JPH026735A - 電気化学的酵素検出法 - Google Patents
電気化学的酵素検出法Info
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- JPH026735A JPH026735A JP63158253A JP15825388A JPH026735A JP H026735 A JPH026735 A JP H026735A JP 63158253 A JP63158253 A JP 63158253A JP 15825388 A JP15825388 A JP 15825388A JP H026735 A JPH026735 A JP H026735A
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（イ）産業上の利用分野
この発明は電気化学的酵素検出法に関する。さらに詳し
くは、アンペロメトリックな電気化学的検出器を用いた
酵素の検出法に関する。
くは、アンペロメトリックな電気化学的検出器を用いた
酵素の検出法に関する。
（ロ）従来の技術
従来、酵素の検出または酵素活性の測定は通常紫外また
は可視光を用いて行われているが、この法具外に、酵素
反応生成物をアンペロメトリックな電気化学的検出器を
用いて検出する方法が知られている。その１つの例とし
て、酵素にアルカリフォスファターゼ、酵素反応基質に
フェニルフォスフエイトを用いた酵素反応系において、
この反応のアクチベータとして塩化マグネシウムを添加
した後、この酵素反応生成物であるフェノールを検出す
ることにより、上記酵素の検出を行う方法が報告されて
いる（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｙ４１７ （１９８７） ４ｌ−４６ｐ ； Ｃ１
１ｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１／９．１５４
６−１５４９ｐ （１９８５）等）。
は可視光を用いて行われているが、この法具外に、酵素
反応生成物をアンペロメトリックな電気化学的検出器を
用いて検出する方法が知られている。その１つの例とし
て、酵素にアルカリフォスファターゼ、酵素反応基質に
フェニルフォスフエイトを用いた酵素反応系において、
この反応のアクチベータとして塩化マグネシウムを添加
した後、この酵素反応生成物であるフェノールを検出す
ることにより、上記酵素の検出を行う方法が報告されて
いる（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｙ４１７ （１９８７） ４ｌ−４６ｐ ； Ｃ１
１ｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１／９．１５４
６−１５４９ｐ （１９８５）等）。
（ハ）発明が解決しようとする課題
しかしながら、上記のごとく反応のアクチベタとしてマ
グネシウムイオンを必須とする酵素反応系では、添加す
る塩化マグネシウムに由来する塩化物イオンが、アンペ
ロメトリックな電気化学的検出器で低い電位でも検出さ
れてしまい、フロインジェクションアナリシス及び高速
液体クロマトグラフィを用いてもバックグラウンドが増
加する。このため酵素反応生成物であるフェノールを高
感度に検出することか難しいという問題点がある。
グネシウムイオンを必須とする酵素反応系では、添加す
る塩化マグネシウムに由来する塩化物イオンが、アンペ
ロメトリックな電気化学的検出器で低い電位でも検出さ
れてしまい、フロインジェクションアナリシス及び高速
液体クロマトグラフィを用いてもバックグラウンドが増
加する。このため酵素反応生成物であるフェノールを高
感度に検出することか難しいという問題点がある。
この発明はかかる状況に鑑みなされたものであり、特定
の酵素反応系における酵素を、アンペロメトリックな電
気化学的検出器を用いて高感度に検出しうる電気化学的
酵素検出法を提供しようとするものである。
の酵素反応系における酵素を、アンペロメトリックな電
気化学的検出器を用いて高感度に検出しうる電気化学的
酵素検出法を提供しようとするものである。
（ニ）課題を解決するための手段
かくしてこの発明によれば、マグネシウムイオンを必須
とする酵素反応系に、上記マグネシウムイオンの供給体
として中心元素が酸化数の高い酸素酸アニオンからなる
水溶性マグネシウム塩を用いて所定の酵素反応を進行さ
せた後、この反応混合物を電解による電気化学的酸化に
付し、上記酵素反応生成物の電解電流値に基づいて、上
記酵素反応系の酵素を検出することを特徴とする電気化
学的酵素検出法が提供される。
とする酵素反応系に、上記マグネシウムイオンの供給体
として中心元素が酸化数の高い酸素酸アニオンからなる
水溶性マグネシウム塩を用いて所定の酵素反応を進行さ
せた後、この反応混合物を電解による電気化学的酸化に
付し、上記酵素反応生成物の電解電流値に基づいて、上
記酵素反応系の酵素を検出することを特徴とする電気化
学的酵素検出法が提供される。
この発明の検出法は、酵素反応系中の反応生成物を電気
化学的に検出することに基づいて、上記酵素を検出する
方法である。この発明の検出法の対象とする所定の酵素
反応系は、アクチヘータとしてマグネシウムイオンを必
須とするものであり、例えばアルカリフォスファターゼ
、グルコース−６フオスフエイト デヒドロゲナーゼ等
の酵素反応系が挙げられるが、これらに限定されない。
化学的に検出することに基づいて、上記酵素を検出する
方法である。この発明の検出法の対象とする所定の酵素
反応系は、アクチヘータとしてマグネシウムイオンを必
須とするものであり、例えばアルカリフォスファターゼ
、グルコース−６フオスフエイト デヒドロゲナーゼ等
の酵素反応系が挙げられるが、これらに限定されない。
この発明の検出法において、上記マグネシウムイオンの
供給体としては、中心元素が酸化数の高い酸素酸アニオ
ンからなる水溶性マグネシウム塩が選択される。上記“
酸化数の高い”とは、すなわち後述するごとき電解によ
る電気化学的酸化に対して不活性な程度に高い酸化数の
ことを意味する。上記マグネシウム塩としては、例えば
過塩素酸マグネシウム（Ｍｇ（ＣｌＯ２）２）、硝酸マ
グネシウム（Ｍｇ（Ｎｏ３）ｚ） 、硫酸マグネシウム
（ＭｇＳ Ｏ４）等が挙げられ、過塩素酸マグネシウム
が好ましい。
供給体としては、中心元素が酸化数の高い酸素酸アニオ
ンからなる水溶性マグネシウム塩が選択される。上記“
酸化数の高い”とは、すなわち後述するごとき電解によ
る電気化学的酸化に対して不活性な程度に高い酸化数の
ことを意味する。上記マグネシウム塩としては、例えば
過塩素酸マグネシウム（Ｍｇ（ＣｌＯ２）２）、硝酸マ
グネシウム（Ｍｇ（Ｎｏ３）ｚ） 、硫酸マグネシウム
（ＭｇＳ Ｏ４）等が挙げられ、過塩素酸マグネシウム
が好ましい。
この発明における酵素の検出は、上記所定の酵素反応系
の反応生成物を検出することによって行われる。上記酵
素反応生成物の検出は、該酵素反応溶液を電解による電
気化学的酸化に付し、この一 溶液中の反応生成物の電解電流値でもって行われる。こ
の検出には通常のアンペロメトリックな電気化学検出器
、例えば島津製作所Ｌ−ＥＣＤ−８Ａか用いられる。従
って検出システムはフローシステムとされることが好ま
しい。上記検出における検出電位は０−１．ＯＶ （ｖ
ｓ Ａｇ／ＡｇＣ１）が適している。１．ＣＩＶ以上の
場合検出時のバックグラウンドがあかり好ましくない。
の反応生成物を検出することによって行われる。上記酵
素反応生成物の検出は、該酵素反応溶液を電解による電
気化学的酸化に付し、この一 溶液中の反応生成物の電解電流値でもって行われる。こ
の検出には通常のアンペロメトリックな電気化学検出器
、例えば島津製作所Ｌ−ＥＣＤ−８Ａか用いられる。従
って検出システムはフローシステムとされることが好ま
しい。上記検出における検出電位は０−１．ＯＶ （ｖ
ｓ Ａｇ／ＡｇＣ１）が適している。１．ＣＩＶ以上の
場合検出時のバックグラウンドがあかり好ましくない。
この発明の検出法は、フローインジェクンヨンアナリシ
ス及び高速液体クロマトグラフィとの組み合わせて用い
ることにより、高感度な検出が可能なる。
ス及び高速液体クロマトグラフィとの組み合わせて用い
ることにより、高感度な検出が可能なる。
（ホ）作用
この発明によれば、マグネシウムイオンを必須とする酵
素反応系に、中心元素が酸化数の高い酸素酸アニオンか
らなる水溶性マグネシウム塩を用いて所定の酵素反応を
進行させた後、この反応混合物を電解による電気化学的
酸化に付し、所定の電解電流値により上記酵素反応生成
物を検出し、この検出に基づいて、上記酵素反応系の酵
素が検出されることとなる。
素反応系に、中心元素が酸化数の高い酸素酸アニオンか
らなる水溶性マグネシウム塩を用いて所定の酵素反応を
進行させた後、この反応混合物を電解による電気化学的
酸化に付し、所定の電解電流値により上記酵素反応生成
物を検出し、この検出に基づいて、上記酵素反応系の酵
素が検出されることとなる。
以下実施例によりこの発明の詳細な説明するが、これに
よりこの発明は限定されるものではない。
よりこの発明は限定されるものではない。
（へ）実施例
第１図はこの発明の電気化学的酵素検出法を実施する一
例の検出システムを例示する構成説明図である。該図に
おいて検出システム（１）には、移動相供給部（図示し
ない）がら送液ポンプ（２）、オートインジェクタ（３
）、カラム（４）、電気化学的検出器（５）をこの順に
接続してさらにドレインへ延設される試料分析流路（ａ
）と、該流路に付設される制御部（６）および記録計（
７）とから主として構成された高速液体クロマトグラフ
装置が使用される。上記制御部（６）は、送液ポンプ（
２）、オートインジェクタ（３）、電気化学的検出器（
５）及び記録計（７）に電気接続されており、これらを
予め設定されたプログラムに従って駆動しうるよう構成
されている。
例の検出システムを例示する構成説明図である。該図に
おいて検出システム（１）には、移動相供給部（図示し
ない）がら送液ポンプ（２）、オートインジェクタ（３
）、カラム（４）、電気化学的検出器（５）をこの順に
接続してさらにドレインへ延設される試料分析流路（ａ
）と、該流路に付設される制御部（６）および記録計（
７）とから主として構成された高速液体クロマトグラフ
装置が使用される。上記制御部（６）は、送液ポンプ（
２）、オートインジェクタ（３）、電気化学的検出器（
５）及び記録計（７）に電気接続されており、これらを
予め設定されたプログラムに従って駆動しうるよう構成
されている。
上記電気化学的検出器（５）にはアンペロメトリックな
電気化学的検出器（島津製作所Ｌ−ＥＣＤ一 ６Ａ）が使用されている。
電気化学的検出器（島津製作所Ｌ−ＥＣＤ一 ６Ａ）が使用されている。
上記検出システム（１）に対して、１．５ｍＭＭｇ（Ｃ
ＩＯａ）２の炭酸バッファ（ｐＨ９，６） １．０μρ
を、オートインジェクタ（３）により注入し、検出電位
を０．８Ｖ （ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣ１）として検出した
ところ、第２図に示すピークが得られた。一方、上記検
出システムに対して、１．５ｍｌｖＩ−ＭｇＣ１２の炭
酸バッファ（ｐＩ−（９，６） １０μＱについて同条
件で検出したところ、第３図に示すピークが得られた。
ＩＯａ）２の炭酸バッファ（ｐＨ９，６） １．０μρ
を、オートインジェクタ（３）により注入し、検出電位
を０．８Ｖ （ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣ１）として検出した
ところ、第２図に示すピークが得られた。一方、上記検
出システムに対して、１．５ｍｌｖＩ−ＭｇＣ１２の炭
酸バッファ（ｐＩ−（９，６） １０μＱについて同条
件で検出したところ、第３図に示すピークが得られた。
これらの比較から、ＭｇＣ＋２よりもＭｇ（ＣＩｏ ４
）２を用いた方か、電気化学的検出器（５）におけるフ
ェノル検出ピーク出現域（イ）でのバックグラウンドを
小さくてきることか確認された。
）２を用いた方か、電気化学的検出器（５）におけるフ
ェノル検出ピーク出現域（イ）でのバックグラウンドを
小さくてきることか確認された。
・次に、試料溶液として下記酵素反応溶液を調製し、こ
れについて下記条件により分析・検出を検討した。
れについて下記条件により分析・検出を検討した。
試料溶液（酵素反応溶液）。
アルカリフォスファターゼ（以下ＡＬＰと略す）溶液（
ＡＬＰをリン酸緩衝生理食塩水に溶解したもの）５μＱ
を、酵素反応基質液（Ｉ ｍｍｏｌ／ρフェニルフォス
フエイト、１．５ｍｍｏ１１０．Ｍｇ（ＣＩｏ ４）２
を含むｐＨ９，６の００５Ｍカリウム−炭酸バッファ）
２００μりに加え、３７℃で３０ｍ１ｎインキユベート
する。
ＡＬＰをリン酸緩衝生理食塩水に溶解したもの）５μＱ
を、酵素反応基質液（Ｉ ｍｍｏｌ／ρフェニルフォス
フエイト、１．５ｍｍｏ１１０．Ｍｇ（ＣＩｏ ４）２
を含むｐＨ９，６の００５Ｍカリウム−炭酸バッファ）
２００μりに加え、３７℃で３０ｍ１ｎインキユベート
する。
これを分画分子量３０．０００の限外口過膜を用いて口
過したもの。
過したもの。
高速液体クロマトグラフィの分析条件：移動相：２０％
メタノールを含む０．１Ｍカリウム−リン酸バッファ（
ｐＨ６，８） 流速：１ｍＱ／ｍｉｎ カラム、内径４ 、６ｍｍ 、長さ５０ｍｍのＣＩ８逆
相カラム 検出電位： ０．８Ｖ （ｖｓ Ａｇ／ ＡｇＣｌ）以
上の条件下において、高速液体クロマトグラフ装置のオ
ートインジェクタ（３）から上記試料１０μρを注入し
て分析・検出を行ったところ、前述の確認試験と同様に
バックグラウンドが低減し、その結果上記酵素反応生成
物であるフェノールに基づくピークが、従来よりも高感
度で検出できた。
メタノールを含む０．１Ｍカリウム−リン酸バッファ（
ｐＨ６，８） 流速：１ｍＱ／ｍｉｎ カラム、内径４ 、６ｍｍ 、長さ５０ｍｍのＣＩ８逆
相カラム 検出電位： ０．８Ｖ （ｖｓ Ａｇ／ ＡｇＣｌ）以
上の条件下において、高速液体クロマトグラフ装置のオ
ートインジェクタ（３）から上記試料１０μρを注入し
て分析・検出を行ったところ、前述の確認試験と同様に
バックグラウンドが低減し、その結果上記酵素反応生成
物であるフェノールに基づくピークが、従来よりも高感
度で検出できた。
・またさらに、上記と同様なＡＬＰ溶液と酵素反応基質
液（ｉｖｌｇ（ＣＩｏ ４）２を含む）とからなる酵素
反応溶液について、該ＡＬＰの量を種々減少させて調製
し、これらについて上記検出システムにより上記と同様
に分析・検出に付したところ、１ａｍｏｌのＡＬＰによ
って生成したフェノールを検出てきた。すなわち、Ｉａ
ｍｏｌのＡＬＰが検出てきたことになる。
液（ｉｖｌｇ（ＣＩｏ ４）２を含む）とからなる酵素
反応溶液について、該ＡＬＰの量を種々減少させて調製
し、これらについて上記検出システムにより上記と同様
に分析・検出に付したところ、１ａｍｏｌのＡＬＰによ
って生成したフェノールを検出てきた。すなわち、Ｉａ
ｍｏｌのＡＬＰが検出てきたことになる。
以上述べたごとく、アクチベータとしてＭｇ（ＣＩｏ
４）２を用いることにより、ＡＬＰ七フェニルフォスフ
エイトとの酵素反応系で生じたフェノールを、上記検出
システムにおいてバックグラウンドを小さくして高感度
で検出することができる。
４）２を用いることにより、ＡＬＰ七フェニルフォスフ
エイトとの酵素反応系で生じたフェノールを、上記検出
システムにおいてバックグラウンドを小さくして高感度
で検出することができる。
（ト）発明の効果
この発明によれば、マグネシウムイオンを特徴とする特
定の酵素反応系における酵素を、アンペロメトリックな
電気化学的検出器におけるバックグラウンドを増加させ
ることなくこの反応の生成物を高感度に検出することに
より、高感度に検出てきる。またこの発明の方法は、高
速液体クロマトグラフィまたはフローインジェクション
アナリシスのいずれにも適用でき、かつ高感度で酵素を
検出することができる。
定の酵素反応系における酵素を、アンペロメトリックな
電気化学的検出器におけるバックグラウンドを増加させ
ることなくこの反応の生成物を高感度に検出することに
より、高感度に検出てきる。またこの発明の方法は、高
速液体クロマトグラフィまたはフローインジェクション
アナリシスのいずれにも適用でき、かつ高感度で酵素を
検出することができる。
第１図はこの発明の電気化学的酵素検出法を実施する一
例の検出システムを例示する構成説明図、第２図は、第
１図の検出システムにＭｇ（ＣｌＯ４）２を用いたとき
のバックグラウンドの影響を示す検出ピーク図、第３図
は、第１図の検出システムにＭｇＣｌ２を用いたときの
バックグラウンドの影響を示す検出ピーク図である。 （１）・・・・・検出システム、（２）・・・送液ポン
プ、（３） オートインジェクタ （４）・・・・・・カラム （５）・・・電気化学的検出器、 （６）・・・・・・制御部、 （７）・・・記録
計。 第 図 第 図 第 図
例の検出システムを例示する構成説明図、第２図は、第
１図の検出システムにＭｇ（ＣｌＯ４）２を用いたとき
のバックグラウンドの影響を示す検出ピーク図、第３図
は、第１図の検出システムにＭｇＣｌ２を用いたときの
バックグラウンドの影響を示す検出ピーク図である。 （１）・・・・・検出システム、（２）・・・送液ポン
プ、（３） オートインジェクタ （４）・・・・・・カラム （５）・・・電気化学的検出器、 （６）・・・・・・制御部、 （７）・・・記録
計。 第 図 第 図 第 図
Claims (1)
- １、マグネシウムイオンを必須とする酵素反応系に、上
記マグネシウムイオンの供給体として中心元素が酸化数
の高い酸素酸アニオンからなる水溶性マグネシウム塩を
用いて所定の酵素反応を進行させた後、この反応混合物
を電解による電気化学的酸化に付し、上記酵素反応生成
物の電解電流値に基づいて、上記酵素反応系の酵素を検
出することを特徴とする電気化学的酵素検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63158253A JPH026735A (ja) | 1988-06-25 | 1988-06-25 | 電気化学的酵素検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63158253A JPH026735A (ja) | 1988-06-25 | 1988-06-25 | 電気化学的酵素検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH026735A true JPH026735A (ja) | 1990-01-10 |
Family
ID=15667590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63158253A Pending JPH026735A (ja) | 1988-06-25 | 1988-06-25 | 電気化学的酵素検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH026735A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030053195A (ko) * | 2001-12-22 | 2003-06-28 | 윤윤모 | 연약지반용 매트 및 이를 이용한 연약지반 개량공법 |
| JP2014163728A (ja) * | 2013-02-22 | 2014-09-08 | Toyobo Co Ltd | イムノアッセイ方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5245399A (en) * | 1975-09-22 | 1977-04-09 | Chembro Holdings Pty Ltd | Method of measurements of level of alkali phosphatase in body fluids |
-
1988
- 1988-06-25 JP JP63158253A patent/JPH026735A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5245399A (en) * | 1975-09-22 | 1977-04-09 | Chembro Holdings Pty Ltd | Method of measurements of level of alkali phosphatase in body fluids |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030053195A (ko) * | 2001-12-22 | 2003-06-28 | 윤윤모 | 연약지반용 매트 및 이를 이용한 연약지반 개량공법 |
| JP2014163728A (ja) * | 2013-02-22 | 2014-09-08 | Toyobo Co Ltd | イムノアッセイ方法 |
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