JPH0285760A - 液体検知装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 流亙分互 本発明は、液体検知装置、より詳細には、液中の尿素量
の検出、日本酒成分の検出、化学物質の検出・同定装置
に関するものである。

従米挟生 試料中の尿素を比較的簡単に測定する装置として、各種
キットが発売されている。その原理は、試料中の尿素を
ウレアーゼで分解し、発生するアンモニアを、（１）酵
素法で検出するもの、あるいは、（２）インドフェノー
ル法で検出するものである。しかしながら、（１）の酵
素法では複雑な手順に加えて、紫外あるいは可視分光器
を必要とする。また、（２）の最も簡便と思われる場合
でも約３０分の時間を要し、定量的測定のためにはやは
り可視分光器での測定が必要である更に、化学物質の検
出・同定のために、その化学物質と選択的に反応する酵
素により化学反応を起こし、その化学反応の程度を溶液
のＰＨ指示薬の発色によりモニターする方法が古くから
知られている。例えば、米国特許第３１４５０８６号。

３２４９５１３号、あるいは、３３９５０８２号では、
尿素を検出するためにウレアーゼを用い、ウレアーゼに
よる尿素の分解により発生するアンモニアをＰＨ指示薬
の変色により検出している。

しかしながら、試料中の成分を分析しようとする場合、
その中に含まれる成分が防害物質となることがある。例
えば、尿素量を検出したい場合、尿素をウレアーゼによ
って分解し、発生したアンモニアによるＰＨ変化をｐＨ
指示薬の色変化によって検出する手段が多くとられるが
、さまざまな物質がこれらの反応を阻害する。第９図乃
至第１１図は、尿素４　ｐｐｍの１５％エタノール溶液
に夾雑物としてＮ　ａ　ＣＱ　、コハク酸、アミノ酸（
１７種の混合）を加えたときのＰＨ指示薬（ＢＴＢ）の
変色の変化（６３３ｎ＋ａにおける吸光度変化）を示す
が、これらの結果から、尿素を感度よく検出するために
は、例えば、無機イオン〈１５０ｐｐｍ、全アミノ酸＜
５ｐｐｍ、全有機酸くｌｐｐｍ程度迄夾雑物を除去する
必要がある。

更に、日本酒の尿素量を検出する場合に関していえば、
日本酒のＰＨは４程度であり、ウレアーゼの至適ＰＨが
７（中性）前後であるので日本酒中の夾雑物をとり除き
かつｐＨを７前後にする必要がある。特定化学物質とそ
れと選択的に反応する酵素および反応モニター用ｐＨ指
示薬の溶液系において、特定化学物質と酵素との反応に
より酸性物質あるいはアルカリ性物質が生成あるいは減
少する場合、原理的には、そのＰＨ変化をＰＨ指示薬に
より簡便にモニターできる。しかしながら、酵素そのも
のは両性物質であるので、溶液系は一種の緩衝効果をも
っている。従って、生成あるいは減少する酸性物質ある
いはアルカリ性物質が微量である場合、溶液のｐＨは変
化せず、ｐＨ指示薬の変色は起こらない。このため、特
定化学物質−酵素−ｐＨ指示薬の溶液系では高感度な検
出ができない。

目的 本発明は、上述のごとき実情に鑑みてなされたもので、
液体中の成分、特に、アルコール飲料中の尿素量を簡便
かつ迅速に側定することのできる液体検知装置、或いは
、日本酒の夾雑物をとり除きかつｐＨを７前後にするよ
うな液体検知装置、更には、酵素を固定化することによ
り、溶液の緩衝効果をおさえ、高感度検出を可能とする
ような液体検知装置を提供することを目的としてなされ
たものである。

構−一」又 本発明は、上記目的を達成するために、イオン交換機能
を有する層及び該イオン交換機能を有する層の下に設、
けられた色素層・酵素層・試料溜め層とを有するセルと
、前記試料溜め層中を透過する光を放射するための光源
と、該試料溜め層中の透過光を検出するための光検出器
とを有すること、或いは、前記酵素層を固定化酵素層と
したこと、或いは、前記イオン交換機能を有する層が、
強塩基性イオン交換機能と、弱酸性イオン交換機能とを
有する層であることを特徴としたものである。

以下、本発明の実施例に基づいて説明する。

本発明では、液中尿素を検出するために、酵素法を採用
した。即ち、試料の尿素とウレアーゼを反応させ、尿素
をアンモニアと炭酸ガスに分解し。

発生したアンモニアを検出することにより尿素量を決定
するものである。一般に、アンモニアは水に対しての溶
解度が炭酸ガスより高いので、尿素の分解によりアンモ
ニウムイオンが生成し、従って、溶液のＰＨが上昇する
。この際、Ｐ、Ｈ指示薬、例えば、ブロモチモールブル
ー（ＢＴＢ）が存在すると黄から緑〜青に溶液の色が変
化する。緑〜青色は５００〜７００ｎｍに光吸収をもつ
もので、例えば６６０ｎｍのＬＥＤを光源とし、色変化
した溶液の光吸収量をモニターし、検量線と比較するこ
とにより溶液中の尿素量が決定できる。しかしながら、
尿素を含んだ試料、例えば清酒はそのＰ　Ｈは銘柄によ
り、あるいは製造条件により異なるので、このままでは
−船釣な装置となりえない。

第１図は１本発明の一実施例を説明するための構成図で
１図中、１は試料のｐＨを６〜７とするためのカラム方
式のイオン交換樹脂層、２は色素層、３は固定化酵素層
、４は試料溜め層で、これらによって、直方体又は円柱
等の柱状セルを構成している。５はＬＥＤ光源、６はフ
ォトダイオードである。

第２図は、イオン交換樹脂層１の構成の一例を示す図で
、ｌａはＨ型陽イオン交換樹脂層、１ｂはＯＨ型陰イオ
ン交換樹脂、ＩＣは濾紙で、Ｈ型陽イオン交換樹脂層１
ａで交換樹脂層上に滴下された試料中のカチオンとの、
ＯＨ型陽イオン交換樹脂層１ｂで試料中のアニオンとの
イオン交換によって試料のｐ　Ｈを、試料本来のＰＨに
よらず、６〜７とすることができる。尿素は非電解質で
あり、イオン交換樹脂との相互作用は少ない、なお。

これらＩ−（型陽イオン交換樹脂層１　ａとＯＨ型陰イ
オン交換樹脂層１ｂは逆の順でもよいし、あるいはＨ型
とＯＨ型のイオン交換樹脂をあらかじめ混合して一層と
したり、あるいは両性イオン交換樹脂の一層とすること
も可能である。イオン交換樹脂層を通過した試料は色素
ｒｔｊｊ２に浸みこみ色素をとかしだす０例えば、試料
として清酒を用いた場合、ｐＨ；４であり、イオン交換
樹脂層通過後の濾液はＰＨ６〜７となる。従って、色素
としてＢＴＢを使用した場合、色素層を通過した液は黄
色となっている。この黄色の試料は固定化ウレアーゼ層
；３で、ウレアーゼの働きにより尿素の分解、アンモニ
アの生成が起こり、緑〜青色に変色する。

この変色した液が試料溜め層４に貯りこみ、ＬＥＤ光源
５からの６６０ｎｍの光の変色程度をフォトダイオード
６でモニターする。尚、ここでウレアーゼを固定化せず
用いた場合、試料液はウレアーゼの溶解により尿素が存
在しなくても青く変色する。従って、微量尿素の検出の
ためには酵素の固定化が必須である。また、試料溜め層
４内に、検出用の光のパスを邪魔することなく５色素コ
ートしたナイロンメツシュ、酵素固定化したナイロンメ
ツシュを詰めこむことにより、反応溶液の上下方向の色
ムラをなくすことが可能となり、分解能がより向上する
。

□例１ １５ｍ＋ａ角高さ３５ｍｍのポリスチレン製透明セルに
、イオン交換樹脂（〜ｉｏｍｍ）、色素層（〜５ｍｕｍ
）　、固定化酵素層（〜５ｍｍ）、試料溜め層（〜５ｍ
ｍ）を形成した。試料溜め層をはさんでＬＥＤ（スタン
レーＦＨ５１１、発光波長６６０ｎｍ）、Ｓｉフォトダ
イオードを設置した。

以下、各層について説明する。

くイオン交換樹脂層〉 湿潤したイオン遅滞樹脂（ダウケミカル社製、リターデ
ィオンＩＩＡ−８，５０〜１００メツシユ）２ｍＱを密
に充填、弱酸性イオン交換濾紙（アトバンチツク、ＣＭ
）で色素層と分離した。

く色素層〉 エチルアルコールに溶かしたブロムチモールブルー１％
溶液にナイロンメツシュを浸漬後、ナイロンメツシュを
取り出し乾燥したものを厚さ５■につめて色素層とした
。

く固定化酵素層〉 ポリアミド樹脂（ナイロン６）のメツシュを化学処理に
より表面を活性化しグルタルアルデヒドを固定し、この
膜をウレアーゼ（シグマ社製、Ｎｏ、Ｕ−１５００）の
５ｗｔ％水溶液に０℃で４時間浸漬し、ウレアーゼをポ
リアミド樹脂に結合したグルアルアルデヒドのホルミル
基に固定した。

このメツシュを厚さ５ｍｍにつめた。

清酒２ｍＱを約０．０２ｍＱずつセル中央に滴下し、滴
下が終了してから３分後に、フォトダイオードからの出
力を測定し■を得た。一方、固定化酵素層にウレアーゼ
なしのブランクセルにおけるフォトダイオードの出力を
ｄＩｇ定し工０を得た。

１ｏｇＩｏ／Ｉが溶液の吸光度を与える。

第３図に２尿素量既知の試料を用いて得た、尿素量対吸
光度の関係を示す。この結果、約２Ｐｐｍ迄の尿素量が
検出できることがわかった。

上述のように、上記実施例によると、ウレアーゼの分解
によって生じたアンモニアで試料のｐＨが瞬時に変化す
ることに着目し、このＰＨ変化をｐＨ指示薬で可視化し
、光学的にｐＨ変化を測定するようにしたので、インド
フェノール法（１５〜３０分必要）あるいは酵素法（約
２０分）において、アンモニアを化学反応で検出する際
に必要な時間を省略でき゛、約５分程度での尿素の測定
を可能とならしめた。

また、本実施例においてはＰＨ変化に着目しているため
、試料そのもののｐＨにより結果がふられる可能性があ
り、第１図のような構成が必然となる。しかも、イオン
交換樹脂を通して試料のｐＨを６〜７とすることにより
、赤色ＬＥＤの発光領域で色変化するブロムチモールブ
ルー指示薬が使用でき、しかもアンモニアの発生でｐＨ
値がｐＨχ４付近にくらべより大きく変化し、この両者
により高感度な尿素検出が可能となった。

また、検出用の光のバスを邪魔することなく、色素コー
トしたナイロンメツシュ、酵素固定化したナイロンメツ
シュを試料溜め層に詰めこむことにより、反応溶液の上
下方向の色ムラをなくすことが可能となり、分解能がよ
り向上する。

また、日本酒には、アミノ酸や有機酸、無機イオン等が
入っており、ｐＨも４前後である。これらを取り除き、
かつｐＨを７前後とするために、イオン交換樹脂又はイ
オン交換濾紙を用いる。これらのものを完全にとり除く
には、強塩基性のものと強酸性のものを用い、それぞれ
のイオン交換樹脂の量も多くすればよいが、実際には被
測定物質（例えば尿素）もイオン交換樹脂に吸着されて
しまうので、イオン交換樹脂の量と種類を適切に選ぶ必
要がある。そこで、次の実施例では、強塩基性イオン交
換樹脂十弱酸性イオン交換樹脂、又は、強塩基性イオン
交換樹脂十弱酸性イオン交換濾紙を用いたことを特徴と
している。

まず、アミノ酸、有機酸をとりのぞくには、強塩基性イ
オン交換樹脂を用いるのが効果的である。

イオン交換樹脂の量が多い方が酸もよくとりのぞけるが
、同時に尿素等の被測定物質もとりのぞいてしまう。イ
オン交換樹脂の量をなるべく減らし、かつ、後の分析処
理にさしつかえない程度に酸が除去できるよう、イオン
交換樹脂の量を適当に選んでも、ｐＨ値が少なくとも１
０〜１１程度にまであがってしまうのが普通である。そ
こで今度は。

ｐ　Ｈを下げるため酸性のイオン交換樹脂を用い。

その量を適当に選んでＰＨを７付近にする。このとき、
強酸性のものを用いると、イオン交換樹脂の量とｐＨと
の関係が非常に敏感で、ｐＨをコントロールすることが
非常に困難である。一方、弱酸性のものを用いるとイオ
ン交換樹脂の量とｐＨとの関係がゆるやかであるので、
十分コントロールが可能である。また、このときイオン
交換濾紙を用いると、枚数によりｐＨのコントロールが
可能となる。以下、実施例に基づいて説明する。

去−］し二吐−」ユ 第４図は、本実施例の１つを説明するための構成図で、
図中、１１は強塩基性イオン交換樹脂。

１２は弱酸性イオン交換樹脂、１３は濾紙で、弱酸性イ
オン交換樹脂１２としてダウ社製（ダウエックスＭＷＣ
−１，５０〜１００メツシュ）を用い、ＨｅΩ１０％溶
液を用いて前処理をし°た後。

十分洗浄した６強塩基性イオン交換樹脂１１としてダウ
社１１（ダウエックス１−ｘ８，５０〜１００メツシユ
）を用い、Ｎ　ａ　ＯＨ１０％溶液を用いて前処理をし
た後、十分洗浄した。これらを、第４図のように、下部
が５φ、上部が１５φのカラムに弱酸性イオン交換樹脂
０　、２　ｍ　Ｑ　、強塩基性イオン交換樹脂２　ｍ　
Ｑの順につめる。このときセパレータとして市販の濾紙
１３を用いた。このカラムに尿素１０ρＰ１１の日本酒
４　ｍ　Ｑを上から滴下した（ｐＨ４，１）。濾液は有
機酸約５ｐｐａ＋、アミノ酸約Ｉ　ＰＰＩＩＩ　Ｌか含
まず、ＰＨ指示薬の発色阻害は無視できる。又、ＰＩ（
は６．８であった。この液を２つにわけ、両方にＢＴＢ
Ｉ％液を１００μＱ、もう一方にはさらにウレアーゼを
入れたところ、それぞれ黄色、青緑色となり、十分尿素
が検出できた。

ス］例３ 第５図は、第４図に示した実施例の変形実施例を説明す
るための構成図で１図中、１１は強塩基性イオン交換樹
脂、１４は弱酸性イオン交換濾紙で、弱酸性イオン交換
濾紙１４としてアトバンチツク社製（ＣＭ）を用い、こ
れを図示のように１５φのカラムに１４枚重ねた。この
上に強塩基性イオン交換樹脂（実施例２と同様のもの）
１１を２ｍ　Ｑつめた。このカラムに日本酒４ｍＱを滴
下したところ、実施例２と同様の結果が得られた。各種
市販清酒で求めた清酒中尿素量と６３３ｎｍにおけるウ
レアーゼ入りとなしのものの吸光度の差との関係を第６
図に示す。各種銘柄（０１口、Δ、等にて示す）により
日本酒の成分（尿素検出側にとっては夾雑物）およびそ
の量は種々異なるが。

簡便に尿素が検出できた。

而して、日本酒中の成分の分析において、場合によって
は（例えば尿素分析）日本酒中の酸をとり除きかつｐＨ
を７にしたいが、これらの実施例２及び３においては強
塩基性イオン交換樹脂十弱酸性イオン交換樹脂（又は濾
紙）を備えているので、上記目的を達成できる。

更に、特定化学物質とそれと選択的に反応する酵素およ
び反応モニター用ｐＨ指示薬の溶液系において、特定化
学物質と酵素との反応により酸性物質あるいはアルカリ
性物質が生成あるいは減少する場合、原理的には、その
ＰＨ変化をｐ　Ｈ指示薬により簡便にモニターできる。

しかしながら、酵素そのものは両性物質であるので、溶
液系は一種の緩衝効果をもっている。従って、生成ある
いは減少する酸性物質あるいはアルカリ性物質が微量で
ある場合、溶液のｐＨは変化せず、ｐＨ指示薬の変色は
起こらない、このため、特定化学物質−酵素−ＰＨ指示
薬の溶液系では高感度な検出ができない。以下の実施例
は、上記の系において酵素を固定化することにより、溶
液の緩衝効果をおさえ、高感度検出を可能とするもので
ある。

Ｌ施　例ニーＡ− 担体結合法により酵素を固定化した。即ち、ポリアミド
樹脂（ナイロン６）のメツシュ（２ｃａ＋角。

１０枚）をＣａ　ＣＱ２・２　Ｈ２Ｏ２４ｔｚｔ％、純
水１１．６ｔ＋ｔ％、メタノール６４．７すｔ％の混合
液４７ｇに含浸し、４０℃で２０分間放置→ナイロンメ
ツシュの水洗→３．６５　Ｎの塩酸溶液１００ｇに含浸
、４０〜４５℃で２０分放置→ナイロンメツシュの水洗
→５０％グルタルアルデヒド水溶液５ｍＱとホウ酸緩衝
液（ｐＨ８，８）１５ｒｒ＋Ｑの混合溶液に含浸、０℃
で２０分間放置→ナイロンメツシュをホウ酸緩衝液で洗
浄→Ｎ　ａ　ＯＨと０．０５Ｍ　ＫＨ２ＳＯ４でＰＨ６
，９に調整した液１０　ｍ　Ｑにウレアーゼ３０ｍｇ、
ＥＤＴＡ　　１５ｍＨ。

２−メルカプトエタノール０．４μＱの混合液に含浸、
０℃４時間放置→０．２ＭのＮ　ａ　ＣＱ液で洗浄→水
洗→室温乾燥した。この結果、ウレアーゼはそのＮ末端
でグルタルアルデヒドを通じて、ナイロンメツシュのア
ミノ基に固定化される。

このようにして、ナイロンメツシュに固定化したウレア
ーゼにより、純水中の尿素を分解後、その上澄液をサン
プリングし、ブロモチモールブルーを加えて変色させ、
６３２．８ｎｍの吸光度を測定した。その結果を第７図
に示す、吸光度０．０５迄の側定が可能であるので、第
７図から１ρＰＩ１１の尿素が検出できることがわかる
。又、尿素ｏ　ｐｐｍのとき、吸光度は０であり、固定
化によりウレアーゼの存在でもｐＨが変化していないこ
とが結論できる。

第８図は比較のために、非固定のウレアーゼを使った場
合の実験結果を示した。６３２．８ｎｍの吸光度は使用
したブロモチモールブルーの絶対量に依存するので絶対
値そのものは比較できない。

しかしながら、尿素ｏ　ｐｐａ＋でも０．２程度の吸光
度を示すこと（これは前述したようにウレアーゼの存在
で溶液のｐＨが上昇したことによる）、最小検出量は３
０ｐｐｍ程度であることがわかる。勿論、ウレアーゼの
址を減らすことによりブランク時の吸光度を減少させつ
る。しかしながら、この場合、反応時間がきわめて遅く
なり実際的でない。

以」二で明らかなように、この実施例によると、酵素を
固定化することにより感度は約１０倍上昇している。

実施例５ 包括法により酵素を固定化した行程を以下に示す。

純水をＮ２ガスで３０分バブリング ↓ この水１００ｍＱにアクリルアミド９．７ｇ、Ｎ。

Ｎメチレンビスアクリルアミド１．９ｇ、リボフラビン
１５ｍｇ、　Ｋ２Ｓ、０．　１６ｍｇを加え、Ｎ２バブ
リングを行いながら３０分間撹拌 ↓ この溶液Ｌｍ１２にウレアーゼ２０ｍｇを溶解↓ ポリプロピレンフィルムではさみこんだスペーサー中に
上記溶液をいれ、４５０ｎｍの青色蛍光燈で５分間光重
合 ↓ 上記ポリアクリルアミドゲルを純水で洗浄後乾燥。

このようにして作成した固定化ウレアーゼでも第７図と
ほとんど同一の結果が得られ、包括法でも酵素が充分固
定化されていることが明らかとなった・ 従って、これらの実施例４及び５によると、酵素固定化
により検出感度が向上した結果、日本酒中の尿素の検出
（尿素含有量数ρｐｐｍ〜３０ｐｐｍ程度）に適用が可
能となる。

羞−一米 以上の説明から明らかなように、本発明によると、ウレ
アーゼの分解によって生じたアンモニアで試料のＰＨが
瞬時に変化することに着目し、このＰＨ変化をｐＨ指示
薬で可視化し、光学的にＰＨ変化を測定するようにした
ので、インドフェノール法（１５〜３０分必要）あるい
は酵素法（約２０分）において、アンモニアを化学反応
で検出する際に必要な時間を省略でき、約５９程度での
尿素の測定ができる。また、日本酒中の成分の分析にお
いて、場合によっては（例えば尿素分析）日本酒中の酸
をとり除きかつｐＨを７にしたいが、このような場合に
おいて１強塩基性イオン交換樹脂十弱酸性イオン交換樹
脂（又は濾紙）を備えているため、このような要求に応
じることができる。更に、酵素固定化により検出感度が
向上した結果、日本酒中の尿素の検出（尿素含有量数Ｐ
ρｍ〜３０ｐｐｍ程度）に適用が可能となる等の利点が
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明の一実施例を説明するための構成図、
第２図は、第１図に示したイオン交換樹脂層の一例を示
す詳細図、第３図は、尿素はと吸光度の関係を示す図、
第４図及び第５図は、それぞれ本発明の他の実施例を説
明するための構成図、第６図は、実験結果を示すグラフ
、第７図は１本発明の他の実施例における実験結果を示
すグラフ。 第８図は、第７図との比較に用いるためのグラフ、第９
図乃至第１１図は、夾雑物が測定結果に影響を与えるこ
とを説明するためのグラフである。 １・・・イオン交換樹脂層、ｌａ・・・Ｈ型陽イオン交
換樹脂層、１ｂ・・・ＯＨ型陰イオン交換樹脂層、ｌｃ
・・・濾紙、２・・・色素層、３・・・固定化酵素層、
４・・・試料溜め層、５・・・ＬＥＤ光源、６・・・フ
ォトダイオード、１１・・・強塩基性イオン交換樹脂、
１２・・・弱酸性イオン交換樹脂、１３・・濾紙、１４
・・・弱酸性イオン交換濾紙。 移 第　　１　　図 試料　　　　　　　　　　　第　２　図■ 第３図 清酒千の尿素量／ｐｐｍ 第４図　　　第５図 第６図 ＩＱ　　　　　　２０ 尿素ｐｐｍ 第７図 第８図 純水中の尿素／ｐｐｍ 第９図 第１１図 アミノ酸　（ｐＩ）ｍ） 第　１０　図 １゜ コハク酸　（ｐｌ）ｍ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、イオン交換機能を有する層及び該イオン交換機能を
   有する層の下に設けられた色素層・酵素層・試料溜め層
   とを有するセルと、前記試料溜め層中を透過する光を放
   射するための光源と、該試料溜め層中の透過光を検出す
   るための光検出器とを有することを特徴とする液体検知
   装置。 ２、前記酵素層を固定化酵素層としたことを特徴とする
   請求項第１項に記載の液体検知装置。 ３、前記イオン交換機能を有する層は、強塩基性イオン
   交換機能と、弱酸性イオン交換機能とを有する層である
   ことを特徴とする請求項第１項、又は第２項に記載の液
   体検知装置。