducer was applied to the sealing part of the straw (1) and dried. An impregnated layer (9) of the ice crystal inducing agent mixture was formed, each liquid layer was filled in the same manner as in Example 1, and finally, heat sealing (10) was performed for sealing. Straw (1) Example 3: Method of mixing ice crystal inducer with polyvinyl alcohol and pinching with cotton plug As shown in Figure 3, culture solution (2
), then the embryo (4) is filled with the cryopreservation solution (3) with an air space (5) between them, and an air space (5) of 0.2
Fill with 5M sucrose solution (6) and heat seal the end (1).
0) and sealed. When the mouth of the container at the other end was sealed with a cotton plug, a layer of a mixture of silver iodide and polyvinyl alcohol powder as an ice crystal inducer mixture (11) was sandwiched and held in the middle of the cotton plug. As a result of experiments using this, Examples 1 and 2 were obtained by cooling.
It was transplanted in the same manner as in the previous study, and was effective for cryopreservation of embryos. Furthermore, as a result of culturing the viability of live livers after thawing that had been cooled and cryopreserved in the same manner, it was confirmed that embryos developed with a high probability as in the above example, and high viability was confirmed. [Effects of the Invention] As explained above, the embryo cryopreservation method according to the present invention not only does not require a planting device, but also removes the ice crystal inducing agent, which is considered harmful to embryos, from the tip of the straw, which can be cut off at the time of transplantation. Because it is used after being retained with a carrier such as polyvinyl alcohol powder or adhesive, there is no risk of adverse effects on the embryo, and it can be directly transferred without removing the embryo after freezing and thawing1.
Since it is effective in serial dilution and non-dilution transplantation methods, it is extremely useful for enhancing the effect of cryopreservation of embryos and saving labor for transplantation into recipient animals.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
第１図は凍結保存容器としてプラスチックスドローを用
い、氷晶誘起剤混合物で封止する場合の断面図である。
第２図は氷晶誘起接着剤を添着し乾燥させておいたプラ
スチックスドローを用いる場合の断面図である。第３図
は綿栓で氷晶誘起剤混合物を挾むように保定した場合の
断面図である。
第４図は動物胚の凍結の温度−時間曲線を示すグラフで
ある。
（１）ストロ−（２）培養液
（３）凍結保存液 （４）胚
（５）空気層 （６） ０．２５Ｍショ糖液
（７）（１１）氷晶誘起剤混合物 （８）綿栓（９）氷
晶誘起剤混合物の添着層
（１０）熱シール
以上FIG. 1 is a cross-sectional view when a plastic suction drawer is used as a cryopreservation container and sealed with an ice crystal inducing agent mixture. FIG. 2 is a sectional view in the case of using a plastic draw to which an ice crystal inducing adhesive has been applied and which has been dried. FIG. 3 is a cross-sectional view of the ice crystal inducing agent mixture held between the cotton plugs. FIG. 4 is a graph showing a temperature-time curve for freezing animal embryos. (1) Straw (2) Culture solution (3) Cryopreservation solution (4) Embryo (5) Air layer (6) 0.25M sucrose solution (7) (11) Ice crystal inducer mixture (8) Cotton plug (9) Impregnation layer of ice crystal inducer mixture (10) Heat sealing or more