JPH0257950A

JPH0257950A - イオン濃度測定用プローブ

Info

Publication number: JPH0257950A
Application number: JP20981188A
Authority: JP
Inventors: Hideki Nakamura; 英樹中村; Hiroshi Sugise; 杉瀬　博司; Tetsuo Asakura; 哲郎朝倉; Masao Kaneko; 正夫金子; Takeshi Shimomura; 猛下村
Original assignee: Terumo Corp; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Terumo Corp; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1988-08-24
Filing date: 1988-08-24
Publication date: 1990-02-27

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は液体又は気体中のイオン濃度を光学的に測定す
るためのプローブに関する。

〔従来の技術〕

微小化、低雑音化などを目的として、従来の電気化学的
イオン濃度測定方法に代わって、光学式のイオン濃度の
測定方法が種々考案された。特に、イオン濃度に対応し
て分光学的性質が変化する螢光体を用いた手法は高感度
とされている。この手法を用いて測定を行うためには、
該螢光体または燐光体を、被験液に溶出しないよう、あ
るマ）　ＩＪフックス固定する。ここでマトリックスは
螢光体または燐光体と測定すべきイオンとの接触を妨げ
ることがなく、かつ螢光体または燐光体のイオン濃度に
対応して分光学的に変化するという性質を著しく妨害す
ることのないよう固定がなされなければならない。以下
に、水素イオン濃度測定方法を例にとって、従来の発明
を列挙すると、■　キャリア膜にセルロースを用いて、
螢光体と共重合可能なモノマーとをセルロースの網目の
中で共重合させて、セルロースと、螢光体とモノマーと
の共重合体とは互いに化学的に結合していない。いわゆ
る相互侵入網目構造をとる方法（米国特許第４．５６８
，５１８号明細書）。

■　セルロースに官能基を形成した物に、共有結合をも
って、螢光体を結合せしめる方法（西独特許第３３４３
６３６号明細書“アナリティカル・ケミストリー”　１
９８２年第５４巻第８２１〜８２３頁、“ＩＥＥＥ　　
）ランスアクションズ・オン・バイオメディカル・エン
ジニアリング、１９８６年第ＢＭＥ−３３巻第１１７〜
１３２頁）。

■　イオン交換膜に、イオン結合をもって、螢光体を結
合せしめる方法（特開昭６０−８６４４９号公報）。

■　シランカップリング剤などを介して、共有結合をも
って、螢光体を光ファイバーなどのガラス面に直接結合
せしめる方法（特開昭６０１０００３７号公報“アナリ
ティカル・サイエンス”、１９８７年第３巻第７〜９頁
）。

などが挙げられる。

上記のようにして、例えば光ファイバーの先端に固定化
した螢光体を被験液と接触させ、励起光を照射し、生じ
る螢光の分光学的特性（螢光強度、螢光スペクトルなど
）を測定する。そして、この測定値と予め求められたｐ
Ｈとの関係がら被験液のｐＨを知るのである。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、このような従来の固定化方法では、以下
のような種々の問題があった。

先ず、■については、作製方法が複雑であった。

また、■及び■では、溶媒に難溶性のセルロースを固定
用担体として用いているため、螢光体を結合した後に多
孔性を失うことなくセルロースを薄膜とするのは不可能
かまたは困難であり、例えば光ファイバーの先端に薄膜
として該セルロース膜を固定するのは容易ではなかった
。次に、■では、手段としては簡単であるが、結合が弱
く強イオン強度下では螢光体が吸着する恐れがあった。

また、薄膜とするのは容易ではなく応答速度が遅かった
。

また、■では、結合は強いが、結合可能な有効な面積が
小さく、十分な螢光強度を得ようとして螢光体の密度を
上げようとすると、かえって螢光強度が低下してしまっ
た（濃度消光）。

本発明は、このような従来の固定化方法を持ったイオン
濃度測定用プローブの問題点に鑑みてなされたものであ
って、作製が容易で、螢光体が、その螢光分光学的特性
を著しく損なうことなく脱着することのない強固な結合
によって固定され、応答速度が速く、十分に強い螢光強
度を有するイオン濃度測定用プローブを提供することに
ある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、螢光体または燐光体がイオン濃度の変化によ
って受ける、螢光分光学的変化を計測することによって
該イオン濃度を測定する光学式イオン濃度測定手段にお
いて、該螢光体または該燐光体がタンパク質と化学的に
結合して担体に被着されてなることを特徴とするイオン
濃度測定用プローブからなる。

ここで言う「螢光分光学的変化」とは、螢光体または燐
光体の発光強度、励起スペクトル（光吸収スペクトルに
対応）、発光スペクトルなどのいわゆる螢光分光学的特
性の変化である。

ここで言うタンパク質はいわゆる生体由来のもの、また
は人造のいわゆる合成タンパク質も含む。

望ましくは、前記のタンパク質は綱フィブロインからな
る。

また、望ましくは、同じく前記のタンパク質はコラーゲ
ンからなる。

螢光体または燐光体の中には、周囲のイオン濃度に対応
してその螢光分光学的特性が可逆的に変化するものがあ
り、該特性の変化を知ることによって該イオン濃度を計
測することは既に衆知の技術である。

既に多くの種類の螢光体について、ｐＨ感応性が見いだ
されている。例えば、ピラニン（１−ヒドロキシピレン
−３，，６，８−１−リスルホン酸ナトリウム塩）、β
−メチルウンベリフェロン（７−ヒドロキシ−４−メチ
ルクマリン）、フルオしセインアミンなどがある。これ
らの螢光体の性質は多くの文献等〔（フレゼニウス・ツ
ァイトシュリフト・フィル・アナリティッシエ・ヘミ−
（ＦｒｅｓｅｎｉｕｓＺｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ　　ｆｌ
、ｆｒ　　八ｎａｌｙｔｉｓｃｈｅ　　Ｃｈｅｍｉｅ）
、１９８３年第３１４巻第１１９〜１２４頁、他〕に詳
しく記載されている。キノリン−８−オール・スルホネ
ートは、それ自体は無螢光性であるが、アルミニウム（
Ｉ［）　、マグネシウム（ＩＩ）　、亜鉛（ＩＩ）など
の金属イオンと配位結合すると螢光を発する（ＣＲＣク
リティカル・レビューズ・イン・アナリティカル・ケミ
スト！Ｊ−１９８０年第８巻第３６７頁）。

また、タンパク質の標識として螢光体による化学修飾が
よく行われている。

発明者らは、鋭意検討の結果、上記のようなイオン濃度
感応性の螢光体または燐光体をタンパク質に化学結合し
、担体に被着されてなるイオン濃度測定用プローブは、
作製が容易で、その螢光分光学的特性を著しく損なうこ
となく脱着することのない強固な結合によって螢光体が
固定され、応答速度が速く、十分に強い螢光強度を有す
るものであることを見いだした。

作製に当っては、タンパク質の官能基との間での化学結
合が容易なように、螢光体は予め何らかの化学修飾を受
けていることが望ましいが、必ずしもその必要はない。

望ましいことに、タンパク質はその分子の側鎖にはアミ
ノ基、チオール基、水酸基などの官能基を多く持つので
、螢光体をスルホアミド結合、チオエステル結合、アミ
ド結合、エステル結合などの結合形態により化学結合す
ることは、比較的容易である。また、これらの結合形態
の中から、それぞれの螢光体とタンパク質に最も適した
ものを選択することができる。

タンパク質は多くの群から選択することができるが、成
膜性の良さ、不溶化のし易さから、絹フィブロインまた
はコラーゲンが望ましい。すなわち、両者とも不溶性の
形態をとりうるものであり、その水溶液から容易に所望
する形状の成膜が可能である。また、更に望ましいこと
に、螢光体との化学結合の操作においても変性すること
がない。

螢光体を固定化したタンパク質が直接的に被験液に接触
する場合はタンパク質の不溶化が必要である。絹フィブ
ロインにあっては、加熱、メタノール処理などによって
いわゆるβ化により水に不溶となる。また、コラーゲン
はインシアネート化合物、カルボジイミド化合物などに
より、架橋を行うことが容易であり、不溶化ができる。

被験液とタンパク質が、例えば半透膜などを介して直接
的に接触していない場合は、タンパク質の不溶化は特に
は必要ない。タンパク質の不溶化は、螢光体との化学結
合操作の前に行っても、後に行っても構わない。

このようにして螢光体を固定化したタンパク質を、担体
として、例えば光ファイバーの先端に固着させ、被験液
に浸漬して、適当な波長の励起光を該光ファイバーを通
して送り、発する螢光の強度、スペクトルなどを測定す
ることによって、被験液のイオン濃度を知ることができ
るのである。

即ち、遠隔測定、センサーカテーテルとしての血管内測
定などには、光ファイバーの使用が有効であり、螢光体
を結合させた／または結合させていないタンパク質を光
ファイバーの先端に固着することができる。本発明にお
いては、該タンパク質は水溶液の形態を取りうるので、
微細な光ファイバーの先端に容易に薄膜を形成しろるの
である。

該タンパク質と被験液との間に半透膜、イオン交換膜な
どを必要に応じて介在させることもできる。

励起光と螢光とを同一の光フアイバー内に通すこともで
きる。

光ファイバーとしては、プラスチック製（例えばＰＭＭ
Ａ）　、石英製のものを用いることができる。

投する励起光は、一般にはキセノンランプ、超高圧水銀
灯、ハロゲンランプ、タングステンランプなどのいわゆ
る連続スペクトル光源からの光を、干渉フィルター、モ
ノクロメータなどに通して、いわゆる単色成分を取り出
すことによって作り出せるが、レーザーなどの単色性の
光源を使用することもできる。励起光の波長成分は複数
でも構わない。また、時間的に連続した光でも、パルス
光でも構わない。

螢光は、通常は干渉フィルター、モノクロメータなどで
螢光成分だけとされてから、光電子増倍管、フォトダイ
オードなどの光電変換素子によって電気信号に変換され
、計測される。励起光強度を測定して、螢光強度の参照
信号とすることもできる。

また、本発明のイオン濃度測定用プローブ、特にｐＨ測
定用プローブは重炭酸水溶液及び気体透過膜などとの併
用によってｐ　ＣＯ２測定用プローブにも応用できる。

更には、酵素を使ったセンサー（例えば、ペニシリナー
ゼと本発明のｐＨ測測定ズブローブとの併用によるペニ
シリンセンサー）などにも応用できる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を図面を参照して具体的に説明す
る。

実施例１ピラニン（コダック社製試薬）を先ず、ＤＭＳＯ（ジメ
チルスルホキシド）中で、酢酸ナトリウムの触媒下で２
倍量の無水酢酸によって水酸基をアセトキシ化した。

精製、乾燥を施し、赤外吸収スペクトル、紫外吸収スペ
クトルによって、アセトキシ基（ＣＨ。

Ｃｏｏ−）の存在、水酸基の消滅を確認した。次に、タ
ンパク質との化学結合を容易にすべく、四塩化炭素中、
還流下で、約５倍量の五塩化燐によってスルホン酸基を
塩化スルホニル化した。精製、乾燥を施し、赤外吸収ス
ペクトルによって塩化スルホニル基（−３Ｏ２１）の存
在を確認した。

このようにして、化学修飾したピラニンのアセトン溶液
を５％絹フィブロイン水溶液に加え、弱アルカリとして
冷却下で反応させた。水溶液は赤く変色した。該水溶液
を水で透析し、未反応のピラニン（緑色）を除去した。

透析後の絹フイブロイン水溶液を濃縮後、平滑なテフロ
ン製の板上でキャスト法によって成膜した。液膜にメタ
ノール水溶液を注ぎ、水不溶化した。アルカリ処理によ
ってアセトキシ基を水酸基に戻した。

このようにして作製したピラニンを化学結合した絹フイ
ブロイン膜を、螢光分光光度計（日立製作新製、Ｆ−４
０００）内におかれた螢光セルに、励起光とのなす角が
４５度となるようにセットし、セル内の燐酸緩衝液のｐ
Ｈと波長５４８ｎｍでの螢光強度との関係を求めたとこ
ろ、第１図のようになり、ｐＨ測定用プローブができた
。

実施例２実施例１と同様にして作製した化学修飾を施したピラニ
ンのアセトン溶液を、０．０３％コラーゲン溶液に滴下
し、弱アルカリとして冷却下で反応させた。以下、実施
例１と同様にして透析、成膜した。液膜をヘキサメチレ
ンジイソシアネートのエタノール溶液中に浸漬し架橋し
た。アルカリ処理によってアセトキシ基を水酸基に戻し
た。

このようして作製したピラニンを化学結合したコラーゲ
ン膜を、両端をカミソリ刃で切断したプラスチック製光
ファイバー（長さ２ｍｓ三菱レーヨン製５）Ｉ２００１
）の片端に第２図の様に取り付けｐＨ測定用プローブと
した。該光ファイバーのもう一方の端を第３図の光学式
測定装置に結合させ、励起波長４８１０ｍ、螢光測定波
長５４５ｎｍにおいて、第４図のようなｐＨと螢光強度
との関係が得られた。ｐＨ５，３４から８への９０％応
答速度は２０秒以下と非常に速かった。

〔発明の効果〕

本発明のイオン濃度測定用プローブは、下記に示すよう
な効果を得ることができる。

（１）螢光体のタンパク質への直接的な化学結合により
強固な固定が可能となる。

（２）光フアイバー先端への固定が容易である。

（３）薄膜形成が容易にできる。

（４）応答速度が速い。

（５）生体適合性が期待できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例１におけるｐＨと螢光強度との
関係、第２図は実施例２におけるｐＨ測定用プローブの
一断面図（概略図）、第３図は実施例２における光学式
測定装置の概略図であり、第４図は実施例２におけるｐ
Ｈと螢光強度との関係である。１・・・・螢光体を固定化したコラーゲン膜、２・・・
・光ファイバーのコア、３・・・・光ファイバーのクラッド、４ａ・・・・キセノンランプ、　　　４ｂ・・・・電源
、５・・・・コンデンサーレンズ、　　　６・・・・絞
す、７・・・・熱線吸収フィルター８・・・・ピンホール、９・・・・コリメータレンズ、１０・・・・紫外線吸収フィルタ１１・・・・干渉フィルター　１２・・・・平凸レンズ
、３・・・・二色性鏡（グイクロイック・ミラー）、４
・・・・光フアイバーカップラ及び対物レンズ、５・・
・・光ファイバー６・・・・カットフィルター７・・・・モノクロメータ、８・・・・光電子増倍管、　　１９・・・・高圧電源、
０・・・・プリアンプ用電源、２１・・・・記録計。第１図第２図ｎ第３図Ｈ

Claims

【特許請求の範囲】

（１）螢光体または燐光体がイオン濃度の変化によって
受ける、螢光分光学的変化を計測することによって該イ
オン濃度を測定する光学式イオン濃度測定手段において
、該螢光体または該燐光体がタンパク質と化学的に結合
して担体に被着されてなることを特徴とするイオン濃度
測定用プローブ。
（２）タンパク質が絹フィブロインである請求項（１）
記載のイオン濃度測定用プローブ。
（３）タンパク質がコラーゲンである請求項（１）記載
のイオン濃度測定用プローブ。