JPH03251171A

JPH03251171A - 非う蝕性微生物の製法及び非う蝕性組成物

Info

Publication number: JPH03251171A
Application number: JP33369790A
Authority: JP
Inventors: Takashi Tsurumizu; 隆鶴水; Takashi Hashimoto; 橋本　喬; Makoto Sato; 誠佐藤
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 1990-01-29
Filing date: 1990-11-30
Publication date: 1991-11-08

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】乳ｌ上史上玉上１本発明は、人及び哺乳動物の虫歯（う蝕）の予防または
抑制（以下抑制という）に有効な非う蝕性微生物の製法
及びこの方法によって得られた微生物の生菌体を含有す
る非う蝕性組成物に関する。

正ｊＪ口支ｌ −の明細書において、非う蝕性微生物とは、人及び哺乳
動物の口腔内及び試験管内において、水溶解性及び不溶
解性デキストラン様多糖体（以下ＤＰＳという）産生能
と従って歯垢（プラーク）産生能とを実質的に欠如し、
従って虫歯誘発能を実質的に欠如し、しかもう蝕性微生
物の増殖を抑制する能力を持つ微生物をいう。

虫歯（う蝕）は、歯の表面から始まり漸進的に南の組織
を破壊する疾患で、その直接の原因は口腔内の細菌であ
る。もつとも重要な虫歯原因菌はストレプトコッカス・
ミュウタンス（以下ＳＭという）である。よく知られて
いるように、ＳＭは、人や動物の歯の表面に付着しで、
庶糖から固い粘着性の不溶解性ＤＰＳからなるプラーク
を形成する。３Ｍ以外の虫歯菌もプラークを作るが、Ｓ
Ｍが重要な訳は、プラーク内に居住して乳酸及び酢酸を
産生するからである。

英国特許第１３７５８６６号は「プラーク生成は虫歯発
生の必要条件であり、これに関与する酵素はグルコシル
トランスフェラーゼ載している。

３Ｍ以外のストレプトコッカス（以ＦＳＴＲという）例
えばサンギス、ミチス、サリバリウスかがプラークを作
り、虫歯発生の原因菌であることや食用乳酸菌が虫歯発
生の原因菌であることも知られている。

う蝕性ＳＭの増殖抑制能をもつＳＭの突然変異株として
ＪＨ１４０　（ＡＴＣＣ３１３４１）またはＪＨ　１　
４５　（ＡＴＣＣ３　１　３７７）を用いてＳＭによる
虫歯を抑制する方法は公知である（ヒルマン米国特許第
４　１　３３５７５号）。

これらの株は、ＢＩＴ−２を特殊の培地で培養した後、
変異剤で処理しで得られた。しかしこの方法は、例えば
次の欠点があるので、人の虫歯抑制に天川できるかどう
か極めて疑問である。

本発明者の一人である佐藤誠は、ＳＭをヒトＩ型、ヒト
ＩＩ型及びラッテ型に分類し、っぎのことを報告した。

■　ヒト由来のＳＭの９３９％はヒトＩ型で、残りはヒ
トＩＩ型であった。

■　ラッテ由来のＳＭは、すへてラッテ型であった。

■　マウス及びモルモットからＳＭを検出できなかった
。

■　サル及びハムスター由来のＳＭは、すべてヒトＩ型
であった。

■　ヒト■型、ヒトＩＩ型及びラッテ型は、それぞれブ
ラッタール及びバーチの分類による血清型ｃ，　ｅ，　
ｆ”、　’″ｄ，　ｇ−及び−ａ，　ｂ−に対応する。

１０腔衛生学会雑誌、１９７８年、第２３巻、第２号、
１００−１２３頁１ヒルマンの親株ＢＨＴ−２はラッテ型ＳＭで、人の口腔
から分離されたことがなく、ヒルマン特許は人に用いた
結果を記載していない。

特開昭５８−１６４５１７号公報は、人の口腔から分離
されたう蝕性ＳＭを変異剤で処理して得られたストレプ
トコッカス・ミュウタンス弱毒株に一１１１ｉ微工研条
寄第３１６号）を用いた虫歯抑制用生ワクチンを開示し
ている。このワクチンの微生物の非う蝕性は良好である
が、非う蝕性親株からう蝕性から誘導されたので、ヒル
マンの株と同様の難点を有する。

本発明者は、特開昭５９−　１　５　１　８４７り公報
に次のことを開示した。

（イ）ＳＭは高い変異性をもつが、公知の血清型および
バイオ型にかかわらず、つぎの３種の変異相に分類する
ことができる。

■　相１人及び動物の口腔内に広く分布している「正常の相」。

プラークは多量、固く粘着性で付着能力が高い。ＤＰＳ
及び乳酸産生能は高い。虫歯誘発能は３種の相のうち最
高である。

■　相ＩＩ本質的に不安定な相で、相Ｉ株との間に相互変換性があ
る。乳酸産生能と虫歯誘発能とは相Ｉ株よりも低い。

■　相ＩＩＩ人工的変異手段によって相Ｉ株から得られる相で、性状
は他の相と全く異なる。試験管内での乳酸産生能は低い
。水溶性及び水不溶性ＤＰＳ産生能およびワイヤープラ
ーク形成能は実質的に欠けている。人及び動物の口腔内
ならびに試験管内において少なくともう蝕性ヒト型ＳＭ
と共存する場合、相ＩＩＩ株はＳＭの増殖を特異的に抑
制するので、ＳＭによる虫歯誘発を効果的に予防または
抑制する。相ＩＩＩ株が、相Ｉ株の作用でプラークがす
でに形成された培地または人の口腔内に移植されると、
相ＩＩＩ株は強制的にプラークに侵入して「居住」する
ので、相Ｉ株は外に追い出され、徐々に死滅する。相Ｉ
ＩＩ株は新しいプラークを作る能力をもたないので、プ
ラークが破壊されると、住む場所を失って死滅する。相
Ｉ１１株は、う蝕性ＳＴＲ及び食用乳酸菌の増殖を完全
に抑制する。

（ロ）本発明者は、人工的に虫歯菌から作られた相ＩＩ
Ｉ株（以下人工相ＩＩＩ株という）に類似した性状をも
つヒト夏型およびＩＩ型の相ＩＩＩ株（以下自然相ＩＩ
Ｉ株という）を人の口腔に見出し、これを分離し純粋培
養した。

第１表は本発明者が人から分離した自然相ＩＩＩ株の凝
集値（Ａｇ）及び糖分解を示す。糖の略称はつぎの通り
である。

Ｍａ（マンニトール）、Ｓｏ（ソルビトール）、Ｒａ（
ラフィノース）、Ｓａ（サリシン）Ｃｅ（セロビオース
）、Ｍｅ（メリピオース）、Ｌａ（ラクトース）、Ｓｕ
（シュクロース）、Ｅｓ（エスクリン）。

第１表の自然相ＩＩＩ株は久米（微王研条寄第３１９号
、ヒトＩＩ型、血清型ｄ）のほか、すべてヒト夏型、血
清型Ｃ）である。

比較のためＮＣＴＣ１０４４９（相Ｉ株）のものも示す
。

自然相ＩＩＩ株の特性は次の通りである。

形態学的特性。

ストレプトコッカス、Ｉμｘ１−２μ、ダラム陽性。

ＩＩ　　各種培地での成育。

（３７℃、２４時間、指定ｐＨ） ■　ストツペラー等（Ｓｔｏｐｐｅｌａａｒ　ｅｔ　ａ
ｌｌ　のＴＹＣ寒天平板培地水不溶解性および水溶性ＤＰＳはできない。

コロニーは、円形、扁平、白色、不透明、光沢あり、大
形。

ドツト・ヒユーイツト・ブロス寒天平板培地（米国バル
チモア・バイオロジカル・ラボラトリ−製、以下ＢＢｔ
という）コロニーは、円形、扁平、白色、不透明、光沢あり、多
少粘性、大形。

■　ミチス・サリバリウス寒天平板培地（米国デイフコ
社製）ＤＰＳはできない。コロニーは、円形、淡白色、多少粘
性、大形。

■ ■ ■　プレイン・ハート−インフュージョン寒天平板培地
（ＢＢＬＩコロニーは、円形、多少白色、不透明、光沢あり、大形
。

■　トリプトケース・ソーイ・ブロス（ＢＢＬ）培地の
底部から成育する。

■　ドツト・ヒユーイツト・ブロス（ＢＢＬ）培地の底
部から成育する。

ＩＩｌ、　　生理学的特性。

■　ワイヤー・プラーク生産性：　陰性（水不溶解性Ｄ
ＰＳによる付着能を示す）ＤＰＳによる菌体の凝集：　
　陰性色素生成：　　　　　　　　　陰性成育範囲：ｐＨ５−８，温度１０−３０℃糖分解　　　
第２表のとおり諸性状。

エスクリンの加水分解：　　　陽性溶血性（羊）：　　　　　　−〜＋グルコシルトランスフェラーゼ活性・実質的に欠失 ■　乳酸生産性：　きわめて弱い ■　動物への感染能：　　　　　　陰性■　う蝕能カニ
　　実質的に欠失 ■　免疫学的性状。

画架：　　　　　ヒトＩまたはＩＩ型ＳＭの自然相ＩＩＩ株は先に定義した非う蝕性微生物で
あり、試験管内外において非う蝕ＳＴＲ及び食用乳酸菌
の増殖を効果的に抑制する。

自然相ＩＩＩ株の培養６ＳＭの自然相ＩＩＩ株を公知のＳＭに応用される培養法
により培養することができる。好気的に培養できるが、
嫌気的条件での培養が実用的である。自然培地も合成培
地も使用できるが、人世生産には液体培地がよい。ＳＴ
Ｒ培養に適する各種の培地を、ｐＨ５，６−９，０（例
えば７０）、温度２３−３９℃（例えば３７℃）で用い
ることができる。培養（例えば１２−７２時間）完了後
の培養液は例えば約１０８個／ｍｌの生菌を含有して５
ｓる。

（ハ）純粋培養された自然相ＩＩＩ株の生菌体を有効成
分とし、経口投与に適する担体または賦形剤と共存させ
てなる、非う蝕性組成物によって、う蝕性ストレプトコ
ッカス（ＳＴＲ）及び食用乳酸菌による人及びは乳類飲
虫歯を完全に抑制することができる。

培養液をそのまま人の口腔に投与してもよいが、実用的
には、培養液から菌体を常法により分離し、これを適当
な担体に分散させる。または分離された菌体を凍結乾燥
して保存し、使用時に、生菌を適当な担体に分散させる
。凍結乾燥及び保存は常法による。

自然相ＩＩＩ株は付着能が弱く、しかもプラーク形成能
が欠けているので、多世の投与が実用的である。たとえ
ば組成物が液状である場合、組成物中の自然相ＩＩＩ株
生菌体の実用的濃度は、例えば１０５ないしｌＯ８個／
■である。例えば、約１Ｏ７−ｌＯ９個／ｌｌＩ２．の
食用乳酸菌と約１０６個／Ｉβの自然相ＩＩＩ株とを含
む非う蝕性組成物５５０−１ｏｏβを毎日人に投与する
と口腔内のう蝕性ＳＴＲおよび食用乳酸菌は約１−２週
間で完全に消滅することが認められる。

が　°　しようとする課題本発明は、この自然相１１１３Ｍのひとつであるストレ
プトコッカス・ミュウタンスＴＭＤ−ＮＣ４９（微工研
条寄第３１８号）を長期間継代培養した結果、親株と異
なる菌学的特徴をもつ非う蝕微生物が得られるという意
外な知見に基すいている。

本発明の目的は、ストレプトコッカス属に属する非う蝕
性微生物の製法及びこの方法で得られた非う蝕性微生物
の生菌体を含有する虫歯抑制用口腔用組成物を提供する
ことにある。

課題を　゛するための本発明は、（イ）人の口腔から分離され、（ロ）人及び
哺乳動物の口腔内において虫歯誘発能能を実質的に欠如
しかつう蝕性ストレプトコッカス微生物及び食用乳酸菌
の増殖を抑制することができ（ハ）継代培養によって、
マンニトール、ソルビトール及びメリピオースの糖分解
と抗ストレプトコッカス・サンギス血清に対するゲル内
沈降反応とが実質的陽性から実質的陰性に変わる能力を
もつストレプトコッカス・ミュウタンスを親株として、
前記の糖分解と沈降反応とが実質的陰性に変わるまで培
地に継代培養し、得られた所望の微生物を培地から回収
する工程からなる非う蝕性微生物の製法を提供する。

次に本発明は、本発明の方法によって得られたられた非
う蝕性微生物の生菌体を有効成分とし、経口投与に適す
る担体または賦形剤を含有してなる、ストレプトコッカ
ス属細菌及び食用乳酸菌によって続発される人および哺
乳動物の虫歯を予防または抑制するための口腔用組成物
を提供する。

下記において本発明の詳細な説明する。

自然相ＩＩＩ株ストレプトコッカス・ミュウタンスＴＭ
Ｄ−ＮＣ４９（微工研条寄３１８号）を親株として、長
世代培地に継代培養すると、前記のとおり性状の異なる
微生物が得られる。得られた微生物はストレプトコッカ
スｓｐ、６４８０と命名され、■９８９年１２月２５日
微工研に寄託された（微工研菌寄１１１７０号）。

６４８０株の非う蝕性等の生物学的性状は、特記しない
かぎり親株ＴＭＤ−ＮＣ４９の性状と実質的に同一であ
る。

下表において、Ａは代表的なＳＭの自然相Ｉ株ＮＣＴＣ
ｌ　０４４９　（ＡＴＣＣ２５１７５）、Ｂは親株ＴＭ
Ｄ−ＮＣ４９、Ｃは６４８０株、Ｄは人工的相ＩＩＩ株
ＳＭ弱毒株に一１１１微工研条寄第３１６号）で、ＳＴ
ＲはストレプトコッカスＡＴＣＣｌ　５９１０である。

ＤＰＳ形成１立邂マンニトール　＋ソルビトール　＋メリピオース　＋ｌ！！ｔｉ　（１０乳酸　　　　２．２７酸　　　　　０．１８＋　　　　　　　± ＋２．２１　　　　２．１６　　　　２．５１０　　　　
　　０　　　　　　０、０８各種ストレプトコッカスの
抗原性を示す第３表において（第１表全照）サンギスは
ＳＴＲサンギス（ＡＴＣＣ１５９１４）、ミチスは同ミ
チス（ＡＴＣＣ９８１１）である。

第３表は、コーリー（Ｋｏｈｌｙ　Ａ　、Ｅ、　）等の
方法（ＡＩ）Ｉ）ｌｉｅｄ旧ｃｒｏｂｉｏ１．、２８：
　８３６．１９７４）により各種ストレプトコッカスの
菌体から抽出した多糖抗原を用いて、抗口腔ＳＴＲ属微
生物の血清に対するゲル内沈降反応を調へた結果をしめ
ず（第１表蚕照）。

Ａ　　　　　　　　＋十　　　　士　　　　士　　　　
　　十すンギス　＋＋十−＋ミチス＋　＋＋例えば、バーシース・マニュアル・オブ・デターミネイ
チブ・バクテリオロシー（Ｂｅｒｇｙ’ｓＭａｎｕａｌ
　ｏｆ　Ｄｅｔ、ｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ）１９８９年、ｌ　０５５頁によると、Ｓ
Ｍのマンニトール、ソルビトール及びメリピオース分解
能は陽性である。人の口腔から分離された自然相ＩＩＩ
株もう蝕性ＳＭ野生株を変異処理して得られた人工的相
ＩＩＩ株ＳＭ弱毒株Ｋ　−ＩＩＩｆ微工研条寄３１６号
も同様に陽性であるが、６４８０株のこれらの糖分解能
は、実質的に陰性である。

親株ＴＭＤ−ＮＣ４９は、抗すンギス血清に対して実質
的に陽性のゲル内沈降反応を示す。

６４８０株の作成。

６４８０株を得るための継代培養は、親株をＳＴＲ属微
生物培養に用いられる各種の公知の培地を用いて行うこ
とができる。実用的には液体培地を用いる嫌気培養がよ
い。

本発明者が試験に用いた培地の例をあげる。

（１）トッド・ヒュウイット・ブロス（米国ＢＢＬ社製
）。

（２）スキムミルク培地（スキムミルク５％、イースト
エキス０５％）。

培養はｐＨ５，６−９，０（例えば７０）温度２３−３
９℃（例えば３７℃）で、１８−７２時間、通常は嫌気
的に行われる。

長世代にねたり継代培養すると、前記の３種の糖分解能
は、実質的陽性から疑陽性を経て実質的陰性に変わる。

培養中に両株の不利な干渉は認められない。継代培養の
回数は、使用される培地等の培養条件によって異なり、
例えば８０−２００回以上である。

例えば、第１回目の培養終了後５少量の培養物を寒天培
地に移し同様の条件で培養する。こうして得られたコロ
ニーを前記の性状を基準として調べて選別し、選ばれた
コロニーを次の継代培養に何する。このような培養と選
別との組合わせ（以下クローニングという）によって所
望の微生物を得ることができる。選別のための培養は適
時行えばよく、各継代培養ごとに行う必要はない。異な
る培地を用いて継代培養することもできる。

公知のう蝕性ＳＭ相■株および人工相ＩＩＩ株Ｋ　−Ｉ
ＩＩを長期間継代培養しても、本発明による微生物は得
られなかった。

６４８０株の用法及び組成物。

６４８０株は親株と実質的に同一の非う蝕性をもつので
、親株と同様な方法でＳＴＲ属細菌及び食用乳酸菌によ
って誘発される人および哺乳動物の虫歯の効果的予防ま
たは抑制に用いることができる。

所望により、６４８０株の生菌体の一部を、１種以上の
大型自然相ＩＩＩ株の生菌体に替えることができる。と
くにクローニングの初期において、同じ培地中に親株と
６４８０株とが共存するので、この場合、培養液中の両
者の比率にかかわらず、継代培養を中止して、培養物を
虫歯抑制に供することができる。

所望により、培養液をそのまま人または哺乳動物の口腔
に投与してもよいが、実用的には、例えば、培養液から
常法（例えば遠心処理、８０００ｒ、　ｐ、　ｍ、　）
により菌体を分離し、適当な緩衝液（例えば燐酸緩衝液
）（ｐＨ６，８−７，０）に加えで、凍結乾燥して長期
間保存することができる。

組成物は、固体でも、液体でも、または飴状の半固体で
もよい。適当な液状担体の例は、水、シロップ、獣乳で
ある。食用乳酸菌の生菌体を含むヨーグルト等の混合飲
料は、口腔内の乳酸菌によるう蝕誘発も抑制するので、
とくに有利である。

例えば、人に対して、ｓｐ、６４８０株単独または１種
以上の大型自然相ＩＩＩ株と混合した生菌体ｔｏ　　−
１０９／ｍｌを含む液状組成物５〇−１００ｍ１を毎日
１回食後に投与すると、投与開始後約１−２週間−から
口腔内のう蝕性ＳＭの濃度漸減が認められた。

下記の試験例２は、人Ｉ及びＩＩ型ＳＭに感染された人
のう蝕抑制試験であるが、へＩＩ型（ｄ型）に感染され
た人のう蝕抑制効果は人■型（Ｃ型）の結果と実用的に
著差を認めなかった。その理由は、プラーク形成能抑制
能は、ＳＭの血清型と直接の関係がないからである。

人のＳＭの感染による犬、猫等の哺乳動物の虫歯が最近
問題になっている。本発明者が多数の飼い大を調へた結
果、約６０％にＳＭが認められたが、このＳＭは人から
感染したものと思われる。

本発明によるｓｐ、６４８０株または自然相ＩＮ株の１
種以上との生菌体の単独または組み合わせ投与によって
、虫歯誘発を効果的に抑制することができる。このため
に、培養液または生菌体を餌に混ぜてもよい。

及凰訓下記の非限定的実施例および試験例により本発明を説明
する。下記において、培養は、ガスパックシステム（米
国ＢＢＬ製）を用い嫌気条件において温度３７℃で行っ
た。４９株とは、ストレプトコッカス・ミュウタンスＴ
ＭＤ−ＮＣ４９（微工研条寄第３１８号）、６４８０株
とは、ストレプトコッカスｓｐ、６４８０　（微工研菌
寄第１１１７０号）である。う蝕誘発に用いたＳＡはＮ
ＣＴＣｌ　０４４９　（ＡＴＣＣ２５１７５）である。

害ＪＪ引工６４８０株のＲ製。

４９株を前記のスキムミルク培地（５ｍｌ）で１８時間
培養し、培養物（１白金耳）をＴＹＣ寒天培地（１５ｍ
ｌ、掻東製薬製）に移してさらに４８時間培養した。得
られたコロニーを前記の糖分解を基準として選別した。

選別されたコロニを前記と同様の方法で１５０回継代培
養した。得られた培養液の微生物の性状を調べた後、常
法により遠心処理（８００（ｌ　ｒ、ｐ、ｍ／　１０分
間）し、所望の６４８０株を回収した。

友ｉ亘孟ステッキ製剤。

マルトース（０，７５ｇ）とラクトース（０，２５ｇ）
とからなるｋｇの粉剤チューブに実施例１記載の６４８
０生菌体を加え、含有量１０６ＣＦＵのチューブ製剤を
常法により製造した。

Ｋ鬼五Ａ錠剤。

マルトース（１，５ｇ）　、ラクトース（０，５ｇ）蔗
糖脂肪酸エステル（０，１ｇ）を用い、実施例１記載の
ｓｐ、６４８０株の生菌体含有量１０６ＣＦＬＩの錠剤
を常法により製造した。

式■上」動物の虫歯抑制試験６コールデン・ハムスター（雄雌２生後２１日）を用いて
４０日間試験した。

第１群（動物数１０）と第２群（動物数９）とは、経口
的にう蝕性ＳＭ　（ＡＴＣＣ２７１７５ＮＣＴＣ１０４
４９）を感染させた後、第１群は４９株、第１．３群は
ｓｐ、６４８０株の生菌体１０６個を口腔内に投与した
。第３群（動物数１１）はＳＭ未感染で６４８０株を投
与した。各群をダイエツト２０００　（う蝕誘発飼料、
船橋農場製）で飼育した。第４群（動物数９）は第１対
照群で３Ｍ感染後未処理。第５群（動物数１１）は第２
対照群で、ＳＭ未感染でう蝕誘発祠料を与えた。

４９株または６４８０株の経口投与量は、毎日１回生菌
体約１０６個であった。

第４表は、６４８０株も親株ＴＭＤ−ＮＣ４９もＳＭに
より誘発される虫歯を、有意義差なく効果的に抑制する
ことを示す。

１丘１群　　　Ａ　　　　　　　　　Ｂ１　　　１０５．４　　　　１２．８±０６３２　　　
１７３．８　　　　１．０±０．８６３　　　１６０．
４　　　１１．９±０．４４　　　１８４．０　　　１
２．７±１，３９５　　　１５７．１　　　１１．７±
０７８ＣＩ　　　　　　　Ｃ２５０１，１０±１８２８４４　　０．７７±１．３０１８　　　０．２７±０．６４１００　　５２２±３８０９　　０１８±０．６０（註）Ａは体重増加（ｇ）、Ｂは歯垢スコア、ヒトの虫
歯抑制試験。

人Ｉ型（Ｃ型）及びＩＩ（ｄ型）ＳＭに感染された成人
男女１６人（２０−２８才）に毎日１回就寝前に実施例
３記載の錠剤１錠を与え、口腔内で溶解させ１５分間以
上保持させた。試験期間は４０日であった。第５表は投
与前と投与後の歯垢付着指数を示す。第６表は投与前と
投与後のう蝕性ＳＭの減少を示す。

４．２３．８２．０７３０２２５３．２１．５３．２２．０７３２．２０９ −１．０一〇、５ ±００１）５４２＋０３１５ ±０ −１．２＋０５＋　０．１ ±０２０５９ −１．８２０５ −０．８ −１．０ −１．０４５９ ±００３０５ −０．３ −０．９０７一〇、９ −１．０十〇 −（）５１５１２０ −１．２５ −１．２２＋（１，１０３一〇、５＝０６ ±Ｏ０７（本単位。プラーク・スコア）６　　ＳＭ菌　　　′ 平均１７１．２３７９０．２２　　０．９４０．４９３６込）１遍旦犬の虫歯抑制試験。

飼い犬雌雄６９頭の臼歯から採取した歯垢をグリセリン
１０％を含む３％ペプトン水溶液に加え凍結した。各材
料を加熱溶解後、ＴＹＣ寒天平板培地纒東製薬製）を用
いて温度３７℃、４８時間嫌気的に培養した。得られた
コロニーから採取した微生物の生物学的性状、血清学的
性状、その他の菌学的性状を常法によって調べた結果、
次のとおり３７頭（５３，６％）にＳＭの存在を認めた
。

血清型ｃ　−１５（４０，５％）血清型ｄ−４（１０，８％）同定不能−１８（４９％）ＳＭの宿主大ｌＯ頭に実施例２によって得られた製剤を
毎日１回１パック食後経口投与し、翌朝唾液中のＳＭの
数（単位ｘｌＯ４個／　ｍ　ｌ　）を調べた結果を法衣
に示す（本は同定不能）。

約２週間後より口腔内ＳＭの濃度減少が認められた。

第二弘前而　　型　　　　　″′　　　２週　　　　　　４週ｌ
　　　　　　ｃ　　　　　　１５０　　　　　　　１１
．１　　　　　　　　０２　　　　　ｃ　　　　　　　
４０　　　　　　　　　Ｄ　　　　　　　　　　　Ｏ３
＊　　　　　　　１３　　　　　　　　０　　　　　　
　　　　０４ｄ　　　　　　　　６　　　　　　　　０
　　　　　　　　　　０５　　　　　ｃ　　　　　　　
２９　　　　　　　　０　　　　　　　　　　０６　　
　　　ｃ　　　　　　２１１　　　　　　　　０　　　
　　　　　　　０７　　　　　ｃ　　　　　　　　８．
６　　　　　　１．５　　　　　　　　０８　　　　　
　本　　　　　　　　７５　　　　　　　　　　０　　
　　　　　　　　　　　０９　　　　　＊　　　　　　
３１３　　　　　　　　＋３　　　　　　　　　　０性
の非う蝕性微生物が得られる。得られた微生物を単独ま
たはＳＭ自然相ＩＩＩ株と組み合わせて、人及び哺乳類
の口腔内における虫歯予防及び抑制に効果的に用いるこ
とができる。

マンニトール、ソルビトール及びメリピオースの糖分解
と抗ストレプトコッカス・サンギス血清沈降反応とが実
質的に陽性で５継代培養により前記の糖分解と沈降反応
とが実質的に陰性に変わる能力をもつ大型非う蝕性微生
物ストレプトコッカス・ミュウタンスの相ＩＩＩ株を、
長期間継代培養すると、前記の糖分解と沈降反応とが実
質的に陰（自発的）手続補正書平成３年２月２２日平成２年　特許願　第３３３６９７号２、発明の名称　　非う蝕性微生物の製法及び非う蝕性
組成物３　補正をする者事件との関係　　特許出願人住所　　東京都港区白金五丁目９番１号名称　　北　里
　研　究　所（社団法人）代表者　大　村　　　　智４、代理人電話　　０３−３３５３−５５２１５、補正命令の日付　自発６、補正により増加する発明の数　　なし■）　明細書
の特許請求の範囲の記載を別紙のとおり補正する。

２）　明細書第４頁下から２行目、「第４１３３５７５号」を「第４１３３８７５号」に補
正する。

３）　同第１６頁１行目、ｆｌ　９８９年１２月２５日
」をｒ１９８９年１２月１９日」に補正する。

４）　同頁２行目、「微工研菌寄１１１７０号」を「微
工研条寄第３２１９号」に補正する。

５）　同第２１頁１０行目、ｒｌＯ７−１０”Ｊをｒｌ
Ｏ”−１０８４に補正する。

６）　同第２２頁下か６４〜３行目、「微工研菌寄第１
１１７０号」を「微工研条寄第３２１９号」に補正する
。

７）　別紙のとおり、原寄託についでの受託証（写）を
特徴する特許請求の範囲１）（イ）人の口腔から分離され、（ロ）人及び哺乳動
物の口腔内において虫歯誘発能能を実質的に欠如しかつ
う蝕性ストレプトコッカス微生物及び食用乳酸菌の増殖
を抑制することができ（ハ）継代培養によって、マンニ
トール、ソルビトール及びメリピオースの糖分解と抗ス
トレプトコッカス・サンギス血清に対するゲル内沈降反
応とが実質的陽性から実質的陰性に変わる能力をもつス
トレプトコッカス・ミュウタンスを親株として、前記の
糖分解と沈降反応とが実質的陰性に変わるまで培地に継
代培養し、得られた所望の微生物を培地から回収する工
程からなる非う蝕性微生物の製法。

２）親株がストレプトコッカス・ミュウタンスＴＭＤ−
ＮＣ４９（微工研条寄第３１６号）である請求項°ｌ記
載の方法。

３）得られた微生物がストレプトコッカスｓｐ．６４８
０　（微工研筆寄第３２１９号）である請求項１記載の
方法。

４）請求項ｌ記載の方法により得られた非う蝕性微生物
の生菌体を有効成分とし、経口投与に適する担体または
賦形剤を含有してなる、ストレプトコッカス属細菌及び
食用乳酸菌によって続発される人および哺乳動物の虫歯
を予防または抑制するための口腔用組成物。

５）請求項１記載の方法により得られた非う蝕性微生物
の生菌体及び人の口腔から分離され純粋培養され、人及
び哺乳動物の口腔内において虫歯誘発能能な実質的に欠
如しかつう蝕性ストレプトコッカス微生物及び食用乳酸
菌の増殖を抑制する能力をもつストレプトコッカスの生
菌体とを有効成分とする請求項３記載の口腔用組成物。

Claims

【特許請求の範囲】１）（イ）人の口腔から分離され、（ロ）人及び哺乳動
物の口腔内において虫歯誘発能能を実質的に欠如しかつ
う蝕性ストレプトコッカス微生物及び食用乳酸菌の増殖
を抑制することができ（ハ）継代培養によって、マンニ
トール、ソルビトール及びメリピオースの糖分解と抗ス
トレプトコッカス・サンギス血清に対するゲル内沈降反
応とが実質的陽性から実質的陰性に変わる能力をもつス
トレプトコッカス・ミュウタンスを親株として、前記の
糖分解と沈降反応とが実質的陰性に変わるまで培地に継
代培養し、得られた所望の微生物を培地から回収する工
程からなる非う蝕性微生物の製法。２）親株がストレプトコッカス・ミュウタンスＴＭＤ−
ＮＣ４９（微工研条寄第３１６号）である請求項１記載
の方法。３）得られた微生物がストレプトコッカスｓｐ．６４８
０（微工研菌寄第１１１７０号）である請求項１記載の
方法。４）請求項１記載の方法により得られた非う蝕性微生物
の生菌体を有効成分とし、経口投与に適する担体または
賦形剤を含有してなる、ストレプトコッカス属細菌及び
食用乳酸菌によって誘発される人および哺乳動物の虫歯
を予防または抑制するための口腔用組成物。５）請求項１記載の方法により得られた非う蝕性微生物
の生菌体及び人の口腔から分離され純粋培養され、人及
び哺乳動物の口腔内において虫歯誘発能能を実質的に欠
如しかつう蝕性ストレプトコッカス微生物及び食用乳酸
菌の増殖を抑制する能力をもつストレプトコッカスの生
菌体とを有効成分とする請求項３記載の口腔用組成物。