JPH03262491A

JPH03262491A - グルコン酸の製造法

Info

Publication number: JPH03262491A
Application number: JP5807990A
Authority: JP
Inventors: Joji Takahashi; 高橋　穣二
Original assignee: IWATA KAGAKU KOGYO KK
Current assignee: IWATA KAGAKU KOGYO KK
Priority date: 1990-03-12
Filing date: 1990-03-12
Publication date: 1991-11-22

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は発酵法によるグルコン酸の製造法に関するもの
である。

［従来の技術］グルコン酸は爽快な酸味を持っているので清涼飲料、食
酢、合成清酒などに配合され、そのラクトンはベーキン
グパウダー、装入納豆、ハム、ソーセージなどにも広く
用いられている。またグルコン酸ナトリウムは洗瓶剤や
缶石防止剤にも用いられており、最近はセメントの分散
剤、凝固遅延剤として多量に使われるようになってきた
。カルシウム塩はカルシウム剤として医療にも用いられ
ている。

グルコン酸は現在、主としてアスペルギルス・ニガー（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）に属する糸状菌
を用いる発酵法により製造されている。他にグルコノバ
クタ−（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）　、アセトバク
ター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）　、シュードモナス（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などの細菌や酵母を用いる方
法も知られている。

発酵法とは別に、ブドウ糖を酸化剤もしくは電気を用い
た酸化による方法ち知られている。

グルコン酸発酵はブドウ糖をグルコン酸に酸化するいわ
ゆる酸化発酵の典型的な例であり、溶存酸素（以下Ｄｏ
と略記する）濃度の影響を強く受けることはよく知られ
ている。

Ｈｅｎ１ｃｋら［Ｉｎｄ、Ｅｎｇ、ｃｈｅｍ、、　　２
７，６８１（１９３５）。

２９．６５３（１９３７）、　２９．７７７（１９３７
）］およびＧａ５ｔ　ｒｏｃｋら［Ｉｎｄ、Ｅｎｇ、ｃ
ｈｅｍ、、　３０，７８２（１９３ｇ）］はアスペルギ
ルス・ニガーによるグルコン酸発酵を回転ドラム発酵槽
を用いて行い、３ａｔｍ程度に加圧して酸素供給を増加
させることにより、グルコン酸の生産速度と収率とが向
上すると報告している。また、ｏｏｓｔｅｒｈｉｕｓら
［Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ、、　　２１゜４２（１９８５）］　も］グルコノバ
クターオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｏ
ｘｙｄａｎｓ）を用いた実験で、同様の結果を得ている
。しかしながら以上の従来例ではＤｏはせいぜい４０ｐ
ｐｍ位までであった。

またこれまでの研究では菌体の生育とグルコン酸の生産
は同時に行われており、グルコン酸の生産という酸化反
応そのものに対するＤｏの影響は必ずしも明確ではなか
った。そこで本発明者らは先に、次に記す如き実験を行
い、グルコン酸の生産性を一段と高めることに成功した
。すなわち、アスペルギルス・ニガーを用い、菌体増殖
のための培養とグルコン酸生産のための培養を別々にお
こない、また酸素供給は常圧空気通気から５気圧の酸素
通気にわたる範囲の検討を行った。その結果、菌体生育
に阻害的であるような高Ｄｏ下においてもＤｏ濃度が増
加するに伴って生酸活性は著しく増大し、Ｄ　０１５０
ｐｐｍでもグルコン酸の生産は充分に行われる、という
新知見を得た。これに基づき３６ｐｐｍのＤｏ濃度下で
生育した菌体を用い、１５０ｐｐｍのＤｏ濃度下でグル
コン酸の生産を行ったところ、顕著な生産性の向上が見
られた［発酵工学、、　　６５，５０１（１９ｇ？）　
　コ　。

さらにグルコン酸発酵はこれまで、遊離菌体を用いて行
われてきているが、本発明者らは、菌体を固定化し、し
かも糸状菌の固定化が従来液相中で生育させることによ
り行われてきているのに対し、当該菌の生育が気相中に
おいて良好である、という特性を利用し不織布を担体と
して気相中で菌糸を生育させる、という新規な固定化法
を提案した（特開平１−１６５３８０号公報）。アスペ
ルギルス・ニガーを用いたグルコン酸生産例では、単位
菌体型あたりのグルコン酸生産速度は気相中固定化菌糸
の方が液相中固定化のものより大きく、繰り返し使用に
おける安定性が格段に優れていることが明らかとなった
。この場合でも高Ｄｏ濃度が反応速度を高めるのに極め
て有効であることがわかった。

［発明が解決しようとする課題］本願は以上の成果を踏まえ更に生産性を上げたものであ
る。すなわち本発明者らの従来知見も含め基質としては
すべてブドウ糖が用いられてきているが、いずれの場合
でも、基質たるブドウ糖の濃度は上限が２０％前後であ
り、これ以上の高濃度とするとグルコン酸の生産速度は
急激に低下する、という限界を有していた。

［課題を解決するための手段］基質をできるだけ高４度で仕込み、生産物を高濃度で蓄
積させたい、ということはグルコン酸に限らず発酵生産
物の生産における経済性追及における共通した課題であ
るが、本発明者は従来のグルコン酸発酵における基質濃
度の上限はブドウ糖の高濃度による阻害によるものでは
ないかと考えた。そこで従来のブドウ糖な溶性としたデ
ンプンに切り換え、デンプン分解酵素を作用させながら
、気相中で生育固定化されたアスペルギルス・ニガーの
菌体層に高Ｄｏ濃度下でこのデンプン溶ン夜を供給した
。その結果驚くべきことに、これまでのグルコン酸発酵
では想像もできなかった糖濃度３０％という高い仕込濃
度においても極めて円滑にグルコン酸の生産が行われる
ことが明らかとなり本発明を完成した。

以下本発明の詳細な説明する。

まず菌の培養について述べる。ポリエステル。

ポリアミド、ポリアクリロニトリル、ポリエチレン、ポ
リプロピレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコールな
どの合成高分子、紙、木綿、麻。

絹、羊毛などの天然高分子、ビスコース、アセテートな
どの半合成高分子などから選ばれた繊維を規則的にまた
は不規則的に二次元ないし三次元的に編み上げたもの、
化学的または物理的な手段により一部分を結合させたも
の、または発泡体からなる１←ｍ〜１．０ｍｍ程度の孔
を有する多孔性担体にアスペルギルス・ニガーに属する
糸状菌の利用可能な成分を含有する培養液を含浸させ、
これに菌を接種し、気相中で１時間〜３０日間好ましく
は２〜７日間培養するか、または培養液に菌を懸濁させ
、この懸濁液を担体に含浸させ、気相中で１時間〜３０
日間、好ましくは２〜７日間培養する。

ここで「気相中」とは気体の雰囲気中に保持し、常に菌
と気体とが密に接触できる条件を意味し、「気体」とは
空気、高濃度酸素含有気体、純酸素など酸素を含有する
もので、二酸化炭素や窒素を適当量含むものを意味し、
これらの気体は、静止あるいは強制的に撹拌または通気
させてよい。また「含浸させる」とは担体の空隙に培養
液、菌の懸濁液などの溶液を保持させることを意味する
。担体に含浸させる培養液は特に制限されるものではな
く、アルペルギルス・ニガーの生育に繁用される、天然
培地、合成培地いずれもが使用できる。

培養液に懸濁させるときの菌の形態は、胞子または生育
初期の菌糸またはその切片等いずれでもよく、液中の細
胞数はｌＸｌ０’〜ｌＸｌ０’個／ｍＩ！程度が好適で
ある。気相中での菌の生育条件は温度２５〜４０℃好ま
しくは２８〜３５℃、気相中の相対湿度は６０％以上、
ｐＨ２〜８の各条件により適宜選定できる。

次にグルコン酸生産用の培地であるが、基質としては溶
性デンプン又はデンプンを液化して２０〜３５％水溶液
とし、これにリン酸塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩
など通常の糸状菌の培地に配合させる塩類を必要に応じ
適宜加える。またデンプンの分解がグルコン酸生産の律
速にならないように、使用菌のデンプン分解酵素が充分
強力でない場合には、α−アミラーゼやグルコアミラー
ゼなどのデンプン分解酵素を適宜加えてやることが重要
である。α−アミラーゼは０．００５〜０．１％、グル
コアミラーゼは０．０５〜１．０％程度加えればアミラ
ーゼ生成の微弱な菌株を用いた場合でもデンプンの分解
は円滑に行われる。培地のｐＨは２〜８の範囲で良好な
結果が得られる。

発酵は前記組成の培地を、担体に固定された菌糸に供給
し、発酵容器内の温度は２４〜４０°Ｃ５好ましくは２
８〜３５℃に調整し、酸素を富化した前記の気体を通気
し、高Ｄｏ濃度雰囲気下、つまりＤｏ濃度は２０〜２０
０ｐｐｍの範囲から選ばれた条件下で行われる。発酵が
進みデンプンがブドウ糖になりブドウ糖がグルコン酸に
変換されるにしたがって発酵液のｐＨが下がるのでたと
えば、アルカリ金属（ナトリウム、カリウムなど）、ア
ルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウムなど）の水
酸化物や炭酸塩のような塩基の水溶液を添加してｐＨを
４〜８好ましくは５〜８に保つのが好ましい。

発酵液の糖分析を行い糖がほぼ完全に消費し尽くされた
時点で発酵を停止する。なお本発明の方法では固定化菌
体を用いて発酵を行っているので特開平１−２２５４７
７号公報にみられる如く高Ｄｏ濃度下のため雑菌の繁殖
が無く、培地を未殺菌のまま回分発酵、連続発酵のいず
れをも行うことができ、しかも回分発酵といえども、同
一の菌体を用いて繰り返し発酵ができる。

本発明の固定化菌体作製に使用する器具、培地などは、
滅菌または除菌ｔたものを用いることが好ましく、反応
基質溶液は殺菌を必要としない。

生成したグルコン酸は用途によっては発酵終了液のまま
で製品とすることができるが、単離精製が必要とされる
場合には通常の方法で行えばよい。

さて本発明の方法で用いる装置であるが、発酵を行うた
めの容器と当該容器と培養液中の溶存酸素濃度を保持す
るために必要な装置（以下溶存酸素濃度保持装置と略記
する）の２種の装置から構成されているものであればよ
く、装置の大きさ、構造、構成については各種のものが
用いられる。

発酵用の容器としては管または塔壁、槽壁、膜もしくは
フィルム型のいずれの型のものを使用でき、特に耐圧性
の容器が好ましい。溶存酸素濃度保持装置としては、発
酵容器内への通気を行うための通気装置または基質溶液
に酸素を供給するための酸素溶解装置を利用することが
できる。具体的には本発明者らによる特開平１−２２５
４７７号公報に記載のものなどを挙げることができる。

［実施例］以下に実施例をあげて本発明の内容を更に詳細に説明す
る。

夏凰亘ユ関西フェルト株式会社製のニューファインフェルト（９
，４ｃｍＸ　８　ｃｍ）を円筒形とし、内側をステンレ
ス製の金網で補強し、担体とした。ブドウ糖３％、酵母
エキス０．９％、マルトエキストラクト（デイフコ製）
０．９％、ペプトン１．５％を含有し、ｐＨを６．０に
調整した培養液中にアスペルギルス・ニガーＩＡＭ２０
９４の胞子を懸濁させ、胞子濃度１０’個／ｍｆ程度の
胞子懸濁液を調製し、上記の担体をこの懸濁液中に十分
に浸した後、引き上げて、ガラス製円筒（直径５ｃｎ＋
、長さ３０ｃｍ）中に直立させ、綿栓を施し、３０℃で
４８時間静置培養を行って水洗ｌ争を行い、以下に述べ
るグルコン酸生産用の固定化菌体を得た。なお菌体量測
定用に上述と同様固定化菌体を調製し、乾燥菌体重量を
測定したところ、約３２０ｍｇの菌体が担体に固定され
ていた。

次に、溶性デンプン３０％、硫酸マグネシウム０、０１
５％、リン酸二水素カリウム０．０２％、リン酸水素二
ナトリウム０．０４％、ａ−アミラーゼ（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ属細菌起源、ＡＢＣ社製）０．０２％、グルコアミ
ラーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、ＳＩＧＭＡ社″！Ａ）　
ｏ、ｓｏ％力）らなる培養液を調製し、その２００ｍｆ
を前記固定化菌体を含む担体を内蔵したステンレススチ
ール製耐圧円筒の中に注ぎ、ガラスポールフィルターを
用い円筒底部から純酸素を通気し、５　ｋｇ／ａｍ２の
加圧下でＤｏ濃度を１５０ｐｐｍに調整しながら３０℃
初発ｐＨ７，６で発酵をおこなった。発酵進行に伴った
ｐ＋（の低下はｐＨコントローラーを用い６規定の水酸
化ナトリウム液を滴下して補正し、ｐＨ７，６に保持し
た。残部は還元糖をネルリン・ソモジー法で、全糖は予
め加水分解後還元糖同様ソモジ・ネルラン法で定量した
。生成したグルコン酸は日立６５５型高速液体クロマト
グラフ装置を用いて定量した。

カラムには東ソー製ＴＳＫ−ｇｅｌ　ｓｅｘを、検出器
には日立製作新製ＨＩ丁ＡＣＨＩ　Ｌ−４００型ＵＶ検
出器を用いた。

なお従来のブドウ糖を基質とした発酵と比較を行う意味
で、上記とは別に溶性デンプン３０％の代わりに、ブド
ウ糖３０％を配合した培地も調製しその他の条件はすべ
て同一とした発酵も平行して行ったが、３０％ブドウ糖
培地においてはグルコン酸の生産は認められなかった。

この事からも溶性デンプン基質の方がはるかに優れてい
ることがわかる。

結果は第１表ならびに第２表に記した如くであった。こ
の溶性デンプン基質では高濃度培養の場合でも繰り返し
生産が可能であることを証明している。またＤ　０１５
０ｐｐｍの条件下では、グルコン酸生産菌体量の原料は
もちろん増加は非常に少なく、また雑菌の増殖は最後ま
で認められなかった。

失１目生旦発酵時における溶性デンプンを１０％、ブドウ糖を１０
％に調整しその他の条件は実施例１とまったく同様にし
た発酵を行った。結果は第３表ならびに第４表に記した
如くであった。低基質濃度条件下で発酵を行った場合に
おいても溶性デンプン基質の方が優れた結果が得られた
ことがわかる。

及見貝ユ実施例１におけると同様の装置、即ち関西フェルト株式
会社製のニューファインフェルト（９，４ｃｍＸ　８　
ｃｍ）を円筒形にして内側をステンレス製金網で補強し
たものを担体とした。

溶性デンプン３％、コーンステイブリカー２％、硫酸マ
グネシウム０．０５％、リン酸二水素カリウム０．０５
％、尿素０．０２５％、リン酸水素アンモニウム０．１
％を含有する培養７夜ｐＨ５，８中にアスペルギルス・
ニガーＮＲＲＬ−３の胞子を懸濁させて胞子濃度ｌＸｌ
０’個／ｍｆ程度の胞子懸濁液を調製し、上記担体をこ
の懸ＦＸｈ？’ｆｔ中に十分浸した後引き上げて、実施
例１と同様にしてグルコン酸生産用の固定化菌体を得た
。菌体量測定用に上述と同様にして固定化菌体を調製し
、乾燥菌体重量を測定したところ３６２ｍｇの菌体が担
体に固定化されていた。

グルコン酸生産用反応液としては溶性デンプン３０％、
硫酸マグネシウム０．０５％、リン酸二水素カリウム０
．０２％、リン酸水素二ナトリウム０．０４％、ａ−ア
ミラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌起源、　ＡＢＣ社製
）０．０１％、グルコアミラーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属
起源１Ｓ　Ｉ　ＧＭＡ社製）０．３％からなる培養液ｐ
Ｈ５，８を調製し、実施例１に準じて５　ｋｇ／ｃｍ”
の加圧下ＤＯ濃度１５０ｐｐｍに調節しながら３０℃、
初発ｐＨ５，８で発酵をおこなった。発酵に伴ったｐＨ
の低下はｐＨコントローラーを用い６規定の水酸化ナト
リウム液を滴下して補正しｐＨ５，８に保持した。

その結果は第５表に示す如くで、実施例１のアスペルギ
ルス・ニガーＩＡＭ２０９４を用い、デンプン分解酵素
の補強を強くしたものと比べて、はぼ同等のグルコン酸
生産能を示した。

見五員ユ関西フェルト株式会社製のレーヨン５０％と吸水性アク
リル５０％の混紡不織布（９，４ｃｍＸ　８　ｃｍ）を
円筒形とし、内側をステンレス製の金網で補強し担体と
した。ブドウ糖３％、酵母エキス０．９％、マルトエキ
ストラクト（デイフコ製）０．９％、ペプトン１．５％
を含有し、ｐＨを６．０に調整した培養液中にアスペル
ギルス・ニガーＩＡＭ２０９４の胞子を懸濁させ、胞子
濃度ｉｏ’個／ｍＲ程度の胞子懸濁培養液を調製し上記
の担体をこの胞子懸濁培養液中に浸した後引き上げて、
酸素吹き込み口を備えたガラス製円筒（直径５ｃｍ、長
さ３０ｃｍ）中に直立させ綿栓を施し、大気圧の条件で
純酸素を通気し、３０″Ｃで４８時間静置培養を行って
水洗浄を行い、以下に述べるグルコン酸生産用の固定化
菌体を得た。なお菌体量測定用に上述と同様固定化菌体
を調製して発育した乾燥菌体重量を測定したところ２６
０ｍｇの菌体が担体に固定されていた。

次に予めα−アミラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌起源
、　ＡＢＣ社製）　０．６ｇで液化させたデンプン３０
０ｇを含む溶液と硫酸マグネシウムＯ，１５ｇ　、　リ
ン酸二水素カリウム０．２ｇ、リン酸水素二ナトリウム
０．４ｇ、グルコアミラーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属起源
、ＳＩＧＭＡ社製）５ｇとで全体を蒸留水で１０００＋
＋＋ｊ！とする培養液を調製し、その２００ｍｊ！を前
記した固定化菌体を含む担体を内蔵したステンレススチ
ール製耐圧円筒の中に注ぎ、ガラスポールフィルターを
用い円筒底部から純酸素で５　ｋｇ／ｃｍ２の加圧下で
Ｄｏ濃度を１５０ｐｐｍに調節しながら３０℃初発ｐＨ
７，６で発酵をおこなった。発酵進行に伴ったｐＨの低
下はｐＨコントローラーを用い６規定の水酸化ナトリウ
ム液を滴下して補正しｐＨ７，６に保持した。

生成したグルコン酸は高速液体クロマトグラフィーで、
残金糖は加水分解して還元糖に変換させネルリン・ソモ
ジー法で分析した。

結果は第６表に記した如くで、グルコン酸生酸速度に格
段の向上が認められ、これは本発明のデンプンの形態に
関する汎用性と固定化菌体の高Ｄｏ条件下調製の有効性
を示すものである。

（以下余白）第１表　　溶性デンプン（３０％）を基質とした場合繰
り返し　　発酵時間　　延べ発酵時間　　グルコン酸収
率　　グルコン酸生産速度×回　　数　　　［ｈｌ　　
　　　　［ｈｌ　　　　　　　［％］　　　　　　　［
ｇ／′ｇ　ｃｅｌｌｈ］６１４５９０６５４９９４９９７４９９７第２表　　ブドウ＠　（３０％）を基質とした場合（比
較例）繰り返し　　発酵時間　　延べ発酵時間　　グル
コン酸収率　　グルコン酸生産速度×回　　数　　　　
［ｈｌ　　　　　　［ｈｌ　　　　　　　［％］　　　
　　　　［ｇ／ｇ　ｃｅｌｌ　ｌ＋］６６　　　　　６
６ ※　菌体量不変として計算　３２０　ｍｍ２０［１ｍｊ
’　＝１．６　ｇ／４２第３表溶性デンプン（１０％］を基質とした場合第４表ブドウ糖（１０％）を基質とした場合（比較例）繰り返
し　　発酵時間　　延べ発酵時間　　グルコン酸収率　
　グルコン酸生産速度※回　　数　　　　［ｈｌ　　　
　　　［ｈｌ　　　　　　　［％］　　　　　　　［ｇ
／ｇ　ｃｅｌｌ　−ｈ１９７１５．５１６．５５６１５．５６７７９６１５８３０９１２４．５４０５１５７．５７４５９２．３８９．０８４９０、１８４．６８７、１６８８７．２９０．９８７．４８５３．１１３．４１３１２１３．２７４３３．２４３．３３０２ ※ 菌体量不変として計算３２０■／２０（転）＝１．６　ｇ／β× ９８６１６．５１７．０１６．５１６．５１７．０１７．０１７．０９７３７９．５９６．５１３２９５１４６．５６３５１８０．５８９．９８６３５８７．３８５、１３２２１８４．６８４．８６２菌体量不変として計算　３２０　ｍｇ／２００ｍＮ　＝
１．６　ｇ／１１．８４９８３．１３３．１４８８８７８３８６２．９０３．０１第５表溶性デンプン（３０％）を基質とした場合第６表溶性デンプン（３０％）を基質とした場合繰り返し　　
発酵時間　　延べ発酵時間　　グルコン酸収率　　グル
コン酸生産速度×回　　数　　　［ｈｌ　　　　　　［
ｈｌ　　　　　　　［％］　　　　　　　［ｇ／′ｇ　
ｃｅｌｌｈ］１６７９０．２２．８４６６６６０６２８５０７３９６２０８４．４７８．１８４１０８４７８．４５４５６７４．７７２．６４００４９．０８２３８５７８６９７．２６２９６．８９ × 菌体量不変として計算　３６２　ｍｇ／２０（転）墓１
．８　ｇ／ｊ２※ 菌体量不変として計算　２６０　ｍｇ／２００＋ｎｆ　
＝１．３　ｇ／＊［発明の効果］本発明の方法はこれまで記してきた如く、従来ブドウ糖
を基質として用いてきたグルコン酸発酵において、新た
にデンプンを基質として用いることが可能となり、しか
もこれによってブドウ糖の高濃度による発酵阻害作用を
避けて、培養液濃度を一段と上げることができ、短期間
の発酵時間をもって高収率でグルコン酸の生産を可能に
した新規なものである。

またブドウ糖はデンプンを原料とする産物であるが、本
発明によれば、デンプンの糖化である加水分解反応と糖
化産物であるブドウ糖をグルコン酸に変換する酸化反応
の両者を同一系内で併せもつ工程の単純化が実現し、し
かも高酸素濃度の環境内であるために反応液を殺菌しな
くとも長期間反応または繰り返し反応が可能であること
に大きな意義があり、かつまた新たなグルコン酸発酵の
基質としてデンプンの提供は、アミラーゼ活性を持つグ
ルコン酸生産菌の有効利用にもつながるもので、産業上
極めて有効な発明である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）発酵法によりグルコン酸を製造するに際し、基質
としてデンプンを用い、デンプンをデンプン分解酵素で
分解させながら、気相中で生育固定化された菌体層中を
高溶存酸素濃度条件下に溶液の形で供給することを特徴
とするグルコン酸の製造法。