JPH0319692A - ファージφＣ３１の部位特異的な組込み機能の新規使用 - Google Patents
ファージφＣ３１の部位特異的な組込み機能の新規使用Info
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、ファージφＣ３１の部位特異的な組込み機能
を含むＤＮＡ配列を含有するブラスミト゛による放線菌
の形質転換方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、
ファージφＣ３１の部位特異的な組込み機能を含むＤＮ
Ａ配列とともに、ある種の抗生物質生合戊遺伝子を用い
て、ハイブリ，ド抗生物質を製造すること、および抗生
物質の産生を増大させることに関する。
を含むＤＮＡ配列を含有するブラスミト゛による放線菌
の形質転換方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、
ファージφＣ３１の部位特異的な組込み機能を含むＤＮ
Ａ配列とともに、ある種の抗生物質生合戊遺伝子を用い
て、ハイブリ，ド抗生物質を製造すること、および抗生
物質の産生を増大させることに関する。
【従来の技術】 ゛
抗生物質の生合或に関与しているタンパク質をコードし
ている遺伝子のインビボでの増幅は、該抗生物質の産生
を増加させるのに有用である。放線菌においては、この
増幅のための一般的な方法は自律的に複製するプラスミ
ドによるものであった。ストレプトマイセス属のクロー
ニング系の概要については、ホノプウット等［１１ｏｐ
ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１５３Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１６ （１９８７）］およ
びホップウッド等［Ｈｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，９
Ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ１５９ （１！１８６）］
を参照。
ている遺伝子のインビボでの増幅は、該抗生物質の産生
を増加させるのに有用である。放線菌においては、この
増幅のための一般的な方法は自律的に複製するプラスミ
ドによるものであった。ストレプトマイセス属のクロー
ニング系の概要については、ホノプウット等［１１ｏｐ
ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１５３Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１６ （１９８７）］およ
びホップウッド等［Ｈｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，９
Ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ１５９ （１！１８６）］
を参照。
本発明は、ハイブリット抗生物質などの新規産物の生戊
を導く異種遺伝子を付加する方法、およ１０ びある遺伝子の量を増加させる方法を提供するものであ
る。本発明の方法は、自律的に複製するプラスミドによ
る方法を凌ぐ多くの利点を有している。 ファージφＣ３１の部位特異的な絹込み機能を含んでい
るプラスミドを用いて、選択した遺伝子のコピーを多数
の別宿主の染色体中に永久的に絹込むことができる。本
ベクターはこれらの宿主を極めて効率的に形質転換する
ことかてきる。これらベクターの一部は放線菌の複製起
源を有していないので、これらプラスミドは放線菌宿主
中では自律的に複製するベクターとして存在することが
できない。これらプラスミドは宿主中で組込まれた形態
でのみ存在する。組込まれた形態は極めて安定であり、
抗生物質の選択圧をかけることなく遺伝子のコピーが維
持されることを可能にする。 この結果は、発酵過程のコスト、効率、および安定性の
点から極めて有益である。 本絹込みベクターを用いて、ハイブリノド抗生物質もし
くはその他の新規２次中間代謝物なとの新規産物を生成
させるか、または既知産物の収量を増加させる遺伝子を
組込むことかできる。また、このベクターを用いて、あ
る菌株に抗生物質ｍｌ性遺伝子を組込み、この菌株が通
常は感受性である化合物を用いる生物変換を行わせるこ
とができる。 得られた形質転換宿主および抗生物質の製造方法は本発
明の範囲内に含まれる。
を導く異種遺伝子を付加する方法、およ１０ びある遺伝子の量を増加させる方法を提供するものであ
る。本発明の方法は、自律的に複製するプラスミドによ
る方法を凌ぐ多くの利点を有している。 ファージφＣ３１の部位特異的な絹込み機能を含んでい
るプラスミドを用いて、選択した遺伝子のコピーを多数
の別宿主の染色体中に永久的に絹込むことができる。本
ベクターはこれらの宿主を極めて効率的に形質転換する
ことかてきる。これらベクターの一部は放線菌の複製起
源を有していないので、これらプラスミドは放線菌宿主
中では自律的に複製するベクターとして存在することが
できない。これらプラスミドは宿主中で組込まれた形態
でのみ存在する。組込まれた形態は極めて安定であり、
抗生物質の選択圧をかけることなく遺伝子のコピーが維
持されることを可能にする。 この結果は、発酵過程のコスト、効率、および安定性の
点から極めて有益である。 本絹込みベクターを用いて、ハイブリノド抗生物質もし
くはその他の新規２次中間代謝物なとの新規産物を生成
させるか、または既知産物の収量を増加させる遺伝子を
組込むことかできる。また、このベクターを用いて、あ
る菌株に抗生物質ｍｌ性遺伝子を組込み、この菌株が通
常は感受性である化合物を用いる生物変換を行わせるこ
とができる。 得られた形質転換宿主および抗生物質の製造方法は本発
明の範囲内に含まれる。
本発明は、抗生物質産生ストレプ１・マイセスおよび関
連生物におけるクローン化遺伝子の導入および維持に大
きな進歩をもたらすものである。本発明はアクチノファ
ージφＣ３］［チャター等（Ｃｈａｔｅｒ ｅｔ ａｌ
．，Ｇｅｎｅ １９ ： ２１−３２ （１９８２））
］の〜２ｋｂフラグメントを利用することに基ついてい
る。このフラグメン１・を含有するベクターであるプラ
スミ ドｐＫＣ７９６は、Ｎ Ｒ Ｒ Ｌ （Ｎｏｒ
ｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｐｅｏｒｉａ ｌｌｌｉｎｏ
ｉｓ ６１６０４）から受託番号Ｂ−１ ８４ ７７（
寄託日： １９８９年４月４日）のもとで入手すること
ができる。このプラスミドはブダペスト条約に則って寄
託が為されている。ｐＫＣ７９６の制限地図については
第１図を参照。 本明細書に開示した発明のために以下の用語を定義する
。 抗生物質：微生物によって産生される物質であって、天
然に、または限定された化学的修飾を受けた後、他の微
生物または真核細胞の増殖を阻害するかまたは死滅させ
る物質。 抗生物質生合成遺伝子・１次中間代謝物を抗生物質中間
体（抗生物質活性を有していることもある）に、次いで
抗生物質に変換する過程における酵素反応に必要な酵素
活性をコートしているか、または該酵素活性の発現を調
節する産物をコードしているＤＮＡセグメント。 抗生物質生合成経路：１次中間代謝物を抗生物質中間体
に、次いで抗生物質に変換する過程に必要な一群の抗生
物質生合成遺伝子および生化学反応。 抗生物質産生微生物：抗生物質を産生ずるか、または発
現したときには抗生物質を産生させるであろう遺伝子を
含有しているあらゆる微生物であって、アクチノブラ不
ス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、アクチノマズラ（Ａ
ｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）、セフ７０スポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉ
ｕｍ）、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏ
ｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌ１ｉｕｍ）、ノ
カルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、およびス１・レプトマ
イセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含むが、これら
に限定はされない。 抗生物質耐性付与遺伝子 ある抗生物質に対する耐性を
付与する活性をコードしているＤＮＡセグメント。 ＡｍＲ アブラマイシン耐性の表現型またはそれを付
与する遺伝子。 ＡｐＲ：アンピンリン耐性の表現型またはそれを付与す
る遺伝子。 ａｔｔＰ：宿主染色体中への組込みのためのファ一ジφ
Ｃ３１の付着部位。 ｃｏｓ部位，ラムダ（λ）の付着末端配列。 宿主細胞二組換えＤＮＡクローニングベクターで形質転
換されうる生物であって、その生存プロ１３ Ｉ４ トプラス１・を含む。 ハイブリソド抗生物質：元の宿主細胞によって産生され
る抗生物質を修飾することか可能な酵素をコートしてい
る異種の抗生物質生合成遺伝子が抗生物質産生微生物中
に導入されたときに産生される抗生物質。 組込みベクター 宿主細胞に導入されたときに該宿主細
胞内で自律的に複製せず、代わりに絹換えによって宿主
染色体中に組込まれるベクターｏｒｉ 本明細書に添
付した図面においては、大腸閑の複製起源。 組換えＤＮＡクローニングベクター・別のＤＮＡを付加
したか、または付加することができるＤＮＡ分子からな
る、選択可能な、自律的に複製するか、または染色体に
組込まれるあらゆる媒体であり、プラスミドおよびファ
一／を含むかこれらに限定はされない。 ｒｅｐ ：本明細書に添付した図面においては、ス｝・
レプ１・マイセス属ブラスミトの複製起源。 制限フラグメント：１またはそれ以上の制限酵素の作用
によって生成するあらゆる直線状のＤＮＡ。 感受性宿主細胞 ある抗生物質の存在下では、その抗生
物質に対する耐性を付与するＤＮＡセグメントがないと
増殖することができない宿主細胞であって、その生存プ
ロトプラストを含む。 部位特異的な組込み・ブラスミト”あるいはファ−ジに
よってフードされている特異的な絹換え系（ｉｎｔ）な
らびに特異的な細菌性付着部位（ａｔｔＢ）およびプラ
スミドあるいはファージ付着部位（ａｔｔＰ）を利用す
る、ベクターによる宿主染色体への絹込みの過程。 形質転換体 形質転換を受けた受容宿主細胞であって、
その生存プロトプラス１・を含む。 形質転換．受容宿主細胞の遺伝子型が変化する結果にな
る、受容宿主細胞（その生存プロトプラストを含む）へ
のＤＮＡの導入と、その後の該ＤＮＡの維持。 ｔｓｒ ：チオストレプトン耐性の表現型またはそれを
付与する遺伝子。 本明細書に添付した図面に示されている制限部位および
機能地図は、本明細書に記載した組換えＤＮΔベクター
の概要を図示するものてある。地図上の制限部位の間隔
はベクター上の制限部位の実際の間隔に比例しているか
、観察される制限部位の距離が、計算された地図」二の
距離と若干異なっていることもある。この地図は、ある
制限酵素の切断部位を必ずしも全て挙げているものでは
ない。 従って、ベクター」二には地図に示されているよりも多
数のある種類の制限部位か存在していることもある。 第１図は、ブラスミトｐＫＣ７９６の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第２図は、プラスミドｐＯＪｌ７］の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第３図は、プラスミドｐｏ Ｊ ２ ４ ２の制限部位
および機能地図を示す模式図であり、 第４図は、プラスミドｐＯＪ２４３の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第５図は、プラスミドｐＨ Ｊ Ｉ− ２．８ ０の制
限部位および機能地図を示す模式図であり、第６図は、
プラスミドｐｓＫｃ５０の制限部位および機能地図を示
す模式図であり、 第７図は、プラスミドｐｓＫｃ５１の制限部位および機
能地図を示す模式図である。 本発明は、放線菌ファージφＣ３］の部位特異的な組込
み機能を含んでいるプラスミドベクターを提供するもの
である。以下に示すこの領域のＤＮＡ配列は本発明前に
は知られていなかったものである。この配列の一方の鎖
だけを、５→３゛の方向て示ず。 ｌ７ １８ １ ＣＧＴＣＣＣＧＴＡＣ ＡＡＣＧＴＣＧＣＧＣ
ＧＴＧＡＧＣＧＧＧＴ ＣＧＧＴｒＣＣＧＧＴ ＧＡＡ
ＧＡＧＡＴＡＣ１５１ ＧＣＧＣＧＣＴＧＣＣ ＣＣ
ＡＧＧＡＣＧＡＣ ＧＡＣＧＧＣＧＡＧＣ ＣＧＧＴＧ
ＡＣＧＣＴ ＣＧＡＡＴＧＧＣＧＴ２０１ ＴＣＧＣ
ＧＧＴＣＧＧ ＣＧＧＣＧＴＡＴＧＡ ＣＴＧＧＣＴＣ
ＧＣＣ ＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣ ＡＧＡＣＧＴＧＧＣＡ
２５１ ＧＡＴＧＴＧＧＧＡＧ ＣＧＣＡＣＧＧＧＧ
Ｃ ＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡ ＣＧＴＣＣＣＧＭＧ ＧＣ
ＧＴＧＧＣＧＣＧＡａ仁ＩＩ ３０１ ＧＣＴＴＣＣＣＣＧＴ ＧＣＣＧＧＡＧＣＭ
ＴＣＧＣＣＣＴＧＧＧ ＴＧＧＧＴＴＡＣＡＣ ＧＡ
ＣＧＣＣＣＣＴＣ３５１ ＴＡＴＧＧＣＣＣＧＴ Ａ
ＣＴＧＡＣＧＧＡＣ ＡＣＡＣＣＧＡＡＧＣ ＣＣＣＧ
ＧＣＧＧＣＡ ＡＣＣＣＴＣＡＧＣＧ４０１ ＧＡＴ
ＧＣＣＣＣＧＧ ＧＧＣＴＴＣＡＣＧＴ ＴＴＴＣＣＣ
ＡＧＧＴ ＣＡＧＡＡＧＣＧＧＴ ＴＴＴＣＧＧＧＡＧ
Ｔ６０１ ＡＧＣＧＡＣＡＣＡＧ ＣＧＴＡＧＣＧＣ
ＣＡ ＡＣＧＡＡＧＡＣＡＡ ＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣ
ＣＴＴＣＡＧＣＧＣＧ６５１ ＡＡＧＴＣＧＡＧＣＧ
ＣＧＡＣＧＧＧＧＧＣ ＣＧＧＴＴＣＡＧＧＴ ＴＣ
ＧＴＣＧＧＧＣＡ ＴＴＴＣＡＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＡ
ＴＴＧＣ ＧＧＡＣＣＧＡＴＣＡ ＴＣＧＡＧＣＣＣＧ
Ｃ ＴＧＡＧＴＧＧＴＡＴ ＧＡＧＣＴＴＣＡＧＧＣＧ
ＴＧＧＴＴＧＧＡ ＣＧＧＣＡＧＧＧＧＧ ＣＧＣＧＧ
ＣＡＡＧＧ ＧＧＣＴＴｒＣＣＣＧ ＧＧＧＧＣＡＡＧ
ＣＣＡｎＣＴＧＴＣＣＧ ＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡ ＧＣ
ＴＧＴＡＣＴＧＣ ＧＡＧＴＧＴＧＧＣＧ ＣＣＧＴＣ
ＡＴＧＡＣｎＣＧｋＡＧＣＧＣ ＧＧＧＧＡＡＧＡＡＴ
ＣＧＡＴＣＡＡＧＧＡ ＣＴＣＴＴＡＣＣＧＣ ＴＧ
ＣＣＧＴＣＧＣＣＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴ ＣＧＡＣＣＣ
ＧＴＣＣ ＧＣＡＣＣＴＧＧＧＣ ＡＧＣＡＣＧＡＡＧ
Ｇ ＣＡＣＧＴＧＣＡＡＣＧＴＣＡＧＣＡＴＧＧ ＣＧ
ＧＣＡＣＴＣＧＡ ＣＡＡＧＴＴＣＧＴＴ ＧＣＧＧＡ
ＡＣＧＣＡ ＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡ１９０１ １９５１ ２００１ ２０５１ ２１０１ ＣＧＧＧＣＧＡＡＣＣ ＴＴＧＴＴＧＣＧＧＡ ＧＣＧ
ＣＧＣＣＧＡＣ ＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧ ＣＣＣＴｒＧ
ＡＡＧＡｃｃＴＧＴＡｃＧＡＡ ＧＡＣＣＧＣＧＣＧＧ
ＣＡＧＧＣＧＣＧＴＡ ＣＧＡＣＧＧＡＣＣＣ ＧＴ
ＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＣＧ ＧＭＧＣＡＡ
ＣＡＧ ＧＣＡＧＣＧＣＴＧＡ ＣＧＣＴＣＣＧＧＣＡ
ＧＣＡＡＧＧＧＧＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣ ＴＴＧ
ＣＣＧＡＡＣＴ ＴＧＡＡＧＣＣＧＣＣ ＧＡＡＧＣＣ
ＣＣＧＡ ＡＧＣＴＴＣＣＣＣＴＴＧＡＣＣＡＡＴＧＧ
ＴＴＣＣＣＣＧＡＡＧ ＡＣＧＣＣＧＡＣＧＣ ＴＧ
ＡＣＣＣＧＡＣＣ ＧＧＣＣＣＴＭＧＴ９０１ ＣＴ
ｒＣＣＧＧＣＡＧ ＧＧＡＡＡＣＧＴＣＡ ＴＧＧＡＣ
ＣＴＧＡＴ ＴＣＡＣＣＴＧＡＴＴ ＡＴＧＣＧＧＣＴ
ＣＧＣＧＧＣＴＴＣＧＡＧ ＣＴＴＧＴＴＴＣＧＧ Ａ
ＧＡＣＧＡＡＧＧＡ ＧＡＴＣＡＣＧＣＧＣ ＡＡＣＧ
ＧＣＣＧＡＡＴＧＧＴＣＡＡＴＧＴ ＣＧＴＣＡＴＣＡ
ＡＣ ＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣ ＡＣＴＣＧＡＣＣＡＣ
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ＧＧＴ ＧＧＣＧＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＣＧＣＡＣ
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ＴＴＣＧＣＣＧＣＴＧＡＧＧＴ ＧＡＴＣＴＡＣＡＡＧ
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ＣＡ ＧＣＧＣＧＡＣＣＣＧ ＡＴＣＡＣＧＣＴＣＣ
ＧＧＣＣＧＧＴＣＧＡ９ ２８５１ ＣＣＧＴＣＧＧＧＧＧ ＧＣＴＣＡＡＴＧ
ＡＧ ＣＧＧＡＴＡＣＡＣＡ ＡＴＣＧＣＴｒＧＧＣ
ＴＣＧＣＡＴＧＧＣＴ２０ ３０５１ ＧＧＣＣＴＴＣＡＴＧ ＧＧＴＴＧＧＣＴ
ＣＡ ＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴ ＣＡＴＧＡＣＧＧＧＣ
ＧＧＴＣＧＣＴＴＣＴ３１０１ ＡＧＣＸＣＴＧＣＣ
Ｇ ＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴ ＡＣＴＣＡＣＧＴＧＡ Ｇ
ＴＡＧＧＴＡＧＧＧ ＧＧＧＴＧＴＣＧＡＣ３３０１
ＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴ ＡＴＣＧＣＣＣＧＴＧ ＧＧ
ＡＡＣＡＡＣＧＣ ＴＧＣＧＧＣＧＡＡＧ ＡＴＧＣＧ
ＴＣＧＴＧ３３５１ ＣＴＡＴＣＣＧＴＡＡ ＧＧＣ
ＡＧＴＧＧＧＣ ＧＣＧＣＡＣＴＧＴＧ ＣＴＡＣＣＴ
ＧＣＣＴ ＧＧＧＴＴＧＧＴＡＣ３４０１ Ｃ 上記の配列中、Ａはテオキンアテニル残基、Ｇはテオキ
ングアニル残基、Ｃはテオキ／冫チ／ル残基、Ｔはチミ
ジル残基、モしてＸはデオキンアデニル、デオキシ／チ
ジル、デオキングアニル、またはチミンル残基である。 部泣特異的な組込みに必要なＤ Ｎ Ａ要素の全てを含
有しているＤＮＡ配列は、上記配列の位置２７９て始ま
るＡａｔｌｌ制限部位（下線部）と位置２３６９の下線
を引いたチミシルヌクレオチドによって囲まれている。 この配列を含有するプラスミドは放線菌を極めて高率で
形質転換する。このプラスミドは、この配列を含有して
いるファーシク口ニングヘクタ−［ノユアレッおよびチ
ャター（Ｓｕａｒｅｚ． Ｊ． Ｅ． ａｎｄ Ｃｈａ
ｔｅｒ， Ｋ． Ｆ． ． Ｎａｔｕｒｅ ２８６ ：
５２７−５２９ （＋９ｇｏ））ｒよりも優れている
（プラスミドにクロ−ンすることができるＤＮＡ量に対
する制限か少ない）。ファージベクターのクローニング
能力は、パ，ケーシングされ得るＤＮＡｔに制限される
。 このフラグメン１・を含有させて創製することかできる
ベクターの多様性には実質的に制限がないことを理解す
るのは当業者には容易であろう。唯一の絶対的な要件は
、構築か行われる宿主細胞、例えば天腸菌（Ｅ． ｃｏ
ｔ ｉ）またはバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）において
機能する複製起源をこのプラスミドが含有していること
である。放線菌の複製起源は必要ではない。事実、φＣ
３１フラグメントを含有している好ましいプラスミドは
放線菌の複製起源を含有していない。抗生物質耐性遺伝
子、多重クロニング部位、およびｃｏｓ部位などの他の
特性が有用であるか、必須ではない。コスミドンヤトル
ベクターの調製および使用についての記述を、ラオ等［
Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，１９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３ ： １６６−１
９８ （Ｒ． Ｗｕ ａｎｄ Ｌ． Ｇｒｏｓｓｍａｎ
， ａｄｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ）
］に見ることができる。要するに、φＣ３１フラグメン
トを含有し、ファージプラー２１ ２２ クを生成しないあらゆるプラスミトか本発明の範四内に
含まれる。 本発明の好ましい態様はプラスミドｐＫＣ７９６である
（第１図を参照）。このプラスミ１・は、フラスミトの
構築を容易にするｐＵＣプラスミド［ベセスタ・リサー
チ・ラホラ１・リーズ社（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｐ．０
．Ｂｏｘ ５７７ ＧａｉＬｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ
２０７６０）から人手可能］由来の大腸菌複製起源を有
している。犬腸閑てのプラスミドの構築はス］・レプト
マイセス属で行う構築に比へて簡単かつホ速であるので
、最初の段階の全てを犬腸菌中て行うことかてきるのが
好都合である。その後、最終生成物たけを、抗生物質製
造に用いるためにストレブトマイセス属に導入する。 本ベクターはスｌ・レプトマイセス属の複製起源を有し
ておらず、これは組込みベクターにおいては極めて好都
合てある。染色体中の複数の複製起源は構築の不安定性
を導くこともある。ストレプトマイセス属の複製起源と
組込み機能を有するベクターの形質転換率か、とちらか
の機能だけを有するベクターの形質転換率に比へて極め
て低いことか実験によって示されていた。この結果は不
安定性の問題によるものてあるのかもしれない。 また、プラスミドｐＫＣ７９６はストレプ］・マイセス
属ファージφＣ３１の付着部位（ａｔｔ Ｐ ）ヲ含有
している［チャター等（Ｃｈａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．．
Ｇｅｎｅ１９ ： ２１−３２ （＋９８２））コ。こ
の部位はφＣ３１由来の〜４ｋｂ Ｃｌａｒ−Ｋｐｎｌ
フラグメント上に存在ずる。ａｌｌ Ｐおよびａｃｔ
Ｂ部位を認識するタンパク質（群）は染色体中への部位
特異的な組込みを行わしめる。絹込みが為されたときに
は、この構築物は極めて安定であり、実質的には天然の
状態に逆戻りしない。組込みの部位特異的な性質は組込
み体の分析を容易にする。 さらに、プラスミドｐＫＣ７９６は、大腸閑とス１・レ
プトマイセス属の両方で好都合に選択されつるアブラマ
イ／ン耐性遺伝子を含有している。 ストレプトマイセス属における形質転換過程中でのアブ
ラマイシン選択は、ベクター」二にストレプトマイセス
属複製起源が存在しないということから、組込みか起こ
ったことを確実なものにする。 組込まれたＤＮＡか安定であるので、次いて、所望の表
現型が失われるということを懸念することなくアブラマ
インン選択を除くことがてきる。 本ベクターはｌａｃα（β−ガラクトシターゼ）遺伝子
内に多重クローニング部位を含んている。利用可能なク
ローニング部位については第１図を参照。 挿入体を含むｐＫＣ７９６プラスミドを保持している犬
腸菌形質転換体は、Ｘガル（５−ブロモ４−クロロ−３
−インドリルーβ一Ｄ−ガラクト／ド）およびＩ ＰＴ
Ｇ（イソフロビルーβ一Ｄ−チオガラクトンド）を含む
培地て増殖させたときに、白色コロニー（青色と対照的
に）として容易に検出される。 本発明の最も重要な長所の１つは、極めて高率で多数の
放線菌株を形質転換する本ベクターの能力である。以下
に挙げる表は、プラスミドｐＫＣ７９６によるいくつか
の代表的な形質転換の結果を示すものである。 第１表 菌 株 Ｓ．アンボファシエンス Ｓ．グリセオフスカス Ｓ．リビタンス Ｓ リプマニ Ｓ フランエ Ｓサーモトレランス アミコラトプシス・オリエンタリス およその形質転換 頻度（ＤＮＡ１μ９あたり） 〉１０６ 〉１０６ 〉１０° 〉］０４ 〉１０″ 〉１０３ 〉１０２ 以下の表は、本発明を適用することかできる抗生物質産
生微生物を列挙するものてあるが、全てを挙げるもので
はない。また、ある場合には、本発明を用いて生戊物の
量の増加、あるいは抗生物質以外の新規産物を得ること
もてきる。 ２５ ２６ 多数の種 種々のアミノサイ クリトール類 ミクロモノスボラ属（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）
多数の種 ケンタマイシ
ン類サツ力口ボリスボラ属（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙ
ｓｐｏｒａ）多数の種
種々のアミノサイクリトール類 ストレブトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ア
ルボグリセオラス（ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）アル
プス変種メタマインヌス（ａｌｂｕｓｖａｒ． ｍｅｔ
ａｍｙｃｉｎｕｓ） アクアカヌス（ａｑｕａｃａｎｕｓ） アトロファ／エンス（ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ）ビキニ
エンシス（ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ）プルエンシス変種
プルエンシス （ｂｌｕｅｎｓｉｓ ｖａｒ． ｂｌｕｅｎｓｉｓ）カ
ヌス（ｃａｎｕｓ） カテヌラエ（ｃａｔｅｎｕｌａｅ） クレストマイセチクス（ｃｈｒｅｓｔｏｍｙｃｅＬｉｅ
ｕｓ） クリスタリヌス（ｃｒｙｓｔａｌ ｌ ｉｎｕｓ）エリ
スロクロモゲ不ス変種ナルトエ ンンス（ｅｒｙｔｈｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｖａ
ｒ不オマイシン類 メタマイシン Ｎ−メチルハイグロ マイシンＢ ハイグロマイシン類 ストレプトマインン ブルエンソマイシン リボンルパロマミン カテヌリン アミノンジン ハイグロマイシンＡ エウロシジクス（ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ）フラジエ（
ｆｒａｄｉａｅ） Ａｌ６３１６−Ｃ ハイブリマインン類 および不オマイシン類 フランエ変種イタリクス（ｆｒａｄｉａｅｖａｒ． ｉ
ｔａｌｉｃｕｓ） ガルブス（ｇａｌｂｕｓ） グリセウス（ｇｒｉｓｅｕｓ） グリセオフラパス（ｇｒｉｓｅｏｌ’ ｌａｖｕｓ）ホ
フエンシス（ｈｏｆ ｕｅｎｓ ｉｓ）ハイグロスコピ
カス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）アミノンジン ストレプトマインン ストレプ１・マインン ＭＡＩ２６７ セルドマインン複合体 ハイグロマイゾン類、 ロイカニシジン、およ びハイグロリジン ハイグロスコピカス品種グレボサス （ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｆｏｒｍａ ｇｌｅｂ
ｏｓｕｓ）ハイグロスコピカス変種リモネウス （ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ． Ｉｉｍｏ
ｎｅｕｓ）ハイグロスコビカス変種サガミエンシス（ｈ
ｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕＳｖａｒ． ｓａｇａｍｉｅｎ
ｓｉｓ）カナマイセチカス（ｋａｎａｍｙｃｅｔ ｉｃ
ｕｓ）カスカエン／ス（ｋａｓｕｇａｅｎｓ ｉｓ）カ
スガスピナス（ｋａｓｕｇａｓｐｉ ｎｕｓ）ラベンデ
ュラエ（Ｉａｖｅｎｄｕｌａｅ）リビダス（ｌ ｉｖｉ
ｄｕｓ） グレボマイ／ン バリダマイシン類 スペクチノマイシン カナマインンＡ およびＢ カスガマイシン類 力スガマイシン類 不オマインン リビドマイシン類 ミクロスボレウス（ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）不トロ
プシス（ｎｅｔｒｏｐｓ ｉｓ）ノボリトエンシス（ｎ
ｏｂｏｒｉＬｏｅｎｓｉｓ）オリバセウス（○ｌ ｉｖ
ａｃｅｕｓ）オリボレチクリ変種セル口フィラス （ｏｌｉｖｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ｖａｒ． ｃｅｌｌｕ
ｌｏｐｈｉｌｕｓ）ボーレンンス（ｐｏｏｌｅｎｓｉｓ
） ラメウス（ｒａｍｅｕｓ） リボンジフィクス（ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ）リモ
ファンエンス（ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ）リモサス品種
パロモマインヌス （ｒｉｍｏｓｕｓ ｆｏｒｍａ ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉ
ｎｕｓ）スベクタビリス（ｓｐｅｃｔａｂｉ ｌ ｉｓ
）テネブラリウス（ｔｅｎｅｂｒａｒｉｕｓ）ＳＦ−７
６７ ＬＬ−ＡＭ３１ ハイグロマイシン類 ストレプトマイシン デストマイシンＡ ストレプトマイシン ストレブトマインン ＳＦ７３３ デストマイシンＡ パロモマイシン類 およびカテヌリン スペクチノマイシン トブラマインンおよ びアブラマイシン 多数の種 ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ） メジテラネイ（ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）ストレブト
マイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）コリナス（ｃ
ｏｌ ｌ ｉｎｕｓ） ジアストク口モゲネス （ｄｉａＳｔｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）ガルブス亜種
グリセオスポレウス （ｇａｌｂｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｇｒｉｓｅｏｓｐｏｒ
ｅｕｓ）ハイグロスコピカス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃ
ｕｓ）ハイグロスコピカス変種ゲルダヌス 変種ノバ（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒｇｅｌ
ｄａｎｕｓ ｖａｒ． ｎｏｖａ）ニゲラス（ｎｉｇｅ
ｌ ｌｕｓ） リンリエン／ス（ｒｉｓｈｉｒｉｅｎｓｉｓ）種Ｅ／７
８ ４ 種Ｅ８８ スペクタビリス（ｓｐｅｃｔａｂｉ Ｉ ｉｓ）種々の
アンサマインン類 リファマイシン アンサトリエン類および ナプトマイシン類 アンサトリエン類および ナプ１・マインン類 ナブトマイシンＢ ハービマイソン ゲルダマイシン ２１−ヒドロキン−２５ デメチル２５−メチル チオブロトストレブト バリシン マイフトリエン類 アクタマインンおよび マイコトリエン類 マイコトリエン類 ス１・レプトバリシン類 ２９ ３０ 筆牟衣アントラサイクリンおよびキノン系抗生物質を産
生カエスピトサス（ｃａｅｓｐｉ ｔｏｓｕｓ）コエリ
カラ−（ｃｏｅｌ ｉｃｏｌｏｒ）コエルレオルビジク
ス （ｃｏｅｒｕｌｅｏｒｕｂｉｄｉｃｕｓ）サイア不ウス
（ｃｙａｎｅｕｓ） フラボグリセウス（ｆ Ｉａｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）ガリ
レウス（ｇａｌ ｉｌａｅｕｓ） ルシタナス（ｌｕｓｉｔａｎｕｓ） ペウセチカス（ｐｅｕｃｅｔ ｉｃｕｓ）ビオロクロモ
ゲ不ス ミトマインンＡ，Ｂ およびＣ アクチノ口ジン タウノマインン ／トリサルビシン サイアノサイクリンＡ アクラ／ノマインンＡ１ アウラマインン類および スルフルマイシン類 ナプチリジノマイシン タウノマイシンおよび アドリアマイシン ラクタマデュランス （ｌａｃｔａｍａｄｕｒａｎｓ） ユニフォルミス（ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）セファマイシン
Ｃ ノ力ルジシン アルゲンテオラス（ａｒｇｅｎｔｅｏｌｕｓ）カトレヤ
（ｃａｔｔｌｅｙａ） チャルトレウンス（ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｓ）ンンナモ
不ンシス（ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）クラブリゲラ
ス（ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）フィムブリアツス（ｆ
ｉｍｂｒｉａｔｕｓ）フラホビレンス（ｆｌａｖｏｖｉ
ｒｅｎｓ）フラバス（ｆｌａｖｕｓ） フルボビリンス（ｆｕｌｖｏｖｉｒｉｄｉｓ）アスパレ
ノマイシンＡ１ ＭＭ４５５０，および ＭＭ］３９０２ チェナマイシン ＳＦ １６２３、および セファマインンＡおよびＢ セファマインンＡおよびＢ ＰＡ−３２４ ］ ３−１、 セファマイ／ンＣ， Ａ１６８８６Ａ，ペニシリ ン類、セファロスボリン類、 クラプラン酸、および その他のクラバム類 セファマインンＡおよびＢ ＭＭ４．５５０、および ＭＭｌ３９０２ ＭＭ４５５０、および ＭＭＩ３９０２ ＭＭ４５５０、および ハルステシ（ｈａｌｓｔｅｄｉ） ヘテロモルフス０＋ｅｔｅｒｏｍｏｒｐｌ＋ｕｓ）ハイ
グロスコビクス （ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ） リブマニ−（ｌｉｐｍａｎｉｉ） オリバセウス（ｏｌ ｉｖａｃｅｕｓ）バナエン／ス（
ｐａｎａｙｅｎｓ ｉｓ）ロチェイ（ｒｏｃｈｅｉ） シオヤエンンス（ｓｉｏｙａｅｎｓｉｓ）種ＯＡ−６
１ ２９ および力ルペチマイシンＡ およびＢ セファマイシンＡおよびＢ Ｃ２０８＋Ｘ、および セファマイシンＡおよびＢ デアセト牛ノセファ口ス ボリンＣ セファマインン、ペニシリ ンＮ，７〜メトキシセファ 口スポリンＣ，Ａ１６８８ ４、ＭＭ４５５０、および ＭＭ １ ３ ９ ０ ２ エピチェナマイシンＦ１ ＭＭ４５５０および ＭＭ ｌ ３ ９ ０ ２ Ｃ２０８ １Ｘおよびセファ マイシンＡおよびＢ セファマイ／ンＡおよびＢ ＭＭ４５５０，および ＭＩＶＮ３９０２ ＯＡ−６１２９Ａ ビリドクロモゲ不ス （ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）セファマイン
ンＡおよびＢ 築旦衣マクロライド、リンコサミド、およびストレプト
ロザリア（ｒｏｓａｒｉａ） アルビレチクリ（ａｌｂｉｒｅｔｉｃｕｌｉ）アルボグ
リセオラス（ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕＳ）アルプス（
ａｌｂｕｓ） アルプス変種コイルマイセチカス （ａｌｂｕｓ ｖａｒ． ｃｏｉｌｍｙｃｅｔｉｃｕｓ
）アンポファシエンス（ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）アン
チビオチカス（ａｎＬｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）アベルミチ
リス（ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ビキニエンノス（ｂｉ
ｋｉｎｉｅｎｓｉｓ）ロザラミシン カルボマイシン ミコノマイシン アルボマイセチン コレイマインン スピラマイシンおよび フォロマンジンＤ オレアンドマイ／ン アベルメクチン類 力ルコマインン ３３ ３４ カエレスチス（ｃａｅｌｅｓＬｉｓ） シネロクロモゲネス （ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）ンラタス（ｃ
ｉｒｒａｔｕｓ） デルテ（ｄｅｌＬａｅ） ジャカルテンシス（ｄｊａｋａｒｔｅｎｓ ｉｓ）エウ
ロンジカス（ｅｕｒｏｃ ｉｄ ｉｃｕｓ）エウリテル
マス（ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ）ファシクラス（ｒａＳ
Ｃｉｃｕｌｕｓ）フェレウス（ｆｅｌ Ｉｅｕｓ） フィムブリアタス（ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ）フラポク口
モゲ不ス （ｆｌａｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）フラジエ（ｆｒ
ａｄｉａｅ） フンギシジカス（ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）フン牛シ
ジカス変種エスピノマイ セチカス（ｒｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒｅｓｐｉ
ｎｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ） フルジンジカス（ｆｕｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ）ゴ／キエ
ンシス（ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉｓ）Ｍ１８８および セレスチセチン シネロマイシンＢ シラマイシン デルタマイシン類 ニタマインン メチマイシン アンコラマイシン アマロマインン アルゴマイシンおよび ビクロマインン アマロマイシン アマロマイシンおよび シンコマイシン類 タイロシン ＮＡ−１ ８ １ エスピノマイシン類 マイデカマインン パンダマイシン グリセオフラバス（ｇｒｉｓｅｏｆ Ｉａｖｕｓ）グリ
セオフスカス（ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）グリセオラ
ス（ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ） グリセオスピラリス（ｇｒｉｓｅｏｓｐｉｒａｌ ｉｓ
）グリセウス（ｇｒｉｓｅｕｓ） グリセウス亜種スルフラス（ｇｒｉｓｅｕｓｓｓｐ．
ｓｕｌｐｈｕｒｕｓ） ハルステジ（ｈａｌｓｔｅｄｉ） ハイグロスコピカス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ハ
イグロスコビカス亜種アウレオラク リモサス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ．
ａｕｒｅｏｌａｃｒｉｍｏｓｕｓ） キタストエンシス（ｋｉｔａｓｔｏｅｎｓｉｓ）ラベン
デュラエ（ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）リンコルネン／ス（
Ｉｉｎｃｏｌｎｅｎｓｉｓ）ロイデンンス（ｌｏｉｄｅ
ｎｓｉｓ） マクロスボレウス（ｍａｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）マイゼ
ウス（ｍａｉｚｅｕｓ） マイカロファンエンス（ｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ）
アクマイシン ブン１・リン グリセオマインン レロマインン ホレリンン パフィロマイシン類 力ルポマイシンおよび ロイカニシジン タイロンン ミルベマイシン類 口イコマインンＡ３ およびジョサマイシン アルドガマインン リンコマイシン へルナマイ７ンＡ およびＢ カルボマイシン イングラマイシン アセチルー口イコマイ ンンおよびエスビノ マイ／ン ３５ ３６ ナルボ不ンシス（ｎａｒｂｏｎｅｎｓ ｉｓ）ナルボネ
ンシス変種ジョサマイセ チカス（ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ ｖａｒｊｏｓａｍｙ
ｃｅｔ ｉｃｕｓ） オリボク口モゲ不ス（ｏｌ ｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎ
ｅｓ）プラテンンス（ｐｌ ａｔｅｎｓ ｉｓ）リモサ
ス（ｒｉｍｏｓｕｓ） ロチェイ（ｒｏｃｈｅｉ） ロチェイ変種ボルビリス （ｒｏｃｈｅｉ ｖａｒ． ｖｏｌｕｂｉｌｉｓ）ロセ
オク口モゲネス（ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）
ロセオ／トレウス（ｒｏｓｅｏｃｉｔｒｅｕｓ）スビニ
クロモゲ不ス変種スラガオ エンンス（ｓｐｉｎｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｖａｒ
ｓｕｒａｇａｏｅｎｓ ｉｓ） テンダエ（ｔｅｎｄａｅ） サーモトレランス（ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ベ
ネズエラエ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）ビオラセオニゲル
（ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ）ジョサマイシンおよび ナルボマイシン ロイコマイシンＡ３ およびジョサマインン オレアンドマイシン ブラテノマイシン タイロシンおよび ノイトラマイシン ランカシジンおよび ボレリジン Ｔ２６３６ アルボサイクリン アルポサイクリン クジマイ７ン類 カルポマイシン カルボマイノン メチマイシン類 ランカシジン類および ランカマイシン シクロベンクン環 含有型 含窒素型 ボリエン型 テトラサイタ リン型 コエリカラー （ｃｏｅｌ ｉｃｏｌｏｒ） エリスロクロモゲネス （ｅｒｙｔｈｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）カスガエン
ンス （ｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ） メチレノマイシンＡ サルコマイシン アウレオスリシン およびチオルチン ビオラセオラバー （ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ） べ不ズエラエ （ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ） グリセウス（ｇｒｉｓｅｕｓ） ノドサス（ｎｏｄｏｓｕｓ） ノウルセイ（ｎｏｕｒｓｅｉ） アウレオファシエンス （ａｕｒｅｏ『ａｃｉｅｎｓ） リモサス（ｒｉｍｏｓｕｓ） メチレノマイシンＡ クロラムフエニ コーノレ カンジシジン アンホテリシンＢ ナイスクチン テトラサイクリン、 クロロテトラサイク リン、デメチルテト ラサイクリン、およ びデメチルク口ロテ トラサイクリン オキシテトラサイク リン ３７ ３８ ミチガ不セ・ピーブイ・ラサイ （ｍｉｃｈｉｇａｎｅｓｅ ｐｖ． ｒａｔｈａｙｉ
）チュニカマイシン 類似体 ノカル／ア属（Ｎｏｃａｒｄ ｉａ） カンジダス（ｃａｎｄｉｄｕｓ） ストレプｔ−マイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
アンチビオチカス（ａｎｔ ｉｂｉｏｔ ｉｃｕｓ）チ
ャルトレウ／ス（ｃｈａｒｔｒｅｕｓ ｉｓ）グリセオ
フラハス変種スリンギエンンス（ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖ
ｕｓ ｖａｒ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）グリセ
オラス（ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ） ビラゾフリン ａｒａ−Ａ チュニカマイシン ストレブトビリタンス シ不フンキ′ン テイコマイセチカス（ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅＬｉｃｕｓ
）ルリダ（ｌｕｒｉｄａ） オリエンタリス（ｏｒｉｅｎｔａｌ ｉｓ）ストレプト
マイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）アンチビオチ
カス（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）アウレウス（ａｕｒ
ｅｕｓ） カヌス（ｃａｎｕｓ） エブロスボレウス（ｅｂｕｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）ハラノ
マチェン／ス（ｈａｒａｎｏｍａｃｈｉｅｎｓｉｓ）プ
リスチナエスビラリス （ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）ロセオスボラ
ス（ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）トヨカエンンス（ｔｏｙ
ｏｃａｅｎｓｉｓ）テイコプラニン アホパルシン リストセチン バンコマイシン アクチノマイシン チオストレブトン アンホマイシン Ｌ Ｌ−ＡＭ３ ７ ４ バンコマイシン プリスチナマイシン Ａ２１９７８Ｃなどの りポベブチド類 Ａ４７９３４ ３９ ４０ オリコスボラス（ｏｆ ｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）アウレオ
ファンエンス（ａｕｒｅｏｒａｃｉｅｎｓ）ボビリ（ｂ
ｏｂｉｌｉ） カカオイ変種アソエンンス （ｃａｃａｏｉ ｖａｒ． ａｓｏｅｎｓｉｓ）チャル
トレウシス（ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｓ）ンンナモネンシ
ス（ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）フングロバツス（ｃ
ｏｎｇｌｏｂａｔｕｓ）オイロシジカス変種アステロシ
ジカス （ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒ． ａｓｔｅｒｏｃ
ｉｄｉｃｕｓ）フラベオラス（ｆｌａｖｅｏｌｕｓ） ガリナリウス（ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｓ）Ａ８０ １９
０ ５ＡおよびＢ１および サリノマイシン ナラシン Ａ８０４３８ リソセリン Ａ２３ １８７ モネンシン イオノマイシン ライドロマインン ＣＰ３８９３６ Ｒ Ｐ−３ ０ ５ ０ ４ ハイグロスコビカス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ラ
サリエンシス（Ｉａｓａｌ ｉｅｎｓｉｓ）ロングウー
デンシス（ｌｏｎｇｗｏｏｄｅｎｓｉｓ）ムタビリス（
ｍｕｔａｂｉｌｉｓ） パクタム（ｐａｃｔｕｍ） リボシジフィカス（ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ）ビオ
ラセオニゲル（ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ）Ａ２１８
、エメリシド、 ＤＥ３９３６、Ａ Ｉ． ２ ０Ａ，Ａ２８６９５Ａ およびＢ１エーテロマ イシン、およびンアネ マイシン ラサロシド リソセリン Ｓｉｌ７４３ａ Ａ８０４３８ ロノマイシン ニゲリシン ４１ ４２ ｐＫＣ７９６の特徴以外の特徴を有する組込みベクター
を創製することか所望であるときには、受託番号ＮＲＲ
Ｌ Ｂ−１８４７７のもとてＮＲＲ１，に寄託されて
いるブラスミトｐＫＣ７９６から、部位特異的な突然変
異誘発と制限酵素消化を組合せることによって、φＣ３
］フラグメントを得ることかできる。始めに、合＋ｆｆ
ｌＤＮＡフラグメントＴＧＴＴＡＧＧＣＧＣＴＧＡＧＡ
ＣＧＧＧＣＣＣＡＣＡＧＣＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＧ
Ｃを用い、アデルマン等［Ａｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ
． ＤＮＡ ２ ： １８３−１９３ （１９８３）］
の方法に従って、このプラスミドに部位特異的な突然変
異誘発を行う。このフラグメン１・をプラスミドに導入
すると、このフラグメンｌ・の３゛末端に制限部位Ａ
ｐａ Ｉが得られる。次いで、このフラグメントをＡａ
ｔｌｌ−Ａｐａ＋制限フラグメン１・とじて単離するこ
とかできる。ある場合には、このＡａｔｌ１部位に放線
菌において機能的なプロモーターを挿入するのが必要に
なることもある。そのようなプロモーターは当業者には
周知である。次いで、このフラグメン１・をそのままで
選択したプラスミドに挿入するか、またはその末端をオ
リゴヌクレオチドリン力一で修飾してそのフラグメント
を所望の制限部位に挿入することができる。また、当業
者なら、いずれかの制限部位を含む合戊ＤＮＡフラグメ
ントを部位特異的な突然変異誘発を用いてプラスミトに
挿入し、その後、制限酵素による消化によってフラグメ
ントを単離することができることは理解されよう。 本発明の組込みベクターは、ストレプトマイセス属の研
究およびス］・レプトマイセス属発醇産物の市販化の多
くの場面で大きな用途を有している。 好ましい利用は、同種遺伝子の追加のコピーまたは異種
遺伝子の新規なコピーを宿主染色体中に糺込むことであ
る。この利用は抗生物質産生または耐性に関係している
遺伝子に限定されない。例えば、栄養要求変異種株にア
ミノ酸産生に関係している遺伝子を組込むこともでき、
特定のアミノ酸か添加されていない培地でのこの株の増
殖を可能にすることかできる。このような試みの全てに
共通する顕著な特徴は、遺伝子のその後の維持を抗生物
質選択なしで行うことにある。 好ましい利用の１つは、ストレブトマイセス・サーモト
レランスのｃａｒ Ｅ遺伝子をストレプトマイセス・ア
ンボファンエンスゲノムに絹込むことによって例示され
る。Ｓ サーモトレランスのＣａｒＥ遺伝子は、イソバ
レリル補酵素Ａのインバレリル基をマクロライド系抗生
物質カルボマイ／ンのミカロース糖残基に結合させる４
”−０−インバレリルア７ラーゼをコードしている。Ｓ
アンボファ７エンスは、マクロライド系抗生物質スピ
ラマイ／ンおよび／Ｉ”−ＯＨ基を有するミカロース残
基を含有する種々の他のスピラマインン関連化合物ヲ産
生ずる。Ｓ アンポファンエンスは４”゜Ｏ−イソバレ
リルア／ラーゼ活性を産生巳ない。 このｃａｒＥ遺伝子は、受託番号ＮＲＲＬＢ−１８１６
９（寄託日： １９８７年２月６日）のもとてＮＲＲＬ
から犬腸菌Ｋｌ２ ＳＦ８として入手することか可能
なプラスミドｐＯＪＩ７１から単離することができる。 ｐＯＪＩ７１の制限部位および機能地図を第２図に示す
。 プラスミドｐＯＪ］７］から単離した〜２．４ｋｂＢａ
ｍＨｌ制限フラグメントを、ＢａｍＨＩ消化したｐＫＣ
７９６（ＮＲＲＬ Ｂ−］ ８４ ７７）に挿入する
。このフラグメン１・を両配向て挿入することがてき、
プラスミドｐＯＪ２４２およびｐｏ Ｊ ２ ４３か得
られる（第３図および第４図をそれぞれ参照）。この両
プラスミドおよび対照ベクターｐＫＣ７９６をＮＲＲＬ
２４２０などのＳ，アンホファ／エンス株に導入した。 形質転換体を始めは抗生物質アブラマインンで選択した
。これらのプラスミドは、ス１・レプトマイセス属の複
製起源がこれらのベクター」二に存在していないので、
必然的に染色体中に組込まれる。安定な組込みのゆえに
、アブラマイシンによるその後の維持は必要ではない。 Ｓ，アンボファンエンス染色体中にｃａｒＥ遺伝子が存
在すると、この菌株はイソバレリルスビラマインンを産
生ずる。親のｐＫＣ７９６ベクターを組込んだＳ．アン
ボファシエンス株はスピラマイシンを産生し続ける。イ
ソバレリルスピラマインンを産生させるこの方法は、自
律的に複製するブ４５ ４６ ラスミドにｃａｒ Ｅ遺伝子を導入することからなる方
法を凌く２つの大きな利点を有している。その第１は、
形質転換体か抗生物質選択なしで増殖することかてき、
従ってコス１・を下げ、効率を上げることかできる。第
２の利点は、組込み形質転換体か同−の遺伝子を担持す
る複製ブラスミ１・よりも多量のイソバレリルスピラマ
インンを産生ずることである（複製プラスミドは抗生物
質産生を抑制するようてある）。これらの利点は組込み
ベクターがとんな遺伝子と一緒に用いられても一般的に
当てはまり、ｃａｒＥＪ！伝子か使用されるときの状況
には限定されない。 即ち、本発明はハイブリノト抗生物質の製造方法であっ
て、 （１）ファージφＣ３１の部位特異的な組込み機能を含
むＤＮＡ配列を含有しているプラスミトベクターであっ
て、ある微生物においてそれまで発現されたことのない
酵素またはその他の遺伝子産物をコードしており、ある
抗生物質をそれまで該微生物によって産生されたことの
ない抗生物質に変換する、抗生物質生合成遺伝子をも含
有するベクターで抗生物質産生微生物を形質転換するこ
と、および （２）該ベクターで形質転換された微生物を、ハイブリ
，｝・抗生物質の産生に適した条件下で培養すること、 を特徴とする方法を提供するものである。 組込みベクターの他の好ましい使用は、抗生物質生合戊
遺伝子（群）をベクターによって宿主染色体中に絹込む
ことにより、抗生物質の産生を増加させることである。 抗生物質の産生を増加させるときには、それぞれの抗生
物質耐性遺伝子（群）の追加のコピーを組込んで抗生物
質による阻害を避けるのが重要になることもある。タイ
ロシン、モネンシン、およびナランンなどの多数の発酵
産物の製造を本方法によって改善することができる。 組込みベクターを用いるクローン化遺伝子の組込みは多
くの利点を有している。選択物質の非存在下でのストレ
プトマイセス発酵（多＜の細胞世代が関係する）におけ
るクローンした遺伝子の安定な維持は重要な問題であっ
たか、これか本発明によって克服される。例えば、タイ
ロンンの製造において、クローンされたｔｙｌＦ遺伝子
の安定な維持はマクロシンのタイロンンへの変換を増強
し、さらに多量のタイロシンを与える。その安定性に加
えて、組込みベクターは自律的なプラスミドに比へて抗
生物質産生の阻害作用か少ない。 組込みベクターを用いてクローン化遺伝子を安定に維持
し、抗生物質産生を増大させることについては、本明細
書ては、このベクターおよびクローンされたタイロンン
生合戊遺伝子を用いてタイロ／ンの産生を増大させるこ
とによって例示されている（実施例３〜５を参照）。 ストレブトマイセス・フラシエＴＩ４０５などのタイロ
ンン産生株は、タイロンン前駆体であるデメチルマクロ
シンおよびマクロシンを蓄積ずる。 染色体中に組込まれたｔｙｌＥおよびｔｙ＋ Ｆ遺伝子
の追加のコピーを有するこの菌株の発酵培養によって、
ｔｙ＋ｐにコーＩＳされているマクロ／ンＯ−メチルト
ランスフエラーゼおよびｔｙ＋Ｅにコードされているデ
メチルマクロンンＯ−メチルトランスフェラーゼの量の
増加が得られる。この結果、デメチルマクロンンのマク
ロンンへの、そしてマクロ７ンのタイロシンへの変換が
増加することになり、従って、所望の最終産物であるタ
イロシンの収量か一層増加することになる。このＬｙｌ
ＥおよびｔｙｌＦ遺伝子は他のタイロンン生合戊遺伝子
とともに、欧州特許公開Ｎ ｏ． ０２３８３２３（１
９８７年９月２３日発行）に記載されている。 ｔｙ＋ Ｆ遺伝子を含有するＢａｍＨＩフラグメントを
、プラスミドｐＨＪＬ２８０［ＮＲＲＬ Ｂ−１８０
４３のもとでＮＲＲＬから犬腸閑ＫＩ２１−ＩＢ１０１
で人手可能（寄託日： １９８６年２月ｌ８日）；第５
図参照］から得る。次いで、このフラグメン１・をＢａ
ｍＨＩ消化したｐＫＣ７９６に挿入ずる。得られたプラ
スミドをｐｓＫｃ５０およびｐＳＫＣ５１と呼ぶ（挿入
されたＢａｍＨＩフラグメン１・の配向が異なっている
）。Ｓ．フラジエの産生株Ｔｌ４０５に導入されると、
組込まれたベクターはタイロンンの産生を、Ｔ１４０５
対照の産生レベルを４９ ５０ １００％として、１３６％まで増加させる。形質転換体
の安定性は、選択の非存在下での少なくとも３継代の後
に、ベクターによって与えられるアブラマインン耐性の
表現型か実質的に１００％のコロニー形戊単位によって
保持されていることによって示される。 タイロシン産生株を形質転換する能力は、試験した他の
部位特異的な組込みベクターては見られない特徴である
。この実験は、スｌ・レブトマイセス属の複製起源を欠
く２種類の他のストレプ１・マイセス属の部位特異的な
組込みベクターを用いて行った 即ち、大腸菌プラスミ
トｐＢＲ３２５中にクローンしたストレブトマイセス・
コエリカラーのミニ環状物であるｐｌＪ４２１０［リジ
エート等（Ｌｙｄｉａｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ． ２０３ ： ７９−８８（１９８
６））］、ならびに組込み性Ｓ アンボファシエンスプ
ラスミドｐＳＡＭ２［パーノデット等（Ｐｅｒｎｏｄｅ
ｔ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ． １９８： ３５−４１ （１９８４））
］から導いたプラスミド［クーストス等（Ｋｕｈｓｔｏ
ｓｓｅＬ ａｌ．．Ｊ．Ｂａｃｔ． １７１ ： １
６−２３ （１９８９））］である。これらのプラスミ
ドは、Ｓ，フラジエのタイロンン産生株に安定に導入す
ることができなかった。抗生物質選択なしての安定な維
持および極めて高い形質転換頻度は、φＣ３］の部位特
異的な組込み機能を含有する組込みプラスミドベクター
の重要な利点てある。 また、クローンしたタイロシン生合成遺伝子を含有する
ベクターを用いて、Ｓ フラジエ突然変異株、例えばＧ
Ｓ ｌ ５［ｔｙｌＦ突然変異株； ＮＲＲＬ］．８０
５８（寄託日： １９８６年３月１９日）］およびＧ
Ｓ ｌ． ６ ［ｔｙ＋Ｅ突然変異株；アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクンヨン（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５２）から受託番号Ａ
ＴＣＣ ３］６６４のもとて人手可能］などのタイロ
シン産生を増大させることができる。前記のブラスミト
ｐｓＫｃ５０およびｐＳＫＣ５］はこのｔｙ＋ Ｅおよ
びｔｙｌＦ遺伝子を含有している。これらのプラスミド
をＳ．フラジエ突然変異株に導入することができる。得
られた形質転換体は増大した量のタイロ／ンを産生じ、
安定に維持されるであろう。 即ち、本発明の重要な態様は、抗生物質産生微生物また
は抗生物質前駆体産生微生物の抗生物質産生能力または
抗生物質前駆体産生能力を増大させる方法であって、 （１）抗生物質生合或経路によって抗生物質または抗生
物質前駆体を産生ずる微生物を、ファージφＣ３］の部
位特異的な組込み機能を含むＤＮＡ配列を含有している
絹込みベクターであって、該生合戊経路の律速である酵
素またはその他の遺伝子産物をコードしている抗生物質
生合成遺伝子をも含有するベクターで形質転換すること
、および（２）該ベクターで形質転換された微生物を、
細胞増殖、該抗生物質生合成遺伝子の発現、および抗生
物質または抗生物質前駆体の産生に適した条件下で培養
すること、 を特徴とする方法を提供することてある［ただし、工程
（１）で選択される抗生物質生合戊遺伝子は、該微生物
の抗生物質産生能力または抗生物質前駆体産生能力の増
大を与えるものとする］。 本発明の目的に用いることができるタイロシン生合成遺
伝子の例には、例えば、ｔｙｌＡ， ｔｙｌＢ，ｔｙｌ
ｃ， ｔｙｌＤ， ｔｙｌＥ， ｔｙｌＦ， ｔｙｌＧ
， ＬｙｌＨ，ｔｙ＋ Ｉ、ｔｙｌＪ， ｔｙｌＫ，
ｔｙｌｌ−、およびＬｙｌＭ遺伝子が含まれる。この群
の中ではｔｙｌＦ遺伝子が好ましいが、これは、それに
よってコードされているマクロシン○−メチルトランス
フェラーゼ酵素がほとんどのタイロシン産生株のタイロ
ンン生合成経路における律速であると考えられるためで
ある。このｔｙ＋ Ｆ遺伝子産物によって触媒される律
速段階のゆえに、ストレプトマイセス・フラジエの最適
発酵条件のもとでは許容されない量までマクロシンが蓄
積される。このｔｙｌＦ酵素はマクロシンのタイロシン
への変換を触媒する。ｔｙｌＦ遺伝子産物、即ちマクロ
シンＯ−メチルトランスフエラーゼの過剰産生は、抗生
物質収量の増大および発酵コストの低下で示されるよう
に、タイロシン生合成経路を一層効率的なものにする。 ストレブトマイセス属の閑株は、いくつかの別種培地の
いずれかを用いる多数の方法で培養する５３ ５４ ことかできる。培養培地中の好ましい炭水化物供給源に
は、例えば、糖蜜、グルコース、テキス｝・ラン、およ
びグリセロールか含まれる。窒素供給源には、例えば、
大豆粉、アミノ酸混合物、およびペブ］・ンか含まれる
。また、栄養無機塩も培地に加えられるか、これにはナ
トリウム、カリウム、アンモニウム、カルンウム、リン
酸、塩酸、硫酸なとのイオンを生成しうる通常の塩か含
まれる。 他の微生物の成長および増殖に必要であるように、必須
の微量元素も加える。通常、この微量元素は、培地の他
の構戊戊分の添加に付随する不純物として供給される。 ストレプトマイセス属の閑株は、好気性培養条件下、約
６〜８の比較的広いｐＨ範囲、約２５〜３７゜Ｃの温度
で増殖する。約３４〜３７゜Ｃの温度では、抗生物質か
産生されないこともある。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれら実施例を理由として限定されるもので
はない。試薬あるいは装置の供給元は便利なように挙げ
たたけであり、本発明を限定するものではない。本発明
を実施するための方法の説明および実際に行った操作は
適当な箇所に記載した。 （以下、余白） 実施例１ プラスミドＩｌｌＫＣ７９６の単離プラスミ
ドｐＫＣ７９６（第１図）は、ノーザン・リージョナル
・リサーチ・センター（ＮＲＲＬ）（Ｐｅｏｒｉａ，
ＩＬ ６１６０４）から受託番号ＮＲＲＬＢ−１８４７
７のもと、太腸菌Ｋ１２ ＤＨ５αとして入手するこ
とができる。大腸菌Ｋ］２ＤＨ５α／ｐＫＣ７９６の凍
結乾燥品を、１００μ９／ ｘ（ｌのアブラマインンを
含むし一寒天プレート［１ｆｆあたり、１０９のトリブ
トン、ｌｏｇのＮａＣｆｆ、５ｇの酵母エキス、および
１５ｇの寒天］て培養し、この菌株の単一コロニー単離
体を得た。このコロニを１００μｇ／ ｘ（ｌアブラマ
イシン含有のＬブロス（寒天を含まないし一寒天）（約
５ ０ ０ ｘＱ）に接種し、細胞が定常期に達するま
で、得られた培養物を曝気しながら３００Ｃでインキユ
ベートした。 この細胞を８ ０ ０ Ｏ ｒｐｍで１０分間遠心した
。 上清をテカンテーノヨンした後、細胞を２５％スクロー
ス、５０ｍＭ｝リス・ＨＣＱ（ｐＨ８．０）（７ｉＣ）
に再懸濁した。新たに調製したリソチーム（５ｉｇ／岬
溶液を０．２５Ｍのを、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８
）（０．４１１Ｑ）および５ ｘ９／ ｚ（ｌ Ｒ Ｎ
アーゼＡ（００５ＪＩ１２）とともに、この溶液に加え
た。この混合物を３７℃で１５分間インキュベート・し
た。これにトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）溶菌混合物［１．
５０ｍＭトリス・ＨＣＱ（ｐＨ８．０）、３％トリトン
ＸＩＯＯＲ、２００ｍＭ ＥＤＴＡ］（０．７５ｘｇ
）を加え、混合し、そして水上で１５分間インキユベー
トした。溶閑が完全でないときには、３７°Ｃで約５分
間さらにインキユベートした。この混合物を２０，００
０ｒｐｍで４０分間遠心した。上清を取り、保持した。 ＤＮＡ溶液（３１．２ｆｆｆｆ）にＣｓＣ４（２８．６
５ｇ”，を加えることによってＣｓＣ（！勾配（密度
１ ５５）を調製した。この勾配溶液を混合して溶解し
、大きい超遠心管に移した。この遠心管を１０ｏ／ｘｃ
臭化エチジウム（〜０ ． ６ １１（１）で満たし、
封をし、そして混合した。 ４９，０００ｒｐＴＩで１８時間遠心することによって
勾配をつけた。長波長のＵＶ光で可視化して低い方のプ
ラスミドＤＮＡのバンドを集めた。イソアミルアルコー
ルで４〜５回抽出することによっ５７ ５８ て臭化エチジウムを除去した。このＤＮＡ溶液をＴＥ緩
衝ｉ１ｔ［ＩＱ＋ｎＭｈリス・ＨＣｌ２（ｐＨ ８．
０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］（２＆）に対して透析し、２
時間後に新たなＴＥに替えた。この透析した溶肢を、フ
ユ．ノールで２回、そしてクロロホルム゜イソアミルア
ルコール（２４：ｌ．）で２回抽出した。１／１０容量
の３Ｍ酢酸ナ１・リウムおよび３容量のエタノールを加
えることによってＤＮＡをエタノール比澱させた。１０
，０００ｒｐｍで１０分間遠心することによってＤＮＡ
を集め、７０％エタノール、続いて１００％エタノール
で洗浄し、乾燥し、そして滅菌ＴＥ（約２５０μｌ！）
に溶解した。濃度および純度は、２６０および２８０ｎ
ｍでの光学密度を測定することによって調べた。ｐＫＣ
７９６の制限部位および機能地図を添付の第１図に示す
。 実施例２ プラスミドｐＯＪ２４２およびｐＯＪ２４３
の構築 Ａ．ブラスミトｐＯＪ１７１の単離 プラスミドｐＯＪ１７１は、Ｎ Ｒ Ｒ Ｌから受託番
号ＮＲＲＬ Ｂ−１８１６９のもと、大腸菌Ｋ ］２
８Ｆ８として入手することができる。プラスミドｐ
ＯＪ］７］はｃａｒ Ｅ遺伝子の供給源である。 犬腸閑Ｋ ］ ２ ＳＦ８／ｐＯＪ Ｉ ７ ］の凍
結乾燥品を、１００μｇ／ ｍ（ｌのアブラマインンを
含むし−寒天プレートで培養し、この菌株の単一コロニ
ー単離体を得た。このコロニーを１００μ９／ Ｉ！（
！アブラマインン含有のＬブロス（約５００ｘのに接種
し、細胞が定常期に達するまで、得られた培養物を曝気
しながら３７°Ｃでインキユベートした。 実質的に上記実施例１記載の方法に従って、細胞からプ
ラスミドＤＮＡを得、プラスミドｐＯＪ２４２およびｐ
ＯＪ２４３の構築に用いた。プラスミトｐＯＪ１７］の
制限部位および機能地図を添付の第２図に示す。 Ｂ プラスミドｐＯＪ２４２およびｐｏ Ｊ ２ ４
３の最終的な構築 プラスミドｐＯＪ２４２およびｐＯＪ２４３は、ｃａｒ
Ｅ遺伝子を含有するベクターである。これらのプラス
ミドを次のようにして構築することができる。プラスミ
ドｐＫＣ７９６ ＤＮＡ（約１０μ９；］ＯμＱ）を、
ＩＯＸのＢ ａｍ）−｛ １緩衝１［６０ｍＭトリス−
ＨＣ（！（ｐＨ７．９）； Ｉ．５Ｍ ＮａＣＱ：およ
び６ ０ ｍＭ ＭｇＣ ｆｆ２］（２ ｕの、Ｈ２０
（６ｕＱ’）、および制限酵素ＢａｍＨＩ［２μＱ，〜
４０単位，本明細書中の単位の定義は、特に記さなけれ
ばニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎ Ｅ Ｂ
； Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ． ３２
Ｔｏｚｅｒ Ｒｏａｄ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ
０１９１５−９９９０）のものに一致する］に加えた。 得られた反応液を３７℃で２時間インキユベートした。 このＢａｍＨ Ｉ 消化したプラスミドｐＫＣ７９６
ＤＮＡを抽出し、次いで、反応混合液の酢酸ナトリウ
ム（ＮａＯ Ａ ｃ）濃度を０．３０Ｍに調節し、２
５容量のエタノールを加え、この反応混合液を−７０’
Ｃまて冷却し、そして沈澱したＤＮＡを遠心してベレ，
２トにすることによってＤＮＡを集めた。このＢａｌｌ
ｌＨｌ消化したブラスミトｐＫＣ７９６ ＤＮＡのペ
レットをＴＥ緩衝液（１０μのに再懸濁した。 ＴＥ緩衝液（１０μＣ〉中のプラスミドｐＯＪ１７１（
約２０μｙ）を、Ｈ２０（７ＦＭ！）、ＩＯＸのＢａｍ
Ｈ ｌ緩衝液［６０ｍＭｈリスーＨＣＲ（ｐＨ７．９）
； １５ＭＮａＣ（；および６ ０ ｍＭ ＭｇＣ ＆
ｚ］ （ Ｉ Ｏ ｔｒの、および制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ （５μＣ； 〜１ ０ ０単位）に加えた。得られ
た反応ｌ皮を３７゜Ｃて２時間インキユベートした。こ
の反応混合液を抽出し、上記のようにしてＤＮＡを集め
た。このＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液（〜１０μのに溶
解した。このＤＮＡを、実質的にマニアティス等［Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９ｇ２Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）］の方法に従い、低
融点アガロースゲル［バイオラ，ド（ＢｉｏＲａｄ，
２２００ Ｗｒｉｇｈｔ Ａｖｃ． ， Ｒｉｃｈｍｏ
ｎｄＧＡ， ９４８０４）］の電気泳動にかけた。 コノゲルは、１ｘのＴＡＢ緩衝液［４０ｍＭ トリス
ー酢酸（ｐＨ７．５）、２ｍＭＥＤＴＡｌ中の０８％低
融点アカ頴一ス（］．ＯＯｊｔのを加熱することによっ
て調製した。この混合物を３７°Ｃまで冷却し、ゲルを
４℃で泳動させた。ローディング緩衝液［水中、０ ２
５％プロムフゴ−ノール・ブルー０．２５％キシレンン
アノール、３０％グリセロール］（２μｌ！）をＤＮＡ
試料に加えた。この試料をゲルにかけた。ブロムフェノ
ール・ブルー染料が６１ ６２ ゲルの末端に来るまて、４゜Ｃ、ＩＯＯＶてゲルを泳動
させた。このケルを０．５μｇ／ Ｒ＋１！臭化エチシ
ウムで染色し、所望の〜２． ４ ｋｂ ｌｌａｍＨ
ｆバントを長波長のＵＶ蛍先によって検出し、そして切
り取った。このケル片に５容量の２０ｍＭｈリスーＨＣ
ｉ！（ｐＨ８．０）および］ｍＭＥＤＴＡを加えた。 このケルを６５゜Ｃで５分間溶解させた。試料を等容量
のフェノールで抽出した。この試料を遠心し、水層を回
収し、再抽出し、そしてＤＮＡを上記のようにして集め
た。このＤＮＡペレソトをＴＥ緩衝液（１０μｇ）に溶
解した。この溶液はプラスミドｐＯＪ１７１の所望の〜
２．４ ｋｂ ＢａｍＨ ［制限フラグメント（〜０
５μｇ）を含有していた。 ＢａｍＨＩ〆肖化したフ゜ラスミドｐＫＣ７９６ Ｄ
ＮＡ （ Ｉ ｕ（ｌ’）を、ｐＯＪＩ７１由来のＢａ
ｍＨＩ制限フラグメント（１０μｇ、〜０ ５μい、Ｉ
ＯＸのリガーゼ緩衝液［６６０ｍＭ｝リスーＨＣｇ（ｐ
Ｈ８．０）６ ６ ｍＭ ＭｇＣ （！２ ： ｌ Ｏ
ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）；および１０ｍＭ
ＡＴＰ］（２μの、およびＨ，Ｏ（６μＱ）に加えた。 Ｔ４ ＤＮＡリガーセ（約１μＱ，〜ｌ． ０ ０単
位）をＤＮＡ溶液に加え、得られた反応液を１５゜Ｃで
一晩（〜１６時間）インキユベートした。この連結した
ＤＮＡは目的のプラスミドｐＯＪ２４２およびｐＯＪ２
４３を含んでおり、これらは〜２． ４ ｋｂ Ｂａｍ
Ｈ ［挿入フラグメントの配向だけが異なっていた。ｐ
ＯＪ２４２およびｐ○Ｊ２４３の制限部位地図を添付の
第３図および第４図に示す。 プラスミドｐＫＣ７９６のＢａｍＨ１部位は、それ自ｆ
本がｌａｃＺ α−フラグメン１・をコートするＤＮ
Ａ配列の一部を形成している多重クローニング部位内に
存在する。大腸菌Ｋ］２ ＤＨ５αなどの大腸菌ΔＭ
１５株におけるｌａｃＺ α−フラグメントの発現は
、機能的なβ−ガラクトンダーゼ酵素を産生ずるこの菌
株の能力を回復させる。即ち、プラスミドｐＫＣ７９６
は犬腸菌Ｋ１２ＤＨ５α株にβ−ガラクトンダーゼ活性
を回復させることができる。しかし、プラスミトｐＯＪ
２４２およびｐＯＪ２４３の構築のときのように、プラ
スミドｐＫＣ７９６のポリリンカーの制限部位中にＤＮ
Ａを挿入すると、ｌａｃＺ α−フラグメント暗号化
配列か分断され、同時にΔＭｌ５突然変異を補足するプ
ラスミドｐＫＣ７９６誘導体の能力が破壊される。β−
ガラクトシダーセは無色の化合物であるＸ−ガル（５−
ブロモー４−クロロ−３−インドリルーβ一Ｄ−ガラク
トピラノシド）をインノゴ色の産物に加水分解すること
ができ、従って、出発プラスミドｐＫＣ７９６を含有す
る形質転換体と、プラスミドｐＯＪ２４２またはｐＯＪ
：ｌ？４３などのプラスミドｐＫＣ７９６誘導体を含有
する形質転換体を識別する都合の良いスクリーニング法
を可能にする。 凍結コンビテントＤＨ５α細胞［ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ社（Ｂ Ｒ Ｌ ） ； Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｉｎｃ． ＋ Ｐ． Ｏ． ＢＯＸ ６００９， Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ． ２０８７７］を製造
元の指示に従って形質転換した。細胞を水上で解凍腰
１形質転換あたりに１００μＱの細胞を取り、未使用の
細胞はドライアイスーエタノール浴で再凍結させた。こ
の細胞（１００μのを、水で５倍希釈しておいたライケ
一ション反応ｉｆｆｌ（１μＱ〉に加えた。この細胞を
水上て３０分間インキュベ−１・し、４２℃で２分間熱
ショックを与え、水に２〜５分間戻した。ＳＯＣ培地（
１村）を加え、振盪しながら３７゜Ｃで１時間、細胞を
インキユベートした。ＳＯＣ培地は、２％（ｗ／ ｖ）
トリブトン、０ ５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２０ｍ
Ｍ グルコース、］ ＯｍＭ ＮａＣＬ ２．５岬Ｋ
Ｃ（、］ ＯｍＭ ＭｇＣＱ２および］ Ｏ ｍＭ Ｍ
ｇＳ Ｏ ４である。 形質転換混合物の一部を、１００μｇアブラマイシン／
ｊＩ（！、４０ｐ９Ｘ−ガル／ｊｌ（！、および４０ｕ
ｙＩＰＴＧ／ｉｃを含有するし一寒天プレートに蒔いた
。Ｉ ＰＴＧはプラスミドｐＫＣ７９６に存在するｌａ
ｃプロモーターを活性化するように作用する。 このプレートを３７℃で一晩インキユベートした。 大腸菌Ｋ］２ ＤＨ５α／ｐＫＣ７９６などの挿入体
を含まないプラスミドを含有するコロニーは、このプレ
ートで青く見える。大腸菌Ｋ］２ＤＨ５α／ｐＯＪ２４
２なとの挿入体を含むプラスミドを含有するコロニーは
白である。数個のアブラ一６５ ６６ マインン耐性の白色コロニーを選択し、次いてそのプラ
スミドＤＮＡの制限酵素分析によってスクリーニングし
た。プラスミトＤＮＡの単離方法に従って、大腸菌Ｋ１
２ＤＨ５α／ｐＯＪ２４２およびｐＯＪ２４３形質転換
体からプラスミトＤＮＡを得た。これらのプラスミドｐ
ｏ Ｊ ２ ４ ２およびｐＯＪ２４３ＤＮＡを、次の
実施例３記載のストレブトマイセス・アンポファシエン
ス株２２８１の形質転換に用いた。たれでも人手するこ
とができるＳ．アンホファシエンス株ＮＲＲＬ２４２０
またはＮＲＲＬＩ．５２６３も同等に機能するであろう
。 実施例３ ストレプトマイセス属の形質転換Ａ．溶液の
リスト 以下に示す溶液は各実施例中で引用されるものであり、
ここに明示する。 ］．Ｐ培地（〜］００ｊｌの 成 分 』しスクロー
ス ］０．３ｇＫ，Ｓｏ４
０．０２５ｇ微量元素溶液（下記２参
照） ＭｇＣ（２’ ６ Ｈ ２０ 水 オートクレープ処理した後、 ＫＨ，ＰＯ．（０．５％） ＣａＣＱ２・２Ｈ２０（３．６８％） ［Ｎ一トリス−（ヒドロキ／メチル） メチル−２−アミノエタンスルホン 酸］、“”Ｔ Ｅ Ｓ ’”緩衝液、０．２５Ｍ（ｐＨ
７．２） ２ 微量元素溶液（〜１の 成 分 ＺｎＣＱ２ ＦｅＣＱ３・６Ｈ，Ｏ ＣＵＣｌ２２・２ ｔ｛２０ ＭｎＣＱ＝ ・４ Ｈ２０ Ｎａ＝Ｂ−０７・ＩＯＨ２０ （ＮＨ４），ＭＯ７０２．・４ Ｈ，ＯＨ，０ Ｏ ２村 ０． ２ ０ ３９ ８０叶 次の成分を追加する。 １村 ］ＯＲｌ！ ］０１Ｒｌ！ 量 ４０ｏ ２００ｏ ］．ＯＲｇ １０１！１１ ］Ｏｏ ］Ｏｘｇ １ｅ ３。改良Ｒ２再生培地（〜］ｆ２） 成 分 量スクロース
１０３ｇＫ２Ｓｏ４
０．２５ｇ微量元素溶液
２ｌｌＱＭｇＣＱ２・６ Ｈ ２０
１ ０ ． １ ２ ｇグルコース
］Ｏｇ■５−アスパラギン・］Ｈ，０
２．Ｏｙカザミノ酸 ０ １９寒
天 ２２９水
全量７００ＪＩｉ２までオートクレー
プ処理前にｐＨを７ ２に調節し、処理後に以下の戊分
を追加する。 Ｋ■ｔ，ｐｏ．（０．０５ｇ／１００ｘの １０００
ＣａＣｌ！！（２．２２９／］ＯＯｚｄ） １０
０３！１２ＴＥＳＦ｝衝液（５．７３ｙ／１００村）（
ｐＨ７．２） １００村４．
軟栄養寒天（ＳＮＡ、〜ＩＱ） 成 分 量ディフコ
・バクト・栄養ブロス ８ｇ寒天
５９５．Ｒ２ＹＥ培地は、Ｒ２培地
１（２に対して２５％酵母エキス２０叶を添加した培地
である。 ６．酵母エキスー麦芽エキス（ＹＥＭＥ、〜ｊ（！）・
成 分 』Ｌ酵母エ
キス ３ｇペプトン
５９麦芽エキス
３ｇグルコース ｌｏ
ｙ７．ＹＥＭＥ＋３４％スクロース液体完全培地は、３
４０９／（ｌのスクロースを含むＹＥＭＥである。 ８，ＹＭＸ培地（〜１ １２） ： 成 分 量酵
母エキス ３ｇ麦芽エキス
３ｇグルコース
２タ寒天
２０ｇ６９ ７０ ９．ＹＭＸ寒天は、０ ３％酵母エキス、０ ３％麦芽
エキス、０．２％デキストロースおよび２．０％寒天か
らなる。 １０．タイロシン発酵培地 成 分 量ビート
・糖蜜 ２％トウモロコシ粉
１ ５％魚粉
０ ９％トウモロコシ・グルテン
０．９％塩化ナトリウム ０．１％
リン酸アンモニウム（二塩基性） ０．０４％炭酸
カルシウム ０．２％粗大豆浦
３％この培地のｐＨをｌＮＮａＯＨ
で７．１に調節する。 １１．ＡＳＩ培地（〜Ｉ（脱イオン水）５成 分
量酵母エキス
１ｇＬ−アラニン
０．２ｇＩ７−アルキニン（遊離塩基） ０．
２ｉｒＩ一一アスパラ十ン ０．５ｇ
可溶性デンプン ５ｇ塩化ナトリウム
２ ５９硫酸ナトリウム
１０ｇミーア・寒天 ２０ｇｌ
２ スピラマイシン発酵培地（〜ＩＱ）成 分
エ 酵母エキス ＩＯＳ＋ＫＣＱ
２ ５９ＭｇＳＯ４
０ １ｇＫＨ．ＰＯ４ １
０ｇＦｅＣＱ， ０．０３１
ｊＺｎＣｆ！２ ０．０３ｇＭ
ｎＣＱ＝ ０．０１ｇモリブデ
ン酸アンモニウム Ｏ． Ｏ Ｏ ５９上記成分を
水（８００村）に溶解し、オートクレープ処理する。こ
の溶液に、水（２００ｉＣ）中の滅菌ジャガイモ・デキ
ストリン（１５ｇ）およびグルコース（ｌｏｇ）を加え
る。 １３．改良Ｒ２軟寒天重層液 或 分 量スクロース
５１．５ｇＭｇＣ ｌ！，・Ｈ
ｔ Ｏ ５ ． ０ ６ ９Ｃａ
ＣＱ， ．１ ． Ｉ
Ｉ９０．２５Ｍ ＴＥＳ（ｐＨ７．２） ５０ｘ
（１上記成分を脱イオン水に溶解して最終容量が５００
ｗＱとなるようにする。この混合物を蒸気処理して寒天
を溶融させ、４ｆｆＣづつ注入し、使用前にオートクレ
ープ処理する。 Ｂ． Ｓ．フラジエの形質転換 ストレブトマイセス・フラジエの培養物をトリプチカー
セー大豆ブロス（ＴＳＢ）（２０ｆｆｃ）に接種し、水
浴インキュベーター中、２９゜Ｃで一晩（約１６時間）
、２ ６ Ｏ ｒｐｍでインキユベートした。この培養
物を、ホモジナイズ容器［トーマス・サイエンティフィ
ック（Ｔｈｏｍａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｒｉｃ， Ｓｗｅ
ｄｅｓｂｏ１ｏ， ＮＪ）］およびＴ−ライン実験室撹
拌機を用いてホモジナイズし、次いでソニファイアー・
セル・デイスラブタ−（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ Ｃｅｌｌ
Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）［ヒート・ンステムズ・ウルトラ
ソニックス社（Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ［Ｉｌｔｒ
ａｓｏｎｉｃｓ， Ｉｎｃ．）］を用いて粉砕した（７
６ワットで７秒間）。このホモジナイズして粉砕した培
養物Ｃ４ｘＱ）を０．３％（ｗ／ｖ）グリシン含有のＴ
ＳＢ（ＢＢＬＸ２０村）に接種し、再度、この培養物を
２９℃で一晩インキユベートした。翌朝、培養物をホモ
ジナイズし、上記のように再培養した。この３回目の一
晩インキュベートの後に、培養物をホモジナイズし、集
め、モしてＰ培地で２回洗浄した。 細胞ベレットを１１ｇ／ｘＱリソチーム［カルビオケム
（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９
２０３７）］含有のＰ培地（ １ ５ ｉＱ）に再懸濁
し、次いで室温で約１．５時間インキユベートしてブロ
トブラストを得た。 このプロトブラストを穏やかに遠心することによって集
め、Ｐ培地で２回洗浄し、Ｐ培地（２岬）に再懸濁し、
使用時まで水上でインキユベートした。 プラスミドＤＮＡ（約１μｇ）をｌｍｇ／＋＆の硫酸ヘ
パリン［シグ？ （Ｓｉｇｍａ）］（約５０μｆ２）に
加え、水」二で約１０分間インキユベートした。もっと
少ないフ７３ ７４ ラスミドＤＮＡ（約５〜Ｉ Ｏ Ｏ ｎｇ）を用いてス
トレプトマイセス・フラジエを形質転換することかでき
る（Ｓ．フランエ宿主から調製されたとき）。ストレプ
トマイセス属のプラスミドＤＮＡを単離する方法は、ホ
ノブウッド等［１１ｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． ．
１９８５Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ ＳＬｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ： Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｊｏｈｎ ｌｎｎｅｓ Ｆ
ｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ＮｏｒｗｉｃｈＥｎｇｌａｎｄ）
］が記載している。始めに、ＤＮＡ／ヘパリン溶液をプ
ロトプラスト（約２００μのに加え、次いて、Ｐ培地中
の５５％ＰＥＧＩＯＯＯ（／グマ）からなる溶液（約０
．９１０をＤＮＡ／プロトプラスト混合物に加え、そし
て得られた混合物を室泥で穏やかに混合した。 この混合物を、その量を変えて、軟Ｒ２寒天重層液（４
ｊｌ（２）を用いてＲ２プレートに蒔いた。形質転換し
たプロトブラストを蒔いた後に、このプレートを２９℃
で２４時間インキユベートし、次いで、５０ｘｇ／ｍＱ
チオストレブトン［スクイブ（Ｅ． ＲＳｑｕｉｂｂ，
Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ ０８５４０）］（２
５ ｕのを含有する軟Ｒ２寒天（４Ｊ！のをプロトプラ
スト上に広げた。 再生か完了するまで、通常は約７〜１４日間、このプレ
ートの２９゜Ｃてのインキュベートを続け、所望のＳ。 フラジエ形質転換体を選択した。 Ｃ ストレプトマイセス属（Ｓ．フラジエを除く）の形
質転換 ホモシナイズして超音波処理したストレプ］・マイセス
属の完全増殖一晩培養物（０．５村）を、０５％グリシ
ンを加えたＴＳＢ（９．５ｘのに接種した。この培養物
を３０’Ｃて２４時間インキユベートした。絹織粉砕機
てホモシナイズした後、ホモジネート（０．５１！ｉ！
）を０ ５％グリンン追加の新鮮なＴＳＢ（９．５ＩＩ
Ｉ（！）に接種した。この培養物を３０℃で２４時間イ
ンキユヘートした。この培養物をホモジナイズし、５Ｍ
の滅菌ポリスチレン製遠心管に移した。３ ５ ０ ０
ｒｐｍで１０分間遠心することによって細胞をベレッ
ト化し、１π９／ ｒｔｒＱのリソチームを含むＰ培地
（ＩＯＲＣ）に再懸濁し、次いて室温で１５〜３０分間
インキユヘートした。 少量の試料を位相差則微鏡で調へることによってプロト
プラス１・の生成をモニターした。プロｌ・ブラストは
球状である。 このプロトプラストを前記のように遠心し、Ｐ培地で１
回洗浄した。細胞をＰ培地（１０ｆｆＣ）に再懸濁し、
それぞれの形質転換に対して１５０ｕ（！のプロトブラ
ストをＩ．５１１ＱのＥ ｐｐｅｎｄｏｒｆＩｌ管に入
れた。ＴＥ緩衝液中のＤＮＡ（ｌ ＯμＱまで）を穏や
かに混合しながら加えた。Ｐ培地中の５０％ポリエチレ
ングリコール１０００（１００μＱ）を直ちに加えた。 それぞれの形質転換混合物を改良Ｒ２表層寒天（４ Ｍ
（１）の２つの管に分け、乾燥改良Ｒ２プレートに注入
した。これらのプレートを３０℃で２４時間インキユベ
ートした。次いで、５０μ９／ｘ（１の最終プレー１・
濃度となるに十分なアブラマイ／ンを含む改良Ｒ２表層
寒天をこれらのプレートに重層した。プレートを３０℃
でインキユベートすると、２〜３日後に形質転換体が現
れた。この形質転換体を、実質的にマニアナイス等［Ｍ
ａｎｉａｔｉｓｅｔ ａｌ． ， １９８２． Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｉｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）］の方法
に従い、サザーン分析によって組込みプラスミドＤＮＡ
の存在について分析した。 実施例４ ストレプトマイセス属による抗生物質産生の
検定 Ａ６ プレート−プラグ検定 ある菌株が抗生物質を産生じているか否かを調べるため
、ストレプトマイセス・アンボファシエンスおよびＳ，
フラソエ形質転換体または親の対照を、Ｒ２寒天再生プ
レートからＡＳＩプレートに移し、コロニーが直径５〜
１０ＲＩＩとなるまで、３０゜Ｃて２〜３日間インキユ
ベートした（Ｓ フラシエについては５〜７日間）。ｐ
ｏ Ｊ ２ ４ ２ ＊タハｐＯＪ２４３で形質転換さ
れたＳ アンボファシエンスによるインバレリルスピラ
マイシンの産生を試験するため、この閑株を、Ａ）５０
ｕｇ／ｘＱアブラマイシン；Ｂ）５０μｇ／ｔｘ（ｌア
ブラマイシンおよび１００ｌＺｇ／１１（！ｃ＋イシ７
；Ｃ）添加なし，まタハＤ）１ ００μｇ／ｘ（ｌｏイ
シンを含有すルＡＳ ］プレートで増殖さぜた。次いで
、コロニーを滅菌移送管［スペク１・ラム・メディカル
・インダストリアル社（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ， Ｉｎｃ．，Ｌｏｓ Ａ
ｎ７７ ７８ ｇｅｌｅｓ，ＣＡ ９００５４）］によってプラグ化し
、このプラグ（ｐｌｕｇ）を、ミクロコノカス・ルテウ
ス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕＬｅｕｓ）ＸＩ６０
（ＡＴＣＣ ９３４ １）を含有する軟寒天栄養ブロ
ス［ディフコ・ラボラ１・リーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＤｅｔｒｏｉＬ．ＭＩ ４８２３
２）］を予め重層しておいたトリプチカーセ大豆寒天（
ＴＳＡ）プレー１・に移した。このプレートを３７°Ｃ
で１６〜２４時間インキユヘートした。ミクロコ，カス
・ルテウスは、タイロシンおよびスピラマイシンに対し
て感受性であり、アブラマインンに対して酬性てある。 従って、ミクロコノカス・ルテウスは、タイロシン、ス
ビラマイ／ンまたはイソバレリル・スビラマイシンを産
生じているス｝・レプトマイセスを含有するプラグの周
囲では増殖することができない。阻害領域は抗生物質の
存在を示している。 Ｂ バイオオートグラフィー ３０’Ｃて適当な時間増殖させた目的の生物を含む全プ
レートからの寒天を、５Ｍのポリプロピレン製の遠心管
に入れたＩＭトリスー）｛ Ｃ Ｃ（ｐＨ ８０ ）（
］． Ｏ ｉｆ！）中で柔化させた。酢酸エチル（Ｉ
ＯｉＣ）を加え、この混合物を室温で１〜２時間にわた
って数回激しく振盪した。層を卓上型遠心機で分離させ
、上層の酢酸エチル層を回収し、ペトリ皿において蒸発
乾固させた。この残留物をメタノール（１肩のに溶解し
た。このメタノール抽出物（約１〜２０μＱ）をＴ Ｌ
Ｃプレートにかけ、乾燥した。 分離は、タイロシンまたはスビラマイシン標準と並べて
、薄層クロマトグラフィー プレート［メルク（Ｍｅｒ
ｃｋ， Ｐ． Ｏ． Ｂｏｘ ２０００， Ｒａｈｗａ
ｙ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０７０６５），ブレーコ
ートされたンリ力ゲル＃６０ Ｆ−２５４］で行った
。寒天プラグを検定するときには、拡散するに充分な時
間、このプラグをプレート上に置き、次いでプレートを
酢酸エチル ジエチルアミン メタノール（９５：５・
５）の上昇液体クロマトグラフィーにかけた。展開した
クロマ１・グラムを、ヒュームフード中で少なくとも２
時間完全に乾燥した。次いで、このクロマトグラムを、
ミクロコッカス・ルテウスＸ］６０を蒔いたＴＳＡプレ
ートに下を向けて〜１５分間置いた。クロマトグラムを
プレートから取り、プレートを３７゜Ｃで１６〜２４時
間インキユベートした。阻害領域をタイロンンまたはス
ビラマイシン標準と比較した。 絹込みプラスミドｐＫＣ７９６たけを含有しているＳ
アンボファシエンス株は、インクラテイソクなＨＰＬＣ
分析で示されるようにスピラマインンを産生じ続けた。 メタノール抽出物を、８０％のアセトニＩ・リルおよび
２０％の０．１％炭酸水素アンモニウム、ｐＨ ＝ ７
を移動相とするテユポン・ボンダパック（ＤｕＰｏｎｔ
Ｂｏｎｄａｐａｋ）Ｃ Ｉ ８カラム［デュポン社（
ＤｕＰｏｎｔ Ｃｏ．． Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏ
ｎ， Ｎｅｗｔｏｗｎ， ＣＴ ０６４７０）］にかけ
た。実験試料をスビラマイシンエステル標準と比較した
。溶出時間を次の表に挙げる。スビラマイシンＩ、■お
よび■の構造は、オムラおよびナカガワ［Ｏｍｕｒａ
ａｎｄ Ｎａｋａｇａｖａ， Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ
． ２８ ： ４０１４３３（＋９７５）］が開示し
ている。 第１１表 ｃａｒ Ｅを用いて イソバレリルスピラマイシン■ ２６ ５イ
ソバレリルスビラマインンＩＩＩ ３２．
０プチリルスピラマイシンＩＩ ２３
．０スビラマイシン標準 スピラマイシン＋ １５．３
スビラマインン■ １６ ５ス
ビラマイシンＩＩＩ １９
．５プラスミドｐＯＪ２４２またはｐＯ３２４３を組込
んだＳ．アンボファシエンス株は、新規なノ＼イブリッ
ド抗生物質インバレリルおよびプチリルスビラマイシン
を産生じた。この結果を次に示す。 以下の表において、Ａは５０μｇ／ＩＩＱのアブラマイ
シンを示し、■７は１００μ９／ｘＱのロインンを示す
。結果は・、スピラマイシンのイソノくレリルおよびプ
チリルスビラマインンへの変換率（％）で表す。 「全スピラマインン＋エステル」の欄は、形質転８ｌ ８２ 換体の全体の抗生物質産生率を表示するものである。従
って、この欄に高い値を有する形質転換体は、同し「変
換率（％）」値および低い「全スビラマインン＋エステ
ルｊ値を有する形質転換体よりもインバレリルおよびプ
チリルスビラマイシンを多く産生じている。プラスミド
ｐｏ Ｊ ２ ２ ４はｐＫ０７９６とは無関係な自律
的に複製するベクターであるが、ｐＯＪ２４２およびｐ
ＯＪ２４３と同一のｃａｒＥ含有フラグメントを含んで
いる。 第１２表 増殖条件および ベクター Ａ“Ｌ ｐＫＣ７９６ ｐＯＪ２４２ ｐＯＪ２４３ ｐＯＪ２２４ Ａ”＋１ ｐＫＣ７９６ ｐＯＪ２４２ ｐＯＪ２４３ ｐＯＪ２２４ Ａ−Ｌ ｐＫＣ７９６ ｐＯＪ２４２ ｐＯＪ２４３ ｐＯＪ２２４ Ａ−Ｌ’ ｐＫＣ７９６ ｐＯＪ２４２ ｐＯＪ２４３ ｐＯＪ２２４ 変換率 全スピラマインン」− （％） エステル（μｇ／試料）２．０ １９ １８ ０６ ３，７ ２，７ ３．３ ０．６ ８３ ８４ これらの結果からいくつかの結論を導くことができる。 最も重要なことは、自律的に複製するプラスミドの代わ
りに組込みベクターを用いると金産生量の大きな増加が
得られるということである。 細胞中にそのようなプラスミドが存在すると、細胞資源
の多くはプラスミトの維持に向けられる。 これは次いで、細胞の抗生物質産生能力が減ずるという
結果になる。抗生物質産生の増加は、クローンされた遺
伝子を維持するためのベクターとしてのｐＫＣ７９６の
多くの利点の１つであるにすぎない。これらのデータに
基づく別の観察結果は、ｃａｒ Ｅ遺伝子がどちらの配
向であっても、スピラマイシンからインバレリルおよび
プチリルスピラマイシンへの大量の変換を引き起こすと
いうことである。この変換は増殖培地中にロイシンが存
在することによって増大する。最後に、抗生物質選択が
組込みベクターによるｃａｒＥ表現型の維持のための必
要条件ではないことを観察することができる。これはｐ
ＫＣ７９６の別の重要な利点を示すものである。 実施例５ プラスミドｐｓＫｃ５０およびｐＳＫＣ５１
の構築 Ａ８プラスミドｐＨＪＬ２８０の単離 受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８０４３のもとでＮＲＲＬ
に寄託されている大腸菌Ｋ］２Ｉ−ＩＢＩＯＩからプラ
スミドｐＨＪＬ２８０を単離した。ｐＨＪＬ２８０の制
限部位および機能地図を第５図に示す。このプラスミド
は、タイロシン生合成遺伝子ｔｙｌＥ， ｔｙｌＤ，
ｔｙｌＦ， ｔｙｌＨおよびｔｙｌ Ｊの供給源として
有用である。これらの遺伝子群はｐＨＪＬ２８０の〜６
ｋｂ ＢａｍＨ Ｉフラグメントに存在している。 アブラマイシンの代わりに１００μ９／ｘ（ｌのアンピ
シリンを培地に用いること以外は、実質的に実施例１の
記載に従ってプラスミドを単離した。 Ｂ．プラスミドｐｓＫｃ５０およびｐｓＫｃ５１の最終
的な構築 プラスミドｐｓＫｃ５０およびｐｓＫｃ５１は、ストレ
ブトマイセス・フラジエ染色体中にタイロンン生合成遺
伝子の追加のコピーを組込ませるた８５ ８６ めに用いたベクターてある。これらのプラスミドを次の
ようにして構築した。プラスミトｐＫＣ７９６ ＤＮ
Ａ（約１０μ１．１０μｇ）を、実施例２Ｂのように制
限酵素ＢａｍＨＩで消化した。実質的に実施例２Ｂのよ
うにして、プラスミドｐｔ｛ Ｊ Ｌ ２８０（約２０
μｇ）をＢａｍＨＩで消化し、〜６ｋｂのＤＮＡフラグ
メントを単離した。次いて、実質的に実施例２Ｂのよう
にして、Ｂ ａｍＨ ｌ ？ｔｊｌ化したｐＫＣ７９６
とｐＨＪＬ２８０の〜６ｋｂフラグメ／トを連結し、大
腸菌Ｄ Ｈ ５α中に導入した。得られたプラスミドは
ｐｓＫｃ５０およびｐｓＫｃ５１であり、これらは〜６
ｋｂ Ｂ ａｍＨ ｌフラグメントの配向たけが異な
っている（第６図および第７図を参照）。次いで、これ
らのプラスミトを」一記実施例３記載のようにしてＳ
フラ７工ＴＩ４０５中に導入した。この試料を、実質的
に上記実施例４に従い、タイロ／ン産生について検定し
た。 Ｓ．フラ／工産生株を用いた実験の結果は次のようであ
った。結果を、対照のＴ１４０５産生株（組込まれたベ
クターを含まない）と比較したときの、産生タイ０７ン
の割合（％）で表す。 第１３表 株 産生されたタイロシン（対照
に対する％） ＴＩ４０５ １００
＋００Ｔ］４０５／ｐＫＣ７９６ 行わず
９８Ｔ １／＋ ０５／ｐｓＫｃ５０ またはｐＳＫＣ５］ １３３ １３６こ
の結果は、タイロシン生合成遺伝子の追加のコピーの組
込みがタイロンン産生を相当に増加させることを示すも
のである。 実施例６ プラスミドｐＫＣ７９６、ｐＳＫＣ５０およ
びｐＳＫＣ５］によるｔｙｌ突然変異株ＧＳＩ５および
ＧＳ］６の形質転換 実施例３の記載のようにして、ス１・レプトマイセス・
フラジエ株ＧＳ］５およびＧＳ］６を増殖させ、プロト
プラスト化し、そしてｐｓＫｃ５０およびｐＳＫＣ５］
で形質転換した。ｐｓＫｃ５０またはｐｓＫｃ５１を含
有しているアブラマインン耐性の形質転換体を、５０μ
ｇ／ｘＱのアブラマイシンを加えたＴＳブロス中、約４
８時間または培養が定常期に達するまで増殖させた。そ
れぞれの培養物（０．５ｉＱ．）をタイロ７ン発酵培地
（実施例３）（７ＪＩのに接種し、この培養物を速く撹
拌しながら２９℃で７日間インキユベートした。それぞ
れの培養物にメタノール（５Ｒｅ）を加えた。手で振盪
して廃合した後、メタノール希釈した発酵培養物をワノ
トマン（Ｗｈａｔｍａｎ） ＃ Ｉ紙で濾過した。この
濾液を、薄層クロマトグラフイ−［バルツおよびセノ（
Ｂａｌｔｚ ａｎｄ Ｓｃｎｏ， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ
ｂ． ＡｇａｎＬｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ２０ ：
２１４−２２５（１９８１））］およびＨ Ｐ Ｌ
Ｃ ［ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ， Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．
２８１ ： ２８８−２９２（１９８３））］により
、タイロシン、マクロンンおよびデメチルマクロ／ンの
存在について分析した。この結果を、同時に行ったｐｓ
Ｋｃ５０またはｐｓＫｃ５１を含まないＧＳＩ５または
ＧＳＩ６からなる対照培養物のものと比較した。
連生物におけるクローン化遺伝子の導入および維持に大
きな進歩をもたらすものである。本発明はアクチノファ
ージφＣ３］［チャター等（Ｃｈａｔｅｒ ｅｔ ａｌ
．，Ｇｅｎｅ １９ ： ２１−３２ （１９８２））
］の〜２ｋｂフラグメントを利用することに基ついてい
る。このフラグメン１・を含有するベクターであるプラ
スミ ドｐＫＣ７９６は、Ｎ Ｒ Ｒ Ｌ （Ｎｏｒ
ｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｐｅｏｒｉａ ｌｌｌｉｎｏ
ｉｓ ６１６０４）から受託番号Ｂ−１ ８４ ７７（
寄託日： １９８９年４月４日）のもとで入手すること
ができる。このプラスミドはブダペスト条約に則って寄
託が為されている。ｐＫＣ７９６の制限地図については
第１図を参照。 本明細書に開示した発明のために以下の用語を定義する
。 抗生物質：微生物によって産生される物質であって、天
然に、または限定された化学的修飾を受けた後、他の微
生物または真核細胞の増殖を阻害するかまたは死滅させ
る物質。 抗生物質生合成遺伝子・１次中間代謝物を抗生物質中間
体（抗生物質活性を有していることもある）に、次いで
抗生物質に変換する過程における酵素反応に必要な酵素
活性をコートしているか、または該酵素活性の発現を調
節する産物をコードしているＤＮＡセグメント。 抗生物質生合成経路：１次中間代謝物を抗生物質中間体
に、次いで抗生物質に変換する過程に必要な一群の抗生
物質生合成遺伝子および生化学反応。 抗生物質産生微生物：抗生物質を産生ずるか、または発
現したときには抗生物質を産生させるであろう遺伝子を
含有しているあらゆる微生物であって、アクチノブラ不
ス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、アクチノマズラ（Ａ
ｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）、セフ７０スポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉ
ｕｍ）、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏ
ｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌ１ｉｕｍ）、ノ
カルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、およびス１・レプトマ
イセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含むが、これら
に限定はされない。 抗生物質耐性付与遺伝子 ある抗生物質に対する耐性を
付与する活性をコードしているＤＮＡセグメント。 ＡｍＲ アブラマイシン耐性の表現型またはそれを付
与する遺伝子。 ＡｐＲ：アンピンリン耐性の表現型またはそれを付与す
る遺伝子。 ａｔｔＰ：宿主染色体中への組込みのためのファ一ジφ
Ｃ３１の付着部位。 ｃｏｓ部位，ラムダ（λ）の付着末端配列。 宿主細胞二組換えＤＮＡクローニングベクターで形質転
換されうる生物であって、その生存プロ１３ Ｉ４ トプラス１・を含む。 ハイブリソド抗生物質：元の宿主細胞によって産生され
る抗生物質を修飾することか可能な酵素をコートしてい
る異種の抗生物質生合成遺伝子が抗生物質産生微生物中
に導入されたときに産生される抗生物質。 組込みベクター 宿主細胞に導入されたときに該宿主細
胞内で自律的に複製せず、代わりに絹換えによって宿主
染色体中に組込まれるベクターｏｒｉ 本明細書に添
付した図面においては、大腸閑の複製起源。 組換えＤＮＡクローニングベクター・別のＤＮＡを付加
したか、または付加することができるＤＮＡ分子からな
る、選択可能な、自律的に複製するか、または染色体に
組込まれるあらゆる媒体であり、プラスミドおよびファ
一／を含むかこれらに限定はされない。 ｒｅｐ ：本明細書に添付した図面においては、ス｝・
レプ１・マイセス属ブラスミトの複製起源。 制限フラグメント：１またはそれ以上の制限酵素の作用
によって生成するあらゆる直線状のＤＮＡ。 感受性宿主細胞 ある抗生物質の存在下では、その抗生
物質に対する耐性を付与するＤＮＡセグメントがないと
増殖することができない宿主細胞であって、その生存プ
ロトプラストを含む。 部位特異的な組込み・ブラスミト”あるいはファ−ジに
よってフードされている特異的な絹換え系（ｉｎｔ）な
らびに特異的な細菌性付着部位（ａｔｔＢ）およびプラ
スミドあるいはファージ付着部位（ａｔｔＰ）を利用す
る、ベクターによる宿主染色体への絹込みの過程。 形質転換体 形質転換を受けた受容宿主細胞であって、
その生存プロトプラス１・を含む。 形質転換．受容宿主細胞の遺伝子型が変化する結果にな
る、受容宿主細胞（その生存プロトプラストを含む）へ
のＤＮＡの導入と、その後の該ＤＮＡの維持。 ｔｓｒ ：チオストレプトン耐性の表現型またはそれを
付与する遺伝子。 本明細書に添付した図面に示されている制限部位および
機能地図は、本明細書に記載した組換えＤＮΔベクター
の概要を図示するものてある。地図上の制限部位の間隔
はベクター上の制限部位の実際の間隔に比例しているか
、観察される制限部位の距離が、計算された地図」二の
距離と若干異なっていることもある。この地図は、ある
制限酵素の切断部位を必ずしも全て挙げているものでは
ない。 従って、ベクター」二には地図に示されているよりも多
数のある種類の制限部位か存在していることもある。 第１図は、ブラスミトｐＫＣ７９６の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第２図は、プラスミドｐＯＪｌ７］の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第３図は、プラスミドｐｏ Ｊ ２ ４ ２の制限部位
および機能地図を示す模式図であり、 第４図は、プラスミドｐＯＪ２４３の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第５図は、プラスミドｐＨ Ｊ Ｉ− ２．８ ０の制
限部位および機能地図を示す模式図であり、第６図は、
プラスミドｐｓＫｃ５０の制限部位および機能地図を示
す模式図であり、 第７図は、プラスミドｐｓＫｃ５１の制限部位および機
能地図を示す模式図である。 本発明は、放線菌ファージφＣ３］の部位特異的な組込
み機能を含んでいるプラスミドベクターを提供するもの
である。以下に示すこの領域のＤＮＡ配列は本発明前に
は知られていなかったものである。この配列の一方の鎖
だけを、５→３゛の方向て示ず。 ｌ７ １８ １ ＣＧＴＣＣＣＧＴＡＣ ＡＡＣＧＴＣＧＣＧＣ
ＧＴＧＡＧＣＧＧＧＴ ＣＧＧＴｒＣＣＧＧＴ ＧＡＡ
ＧＡＧＡＴＡＣ１５１ ＧＣＧＣＧＣＴＧＣＣ ＣＣ
ＡＧＧＡＣＧＡＣ ＧＡＣＧＧＣＧＡＧＣ ＣＧＧＴＧ
ＡＣＧＣＴ ＣＧＡＡＴＧＧＣＧＴ２０１ ＴＣＧＣ
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ＧＴＧＧＣＧＣＧＡａ仁ＩＩ ３０１ ＧＣＴＴＣＣＣＣＧＴ ＧＣＣＧＧＡＧＣＭ
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ＣＧＣＣＣＣＴＣ３５１ ＴＡＴＧＧＣＣＣＧＴ Ａ
ＣＴＧＡＣＧＧＡＣ ＡＣＡＣＣＧＡＡＧＣ ＣＣＣＧ
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ＡＣＧＣＡ ＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡ１９０１ １９５１ ２００１ ２０５１ ２１０１ ＣＧＧＧＣＧＡＡＣＣ ＴＴＧＴＴＧＣＧＧＡ ＧＣＧ
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ＴＣＧＣＡＴＧＧＣＴ２０ ３０５１ ＧＧＣＣＴＴＣＡＴＧ ＧＧＴＴＧＧＣＴ
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ＴＣＧＴＧ３３５１ ＣＴＡＴＣＣＧＴＡＡ ＧＧＣ
ＡＧＴＧＧＧＣ ＧＣＧＣＡＣＴＧＴＧ ＣＴＡＣＣＴ
ＧＣＣＴ ＧＧＧＴＴＧＧＴＡＣ３４０１ Ｃ 上記の配列中、Ａはテオキンアテニル残基、Ｇはテオキ
ングアニル残基、Ｃはテオキ／冫チ／ル残基、Ｔはチミ
ジル残基、モしてＸはデオキンアデニル、デオキシ／チ
ジル、デオキングアニル、またはチミンル残基である。 部泣特異的な組込みに必要なＤ Ｎ Ａ要素の全てを含
有しているＤＮＡ配列は、上記配列の位置２７９て始ま
るＡａｔｌｌ制限部位（下線部）と位置２３６９の下線
を引いたチミシルヌクレオチドによって囲まれている。 この配列を含有するプラスミドは放線菌を極めて高率で
形質転換する。このプラスミドは、この配列を含有して
いるファーシク口ニングヘクタ−［ノユアレッおよびチ
ャター（Ｓｕａｒｅｚ． Ｊ． Ｅ． ａｎｄ Ｃｈａ
ｔｅｒ， Ｋ． Ｆ． ． Ｎａｔｕｒｅ ２８６ ：
５２７−５２９ （＋９ｇｏ））ｒよりも優れている
（プラスミドにクロ−ンすることができるＤＮＡ量に対
する制限か少ない）。ファージベクターのクローニング
能力は、パ，ケーシングされ得るＤＮＡｔに制限される
。 このフラグメン１・を含有させて創製することかできる
ベクターの多様性には実質的に制限がないことを理解す
るのは当業者には容易であろう。唯一の絶対的な要件は
、構築か行われる宿主細胞、例えば天腸菌（Ｅ． ｃｏ
ｔ ｉ）またはバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）において
機能する複製起源をこのプラスミドが含有していること
である。放線菌の複製起源は必要ではない。事実、φＣ
３１フラグメントを含有している好ましいプラスミドは
放線菌の複製起源を含有していない。抗生物質耐性遺伝
子、多重クロニング部位、およびｃｏｓ部位などの他の
特性が有用であるか、必須ではない。コスミドンヤトル
ベクターの調製および使用についての記述を、ラオ等［
Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，１９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３ ： １６６−１
９８ （Ｒ． Ｗｕ ａｎｄ Ｌ． Ｇｒｏｓｓｍａｎ
， ａｄｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ）
］に見ることができる。要するに、φＣ３１フラグメン
トを含有し、ファージプラー２１ ２２ クを生成しないあらゆるプラスミトか本発明の範四内に
含まれる。 本発明の好ましい態様はプラスミドｐＫＣ７９６である
（第１図を参照）。このプラスミ１・は、フラスミトの
構築を容易にするｐＵＣプラスミド［ベセスタ・リサー
チ・ラホラ１・リーズ社（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｐ．０
．Ｂｏｘ ５７７ ＧａｉＬｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ
２０７６０）から人手可能］由来の大腸菌複製起源を有
している。犬腸閑てのプラスミドの構築はス］・レプト
マイセス属で行う構築に比へて簡単かつホ速であるので
、最初の段階の全てを犬腸菌中て行うことかてきるのが
好都合である。その後、最終生成物たけを、抗生物質製
造に用いるためにストレブトマイセス属に導入する。 本ベクターはスｌ・レプトマイセス属の複製起源を有し
ておらず、これは組込みベクターにおいては極めて好都
合てある。染色体中の複数の複製起源は構築の不安定性
を導くこともある。ストレプトマイセス属の複製起源と
組込み機能を有するベクターの形質転換率か、とちらか
の機能だけを有するベクターの形質転換率に比へて極め
て低いことか実験によって示されていた。この結果は不
安定性の問題によるものてあるのかもしれない。 また、プラスミドｐＫＣ７９６はストレプ］・マイセス
属ファージφＣ３１の付着部位（ａｔｔ Ｐ ）ヲ含有
している［チャター等（Ｃｈａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．．
Ｇｅｎｅ１９ ： ２１−３２ （＋９８２））コ。こ
の部位はφＣ３１由来の〜４ｋｂ Ｃｌａｒ−Ｋｐｎｌ
フラグメント上に存在ずる。ａｌｌ Ｐおよびａｃｔ
Ｂ部位を認識するタンパク質（群）は染色体中への部位
特異的な組込みを行わしめる。絹込みが為されたときに
は、この構築物は極めて安定であり、実質的には天然の
状態に逆戻りしない。組込みの部位特異的な性質は組込
み体の分析を容易にする。 さらに、プラスミドｐＫＣ７９６は、大腸閑とス１・レ
プトマイセス属の両方で好都合に選択されつるアブラマ
イ／ン耐性遺伝子を含有している。 ストレプトマイセス属における形質転換過程中でのアブ
ラマイシン選択は、ベクター」二にストレプトマイセス
属複製起源が存在しないということから、組込みか起こ
ったことを確実なものにする。 組込まれたＤＮＡか安定であるので、次いて、所望の表
現型が失われるということを懸念することなくアブラマ
インン選択を除くことがてきる。 本ベクターはｌａｃα（β−ガラクトシターゼ）遺伝子
内に多重クローニング部位を含んている。利用可能なク
ローニング部位については第１図を参照。 挿入体を含むｐＫＣ７９６プラスミドを保持している犬
腸菌形質転換体は、Ｘガル（５−ブロモ４−クロロ−３
−インドリルーβ一Ｄ−ガラクト／ド）およびＩ ＰＴ
Ｇ（イソフロビルーβ一Ｄ−チオガラクトンド）を含む
培地て増殖させたときに、白色コロニー（青色と対照的
に）として容易に検出される。 本発明の最も重要な長所の１つは、極めて高率で多数の
放線菌株を形質転換する本ベクターの能力である。以下
に挙げる表は、プラスミドｐＫＣ７９６によるいくつか
の代表的な形質転換の結果を示すものである。 第１表 菌 株 Ｓ．アンボファシエンス Ｓ．グリセオフスカス Ｓ．リビタンス Ｓ リプマニ Ｓ フランエ Ｓサーモトレランス アミコラトプシス・オリエンタリス およその形質転換 頻度（ＤＮＡ１μ９あたり） 〉１０６ 〉１０６ 〉１０° 〉］０４ 〉１０″ 〉１０３ 〉１０２ 以下の表は、本発明を適用することかできる抗生物質産
生微生物を列挙するものてあるが、全てを挙げるもので
はない。また、ある場合には、本発明を用いて生戊物の
量の増加、あるいは抗生物質以外の新規産物を得ること
もてきる。 ２５ ２６ 多数の種 種々のアミノサイ クリトール類 ミクロモノスボラ属（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）
多数の種 ケンタマイシ
ン類サツ力口ボリスボラ属（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙ
ｓｐｏｒａ）多数の種
種々のアミノサイクリトール類 ストレブトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ア
ルボグリセオラス（ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）アル
プス変種メタマインヌス（ａｌｂｕｓｖａｒ． ｍｅｔ
ａｍｙｃｉｎｕｓ） アクアカヌス（ａｑｕａｃａｎｕｓ） アトロファ／エンス（ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ）ビキニ
エンシス（ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ）プルエンシス変種
プルエンシス （ｂｌｕｅｎｓｉｓ ｖａｒ． ｂｌｕｅｎｓｉｓ）カ
ヌス（ｃａｎｕｓ） カテヌラエ（ｃａｔｅｎｕｌａｅ） クレストマイセチクス（ｃｈｒｅｓｔｏｍｙｃｅＬｉｅ
ｕｓ） クリスタリヌス（ｃｒｙｓｔａｌ ｌ ｉｎｕｓ）エリ
スロクロモゲ不ス変種ナルトエ ンンス（ｅｒｙｔｈｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｖａ
ｒ不オマイシン類 メタマイシン Ｎ−メチルハイグロ マイシンＢ ハイグロマイシン類 ストレプトマインン ブルエンソマイシン リボンルパロマミン カテヌリン アミノンジン ハイグロマイシンＡ エウロシジクス（ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ）フラジエ（
ｆｒａｄｉａｅ） Ａｌ６３１６−Ｃ ハイブリマインン類 および不オマイシン類 フランエ変種イタリクス（ｆｒａｄｉａｅｖａｒ． ｉ
ｔａｌｉｃｕｓ） ガルブス（ｇａｌｂｕｓ） グリセウス（ｇｒｉｓｅｕｓ） グリセオフラパス（ｇｒｉｓｅｏｌ’ ｌａｖｕｓ）ホ
フエンシス（ｈｏｆ ｕｅｎｓ ｉｓ）ハイグロスコピ
カス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）アミノンジン ストレプトマインン ストレプ１・マインン ＭＡＩ２６７ セルドマインン複合体 ハイグロマイゾン類、 ロイカニシジン、およ びハイグロリジン ハイグロスコピカス品種グレボサス （ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｆｏｒｍａ ｇｌｅｂ
ｏｓｕｓ）ハイグロスコピカス変種リモネウス （ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ． Ｉｉｍｏ
ｎｅｕｓ）ハイグロスコビカス変種サガミエンシス（ｈ
ｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕＳｖａｒ． ｓａｇａｍｉｅｎ
ｓｉｓ）カナマイセチカス（ｋａｎａｍｙｃｅｔ ｉｃ
ｕｓ）カスカエン／ス（ｋａｓｕｇａｅｎｓ ｉｓ）カ
スガスピナス（ｋａｓｕｇａｓｐｉ ｎｕｓ）ラベンデ
ュラエ（Ｉａｖｅｎｄｕｌａｅ）リビダス（ｌ ｉｖｉ
ｄｕｓ） グレボマイ／ン バリダマイシン類 スペクチノマイシン カナマインンＡ およびＢ カスガマイシン類 力スガマイシン類 不オマインン リビドマイシン類 ミクロスボレウス（ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）不トロ
プシス（ｎｅｔｒｏｐｓ ｉｓ）ノボリトエンシス（ｎ
ｏｂｏｒｉＬｏｅｎｓｉｓ）オリバセウス（○ｌ ｉｖ
ａｃｅｕｓ）オリボレチクリ変種セル口フィラス （ｏｌｉｖｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ｖａｒ． ｃｅｌｌｕ
ｌｏｐｈｉｌｕｓ）ボーレンンス（ｐｏｏｌｅｎｓｉｓ
） ラメウス（ｒａｍｅｕｓ） リボンジフィクス（ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ）リモ
ファンエンス（ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ）リモサス品種
パロモマインヌス （ｒｉｍｏｓｕｓ ｆｏｒｍａ ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉ
ｎｕｓ）スベクタビリス（ｓｐｅｃｔａｂｉ ｌ ｉｓ
）テネブラリウス（ｔｅｎｅｂｒａｒｉｕｓ）ＳＦ−７
６７ ＬＬ−ＡＭ３１ ハイグロマイシン類 ストレプトマイシン デストマイシンＡ ストレプトマイシン ストレブトマインン ＳＦ７３３ デストマイシンＡ パロモマイシン類 およびカテヌリン スペクチノマイシン トブラマインンおよ びアブラマイシン 多数の種 ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ） メジテラネイ（ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）ストレブト
マイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）コリナス（ｃ
ｏｌ ｌ ｉｎｕｓ） ジアストク口モゲネス （ｄｉａＳｔｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）ガルブス亜種
グリセオスポレウス （ｇａｌｂｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｇｒｉｓｅｏｓｐｏｒ
ｅｕｓ）ハイグロスコピカス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃ
ｕｓ）ハイグロスコピカス変種ゲルダヌス 変種ノバ（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒｇｅｌ
ｄａｎｕｓ ｖａｒ． ｎｏｖａ）ニゲラス（ｎｉｇｅ
ｌ ｌｕｓ） リンリエン／ス（ｒｉｓｈｉｒｉｅｎｓｉｓ）種Ｅ／７
８ ４ 種Ｅ８８ スペクタビリス（ｓｐｅｃｔａｂｉ Ｉ ｉｓ）種々の
アンサマインン類 リファマイシン アンサトリエン類および ナプトマイシン類 アンサトリエン類および ナプ１・マインン類 ナブトマイシンＢ ハービマイソン ゲルダマイシン ２１−ヒドロキン−２５ デメチル２５−メチル チオブロトストレブト バリシン マイフトリエン類 アクタマインンおよび マイコトリエン類 マイコトリエン類 ス１・レプトバリシン類 ２９ ３０ 筆牟衣アントラサイクリンおよびキノン系抗生物質を産
生カエスピトサス（ｃａｅｓｐｉ ｔｏｓｕｓ）コエリ
カラ−（ｃｏｅｌ ｉｃｏｌｏｒ）コエルレオルビジク
ス （ｃｏｅｒｕｌｅｏｒｕｂｉｄｉｃｕｓ）サイア不ウス
（ｃｙａｎｅｕｓ） フラボグリセウス（ｆ Ｉａｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）ガリ
レウス（ｇａｌ ｉｌａｅｕｓ） ルシタナス（ｌｕｓｉｔａｎｕｓ） ペウセチカス（ｐｅｕｃｅｔ ｉｃｕｓ）ビオロクロモ
ゲ不ス ミトマインンＡ，Ｂ およびＣ アクチノ口ジン タウノマインン ／トリサルビシン サイアノサイクリンＡ アクラ／ノマインンＡ１ アウラマインン類および スルフルマイシン類 ナプチリジノマイシン タウノマイシンおよび アドリアマイシン ラクタマデュランス （ｌａｃｔａｍａｄｕｒａｎｓ） ユニフォルミス（ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）セファマイシン
Ｃ ノ力ルジシン アルゲンテオラス（ａｒｇｅｎｔｅｏｌｕｓ）カトレヤ
（ｃａｔｔｌｅｙａ） チャルトレウンス（ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｓ）ンンナモ
不ンシス（ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）クラブリゲラ
ス（ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）フィムブリアツス（ｆ
ｉｍｂｒｉａｔｕｓ）フラホビレンス（ｆｌａｖｏｖｉ
ｒｅｎｓ）フラバス（ｆｌａｖｕｓ） フルボビリンス（ｆｕｌｖｏｖｉｒｉｄｉｓ）アスパレ
ノマイシンＡ１ ＭＭ４５５０，および ＭＭ］３９０２ チェナマイシン ＳＦ １６２３、および セファマインンＡおよびＢ セファマインンＡおよびＢ ＰＡ−３２４ ］ ３−１、 セファマイ／ンＣ， Ａ１６８８６Ａ，ペニシリ ン類、セファロスボリン類、 クラプラン酸、および その他のクラバム類 セファマインンＡおよびＢ ＭＭ４．５５０、および ＭＭｌ３９０２ ＭＭ４５５０、および ＭＭＩ３９０２ ＭＭ４５５０、および ハルステシ（ｈａｌｓｔｅｄｉ） ヘテロモルフス０＋ｅｔｅｒｏｍｏｒｐｌ＋ｕｓ）ハイ
グロスコビクス （ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ） リブマニ−（ｌｉｐｍａｎｉｉ） オリバセウス（ｏｌ ｉｖａｃｅｕｓ）バナエン／ス（
ｐａｎａｙｅｎｓ ｉｓ）ロチェイ（ｒｏｃｈｅｉ） シオヤエンンス（ｓｉｏｙａｅｎｓｉｓ）種ＯＡ−６
１ ２９ および力ルペチマイシンＡ およびＢ セファマイシンＡおよびＢ Ｃ２０８＋Ｘ、および セファマイシンＡおよびＢ デアセト牛ノセファ口ス ボリンＣ セファマインン、ペニシリ ンＮ，７〜メトキシセファ 口スポリンＣ，Ａ１６８８ ４、ＭＭ４５５０、および ＭＭ １ ３ ９ ０ ２ エピチェナマイシンＦ１ ＭＭ４５５０および ＭＭ ｌ ３ ９ ０ ２ Ｃ２０８ １Ｘおよびセファ マイシンＡおよびＢ セファマイ／ンＡおよびＢ ＭＭ４５５０，および ＭＩＶＮ３９０２ ＯＡ−６１２９Ａ ビリドクロモゲ不ス （ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）セファマイン
ンＡおよびＢ 築旦衣マクロライド、リンコサミド、およびストレプト
ロザリア（ｒｏｓａｒｉａ） アルビレチクリ（ａｌｂｉｒｅｔｉｃｕｌｉ）アルボグ
リセオラス（ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕＳ）アルプス（
ａｌｂｕｓ） アルプス変種コイルマイセチカス （ａｌｂｕｓ ｖａｒ． ｃｏｉｌｍｙｃｅｔｉｃｕｓ
）アンポファシエンス（ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）アン
チビオチカス（ａｎＬｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）アベルミチ
リス（ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ビキニエンノス（ｂｉ
ｋｉｎｉｅｎｓｉｓ）ロザラミシン カルボマイシン ミコノマイシン アルボマイセチン コレイマインン スピラマイシンおよび フォロマンジンＤ オレアンドマイ／ン アベルメクチン類 力ルコマインン ３３ ３４ カエレスチス（ｃａｅｌｅｓＬｉｓ） シネロクロモゲネス （ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）ンラタス（ｃ
ｉｒｒａｔｕｓ） デルテ（ｄｅｌＬａｅ） ジャカルテンシス（ｄｊａｋａｒｔｅｎｓ ｉｓ）エウ
ロンジカス（ｅｕｒｏｃ ｉｄ ｉｃｕｓ）エウリテル
マス（ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ）ファシクラス（ｒａＳ
Ｃｉｃｕｌｕｓ）フェレウス（ｆｅｌ Ｉｅｕｓ） フィムブリアタス（ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ）フラポク口
モゲ不ス （ｆｌａｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）フラジエ（ｆｒ
ａｄｉａｅ） フンギシジカス（ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）フン牛シ
ジカス変種エスピノマイ セチカス（ｒｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒｅｓｐｉ
ｎｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ） フルジンジカス（ｆｕｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ）ゴ／キエ
ンシス（ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉｓ）Ｍ１８８および セレスチセチン シネロマイシンＢ シラマイシン デルタマイシン類 ニタマインン メチマイシン アンコラマイシン アマロマインン アルゴマイシンおよび ビクロマインン アマロマイシン アマロマイシンおよび シンコマイシン類 タイロシン ＮＡ−１ ８ １ エスピノマイシン類 マイデカマインン パンダマイシン グリセオフラバス（ｇｒｉｓｅｏｆ Ｉａｖｕｓ）グリ
セオフスカス（ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）グリセオラ
ス（ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ） グリセオスピラリス（ｇｒｉｓｅｏｓｐｉｒａｌ ｉｓ
）グリセウス（ｇｒｉｓｅｕｓ） グリセウス亜種スルフラス（ｇｒｉｓｅｕｓｓｓｐ．
ｓｕｌｐｈｕｒｕｓ） ハルステジ（ｈａｌｓｔｅｄｉ） ハイグロスコピカス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ハ
イグロスコビカス亜種アウレオラク リモサス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ．
ａｕｒｅｏｌａｃｒｉｍｏｓｕｓ） キタストエンシス（ｋｉｔａｓｔｏｅｎｓｉｓ）ラベン
デュラエ（ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）リンコルネン／ス（
Ｉｉｎｃｏｌｎｅｎｓｉｓ）ロイデンンス（ｌｏｉｄｅ
ｎｓｉｓ） マクロスボレウス（ｍａｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）マイゼ
ウス（ｍａｉｚｅｕｓ） マイカロファンエンス（ｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ）
アクマイシン ブン１・リン グリセオマインン レロマインン ホレリンン パフィロマイシン類 力ルポマイシンおよび ロイカニシジン タイロンン ミルベマイシン類 口イコマインンＡ３ およびジョサマイシン アルドガマインン リンコマイシン へルナマイ７ンＡ およびＢ カルボマイシン イングラマイシン アセチルー口イコマイ ンンおよびエスビノ マイ／ン ３５ ３６ ナルボ不ンシス（ｎａｒｂｏｎｅｎｓ ｉｓ）ナルボネ
ンシス変種ジョサマイセ チカス（ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ ｖａｒｊｏｓａｍｙ
ｃｅｔ ｉｃｕｓ） オリボク口モゲ不ス（ｏｌ ｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎ
ｅｓ）プラテンンス（ｐｌ ａｔｅｎｓ ｉｓ）リモサ
ス（ｒｉｍｏｓｕｓ） ロチェイ（ｒｏｃｈｅｉ） ロチェイ変種ボルビリス （ｒｏｃｈｅｉ ｖａｒ． ｖｏｌｕｂｉｌｉｓ）ロセ
オク口モゲネス（ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）
ロセオ／トレウス（ｒｏｓｅｏｃｉｔｒｅｕｓ）スビニ
クロモゲ不ス変種スラガオ エンンス（ｓｐｉｎｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｖａｒ
ｓｕｒａｇａｏｅｎｓ ｉｓ） テンダエ（ｔｅｎｄａｅ） サーモトレランス（ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ベ
ネズエラエ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）ビオラセオニゲル
（ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ）ジョサマイシンおよび ナルボマイシン ロイコマイシンＡ３ およびジョサマインン オレアンドマイシン ブラテノマイシン タイロシンおよび ノイトラマイシン ランカシジンおよび ボレリジン Ｔ２６３６ アルボサイクリン アルポサイクリン クジマイ７ン類 カルポマイシン カルボマイノン メチマイシン類 ランカシジン類および ランカマイシン シクロベンクン環 含有型 含窒素型 ボリエン型 テトラサイタ リン型 コエリカラー （ｃｏｅｌ ｉｃｏｌｏｒ） エリスロクロモゲネス （ｅｒｙｔｈｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）カスガエン
ンス （ｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ） メチレノマイシンＡ サルコマイシン アウレオスリシン およびチオルチン ビオラセオラバー （ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ） べ不ズエラエ （ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ） グリセウス（ｇｒｉｓｅｕｓ） ノドサス（ｎｏｄｏｓｕｓ） ノウルセイ（ｎｏｕｒｓｅｉ） アウレオファシエンス （ａｕｒｅｏ『ａｃｉｅｎｓ） リモサス（ｒｉｍｏｓｕｓ） メチレノマイシンＡ クロラムフエニ コーノレ カンジシジン アンホテリシンＢ ナイスクチン テトラサイクリン、 クロロテトラサイク リン、デメチルテト ラサイクリン、およ びデメチルク口ロテ トラサイクリン オキシテトラサイク リン ３７ ３８ ミチガ不セ・ピーブイ・ラサイ （ｍｉｃｈｉｇａｎｅｓｅ ｐｖ． ｒａｔｈａｙｉ
）チュニカマイシン 類似体 ノカル／ア属（Ｎｏｃａｒｄ ｉａ） カンジダス（ｃａｎｄｉｄｕｓ） ストレプｔ−マイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
アンチビオチカス（ａｎｔ ｉｂｉｏｔ ｉｃｕｓ）チ
ャルトレウ／ス（ｃｈａｒｔｒｅｕｓ ｉｓ）グリセオ
フラハス変種スリンギエンンス（ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖ
ｕｓ ｖａｒ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）グリセ
オラス（ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ） ビラゾフリン ａｒａ−Ａ チュニカマイシン ストレブトビリタンス シ不フンキ′ン テイコマイセチカス（ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅＬｉｃｕｓ
）ルリダ（ｌｕｒｉｄａ） オリエンタリス（ｏｒｉｅｎｔａｌ ｉｓ）ストレプト
マイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）アンチビオチ
カス（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）アウレウス（ａｕｒ
ｅｕｓ） カヌス（ｃａｎｕｓ） エブロスボレウス（ｅｂｕｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）ハラノ
マチェン／ス（ｈａｒａｎｏｍａｃｈｉｅｎｓｉｓ）プ
リスチナエスビラリス （ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）ロセオスボラ
ス（ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）トヨカエンンス（ｔｏｙ
ｏｃａｅｎｓｉｓ）テイコプラニン アホパルシン リストセチン バンコマイシン アクチノマイシン チオストレブトン アンホマイシン Ｌ Ｌ−ＡＭ３ ７ ４ バンコマイシン プリスチナマイシン Ａ２１９７８Ｃなどの りポベブチド類 Ａ４７９３４ ３９ ４０ オリコスボラス（ｏｆ ｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）アウレオ
ファンエンス（ａｕｒｅｏｒａｃｉｅｎｓ）ボビリ（ｂ
ｏｂｉｌｉ） カカオイ変種アソエンンス （ｃａｃａｏｉ ｖａｒ． ａｓｏｅｎｓｉｓ）チャル
トレウシス（ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｓ）ンンナモネンシ
ス（ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）フングロバツス（ｃ
ｏｎｇｌｏｂａｔｕｓ）オイロシジカス変種アステロシ
ジカス （ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒ． ａｓｔｅｒｏｃ
ｉｄｉｃｕｓ）フラベオラス（ｆｌａｖｅｏｌｕｓ） ガリナリウス（ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｓ）Ａ８０ １９
０ ５ＡおよびＢ１および サリノマイシン ナラシン Ａ８０４３８ リソセリン Ａ２３ １８７ モネンシン イオノマイシン ライドロマインン ＣＰ３８９３６ Ｒ Ｐ−３ ０ ５ ０ ４ ハイグロスコビカス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ラ
サリエンシス（Ｉａｓａｌ ｉｅｎｓｉｓ）ロングウー
デンシス（ｌｏｎｇｗｏｏｄｅｎｓｉｓ）ムタビリス（
ｍｕｔａｂｉｌｉｓ） パクタム（ｐａｃｔｕｍ） リボシジフィカス（ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ）ビオ
ラセオニゲル（ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ）Ａ２１８
、エメリシド、 ＤＥ３９３６、Ａ Ｉ． ２ ０Ａ，Ａ２８６９５Ａ およびＢ１エーテロマ イシン、およびンアネ マイシン ラサロシド リソセリン Ｓｉｌ７４３ａ Ａ８０４３８ ロノマイシン ニゲリシン ４１ ４２ ｐＫＣ７９６の特徴以外の特徴を有する組込みベクター
を創製することか所望であるときには、受託番号ＮＲＲ
Ｌ Ｂ−１８４７７のもとてＮＲＲ１，に寄託されて
いるブラスミトｐＫＣ７９６から、部位特異的な突然変
異誘発と制限酵素消化を組合せることによって、φＣ３
］フラグメントを得ることかできる。始めに、合＋ｆｆ
ｌＤＮＡフラグメントＴＧＴＴＡＧＧＣＧＣＴＧＡＧＡ
ＣＧＧＧＣＣＣＡＣＡＧＣＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＧ
Ｃを用い、アデルマン等［Ａｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ
． ＤＮＡ ２ ： １８３−１９３ （１９８３）］
の方法に従って、このプラスミドに部位特異的な突然変
異誘発を行う。このフラグメン１・をプラスミドに導入
すると、このフラグメンｌ・の３゛末端に制限部位Ａ
ｐａ Ｉが得られる。次いで、このフラグメントをＡａ
ｔｌｌ−Ａｐａ＋制限フラグメン１・とじて単離するこ
とかできる。ある場合には、このＡａｔｌ１部位に放線
菌において機能的なプロモーターを挿入するのが必要に
なることもある。そのようなプロモーターは当業者には
周知である。次いで、このフラグメン１・をそのままで
選択したプラスミドに挿入するか、またはその末端をオ
リゴヌクレオチドリン力一で修飾してそのフラグメント
を所望の制限部位に挿入することができる。また、当業
者なら、いずれかの制限部位を含む合戊ＤＮＡフラグメ
ントを部位特異的な突然変異誘発を用いてプラスミトに
挿入し、その後、制限酵素による消化によってフラグメ
ントを単離することができることは理解されよう。 本発明の組込みベクターは、ストレプトマイセス属の研
究およびス］・レプトマイセス属発醇産物の市販化の多
くの場面で大きな用途を有している。 好ましい利用は、同種遺伝子の追加のコピーまたは異種
遺伝子の新規なコピーを宿主染色体中に糺込むことであ
る。この利用は抗生物質産生または耐性に関係している
遺伝子に限定されない。例えば、栄養要求変異種株にア
ミノ酸産生に関係している遺伝子を組込むこともでき、
特定のアミノ酸か添加されていない培地でのこの株の増
殖を可能にすることかできる。このような試みの全てに
共通する顕著な特徴は、遺伝子のその後の維持を抗生物
質選択なしで行うことにある。 好ましい利用の１つは、ストレブトマイセス・サーモト
レランスのｃａｒ Ｅ遺伝子をストレプトマイセス・ア
ンボファンエンスゲノムに絹込むことによって例示され
る。Ｓ サーモトレランスのＣａｒＥ遺伝子は、イソバ
レリル補酵素Ａのインバレリル基をマクロライド系抗生
物質カルボマイ／ンのミカロース糖残基に結合させる４
”−０−インバレリルア７ラーゼをコードしている。Ｓ
アンボファ７エンスは、マクロライド系抗生物質スピ
ラマイ／ンおよび／Ｉ”−ＯＨ基を有するミカロース残
基を含有する種々の他のスピラマインン関連化合物ヲ産
生ずる。Ｓ アンポファンエンスは４”゜Ｏ−イソバレ
リルア／ラーゼ活性を産生巳ない。 このｃａｒＥ遺伝子は、受託番号ＮＲＲＬＢ−１８１６
９（寄託日： １９８７年２月６日）のもとてＮＲＲＬ
から犬腸菌Ｋｌ２ ＳＦ８として入手することか可能
なプラスミドｐＯＪＩ７１から単離することができる。 ｐＯＪＩ７１の制限部位および機能地図を第２図に示す
。 プラスミドｐＯＪ］７］から単離した〜２．４ｋｂＢａ
ｍＨｌ制限フラグメントを、ＢａｍＨＩ消化したｐＫＣ
７９６（ＮＲＲＬ Ｂ−］ ８４ ７７）に挿入する
。このフラグメン１・を両配向て挿入することがてき、
プラスミドｐＯＪ２４２およびｐｏ Ｊ ２ ４３か得
られる（第３図および第４図をそれぞれ参照）。この両
プラスミドおよび対照ベクターｐＫＣ７９６をＮＲＲＬ
２４２０などのＳ，アンホファ／エンス株に導入した。 形質転換体を始めは抗生物質アブラマインンで選択した
。これらのプラスミドは、ス１・レプトマイセス属の複
製起源がこれらのベクター」二に存在していないので、
必然的に染色体中に組込まれる。安定な組込みのゆえに
、アブラマイシンによるその後の維持は必要ではない。 Ｓ，アンボファンエンス染色体中にｃａｒＥ遺伝子が存
在すると、この菌株はイソバレリルスビラマインンを産
生ずる。親のｐＫＣ７９６ベクターを組込んだＳ．アン
ボファシエンス株はスピラマイシンを産生し続ける。イ
ソバレリルスピラマインンを産生させるこの方法は、自
律的に複製するブ４５ ４６ ラスミドにｃａｒ Ｅ遺伝子を導入することからなる方
法を凌く２つの大きな利点を有している。その第１は、
形質転換体か抗生物質選択なしで増殖することかてき、
従ってコス１・を下げ、効率を上げることかできる。第
２の利点は、組込み形質転換体か同−の遺伝子を担持す
る複製ブラスミ１・よりも多量のイソバレリルスピラマ
インンを産生ずることである（複製プラスミドは抗生物
質産生を抑制するようてある）。これらの利点は組込み
ベクターがとんな遺伝子と一緒に用いられても一般的に
当てはまり、ｃａｒＥＪ！伝子か使用されるときの状況
には限定されない。 即ち、本発明はハイブリノト抗生物質の製造方法であっ
て、 （１）ファージφＣ３１の部位特異的な組込み機能を含
むＤＮＡ配列を含有しているプラスミトベクターであっ
て、ある微生物においてそれまで発現されたことのない
酵素またはその他の遺伝子産物をコードしており、ある
抗生物質をそれまで該微生物によって産生されたことの
ない抗生物質に変換する、抗生物質生合成遺伝子をも含
有するベクターで抗生物質産生微生物を形質転換するこ
と、および （２）該ベクターで形質転換された微生物を、ハイブリ
，｝・抗生物質の産生に適した条件下で培養すること、 を特徴とする方法を提供するものである。 組込みベクターの他の好ましい使用は、抗生物質生合戊
遺伝子（群）をベクターによって宿主染色体中に絹込む
ことにより、抗生物質の産生を増加させることである。 抗生物質の産生を増加させるときには、それぞれの抗生
物質耐性遺伝子（群）の追加のコピーを組込んで抗生物
質による阻害を避けるのが重要になることもある。タイ
ロシン、モネンシン、およびナランンなどの多数の発酵
産物の製造を本方法によって改善することができる。 組込みベクターを用いるクローン化遺伝子の組込みは多
くの利点を有している。選択物質の非存在下でのストレ
プトマイセス発酵（多＜の細胞世代が関係する）におけ
るクローンした遺伝子の安定な維持は重要な問題であっ
たか、これか本発明によって克服される。例えば、タイ
ロンンの製造において、クローンされたｔｙｌＦ遺伝子
の安定な維持はマクロシンのタイロンンへの変換を増強
し、さらに多量のタイロシンを与える。その安定性に加
えて、組込みベクターは自律的なプラスミドに比へて抗
生物質産生の阻害作用か少ない。 組込みベクターを用いてクローン化遺伝子を安定に維持
し、抗生物質産生を増大させることについては、本明細
書ては、このベクターおよびクローンされたタイロンン
生合戊遺伝子を用いてタイロ／ンの産生を増大させるこ
とによって例示されている（実施例３〜５を参照）。 ストレブトマイセス・フラシエＴＩ４０５などのタイロ
ンン産生株は、タイロンン前駆体であるデメチルマクロ
シンおよびマクロシンを蓄積ずる。 染色体中に組込まれたｔｙｌＥおよびｔｙ＋ Ｆ遺伝子
の追加のコピーを有するこの菌株の発酵培養によって、
ｔｙ＋ｐにコーＩＳされているマクロ／ンＯ−メチルト
ランスフエラーゼおよびｔｙ＋Ｅにコードされているデ
メチルマクロンンＯ−メチルトランスフェラーゼの量の
増加が得られる。この結果、デメチルマクロンンのマク
ロンンへの、そしてマクロ７ンのタイロシンへの変換が
増加することになり、従って、所望の最終産物であるタ
イロシンの収量か一層増加することになる。このＬｙｌ
ＥおよびｔｙｌＦ遺伝子は他のタイロンン生合戊遺伝子
とともに、欧州特許公開Ｎ ｏ． ０２３８３２３（１
９８７年９月２３日発行）に記載されている。 ｔｙ＋ Ｆ遺伝子を含有するＢａｍＨＩフラグメントを
、プラスミドｐＨＪＬ２８０［ＮＲＲＬ Ｂ−１８０
４３のもとでＮＲＲＬから犬腸閑ＫＩ２１−ＩＢ１０１
で人手可能（寄託日： １９８６年２月ｌ８日）；第５
図参照］から得る。次いで、このフラグメン１・をＢａ
ｍＨＩ消化したｐＫＣ７９６に挿入ずる。得られたプラ
スミドをｐｓＫｃ５０およびｐＳＫＣ５１と呼ぶ（挿入
されたＢａｍＨＩフラグメン１・の配向が異なっている
）。Ｓ．フラジエの産生株Ｔｌ４０５に導入されると、
組込まれたベクターはタイロンンの産生を、Ｔ１４０５
対照の産生レベルを４９ ５０ １００％として、１３６％まで増加させる。形質転換体
の安定性は、選択の非存在下での少なくとも３継代の後
に、ベクターによって与えられるアブラマインン耐性の
表現型か実質的に１００％のコロニー形戊単位によって
保持されていることによって示される。 タイロシン産生株を形質転換する能力は、試験した他の
部位特異的な組込みベクターては見られない特徴である
。この実験は、スｌ・レブトマイセス属の複製起源を欠
く２種類の他のストレプ１・マイセス属の部位特異的な
組込みベクターを用いて行った 即ち、大腸菌プラスミ
トｐＢＲ３２５中にクローンしたストレブトマイセス・
コエリカラーのミニ環状物であるｐｌＪ４２１０［リジ
エート等（Ｌｙｄｉａｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ． ２０３ ： ７９−８８（１９８
６））］、ならびに組込み性Ｓ アンボファシエンスプ
ラスミドｐＳＡＭ２［パーノデット等（Ｐｅｒｎｏｄｅ
ｔ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ． １９８： ３５−４１ （１９８４））
］から導いたプラスミド［クーストス等（Ｋｕｈｓｔｏ
ｓｓｅＬ ａｌ．．Ｊ．Ｂａｃｔ． １７１ ： １
６−２３ （１９８９））］である。これらのプラスミ
ドは、Ｓ，フラジエのタイロンン産生株に安定に導入す
ることができなかった。抗生物質選択なしての安定な維
持および極めて高い形質転換頻度は、φＣ３］の部位特
異的な組込み機能を含有する組込みプラスミドベクター
の重要な利点てある。 また、クローンしたタイロシン生合成遺伝子を含有する
ベクターを用いて、Ｓ フラジエ突然変異株、例えばＧ
Ｓ ｌ ５［ｔｙｌＦ突然変異株； ＮＲＲＬ］．８０
５８（寄託日： １９８６年３月１９日）］およびＧ
Ｓ ｌ． ６ ［ｔｙ＋Ｅ突然変異株；アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクンヨン（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５２）から受託番号Ａ
ＴＣＣ ３］６６４のもとて人手可能］などのタイロ
シン産生を増大させることができる。前記のブラスミト
ｐｓＫｃ５０およびｐＳＫＣ５］はこのｔｙ＋ Ｅおよ
びｔｙｌＦ遺伝子を含有している。これらのプラスミド
をＳ．フラジエ突然変異株に導入することができる。得
られた形質転換体は増大した量のタイロ／ンを産生じ、
安定に維持されるであろう。 即ち、本発明の重要な態様は、抗生物質産生微生物また
は抗生物質前駆体産生微生物の抗生物質産生能力または
抗生物質前駆体産生能力を増大させる方法であって、 （１）抗生物質生合或経路によって抗生物質または抗生
物質前駆体を産生ずる微生物を、ファージφＣ３］の部
位特異的な組込み機能を含むＤＮＡ配列を含有している
絹込みベクターであって、該生合戊経路の律速である酵
素またはその他の遺伝子産物をコードしている抗生物質
生合成遺伝子をも含有するベクターで形質転換すること
、および（２）該ベクターで形質転換された微生物を、
細胞増殖、該抗生物質生合成遺伝子の発現、および抗生
物質または抗生物質前駆体の産生に適した条件下で培養
すること、 を特徴とする方法を提供することてある［ただし、工程
（１）で選択される抗生物質生合戊遺伝子は、該微生物
の抗生物質産生能力または抗生物質前駆体産生能力の増
大を与えるものとする］。 本発明の目的に用いることができるタイロシン生合成遺
伝子の例には、例えば、ｔｙｌＡ， ｔｙｌＢ，ｔｙｌ
ｃ， ｔｙｌＤ， ｔｙｌＥ， ｔｙｌＦ， ｔｙｌＧ
， ＬｙｌＨ，ｔｙ＋ Ｉ、ｔｙｌＪ， ｔｙｌＫ，
ｔｙｌｌ−、およびＬｙｌＭ遺伝子が含まれる。この群
の中ではｔｙｌＦ遺伝子が好ましいが、これは、それに
よってコードされているマクロシン○−メチルトランス
フェラーゼ酵素がほとんどのタイロシン産生株のタイロ
ンン生合成経路における律速であると考えられるためで
ある。このｔｙ＋ Ｆ遺伝子産物によって触媒される律
速段階のゆえに、ストレプトマイセス・フラジエの最適
発酵条件のもとでは許容されない量までマクロシンが蓄
積される。このｔｙｌＦ酵素はマクロシンのタイロシン
への変換を触媒する。ｔｙｌＦ遺伝子産物、即ちマクロ
シンＯ−メチルトランスフエラーゼの過剰産生は、抗生
物質収量の増大および発酵コストの低下で示されるよう
に、タイロシン生合成経路を一層効率的なものにする。 ストレブトマイセス属の閑株は、いくつかの別種培地の
いずれかを用いる多数の方法で培養する５３ ５４ ことかできる。培養培地中の好ましい炭水化物供給源に
は、例えば、糖蜜、グルコース、テキス｝・ラン、およ
びグリセロールか含まれる。窒素供給源には、例えば、
大豆粉、アミノ酸混合物、およびペブ］・ンか含まれる
。また、栄養無機塩も培地に加えられるか、これにはナ
トリウム、カリウム、アンモニウム、カルンウム、リン
酸、塩酸、硫酸なとのイオンを生成しうる通常の塩か含
まれる。 他の微生物の成長および増殖に必要であるように、必須
の微量元素も加える。通常、この微量元素は、培地の他
の構戊戊分の添加に付随する不純物として供給される。 ストレプトマイセス属の閑株は、好気性培養条件下、約
６〜８の比較的広いｐＨ範囲、約２５〜３７゜Ｃの温度
で増殖する。約３４〜３７゜Ｃの温度では、抗生物質か
産生されないこともある。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれら実施例を理由として限定されるもので
はない。試薬あるいは装置の供給元は便利なように挙げ
たたけであり、本発明を限定するものではない。本発明
を実施するための方法の説明および実際に行った操作は
適当な箇所に記載した。 （以下、余白） 実施例１ プラスミドＩｌｌＫＣ７９６の単離プラスミ
ドｐＫＣ７９６（第１図）は、ノーザン・リージョナル
・リサーチ・センター（ＮＲＲＬ）（Ｐｅｏｒｉａ，
ＩＬ ６１６０４）から受託番号ＮＲＲＬＢ−１８４７
７のもと、太腸菌Ｋ１２ ＤＨ５αとして入手するこ
とができる。大腸菌Ｋ］２ＤＨ５α／ｐＫＣ７９６の凍
結乾燥品を、１００μ９／ ｘ（ｌのアブラマインンを
含むし一寒天プレート［１ｆｆあたり、１０９のトリブ
トン、ｌｏｇのＮａＣｆｆ、５ｇの酵母エキス、および
１５ｇの寒天］て培養し、この菌株の単一コロニー単離
体を得た。このコロニを１００μｇ／ ｘ（ｌアブラマ
イシン含有のＬブロス（寒天を含まないし一寒天）（約
５ ０ ０ ｘＱ）に接種し、細胞が定常期に達するま
で、得られた培養物を曝気しながら３００Ｃでインキユ
ベートした。 この細胞を８ ０ ０ Ｏ ｒｐｍで１０分間遠心した
。 上清をテカンテーノヨンした後、細胞を２５％スクロー
ス、５０ｍＭ｝リス・ＨＣＱ（ｐＨ８．０）（７ｉＣ）
に再懸濁した。新たに調製したリソチーム（５ｉｇ／岬
溶液を０．２５Ｍのを、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８
）（０．４１１Ｑ）および５ ｘ９／ ｚ（ｌ Ｒ Ｎ
アーゼＡ（００５ＪＩ１２）とともに、この溶液に加え
た。この混合物を３７℃で１５分間インキュベート・し
た。これにトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）溶菌混合物［１．
５０ｍＭトリス・ＨＣＱ（ｐＨ８．０）、３％トリトン
ＸＩＯＯＲ、２００ｍＭ ＥＤＴＡ］（０．７５ｘｇ
）を加え、混合し、そして水上で１５分間インキユベー
トした。溶閑が完全でないときには、３７°Ｃで約５分
間さらにインキユベートした。この混合物を２０，００
０ｒｐｍで４０分間遠心した。上清を取り、保持した。 ＤＮＡ溶液（３１．２ｆｆｆｆ）にＣｓＣ４（２８．６
５ｇ”，を加えることによってＣｓＣ（！勾配（密度
１ ５５）を調製した。この勾配溶液を混合して溶解し
、大きい超遠心管に移した。この遠心管を１０ｏ／ｘｃ
臭化エチジウム（〜０ ． ６ １１（１）で満たし、
封をし、そして混合した。 ４９，０００ｒｐＴＩで１８時間遠心することによって
勾配をつけた。長波長のＵＶ光で可視化して低い方のプ
ラスミドＤＮＡのバンドを集めた。イソアミルアルコー
ルで４〜５回抽出することによっ５７ ５８ て臭化エチジウムを除去した。このＤＮＡ溶液をＴＥ緩
衝ｉ１ｔ［ＩＱ＋ｎＭｈリス・ＨＣｌ２（ｐＨ ８．
０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］（２＆）に対して透析し、２
時間後に新たなＴＥに替えた。この透析した溶肢を、フ
ユ．ノールで２回、そしてクロロホルム゜イソアミルア
ルコール（２４：ｌ．）で２回抽出した。１／１０容量
の３Ｍ酢酸ナ１・リウムおよび３容量のエタノールを加
えることによってＤＮＡをエタノール比澱させた。１０
，０００ｒｐｍで１０分間遠心することによってＤＮＡ
を集め、７０％エタノール、続いて１００％エタノール
で洗浄し、乾燥し、そして滅菌ＴＥ（約２５０μｌ！）
に溶解した。濃度および純度は、２６０および２８０ｎ
ｍでの光学密度を測定することによって調べた。ｐＫＣ
７９６の制限部位および機能地図を添付の第１図に示す
。 実施例２ プラスミドｐＯＪ２４２およびｐＯＪ２４３
の構築 Ａ．ブラスミトｐＯＪ１７１の単離 プラスミドｐＯＪ１７１は、Ｎ Ｒ Ｒ Ｌから受託番
号ＮＲＲＬ Ｂ−１８１６９のもと、大腸菌Ｋ ］２
８Ｆ８として入手することができる。プラスミドｐ
ＯＪ］７］はｃａｒ Ｅ遺伝子の供給源である。 犬腸閑Ｋ ］ ２ ＳＦ８／ｐＯＪ Ｉ ７ ］の凍
結乾燥品を、１００μｇ／ ｍ（ｌのアブラマインンを
含むし−寒天プレートで培養し、この菌株の単一コロニ
ー単離体を得た。このコロニーを１００μ９／ Ｉ！（
！アブラマインン含有のＬブロス（約５００ｘのに接種
し、細胞が定常期に達するまで、得られた培養物を曝気
しながら３７°Ｃでインキユベートした。 実質的に上記実施例１記載の方法に従って、細胞からプ
ラスミドＤＮＡを得、プラスミドｐＯＪ２４２およびｐ
ＯＪ２４３の構築に用いた。プラスミトｐＯＪ１７］の
制限部位および機能地図を添付の第２図に示す。 Ｂ プラスミドｐＯＪ２４２およびｐｏ Ｊ ２ ４
３の最終的な構築 プラスミドｐＯＪ２４２およびｐＯＪ２４３は、ｃａｒ
Ｅ遺伝子を含有するベクターである。これらのプラス
ミドを次のようにして構築することができる。プラスミ
ドｐＫＣ７９６ ＤＮＡ（約１０μ９；］ＯμＱ）を、
ＩＯＸのＢ ａｍ）−｛ １緩衝１［６０ｍＭトリス−
ＨＣ（！（ｐＨ７．９）； Ｉ．５Ｍ ＮａＣＱ：およ
び６ ０ ｍＭ ＭｇＣ ｆｆ２］（２ ｕの、Ｈ２０
（６ｕＱ’）、および制限酵素ＢａｍＨＩ［２μＱ，〜
４０単位，本明細書中の単位の定義は、特に記さなけれ
ばニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎ Ｅ Ｂ
； Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ． ３２
Ｔｏｚｅｒ Ｒｏａｄ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ
０１９１５−９９９０）のものに一致する］に加えた。 得られた反応液を３７℃で２時間インキユベートした。 このＢａｍＨ Ｉ 消化したプラスミドｐＫＣ７９６
ＤＮＡを抽出し、次いで、反応混合液の酢酸ナトリウ
ム（ＮａＯ Ａ ｃ）濃度を０．３０Ｍに調節し、２
５容量のエタノールを加え、この反応混合液を−７０’
Ｃまて冷却し、そして沈澱したＤＮＡを遠心してベレ，
２トにすることによってＤＮＡを集めた。このＢａｌｌ
ｌＨｌ消化したブラスミトｐＫＣ７９６ ＤＮＡのペ
レットをＴＥ緩衝液（１０μのに再懸濁した。 ＴＥ緩衝液（１０μＣ〉中のプラスミドｐＯＪ１７１（
約２０μｙ）を、Ｈ２０（７ＦＭ！）、ＩＯＸのＢａｍ
Ｈ ｌ緩衝液［６０ｍＭｈリスーＨＣＲ（ｐＨ７．９）
； １５ＭＮａＣ（；および６ ０ ｍＭ ＭｇＣ ＆
ｚ］ （ Ｉ Ｏ ｔｒの、および制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ （５μＣ； 〜１ ０ ０単位）に加えた。得られ
た反応ｌ皮を３７゜Ｃて２時間インキユベートした。こ
の反応混合液を抽出し、上記のようにしてＤＮＡを集め
た。このＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液（〜１０μのに溶
解した。このＤＮＡを、実質的にマニアティス等［Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９ｇ２Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）］の方法に従い、低
融点アガロースゲル［バイオラ，ド（ＢｉｏＲａｄ，
２２００ Ｗｒｉｇｈｔ Ａｖｃ． ， Ｒｉｃｈｍｏ
ｎｄＧＡ， ９４８０４）］の電気泳動にかけた。 コノゲルは、１ｘのＴＡＢ緩衝液［４０ｍＭ トリス
ー酢酸（ｐＨ７．５）、２ｍＭＥＤＴＡｌ中の０８％低
融点アカ頴一ス（］．ＯＯｊｔのを加熱することによっ
て調製した。この混合物を３７°Ｃまで冷却し、ゲルを
４℃で泳動させた。ローディング緩衝液［水中、０ ２
５％プロムフゴ−ノール・ブルー０．２５％キシレンン
アノール、３０％グリセロール］（２μｌ！）をＤＮＡ
試料に加えた。この試料をゲルにかけた。ブロムフェノ
ール・ブルー染料が６１ ６２ ゲルの末端に来るまて、４゜Ｃ、ＩＯＯＶてゲルを泳動
させた。このケルを０．５μｇ／ Ｒ＋１！臭化エチシ
ウムで染色し、所望の〜２． ４ ｋｂ ｌｌａｍＨ
ｆバントを長波長のＵＶ蛍先によって検出し、そして切
り取った。このケル片に５容量の２０ｍＭｈリスーＨＣ
ｉ！（ｐＨ８．０）および］ｍＭＥＤＴＡを加えた。 このケルを６５゜Ｃで５分間溶解させた。試料を等容量
のフェノールで抽出した。この試料を遠心し、水層を回
収し、再抽出し、そしてＤＮＡを上記のようにして集め
た。このＤＮＡペレソトをＴＥ緩衝液（１０μｇ）に溶
解した。この溶液はプラスミドｐＯＪ１７１の所望の〜
２．４ ｋｂ ＢａｍＨ ［制限フラグメント（〜０
５μｇ）を含有していた。 ＢａｍＨＩ〆肖化したフ゜ラスミドｐＫＣ７９６ Ｄ
ＮＡ （ Ｉ ｕ（ｌ’）を、ｐＯＪＩ７１由来のＢａ
ｍＨＩ制限フラグメント（１０μｇ、〜０ ５μい、Ｉ
ＯＸのリガーゼ緩衝液［６６０ｍＭ｝リスーＨＣｇ（ｐ
Ｈ８．０）６ ６ ｍＭ ＭｇＣ （！２ ： ｌ Ｏ
ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）；および１０ｍＭ
ＡＴＰ］（２μの、およびＨ，Ｏ（６μＱ）に加えた。 Ｔ４ ＤＮＡリガーセ（約１μＱ，〜ｌ． ０ ０単
位）をＤＮＡ溶液に加え、得られた反応液を１５゜Ｃで
一晩（〜１６時間）インキユベートした。この連結した
ＤＮＡは目的のプラスミドｐＯＪ２４２およびｐＯＪ２
４３を含んでおり、これらは〜２． ４ ｋｂ Ｂａｍ
Ｈ ［挿入フラグメントの配向だけが異なっていた。ｐ
ＯＪ２４２およびｐ○Ｊ２４３の制限部位地図を添付の
第３図および第４図に示す。 プラスミドｐＫＣ７９６のＢａｍＨ１部位は、それ自ｆ
本がｌａｃＺ α−フラグメン１・をコートするＤＮ
Ａ配列の一部を形成している多重クローニング部位内に
存在する。大腸菌Ｋ］２ ＤＨ５αなどの大腸菌ΔＭ
１５株におけるｌａｃＺ α−フラグメントの発現は
、機能的なβ−ガラクトンダーゼ酵素を産生ずるこの菌
株の能力を回復させる。即ち、プラスミドｐＫＣ７９６
は犬腸菌Ｋ１２ＤＨ５α株にβ−ガラクトンダーゼ活性
を回復させることができる。しかし、プラスミトｐＯＪ
２４２およびｐＯＪ２４３の構築のときのように、プラ
スミドｐＫＣ７９６のポリリンカーの制限部位中にＤＮ
Ａを挿入すると、ｌａｃＺ α−フラグメント暗号化
配列か分断され、同時にΔＭｌ５突然変異を補足するプ
ラスミドｐＫＣ７９６誘導体の能力が破壊される。β−
ガラクトシダーセは無色の化合物であるＸ−ガル（５−
ブロモー４−クロロ−３−インドリルーβ一Ｄ−ガラク
トピラノシド）をインノゴ色の産物に加水分解すること
ができ、従って、出発プラスミドｐＫＣ７９６を含有す
る形質転換体と、プラスミドｐＯＪ２４２またはｐＯＪ
：ｌ？４３などのプラスミドｐＫＣ７９６誘導体を含有
する形質転換体を識別する都合の良いスクリーニング法
を可能にする。 凍結コンビテントＤＨ５α細胞［ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ社（Ｂ Ｒ Ｌ ） ； Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｉｎｃ． ＋ Ｐ． Ｏ． ＢＯＸ ６００９， Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ． ２０８７７］を製造
元の指示に従って形質転換した。細胞を水上で解凍腰
１形質転換あたりに１００μＱの細胞を取り、未使用の
細胞はドライアイスーエタノール浴で再凍結させた。こ
の細胞（１００μのを、水で５倍希釈しておいたライケ
一ション反応ｉｆｆｌ（１μＱ〉に加えた。この細胞を
水上て３０分間インキュベ−１・し、４２℃で２分間熱
ショックを与え、水に２〜５分間戻した。ＳＯＣ培地（
１村）を加え、振盪しながら３７゜Ｃで１時間、細胞を
インキユベートした。ＳＯＣ培地は、２％（ｗ／ ｖ）
トリブトン、０ ５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２０ｍ
Ｍ グルコース、］ ＯｍＭ ＮａＣＬ ２．５岬Ｋ
Ｃ（、］ ＯｍＭ ＭｇＣＱ２および］ Ｏ ｍＭ Ｍ
ｇＳ Ｏ ４である。 形質転換混合物の一部を、１００μｇアブラマイシン／
ｊＩ（！、４０ｐ９Ｘ−ガル／ｊｌ（！、および４０ｕ
ｙＩＰＴＧ／ｉｃを含有するし一寒天プレートに蒔いた
。Ｉ ＰＴＧはプラスミドｐＫＣ７９６に存在するｌａ
ｃプロモーターを活性化するように作用する。 このプレートを３７℃で一晩インキユベートした。 大腸菌Ｋ］２ ＤＨ５α／ｐＫＣ７９６などの挿入体
を含まないプラスミドを含有するコロニーは、このプレ
ートで青く見える。大腸菌Ｋ］２ＤＨ５α／ｐＯＪ２４
２なとの挿入体を含むプラスミドを含有するコロニーは
白である。数個のアブラ一６５ ６６ マインン耐性の白色コロニーを選択し、次いてそのプラ
スミドＤＮＡの制限酵素分析によってスクリーニングし
た。プラスミトＤＮＡの単離方法に従って、大腸菌Ｋ１
２ＤＨ５α／ｐＯＪ２４２およびｐＯＪ２４３形質転換
体からプラスミトＤＮＡを得た。これらのプラスミドｐ
ｏ Ｊ ２ ４ ２およびｐＯＪ２４３ＤＮＡを、次の
実施例３記載のストレブトマイセス・アンポファシエン
ス株２２８１の形質転換に用いた。たれでも人手するこ
とができるＳ．アンホファシエンス株ＮＲＲＬ２４２０
またはＮＲＲＬＩ．５２６３も同等に機能するであろう
。 実施例３ ストレプトマイセス属の形質転換Ａ．溶液の
リスト 以下に示す溶液は各実施例中で引用されるものであり、
ここに明示する。 ］．Ｐ培地（〜］００ｊｌの 成 分 』しスクロー
ス ］０．３ｇＫ，Ｓｏ４
０．０２５ｇ微量元素溶液（下記２参
照） ＭｇＣ（２’ ６ Ｈ ２０ 水 オートクレープ処理した後、 ＫＨ，ＰＯ．（０．５％） ＣａＣＱ２・２Ｈ２０（３．６８％） ［Ｎ一トリス−（ヒドロキ／メチル） メチル−２−アミノエタンスルホン 酸］、“”Ｔ Ｅ Ｓ ’”緩衝液、０．２５Ｍ（ｐＨ
７．２） ２ 微量元素溶液（〜１の 成 分 ＺｎＣＱ２ ＦｅＣＱ３・６Ｈ，Ｏ ＣＵＣｌ２２・２ ｔ｛２０ ＭｎＣＱ＝ ・４ Ｈ２０ Ｎａ＝Ｂ−０７・ＩＯＨ２０ （ＮＨ４），ＭＯ７０２．・４ Ｈ，ＯＨ，０ Ｏ ２村 ０． ２ ０ ３９ ８０叶 次の成分を追加する。 １村 ］ＯＲｌ！ ］０１Ｒｌ！ 量 ４０ｏ ２００ｏ ］．ＯＲｇ １０１！１１ ］Ｏｏ ］Ｏｘｇ １ｅ ３。改良Ｒ２再生培地（〜］ｆ２） 成 分 量スクロース
１０３ｇＫ２Ｓｏ４
０．２５ｇ微量元素溶液
２ｌｌＱＭｇＣＱ２・６ Ｈ ２０
１ ０ ． １ ２ ｇグルコース
］Ｏｇ■５−アスパラギン・］Ｈ，０
２．Ｏｙカザミノ酸 ０ １９寒
天 ２２９水
全量７００ＪＩｉ２までオートクレー
プ処理前にｐＨを７ ２に調節し、処理後に以下の戊分
を追加する。 Ｋ■ｔ，ｐｏ．（０．０５ｇ／１００ｘの １０００
ＣａＣｌ！！（２．２２９／］ＯＯｚｄ） １０
０３！１２ＴＥＳＦ｝衝液（５．７３ｙ／１００村）（
ｐＨ７．２） １００村４．
軟栄養寒天（ＳＮＡ、〜ＩＱ） 成 分 量ディフコ
・バクト・栄養ブロス ８ｇ寒天
５９５．Ｒ２ＹＥ培地は、Ｒ２培地
１（２に対して２５％酵母エキス２０叶を添加した培地
である。 ６．酵母エキスー麦芽エキス（ＹＥＭＥ、〜ｊ（！）・
成 分 』Ｌ酵母エ
キス ３ｇペプトン
５９麦芽エキス
３ｇグルコース ｌｏ
ｙ７．ＹＥＭＥ＋３４％スクロース液体完全培地は、３
４０９／（ｌのスクロースを含むＹＥＭＥである。 ８，ＹＭＸ培地（〜１ １２） ： 成 分 量酵
母エキス ３ｇ麦芽エキス
３ｇグルコース
２タ寒天
２０ｇ６９ ７０ ９．ＹＭＸ寒天は、０ ３％酵母エキス、０ ３％麦芽
エキス、０．２％デキストロースおよび２．０％寒天か
らなる。 １０．タイロシン発酵培地 成 分 量ビート
・糖蜜 ２％トウモロコシ粉
１ ５％魚粉
０ ９％トウモロコシ・グルテン
０．９％塩化ナトリウム ０．１％
リン酸アンモニウム（二塩基性） ０．０４％炭酸
カルシウム ０．２％粗大豆浦
３％この培地のｐＨをｌＮＮａＯＨ
で７．１に調節する。 １１．ＡＳＩ培地（〜Ｉ（脱イオン水）５成 分
量酵母エキス
１ｇＬ−アラニン
０．２ｇＩ７−アルキニン（遊離塩基） ０．
２ｉｒＩ一一アスパラ十ン ０．５ｇ
可溶性デンプン ５ｇ塩化ナトリウム
２ ５９硫酸ナトリウム
１０ｇミーア・寒天 ２０ｇｌ
２ スピラマイシン発酵培地（〜ＩＱ）成 分
エ 酵母エキス ＩＯＳ＋ＫＣＱ
２ ５９ＭｇＳＯ４
０ １ｇＫＨ．ＰＯ４ １
０ｇＦｅＣＱ， ０．０３１
ｊＺｎＣｆ！２ ０．０３ｇＭ
ｎＣＱ＝ ０．０１ｇモリブデ
ン酸アンモニウム Ｏ． Ｏ Ｏ ５９上記成分を
水（８００村）に溶解し、オートクレープ処理する。こ
の溶液に、水（２００ｉＣ）中の滅菌ジャガイモ・デキ
ストリン（１５ｇ）およびグルコース（ｌｏｇ）を加え
る。 １３．改良Ｒ２軟寒天重層液 或 分 量スクロース
５１．５ｇＭｇＣ ｌ！，・Ｈ
ｔ Ｏ ５ ． ０ ６ ９Ｃａ
ＣＱ， ．１ ． Ｉ
Ｉ９０．２５Ｍ ＴＥＳ（ｐＨ７．２） ５０ｘ
（１上記成分を脱イオン水に溶解して最終容量が５００
ｗＱとなるようにする。この混合物を蒸気処理して寒天
を溶融させ、４ｆｆＣづつ注入し、使用前にオートクレ
ープ処理する。 Ｂ． Ｓ．フラジエの形質転換 ストレブトマイセス・フラジエの培養物をトリプチカー
セー大豆ブロス（ＴＳＢ）（２０ｆｆｃ）に接種し、水
浴インキュベーター中、２９゜Ｃで一晩（約１６時間）
、２ ６ Ｏ ｒｐｍでインキユベートした。この培養
物を、ホモジナイズ容器［トーマス・サイエンティフィ
ック（Ｔｈｏｍａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｒｉｃ， Ｓｗｅ
ｄｅｓｂｏ１ｏ， ＮＪ）］およびＴ−ライン実験室撹
拌機を用いてホモジナイズし、次いでソニファイアー・
セル・デイスラブタ−（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ Ｃｅｌｌ
Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）［ヒート・ンステムズ・ウルトラ
ソニックス社（Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ［Ｉｌｔｒ
ａｓｏｎｉｃｓ， Ｉｎｃ．）］を用いて粉砕した（７
６ワットで７秒間）。このホモジナイズして粉砕した培
養物Ｃ４ｘＱ）を０．３％（ｗ／ｖ）グリシン含有のＴ
ＳＢ（ＢＢＬＸ２０村）に接種し、再度、この培養物を
２９℃で一晩インキユベートした。翌朝、培養物をホモ
ジナイズし、上記のように再培養した。この３回目の一
晩インキュベートの後に、培養物をホモジナイズし、集
め、モしてＰ培地で２回洗浄した。 細胞ベレットを１１ｇ／ｘＱリソチーム［カルビオケム
（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９
２０３７）］含有のＰ培地（ １ ５ ｉＱ）に再懸濁
し、次いで室温で約１．５時間インキユベートしてブロ
トブラストを得た。 このプロトブラストを穏やかに遠心することによって集
め、Ｐ培地で２回洗浄し、Ｐ培地（２岬）に再懸濁し、
使用時まで水上でインキユベートした。 プラスミドＤＮＡ（約１μｇ）をｌｍｇ／＋＆の硫酸ヘ
パリン［シグ？ （Ｓｉｇｍａ）］（約５０μｆ２）に
加え、水」二で約１０分間インキユベートした。もっと
少ないフ７３ ７４ ラスミドＤＮＡ（約５〜Ｉ Ｏ Ｏ ｎｇ）を用いてス
トレプトマイセス・フラジエを形質転換することかでき
る（Ｓ．フランエ宿主から調製されたとき）。ストレプ
トマイセス属のプラスミドＤＮＡを単離する方法は、ホ
ノブウッド等［１１ｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． ．
１９８５Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ ＳＬｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ： Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｊｏｈｎ ｌｎｎｅｓ Ｆ
ｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ＮｏｒｗｉｃｈＥｎｇｌａｎｄ）
］が記載している。始めに、ＤＮＡ／ヘパリン溶液をプ
ロトプラスト（約２００μのに加え、次いて、Ｐ培地中
の５５％ＰＥＧＩＯＯＯ（／グマ）からなる溶液（約０
．９１０をＤＮＡ／プロトプラスト混合物に加え、そし
て得られた混合物を室泥で穏やかに混合した。 この混合物を、その量を変えて、軟Ｒ２寒天重層液（４
ｊｌ（２）を用いてＲ２プレートに蒔いた。形質転換し
たプロトブラストを蒔いた後に、このプレートを２９℃
で２４時間インキユベートし、次いで、５０ｘｇ／ｍＱ
チオストレブトン［スクイブ（Ｅ． ＲＳｑｕｉｂｂ，
Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ ０８５４０）］（２
５ ｕのを含有する軟Ｒ２寒天（４Ｊ！のをプロトプラ
スト上に広げた。 再生か完了するまで、通常は約７〜１４日間、このプレ
ートの２９゜Ｃてのインキュベートを続け、所望のＳ。 フラジエ形質転換体を選択した。 Ｃ ストレプトマイセス属（Ｓ．フラジエを除く）の形
質転換 ホモシナイズして超音波処理したストレプ］・マイセス
属の完全増殖一晩培養物（０．５村）を、０５％グリシ
ンを加えたＴＳＢ（９．５ｘのに接種した。この培養物
を３０’Ｃて２４時間インキユベートした。絹織粉砕機
てホモシナイズした後、ホモジネート（０．５１！ｉ！
）を０ ５％グリンン追加の新鮮なＴＳＢ（９．５ＩＩ
Ｉ（！）に接種した。この培養物を３０℃で２４時間イ
ンキユヘートした。この培養物をホモジナイズし、５Ｍ
の滅菌ポリスチレン製遠心管に移した。３ ５ ０ ０
ｒｐｍで１０分間遠心することによって細胞をベレッ
ト化し、１π９／ ｒｔｒＱのリソチームを含むＰ培地
（ＩＯＲＣ）に再懸濁し、次いて室温で１５〜３０分間
インキユヘートした。 少量の試料を位相差則微鏡で調へることによってプロト
プラス１・の生成をモニターした。プロｌ・ブラストは
球状である。 このプロトプラストを前記のように遠心し、Ｐ培地で１
回洗浄した。細胞をＰ培地（１０ｆｆＣ）に再懸濁し、
それぞれの形質転換に対して１５０ｕ（！のプロトブラ
ストをＩ．５１１ＱのＥ ｐｐｅｎｄｏｒｆＩｌ管に入
れた。ＴＥ緩衝液中のＤＮＡ（ｌ ＯμＱまで）を穏や
かに混合しながら加えた。Ｐ培地中の５０％ポリエチレ
ングリコール１０００（１００μＱ）を直ちに加えた。 それぞれの形質転換混合物を改良Ｒ２表層寒天（４ Ｍ
（１）の２つの管に分け、乾燥改良Ｒ２プレートに注入
した。これらのプレートを３０℃で２４時間インキユベ
ートした。次いで、５０μ９／ｘ（１の最終プレー１・
濃度となるに十分なアブラマイ／ンを含む改良Ｒ２表層
寒天をこれらのプレートに重層した。プレートを３０℃
でインキユベートすると、２〜３日後に形質転換体が現
れた。この形質転換体を、実質的にマニアナイス等［Ｍ
ａｎｉａｔｉｓｅｔ ａｌ． ， １９８２． Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｉｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）］の方法
に従い、サザーン分析によって組込みプラスミドＤＮＡ
の存在について分析した。 実施例４ ストレプトマイセス属による抗生物質産生の
検定 Ａ６ プレート−プラグ検定 ある菌株が抗生物質を産生じているか否かを調べるため
、ストレプトマイセス・アンボファシエンスおよびＳ，
フラソエ形質転換体または親の対照を、Ｒ２寒天再生プ
レートからＡＳＩプレートに移し、コロニーが直径５〜
１０ＲＩＩとなるまで、３０゜Ｃて２〜３日間インキユ
ベートした（Ｓ フラシエについては５〜７日間）。ｐ
ｏ Ｊ ２ ４ ２ ＊タハｐＯＪ２４３で形質転換さ
れたＳ アンボファシエンスによるインバレリルスピラ
マイシンの産生を試験するため、この閑株を、Ａ）５０
ｕｇ／ｘＱアブラマイシン；Ｂ）５０μｇ／ｔｘ（ｌア
ブラマイシンおよび１００ｌＺｇ／１１（！ｃ＋イシ７
；Ｃ）添加なし，まタハＤ）１ ００μｇ／ｘ（ｌｏイ
シンを含有すルＡＳ ］プレートで増殖さぜた。次いで
、コロニーを滅菌移送管［スペク１・ラム・メディカル
・インダストリアル社（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ， Ｉｎｃ．，Ｌｏｓ Ａ
ｎ７７ ７８ ｇｅｌｅｓ，ＣＡ ９００５４）］によってプラグ化し
、このプラグ（ｐｌｕｇ）を、ミクロコノカス・ルテウ
ス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕＬｅｕｓ）ＸＩ６０
（ＡＴＣＣ ９３４ １）を含有する軟寒天栄養ブロ
ス［ディフコ・ラボラ１・リーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＤｅｔｒｏｉＬ．ＭＩ ４８２３
２）］を予め重層しておいたトリプチカーセ大豆寒天（
ＴＳＡ）プレー１・に移した。このプレートを３７°Ｃ
で１６〜２４時間インキユヘートした。ミクロコ，カス
・ルテウスは、タイロシンおよびスピラマイシンに対し
て感受性であり、アブラマインンに対して酬性てある。 従って、ミクロコノカス・ルテウスは、タイロシン、ス
ビラマイ／ンまたはイソバレリル・スビラマイシンを産
生じているス｝・レプトマイセスを含有するプラグの周
囲では増殖することができない。阻害領域は抗生物質の
存在を示している。 Ｂ バイオオートグラフィー ３０’Ｃて適当な時間増殖させた目的の生物を含む全プ
レートからの寒天を、５Ｍのポリプロピレン製の遠心管
に入れたＩＭトリスー）｛ Ｃ Ｃ（ｐＨ ８０ ）（
］． Ｏ ｉｆ！）中で柔化させた。酢酸エチル（Ｉ
ＯｉＣ）を加え、この混合物を室温で１〜２時間にわた
って数回激しく振盪した。層を卓上型遠心機で分離させ
、上層の酢酸エチル層を回収し、ペトリ皿において蒸発
乾固させた。この残留物をメタノール（１肩のに溶解し
た。このメタノール抽出物（約１〜２０μＱ）をＴ Ｌ
Ｃプレートにかけ、乾燥した。 分離は、タイロシンまたはスビラマイシン標準と並べて
、薄層クロマトグラフィー プレート［メルク（Ｍｅｒ
ｃｋ， Ｐ． Ｏ． Ｂｏｘ ２０００， Ｒａｈｗａ
ｙ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０７０６５），ブレーコ
ートされたンリ力ゲル＃６０ Ｆ−２５４］で行った
。寒天プラグを検定するときには、拡散するに充分な時
間、このプラグをプレート上に置き、次いでプレートを
酢酸エチル ジエチルアミン メタノール（９５：５・
５）の上昇液体クロマトグラフィーにかけた。展開した
クロマ１・グラムを、ヒュームフード中で少なくとも２
時間完全に乾燥した。次いで、このクロマトグラムを、
ミクロコッカス・ルテウスＸ］６０を蒔いたＴＳＡプレ
ートに下を向けて〜１５分間置いた。クロマトグラムを
プレートから取り、プレートを３７゜Ｃで１６〜２４時
間インキユベートした。阻害領域をタイロンンまたはス
ビラマイシン標準と比較した。 絹込みプラスミドｐＫＣ７９６たけを含有しているＳ
アンボファシエンス株は、インクラテイソクなＨＰＬＣ
分析で示されるようにスピラマインンを産生じ続けた。 メタノール抽出物を、８０％のアセトニＩ・リルおよび
２０％の０．１％炭酸水素アンモニウム、ｐＨ ＝ ７
を移動相とするテユポン・ボンダパック（ＤｕＰｏｎｔ
Ｂｏｎｄａｐａｋ）Ｃ Ｉ ８カラム［デュポン社（
ＤｕＰｏｎｔ Ｃｏ．． Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏ
ｎ， Ｎｅｗｔｏｗｎ， ＣＴ ０６４７０）］にかけ
た。実験試料をスビラマイシンエステル標準と比較した
。溶出時間を次の表に挙げる。スビラマイシンＩ、■お
よび■の構造は、オムラおよびナカガワ［Ｏｍｕｒａ
ａｎｄ Ｎａｋａｇａｖａ， Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ
． ２８ ： ４０１４３３（＋９７５）］が開示し
ている。 第１１表 ｃａｒ Ｅを用いて イソバレリルスピラマイシン■ ２６ ５イ
ソバレリルスビラマインンＩＩＩ ３２．
０プチリルスピラマイシンＩＩ ２３
．０スビラマイシン標準 スピラマイシン＋ １５．３
スビラマインン■ １６ ５ス
ビラマイシンＩＩＩ １９
．５プラスミドｐＯＪ２４２またはｐＯ３２４３を組込
んだＳ．アンボファシエンス株は、新規なノ＼イブリッ
ド抗生物質インバレリルおよびプチリルスビラマイシン
を産生じた。この結果を次に示す。 以下の表において、Ａは５０μｇ／ＩＩＱのアブラマイ
シンを示し、■７は１００μ９／ｘＱのロインンを示す
。結果は・、スピラマイシンのイソノくレリルおよびプ
チリルスビラマインンへの変換率（％）で表す。 「全スピラマインン＋エステル」の欄は、形質転８ｌ ８２ 換体の全体の抗生物質産生率を表示するものである。従
って、この欄に高い値を有する形質転換体は、同し「変
換率（％）」値および低い「全スビラマインン＋エステ
ルｊ値を有する形質転換体よりもインバレリルおよびプ
チリルスビラマイシンを多く産生じている。プラスミド
ｐｏ Ｊ ２ ２ ４はｐＫ０７９６とは無関係な自律
的に複製するベクターであるが、ｐＯＪ２４２およびｐ
ＯＪ２４３と同一のｃａｒＥ含有フラグメントを含んで
いる。 第１２表 増殖条件および ベクター Ａ“Ｌ ｐＫＣ７９６ ｐＯＪ２４２ ｐＯＪ２４３ ｐＯＪ２２４ Ａ”＋１ ｐＫＣ７９６ ｐＯＪ２４２ ｐＯＪ２４３ ｐＯＪ２２４ Ａ−Ｌ ｐＫＣ７９６ ｐＯＪ２４２ ｐＯＪ２４３ ｐＯＪ２２４ Ａ−Ｌ’ ｐＫＣ７９６ ｐＯＪ２４２ ｐＯＪ２４３ ｐＯＪ２２４ 変換率 全スピラマインン」− （％） エステル（μｇ／試料）２．０ １９ １８ ０６ ３，７ ２，７ ３．３ ０．６ ８３ ８４ これらの結果からいくつかの結論を導くことができる。 最も重要なことは、自律的に複製するプラスミドの代わ
りに組込みベクターを用いると金産生量の大きな増加が
得られるということである。 細胞中にそのようなプラスミドが存在すると、細胞資源
の多くはプラスミトの維持に向けられる。 これは次いで、細胞の抗生物質産生能力が減ずるという
結果になる。抗生物質産生の増加は、クローンされた遺
伝子を維持するためのベクターとしてのｐＫＣ７９６の
多くの利点の１つであるにすぎない。これらのデータに
基づく別の観察結果は、ｃａｒ Ｅ遺伝子がどちらの配
向であっても、スピラマイシンからインバレリルおよび
プチリルスピラマイシンへの大量の変換を引き起こすと
いうことである。この変換は増殖培地中にロイシンが存
在することによって増大する。最後に、抗生物質選択が
組込みベクターによるｃａｒＥ表現型の維持のための必
要条件ではないことを観察することができる。これはｐ
ＫＣ７９６の別の重要な利点を示すものである。 実施例５ プラスミドｐｓＫｃ５０およびｐＳＫＣ５１
の構築 Ａ８プラスミドｐＨＪＬ２８０の単離 受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８０４３のもとでＮＲＲＬ
に寄託されている大腸菌Ｋ］２Ｉ−ＩＢＩＯＩからプラ
スミドｐＨＪＬ２８０を単離した。ｐＨＪＬ２８０の制
限部位および機能地図を第５図に示す。このプラスミド
は、タイロシン生合成遺伝子ｔｙｌＥ， ｔｙｌＤ，
ｔｙｌＦ， ｔｙｌＨおよびｔｙｌ Ｊの供給源として
有用である。これらの遺伝子群はｐＨＪＬ２８０の〜６
ｋｂ ＢａｍＨ Ｉフラグメントに存在している。 アブラマイシンの代わりに１００μ９／ｘ（ｌのアンピ
シリンを培地に用いること以外は、実質的に実施例１の
記載に従ってプラスミドを単離した。 Ｂ．プラスミドｐｓＫｃ５０およびｐｓＫｃ５１の最終
的な構築 プラスミドｐｓＫｃ５０およびｐｓＫｃ５１は、ストレ
ブトマイセス・フラジエ染色体中にタイロンン生合成遺
伝子の追加のコピーを組込ませるた８５ ８６ めに用いたベクターてある。これらのプラスミドを次の
ようにして構築した。プラスミトｐＫＣ７９６ ＤＮ
Ａ（約１０μ１．１０μｇ）を、実施例２Ｂのように制
限酵素ＢａｍＨＩで消化した。実質的に実施例２Ｂのよ
うにして、プラスミドｐｔ｛ Ｊ Ｌ ２８０（約２０
μｇ）をＢａｍＨＩで消化し、〜６ｋｂのＤＮＡフラグ
メントを単離した。次いて、実質的に実施例２Ｂのよう
にして、Ｂ ａｍＨ ｌ ？ｔｊｌ化したｐＫＣ７９６
とｐＨＪＬ２８０の〜６ｋｂフラグメ／トを連結し、大
腸菌Ｄ Ｈ ５α中に導入した。得られたプラスミドは
ｐｓＫｃ５０およびｐｓＫｃ５１であり、これらは〜６
ｋｂ Ｂ ａｍＨ ｌフラグメントの配向たけが異な
っている（第６図および第７図を参照）。次いで、これ
らのプラスミトを」一記実施例３記載のようにしてＳ
フラ７工ＴＩ４０５中に導入した。この試料を、実質的
に上記実施例４に従い、タイロ／ン産生について検定し
た。 Ｓ．フラ／工産生株を用いた実験の結果は次のようであ
った。結果を、対照のＴ１４０５産生株（組込まれたベ
クターを含まない）と比較したときの、産生タイ０７ン
の割合（％）で表す。 第１３表 株 産生されたタイロシン（対照
に対する％） ＴＩ４０５ １００
＋００Ｔ］４０５／ｐＫＣ７９６ 行わず
９８Ｔ １／＋ ０５／ｐｓＫｃ５０ またはｐＳＫＣ５］ １３３ １３６こ
の結果は、タイロシン生合成遺伝子の追加のコピーの組
込みがタイロンン産生を相当に増加させることを示すも
のである。 実施例６ プラスミドｐＫＣ７９６、ｐＳＫＣ５０およ
びｐＳＫＣ５］によるｔｙｌ突然変異株ＧＳＩ５および
ＧＳ］６の形質転換 実施例３の記載のようにして、ス１・レプトマイセス・
フラジエ株ＧＳ］５およびＧＳ］６を増殖させ、プロト
プラスト化し、そしてｐｓＫｃ５０およびｐＳＫＣ５］
で形質転換した。ｐｓＫｃ５０またはｐｓＫｃ５１を含
有しているアブラマインン耐性の形質転換体を、５０μ
ｇ／ｘＱのアブラマイシンを加えたＴＳブロス中、約４
８時間または培養が定常期に達するまで増殖させた。そ
れぞれの培養物（０．５ｉＱ．）をタイロ７ン発酵培地
（実施例３）（７ＪＩのに接種し、この培養物を速く撹
拌しながら２９℃で７日間インキユベートした。それぞ
れの培養物にメタノール（５Ｒｅ）を加えた。手で振盪
して廃合した後、メタノール希釈した発酵培養物をワノ
トマン（Ｗｈａｔｍａｎ） ＃ Ｉ紙で濾過した。この
濾液を、薄層クロマトグラフイ−［バルツおよびセノ（
Ｂａｌｔｚ ａｎｄ Ｓｃｎｏ， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ
ｂ． ＡｇａｎＬｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ２０ ：
２１４−２２５（１９８１））］およびＨ Ｐ Ｌ
Ｃ ［ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ， Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．
２８１ ： ２８８−２９２（１９８３））］により
、タイロシン、マクロンンおよびデメチルマクロ／ンの
存在について分析した。この結果を、同時に行ったｐｓ
Ｋｃ５０またはｐｓＫｃ５１を含まないＧＳＩ５または
ＧＳＩ６からなる対照培養物のものと比較した。
第１図は、プラスミドｐＫＣ７９６の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第２図は、プラスミドｐＯＪ１７１の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第３図は、プラスミドｐＯＪ２４２の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第４図は、プラスミドｐＯＪ２４３の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第５図は、プラスミドｐＨＪＬ２８０の制限部位および
機能地図を示す模式図であり、第６図は、プラスミドｐ
ｓＫｃ５０の制限部位および機能地図を示す模式図であ
り、 第７図は、プラスミドｐＳＫＣ５］の制限部位および機
能地図を示す模式図である。
能地図を示す模式図であり、 第２図は、プラスミドｐＯＪ１７１の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第３図は、プラスミドｐＯＪ２４２の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第４図は、プラスミドｐＯＪ２４３の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第５図は、プラスミドｐＨＪＬ２８０の制限部位および
機能地図を示す模式図であり、第６図は、プラスミドｐ
ｓＫｃ５０の制限部位および機能地図を示す模式図であ
り、 第７図は、プラスミドｐＳＫＣ５］の制限部位および機
能地図を示す模式図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ファージφＣ３１の部位特異的な組込み機能を含む
ＤＮＡ配列を含有しているプラスミドを、該プラスミド
がプラークを形成させることができないという限定条件
のもとで、放線菌中に導入することを特徴とする放線菌
の形質転換方法。 ２、ファージφＣ３ｌの部位特異的な組込み機能を含む
ＤＮＡ配列が、以下の配列で示される請求項１記載の方
法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［配列中、Ａはデオキシアデニル残基、Ｇはデオキシグ
アニル残基、Ｃはデオキシシチジル残基、そしてＴはチ
ミジル残基である］。 ３、ｐＫＣ７９６、ｐＯＪ２４２、ｐＯＪ２４３、ｐＳ
ＫＣ５０、およびｐＳＫＣ５１からなる群から選ばれる
プラスミド。 ４、プラスミドｐＫＣ７９６。 ５、プラスミドｐＯＪ２４２。 ６、プラスミドｐＯＪ２４３。 ７、プラスミドｐＳＫＣ５０。 ８、プラスミドｐＳＫＣ５１。 ９、（１）ファージφＣ３１の部位特異的な組込み機能
を含むＤＮＡ配列を含有しているプラスミドベクターで
あって、ある微生物においてそれまで発現されたことの
ない酵素またはその他の遺伝子産物をコードしており、
ある抗生物質をそれまで該微生物によって産生されたこ
とのないハイブリッド抗生物質に変換する、抗生物質生
合成遺伝子をも含有するベクターで微生物を形質転換す
ること、および （２）該ベクターで形質転換された微生物を、ハイブリ
ッド抗生物質の産生に適した条件下で培養すること、 を特徴とするハイブリッド抗生物質の製造方法。 １０、ファージφＣ３１の部位特異的な組込み機能を含
むＤＮＡ配列が、以下の配列で示される請求項９記載の
方法： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［配列中、Ａはデオキシアデニル残基、Ｇはデオキシグ
アニル残基、Ｃはデオキシシチジル残基、そしてＴはチ
ミジル残基である］。 １１、ハイブリッド抗生物質がイソバレリルスピラマイ
シンである請求項９記載の方法。１２、（１）抗生物質
生合成経路によって抗生物質または抗生物質前駆体を産
生する微生物を、ファージφＣ３１の部位特異的な組込
み機能を含むＤＮＡ配列を含有している組込みベクター
であって、該生合成経路の律速である酵素またはその他
の遺伝子産物をコードしている抗生物質生合成遺伝子を
も含有するベクターで形質転換すること；ただし、ここ
で選択される抗生物質生合成遺伝子は該微生物の抗生物
質産生能力または抗生物質前駆体産生能力の増大を与え
るものである、および（２）該ベクターで形質転換され
た微生物を、細胞増殖、該抗生物質生合成遺伝子の発現
、および抗生物質または抗生物質前駆体の産生に適した
条件下で培養すること、 を特徴とする抗生物質産生微生物または抗生物質前駆体
産生微生物の抗生物質産生能力または抗生物質前駆体産
生能力を増大させる方法。 １３、ファージφＣ３１の部位特異的な組込み機能を含
むＤＮＡ配列が、以下の配列で示される請求項１２記載
の方法： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［配列中、Ａはデオキシアデニル残基、Ｇはデオキシグ
アニル残基、Ｃはデオキシシチジル残基、そしてＴはチ
ミジル残基である］。 １４、プラスミドがプラークを形成させることができな
いという限定条件のもと、ファージφＣ３１の部位特異
的な組込み機能を含有しているプラスミドで形質転換さ
れた放線菌。 １５、ｐＫＣ７９６、ｐＯＪ２４２、ｐＯＪ２４３、ｐ
ＳＫＣ５０ＮおよびｐＳＫＣ５１からなる群から選ばれ
るプラスミドで形質転換された請求項１４記載の放線菌
。
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