【発明の詳細な説明】
発明の背景
技術分野
本発明は、免疫抑制酸性蛋白の検査方法に関す
る。
先行技術
免疫抑制酸性蛋白は、正常人血清中に平均
250μg／ml含まれているが、患者、１部自己免疫
疾病患者等免疫力が低下している患者の血清中に
は400〜2500μg／mlと異常に多く含まれ、免疫能
を抑制する蛋白として各種〔IAP（松田ら，医学
のあゆみ，102巻，P.747昭和52年）α1−アシツド
グリコプロテイン、α1−アンテイトリプシン等〕
同定されている。従つて免疫抑制酸性蛋白の血清
中の量を検査することによつて患者の免疫能をチ
エツクすることができ、治療上の指針となる。従
来の免疫抑制酸性蛋白の検出方法として、例えば
ゲル電気泳動法、免疫電気泳動法、一元放射免疫
拡散法（SRID法）があるが、それぞれ以下の問
題点がある。
従来技術の問題点
ゲル電気泳動法は、免疫抑制酸性蛋白を定量的
に検出できず、又これを判別することが困難であ
るとともに酸性グロブリンやその他の蛋白と泳動
バンドが重なりやすい欠点がある。免疫電気泳動
法は、定量的な検出はある程度可能であるが、泳
動像がはつきりせず、又定量限界値が高いなどの
問題がある。一元放射免疫抑拡散法は、定量的な
検出が可能で定量限界値がいくらか低いなどの利
点はあるが、検出操作に時間がかかるとともに沈
降線が太くなることも多いために測定しにくい。
しかも塞天使用のため商品として保存に気をつけ
る必要があるなどの問題がある。
発明の目的
本発明は上記事情に鑑みてなされたものでその
目的とするところは、免疫抑制酸性蛋白を精度よ
く、短時間で検出でき、しかも商品として安定し
て保持しやすい生体物質検査試薬を用いた検査方
法を提供することにある。
本発明の生体物質検査方法は、検査容器内に、
希釈された免疫抑制酸性蛋白を含む液と抗免疫抑
制酸性蛋白抗体とを入れた後、直径５〜100μで、
比重が1.02〜1.20の有機質又は無機質の着色担体
に免疫抑制酸性蛋白を担持させた生体物質検査試
薬を加えて、該試薬と抗免疫抑制酸性蛋白抗体と
を反応させて上記免疫抑制酸性蛋白の量を検出す
ることを特徴とする。
発明の具体的説明
まず本発明に係る生体物質検査試薬について説
明する。この検査試薬１は、血清中あるいは腹水
中の免疫抑制酸性蛋白（以下IAPと称す）を定量
的に検出するための試薬で、第１図に示すように
担体２にIAP３を担持している。
担体２として有機質又は無機質のものをいずれ
も使用でき、例えば赤血球、プラスチツクビー
ズ、ガラスビーズ等があげられる。ここでプラス
チツクビーズ、ガラスビーズを用いる場合には赤
色等に着色して識別を容易におこなえるようにす
る。プラスチツクビーズとしては、スチレンポリ
マー、アクリルポリマー、ポリカルボン酸、ナイ
ロン等およびそれらの誘導体が適当である。これ
ら担体２は、その直径５〜100μで、比重が1.02〜
1.20である。これは担体２を検査容器４内に入れ
た際に、ここに担持されたIAPが抗免疫抑制酸性
タンパク抗体（以下抗IAP抗体と称す）と有効に
反応し、しかも適度の沈降速度で底部に沈むよう
にするためである。なお赤血球は、その直径７〜
8.5μ、比重が1.090〜1.100で上述した条件を満し
ている。
この担体２に担持するIAP３は、従来公知の方
法例えば癌患者の腹水又は血清の硫安塩析、クロ
マトグラフイー等の処理をおこなうことによつて
得られる。
この担体２にIAPを担持する方法は、従来公知
の方法をそのまま適用できる。
例えば赤血球にIAPを担持するには、グルタル
アルデヒドを加えて撹拌処理した赤血球を、
NaClを含むリン酸緩衝液（PBS）で洗浄した後、
これをPBSに懸濁してタンニン酸溶液を加えて
撹拌し、更にこれをPBSで洗浄後懸濁する。次
いでこのように処理された赤血球とIAP溶液とを
混合、撹拌した後、PBSで洗浄することにより
得られる。
一方ナイロン製の合成樹脂ビーズIAPを担持さ
せる場合は、塩酸で処理したビーズを蒸留水で洗
浄後グルタルアルデヒドを加えて撹拌して、これ
を洗浄する。次いでこのように処理されたビーズ
にIAP溶液を加えて反応させた後PBSで洗浄する
ことにより得られる。
次に上述した生体物質検査試薬１を使用して、
血清中に含まれるIAPを定量的に検出する方法に
ついて述べる。
まず第１図に示すように検査容器４に、所定の
倍率で希釈されたIAP５を含む血清、腹水等の液
６とともに所定量の抗IAP抗体７を入れる。この
検査容器４としてはガラス製試験管、プラスチツ
ク製試験管でもよいが、マイクロプレートが好ま
しい。マイクロプレートはポリスチレン、アクリ
ル等のプラスチツク製のもので、例えば１枚のプ
レートに96個のＵ底あるいはＶ底のウエルのある
ものである。
抗IAP抗体７は、従来公知の方法、例えばIAP
を動物に投与して免疫し、その血清を分離する方
法により得られる。
この検査容器４内では、第２図に示すように体
液中のIAP５と抗IAP抗体７とが反応する。
次いで第３図に示すように上記生体物質検査試
薬１を添加する。ここで未反応の抗IAP抗体が存
在している場合、すなわち投入した抗IAP抗体よ
りIAPの量が少ない場合（第３図）は第４図に示
すように検査容器４底面において凝集反応が生じ
て担体２が底面に広がり、この広がりからこれを
検知することができる。一方未反応の抗IAP抗体
が存在していない場合、すなわち投入した抗IAP
抗体よりIAPの量が多いか、あるいは等量の場
合、第５図に示すように担体２に担持したIAPは
凝集反応をおこすことなく検査容器４の底面中央
に集まつて点状に見え、このことからこれを検知
することができる。
本発明においては、IAPを含む血清の希釈倍率
を変えてそれぞれにつき、抗IAP抗体及び生体物
質検査試薬を順に投入することにより、希釈倍率
の低いものでは凝集反応が生じないが、ある希釈
倍率以上とすることにより凝集反応が生じる。従
つて凝集反応が生じ始めたときの希釈倍率を知る
ことにより、もとの血清中に含まれるIAPの濃度
を知ることができる。
発明の具体的効果
上述した生体物質検査試薬を用いた検査方法に
よれば、凝集反応の生じない状態から凝集反応が
生じた状態へ変化した場合の希釈倍率を検知すれ
ばよいので、血清中のIAP濃度をばらつきなく精
度よく検出することができる。
更に担体２をプラスチツクビーズ又はガラスビ
ーズで形成した生体物質検査試薬は、経済的に品
質が劣化することがないので商品として安定し、
保存しやすい。
次に本発明の効果を確認すべくおこなつた以下
の実施例につき説明する。
まず以下の製法により得た担体にIAPを担持し
て本発明に用いる生体物質検査試薬を得た。ここ
でのIAPは松田ら（医学のあゆみ，102巻，P.747
昭和52年）の報告したいわゆる免疫抑制酸性蛋白
とする。
(1) 担体の作製
赤血球及びナイロン製の赤色担体を用いた。
赤血球はひつじの赤血球で、平均径7μ、比重
1.095である。ナイロン製の担体は、蟻酸にナイ
ロン及びフエノールレツドを溶解して均一な溶液
とし、これを高圧スプレーによつて150℃の容器
内へ噴霧し、蟻酸を飛ばし、これを水で洗浄し
た。得らたプラスチツクビーズは、赤色で約15μ
の径を有し、比重は1.10であつた。
(2) IAPの調製
癌患者腹水の60％硫酸アンモニウム塩飽和によ
る上清にさらに硫酸アンモニウム塩を加え、90％
飽和とし、遠心し、沈殿を得る。この沈殿を
0.02M酢酸緩衝液（PH4.0）に溶かし、同緩衝液
で透析し、次に透析内液を同緩衝液で平衡化した
DEAE−セルロースカラム（フアルマシアフアイ
ン・ケミカル社製）にかけ、同緩衝液で洗浄した
のち、0.4M酢酸緩衝液を流す。溶出液を濃縮し
たのち、PBSで平衡化したセフアデツクスＧ−
100カラム（フアルマシアフアイン・ケミカル社
製）にかけ、溶出された第２のピークを集める。
これを濃縮したものをPH2.5〜6.0のカラム型等電
点電気泳動にかけ、等電点がPH3.0から3.4の画分
を集め、PBSに対し充分に透析し、この透析内
液をIAPとする。
(3) 担体へのIAPの担持
担体が赤血球の場合
５％ひつじ赤血球100mlに2.5％グルタルアルデ
ヒド20ml加えて室温で２時間撹拌する。処理赤血
球を、0.9％NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH
7.5：PBS）で洗浄し、PBSに５％になるよう懸
濁し、0.01％タンニン酸溶液を等量加え、37℃で
10分間撹拌する。その後PBSで洗浄後、PBSに
５％になるよう懸濁し、この100mlと0.8％IAP溶
液100mlとを混合し、37℃で１時間撹拌する。反
応後PBSで洗浄してこれを生体物質検査試薬と
した。
担体がナイロン製プラスチツクビーズの場合
プラスチツクビーズを3.5M塩酸中に浸漬し、
45℃で８分間処理する。蒸留水で洗浄後1.25％グ
ルタルアルデヒドを加え、40分間撹拌する。この
ビーズを水で洗浄後、等量の0.2％IAP溶液を加
え、４℃で１晩おく。この後ビーズをPBSで洗
浄して生体物質検査試薬を得た。
次にこのようにして得られた生体物質検査試薬
による検査方法につき説明する。
まず、あらかじめ投入される抗IAP抗体の調製
について示す。
上述した方法で得られたIAPをフロインドの完
全アジユバントとともにウサギ足の筋肉に２週間
間隔で、１回２mgを５回投与し、最終免疫の１週
間後に全血採血する。血清成分をとり、常法によ
つてγ−グロブリン分画を分離する。これを
0.01Mりん酸緩衝液（PH8.0）で平衡化したDEAE
−セロルースカラムにかけ、素通り分画を集め
る。これを濃縮したのちセフアデツクスＧ−100
ゲルクロマトグラフイーにかけ、最初のピークを
集めて、これを抗IAP抗体とした。
本発明方法では、IAP既知濃度溶液（100μg／
ml，No.１；500μg／ml，No.２）、正常人血清（No.
３〜No.５）、癌患者血清（No.６〜No.８）及び肝癌
患者腹水（No.９）を２％牛胎児血清を含なPBS
で500倍に希釈し、その後適当に希釈したのちそ
れぞれの25μを96穴Ｕ底マイクロプレートに入
れる。それに0.03％抗IAP抗体溶液を25μづつ
加え、プレートをよく振とうしたのち0.8％IAP
感作赤血球を25μ加え、さらに振とうしたのち
室温で２時間静置する。その後管底像すなわち凝
集反応の有無を肉眼で観察した。管底像及びそこ
から計算されるIAP値を第１表及び第２表に示
す。なおこの場合担体が赤血球の場合でも、プラ
スチツクビーズの場合でも同様の結果が得られ
た。
これに対し従来のSRID法でNo.１〜No.９のもの
について同様にIAP値を検出した。その結果を第
２表に併記する。BACKGROUND OF THE INVENTION Technical Field The present invention relates to a method for testing immunosuppressive acidic proteins. Prior Art Immunosuppressive acidic proteins are found on average in normal human serum.
It contains 250 μg/ml, but it is abnormally high at 400 to 2,500 μg/ml in the serum of patients with weakened immune systems, such as patients with autoimmune diseases, and is a protein that suppresses immune function. Various [IAP (Matsuda et al., History of Medicine, Vol. 102, P. 747, 1977) α 1 -Acid Glycoprotein, α 1 - Antetrypsin, etc.]
Identified. Therefore, by examining the amount of immunosuppressive acidic protein in the serum, the patient's immune capacity can be checked, which can provide guidelines for treatment. Conventional methods for detecting immunosuppressive acidic proteins include, for example, gel electrophoresis, immunoelectrophoresis, and single radial immunodiffusion (SRID), but each has the following problems. Problems with the Prior Art Gel electrophoresis has the disadvantage that it cannot quantitatively detect immunosuppressive acidic proteins, that it is difficult to distinguish them, and that electrophoretic bands tend to overlap with acidic globulin and other proteins. Immunoelectrophoresis allows quantitative detection to some extent, but has problems such as poor electrophoretic images and high quantification limits. The one-way radioimmunosuppression diffusion method has the advantage of being able to perform quantitative detection and has a somewhat low quantification limit, but it is difficult to measure because the detection operation takes time and the sedimentation line often becomes thick.
Moreover, since it is used as a seal, there are problems such as the need to be careful in preserving it as a product. Purpose of the Invention The present invention has been made in view of the above circumstances, and its purpose is to provide a biological substance testing reagent that can detect immunosuppressive acidic proteins with high precision and in a short time, and that can be stably maintained as a commercial product. The purpose of this invention is to provide the testing method used. In the biological material testing method of the present invention, in the testing container,
After adding the solution containing the diluted immunosuppressive acidic protein and the anti-immunosuppressive acidic protein antibody,
A biological material testing reagent carrying an immunosuppressive acidic protein is added to an organic or inorganic colored carrier with a specific gravity of 1.02 to 1.20, and the reagent is reacted with an anti-immunosuppressive acidic protein antibody to determine the amount of the immunosuppressive acidic protein. It is characterized by detecting. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION First, the biological substance testing reagent according to the present invention will be described. This test reagent 1 is a reagent for quantitatively detecting immunosuppressive acidic protein (hereinafter referred to as IAP) in serum or ascites, and has IAP 3 supported on a carrier 2 as shown in FIG. Any organic or inorganic carrier can be used as the carrier 2, such as red blood cells, plastic beads, glass beads, etc. When plastic beads or glass beads are used, they are colored red or the like for easy identification. Suitable plastic beads include styrene polymers, acrylic polymers, polycarboxylic acids, nylon, and derivatives thereof. These carriers 2 have a diameter of 5 to 100μ and a specific gravity of 1.02 to 1.02.
It is 1.20. This is because when the carrier 2 is placed in the test container 4, the IAP carried there reacts effectively with the anti-immunosuppressive acidic protein antibody (hereinafter referred to as anti-IAP antibody), and moreover, it sinks to the bottom at an appropriate sedimentation rate. This is to make it sink. The diameter of red blood cells is 7~
8.5μ and specific gravity of 1.090 to 1.100, satisfying the above conditions. The IAP3 supported on the carrier 2 can be obtained by conventionally known methods such as ammonium sulfate salting out of ascites or serum from cancer patients, chromatography, and the like. As a method for supporting IAP on this carrier 2, conventionally known methods can be applied as they are. For example, to carry IAP on red blood cells, red blood cells that have been stirred with glutaraldehyde are
After washing with phosphate buffered saline (PBS) containing NaCl,
This is suspended in PBS, a tannic acid solution is added and stirred, and this is further washed and suspended with PBS. Next, the thus treated red blood cells and IAP solution are mixed and stirred, and then washed with PBS. On the other hand, when supporting nylon synthetic resin beads IAP, the beads treated with hydrochloric acid are washed with distilled water, and then glutaraldehyde is added and stirred to wash the beads. Next, an IAP solution is added to the beads treated in this way to cause a reaction, and the beads are then washed with PBS. Next, using the biological substance testing reagent 1 described above,
We will describe a method for quantitatively detecting IAP contained in serum. First, as shown in FIG. 1, a predetermined amount of anti-IAP antibody 7 is placed in a test container 4 along with a fluid 6 such as serum and ascites containing IAP5 diluted at a predetermined ratio. The test container 4 may be a glass test tube or a plastic test tube, but a microplate is preferred. A microplate is made of plastic such as polystyrene or acrylic, and has, for example, 96 U-bottom or V-bottom wells in one plate. Anti-IAP antibody 7 can be prepared by conventionally known methods such as IAP
It can be obtained by administering to animals, immunizing them, and separating the serum. In this test container 4, IAP5 in the body fluid and anti-IAP antibody 7 react as shown in FIG. Next, as shown in FIG. 3, the biological substance testing reagent 1 is added. If there is unreacted anti-IAP antibody present, that is, if the amount of IAP is smaller than the anti-IAP antibody injected (Figure 3), an agglutination reaction will occur at the bottom of the test container 4 as shown in Figure 4. The carrier 2 spreads on the bottom surface, and this can be detected from this spread. On the other hand, if there is no unreacted anti-IAP antibody, that is, the injected anti-IAP
When the amount of IAP is greater than that of the antibody, or when the amount is equal, the IAP supported on the carrier 2 gathers in the center of the bottom surface of the test container 4 without causing an agglutination reaction, as shown in FIG. 5, and appears dotted. This can be detected from this. In the present invention, by changing the dilution ratio of serum containing IAP and sequentially injecting anti-IAP antibody and biological material testing reagent for each serum, agglutination reaction does not occur at low dilution ratios, but above a certain dilution ratio, This causes an agglutination reaction. Therefore, by knowing the dilution factor at which the agglutination reaction begins, the concentration of IAP contained in the original serum can be determined. Specific Effects of the Invention According to the testing method using the above-mentioned biological material testing reagent, it is only necessary to detect the dilution ratio when the state changes from a state where no agglutination reaction occurs to a state where an agglutination reaction occurs. The IAP concentration can be detected with high accuracy and no variation. Furthermore, biological substance testing reagents in which the carrier 2 is made of plastic beads or glass beads are stable as commercial products because their quality does not deteriorate economically.
Easy to store. Next, the following examples, which were carried out to confirm the effects of the present invention, will be described. First, a biological material testing reagent used in the present invention was obtained by supporting IAP on a carrier obtained by the following manufacturing method. The IAP here is Matsuda et al. (Medicine History, Volume 102, P.747
This is the so-called immunosuppressive acidic protein reported by (1972). (1) Preparation of carrier A red carrier made of red blood cells and nylon was used. Red blood cells are sheep red blood cells with an average diameter of 7μ and a specific gravity.
It is 1.095. The nylon carrier was prepared by dissolving nylon and phenol red in formic acid to form a homogeneous solution, which was sprayed into a container at 150° C. using a high-pressure sprayer to remove the formic acid, and then washed with water. The obtained plastic beads are red and about 15μ.
It had a diameter of , and a specific gravity of 1.10. (2) Preparation of IAP Ammonium sulfate was added to the supernatant of cancer patient ascites saturated with ammonium sulfate to 60%.
Bring to saturation and centrifuge to obtain a precipitate. This precipitation
It was dissolved in 0.02M acetate buffer (PH4.0), dialyzed against the same buffer, and then the dialyzed solution was equilibrated with the same buffer.
The column was applied to a DEAE-cellulose column (manufactured by Pharmacia Fine Chemicals), washed with the same buffer, and then 0.4M acetate buffer was passed through it. After concentrating the eluate, Sephadex G- equilibrated with PBS
100 column (manufactured by Pharmacia Fine Chemical Co., Ltd.) and collect the eluted second peak.
The concentrated product is subjected to column-type isoelectric focusing at pH 2.5 to 6.0, and fractions with isoelectric points of pH 3.0 to 3.4 are collected and thoroughly dialyzed against PBS. shall be. (3) Loading IAP onto a carrier When the carrier is red blood cells: Add 20 ml of 2.5% glutaraldehyde to 100 ml of 5% sheep red blood cells and stir at room temperature for 2 hours. Processed red blood cells were placed in 0.01M phosphate buffer (PH) containing 0.9% NaCl.
7.5: Wash with PBS), suspend in PBS to a concentration of 5%, add an equal volume of 0.01% tannic acid solution, and incubate at 37℃.
Stir for 10 minutes. Thereafter, after washing with PBS, suspend in PBS to a concentration of 5%, mix 100 ml of this with 100 ml of 0.8% IAP solution, and stir at 37°C for 1 hour. After the reaction, it was washed with PBS and used as a biological material testing reagent. When the carrier is nylon plastic beads, soak the plastic beads in 3.5M hydrochloric acid,
Treat at 45°C for 8 minutes. After washing with distilled water, add 1.25% glutaraldehyde and stir for 40 minutes. After washing the beads with water, add an equal volume of 0.2% IAP solution and leave at 4°C overnight. After this, the beads were washed with PBS to obtain a biological substance testing reagent. Next, a testing method using the biological substance testing reagent thus obtained will be explained. First, the preparation of the anti-IAP antibody to be injected in advance will be described. The IAP obtained by the above-described method is administered to the leg muscle of a rabbit together with Freund's complete adjuvant at a dose of 2 mg five times at two-week intervals, and whole blood is collected one week after the final immunization. Serum components are collected and the γ-globulin fraction is separated by a conventional method. this
DEAE equilibrated with 0.01M phosphate buffer (PH8.0)
- Apply to a cellulose column and collect the flow-through fraction. After concentrating this, Cephadex G-100
It was subjected to gel chromatography, and the first peak was collected and used as an anti-IAP antibody. In the method of the present invention, IAP known concentration solution (100μg/
ml, No.1; 500μg/ml, No.2), normal human serum (No.
3 to No. 5), cancer patient serum (No. 6 to No. 8) and liver cancer patient ascites (No. 9) in PBS containing 2% fetal bovine serum.
After diluting the solution 500 times, 25μ of each solution was added to a 96-well U-bottom microplate. Add 25μ of 0.03% anti-IAP antibody solution to it, shake the plate well, and then add 0.8% IAP antibody solution.
Add 25μ of sensitized red blood cells, shake and leave at room temperature for 2 hours. Thereafter, the tube bottom image, that is, the presence or absence of an agglutination reaction, was observed with the naked eye. The fundus images and the IAP values calculated therefrom are shown in Tables 1 and 2. In this case, similar results were obtained whether the carrier was red blood cells or plastic beads. On the other hand, IAP values were similarly detected for No. 1 to No. 9 using the conventional SRID method. The results are also listed in Table 2.
【表】【table】