【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
〔技術分野〕
本発明は、新規なアミラーゼによるマルトース
の製造方法に関するものである。
〔従来技術〕
現在、マルトースは液化澱粉に植物、バシルス
起源のβ−アミラーゼを作用させるか、あるいは
アルペルギルス（Aspergillus）属などの微生物
の生産する糖化型α−アミラーゼを作用させるこ
とにより製造されている。これらの酵素はアミロ
ペクチンのα−１，６−グルコシド結合は分解す
ることができないため、アミロペクチンやこれを
含む液化澱粉からのマルトースの収量は、通常50
〜60％である。そして、これ以上に収量よくマル
トースを得るためには、α−１，６−グルコシド
結合を分解する、プルラナーゼやイソアミラーゼ
などのα−１，６−グルコシダーゼが併用され
る。
〔目的〕
本発明者は、澱粉からマルトースを特異的に生
成する新規なアミラーゼを求めて微生物の検索を
行つてきた結果、バシルス・メガテリウム
（Bacilus megaterium）と固定した細菌が澱粉
をその非還元性未端からマルトース単位で切断
し、α−マルトースを生成する新規なアミラーゼ
を生成することを認め、この酵素をアミラーゼ
G2と命名した。
本酵素と従来、マルトースを特異的に生成する
酵素として知られているβ−アミラーゼとの比較
は第１表に示す通りである。
両酵素の最も大きな違いは、β−アミラーゼが
β−マルトースを生成する加水分解を行うのに対
し、アミラーゼG2はα−マルトースを生成する
加水分解を行うことである。この切断様式の違い
のため、アミラーゼG2によりアミロペクチンま
たはこれを含む澱粉の糖化を行うとき、β−アミ
ラーゼに比べて２〜３％マルトース収量が高くな
ることがわかつた。しかし、この酵素はアミロペ
クチンのα−１，６−グルコシド結合を分解する
ことはできないため、澱粉からのマルトースの収
量は60％前後である。そして、これ以上に高い収
量でマルトースを得るためには、アミロペクチン
のα−１，６−グルコシド結合を分解するイソア
ミラーゼやプルラナーゼと併用する必要があつ
た。しかるに、本発明者は、先に発明した澱粉か
らマルトテトラオースを特異的に生成する新規な
アミラーゼG4（特許出願中）をアミラーゼG2と
併用して用いるとき、澱粉から70％以上の収量で
マルトースが得られることを認めた。本発明は、
この知見に基づいてなされたものである。
[Technical Field] The present invention relates to a method for producing maltose using a novel amylase. [Prior art] Currently, maltose is produced by reacting liquefied starch with β-amylase derived from plants or Bacillus, or with saccharifying α-amylase produced by microorganisms such as Aspergillus. . These enzymes cannot break down the α-1,6-glucoside bond in amylopectin, so the yield of maltose from amylopectin or liquefied starch containing it is usually 50%
~60%. In order to obtain maltose in even higher yields, α-1,6-glucosidase such as pullulanase or isoamylase, which decomposes α-1,6-glucosidic bonds, is used in combination. [Purpose] The present inventor has searched microorganisms for a new amylase that specifically produces maltose from starch, and found that bacteria immobilized with Bacillus megaterium convert starch into its non-reducing property. It was recognized that a new amylase is produced that cleaves the maltose unit from the terminal end to produce α-maltose, and this enzyme was called amylase.
It was named G2. Table 1 shows a comparison between this enzyme and β-amylase, which is conventionally known as an enzyme that specifically produces maltose. The biggest difference between the two enzymes is that β-amylase performs hydrolysis to generate β-maltose, whereas amylase G2 performs hydrolysis to generate α-maltose. Due to this difference in cleavage mode, it was found that when amylase G2 is used to saccharify amylopectin or starch containing it, the yield of maltose is 2 to 3% higher than when using β-amylase. However, this enzyme cannot break down the α-1,6-glucoside bond of amylopectin, so the yield of maltose from starch is around 60%. In order to obtain maltose in a higher yield than this, it was necessary to use it in combination with isoamylase or pullulanase, which decompose the α-1,6-glucoside bonds of amylopectin. However, the present inventor has discovered that when using the previously invented novel amylase G4 (patent pending), which specifically produces maltotetraose from starch, in combination with amylase G2, maltose can be produced from starch with a yield of 70% or more. acknowledged that it can be obtained. The present invention
This was done based on this knowledge.
〔構成〕〔composition〕
本発明は、澱粉又はその派生物である液化澱粉
に、バシルス属細菌の生産するアミラーゼG2と
アミラーゼG4を作用させることを特徴とするマ
ルトースの製造方法に関するものである。
以下に、本発明の詳細を説明する。
先ず、本発明において使用されるアミラーゼ
G2とアミラーゼG4の酵素的性質を記載する。
(A) アミラーゼG2の酵素的性質
(1) 作用；アミロース、アミロペクチン、グリ
コーゲンのα−１，４−グルコシド結合を、
その非還元性未満からマルトース単位で加水
分解する。生成糖はα−マルトースであるこ
とからα−アミラーゼの一種と考えられる
が、エンド型の分解作用を示さず、アミロペ
クチン、グリコーゲンからはリミツトデキス
トリンを残す。サイクロデキストリンを分解
せず、またマルトトリオースの分解力も弱
い。生成糖がα−型であることを除けば、植
物や細菌のβ−アミラーゼに似ているが、ア
ミロペクチンやこれを含む澱粉に対する分解
限度は２〜３％高い。
(2) 作用温度範囲及び最適温度；１％可溶性澱
粉、0.05Mリン酸緩衝液の下で作用させたと
き、約75℃まで作用し、最適温度は約60℃で
ある（第１図ａ）。
(3) 作用PH範囲及び最適PH；約３〜約11の広い
PH範囲に作用する。最適PHは約７〜7.5であ
る（0.05Mリン酸緩衝液、１％可溶性澱粉の
下で作用、（第１図ｂ）。
(4) 熱安定性；0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）
の下で加熱した場合、50℃、10分間の加熱ま
では失活が認められない。60℃10分間の加熱
で約10％失活し、65℃10分間の加熱で約70％
失活し、そして、60℃10分間の加熱で90％以
上失活した（第１図ｃ）。
(5) PH安定性；0.1M緩衝液の下、室温（30℃）
で３時間放置後、残存活性を測定した。その
結果、PH4.5〜８の範囲で安定であつた（第
１図ｄ）。
(6) 安定化；カルシウムイオンによる熱安定性
の増加は認められなかつた。
(7) 阻害剤；本酵素は、１×10-3MのHgCl2、
AgNO3、CuSO4、NiSO4により、それぞれ
約85％、約75％、約70％、約60％阻害され
た。また、１×10-3Mのｐ−クロロマーキユ
リベンゾエートにより約70％阻害された。
(8) 精製方法；本酵素は、液体培養液の上澄か
ら、硫安分画、DEAE−セフアロースカラム
クロマトグラフイー、同カラムによる再クロ
マトグラフイーとバイオゲルA0.5ｍによる
カラムクロマトグラフイーにより、デイスク
電気泳動的に均一まで精製することができ
る。
(9) 分子量；セフアデツクスＧ−200により測
定した分子量は約60000であつた。
(10) 力価測定法；0.1Mリン酸緩衝液に溶解さ
せた２％可溶性澱粉0.5mlに、適量の酵素を
加え、水で全量１mlとし、40℃で反応させ
る。この条件で、１分間に1μモルのグルコ
ースに相当する還元力を生成する酵素量を１
単位とした。
以上の酵素的性質について、従来、知られて
いる植物起源のβ−アミラーゼ及びバシルス属
のβ−アミラーゼはβ−マルトースのみを生成
するのに対し、アミラーゼG2はα−マルトー
スのみを生成する。バシルス ステアロサーモ
フイラス（Bacillus stearothermophilus）の
アミラーゼはアミラーゼG2と同様に、α−マ
ルトースを生成するが、反応初期には、マルト
テトラオースやマルトトリオース、及び微量の
マルトヘキサオースやマルトペンタオースを生
成すると報告されている。従つて、これら酵素
はアミラーゼG2とは本質的に異なつた酵素と
いうことができる。また、最適PH、最適温度、
分子量などの性質においても差が認めらること
から、アミラーゼG2は新規な酵素ということ
ができる。
(B) アミラーゼG4の酵素的性質
(1) 作用；アミロース、アミロペクチン、グリ
コーゲンなどのα−グルカンをマルトテトラ
オースを主成分とする分解物に分解する。本
酵素はエンド型の分解様式を持つα−アミラ
ーゼの一種であり、液化澱粉に作用すると
き、約65〜75％の収量でマルトテトラオース
が得られる。
(2) 作用温度範囲及び最適温度；１％可溶性澱
粉、0.05Mリン酸緩衝液の下で作用させたと
き、約75℃まで作用し、最適温度は約50℃で
ある（第２図ａ）。
(3) 作用PH範囲及び最適PH；約４〜約12の広い
範囲に作用する。最適作用PHは約６〜8.5で
ある（0.05M酢酸またはリン酸緩衝液、１％
可溶性澱粉の下で作用、（第２図ｂ）。
(4) 熱安定性；0.1Mトリス緩衝液（PH7.0）の
下で加熱した場合、50℃、10分間の加熱で約
40％失活し、55℃、10分間の加熱で約85％失
活した〔第２図ｃ〕。
(5) PH安定性；0.1M緩衝液の下で、室温（25
℃）で３時間放置後、残存活性を測定した。
その結果、PH６〜９の範囲で安定であつた
〔第２図ｄ）。
(6) 安定化；カルシウムイオンが存在すると
き、熱安定性の増加は認められた〔第２図ｃ
の破線〕。
(7) 阻害剤；本酵素は、５×10-3MのHgCl2、
CuSO4、ZnSo4、AgNO3、により、それぞ
れ約100％、約95％、約50％、約30％阻害さ
れた。
(8) 精製方法；本酵素は、液体培養物の遠心上
澄液から、硫安分画、DEAE−セフアロース
（Sepharose）カラムクロマトグラフイーと
バイオゲル（Biogel）、A0.5ｍカラムクロマ
トグラフイー及び同ゲルによる再クロマトグ
ラフイーにより、電気泳動的に均一まで精製
することができる。
(9) 分子量；バイオゲル（Biogel）A0.5ｍを
用いたゲル濾過法により測定した分子量は約
１万であつた。
(10) 力価測定法；0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
に溶解させた２％可溶性澱粉0.5mlに、適量
の酵素を加え、水で全量１mlとし、40℃で反
応させる。この条件で、１分間に1μモルの
グルコースに相当する還元力を生成する酵素
量を１単位とした。
以上の酵素的性質について、シユードモナス
スツツツエリのマルトテトラオース生成アミラ
ーゼと比較すると(1)最適作用PHは、アミラーゼ
G4はPH６〜8.5の広いPH範囲にあるのに対し、
シユードモナス スツツツエリの酵素はPH８付
近にあること、(2)アミラーゼG4を澱粉に作用
させたとき、約65〜70％の収量でマルトテトラ
オースを得られるのに対し、シユードモナナ
スツツツエリの酵素の場合は約55％であるこ
と、(3)アミラーゼG4の分子量は１万前後にあ
るのに対し、シユードモナス スツツツエリの
酵素は、48000と58000にある〔バイオケミスト
リーアンドバイオフイジツクス アクタ
（Biochemistry and Biophysics Acta）566
巻、88頁（1979）〕など、アミラーゼG4とシユ
ードモナス スツツツエリの酵素とは、澱粉か
らのマルトテトラオースの収量、最適作用PH、
分子量などの性質において顕著な違いのあるも
のであり、新規な酵素ということができる。
アミラーゼG2を生産する例示菌としては、バ
シルス メガテリウム（Bacillus megaterium）
Ｇ−２を挙げる。この菌株は微工研菌寄第7978号
として、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。また、アミラーゼG4を生産する例
示菌として、バシルス サーキユランス
（Bacillus circilans）G4を挙げる。この菌株は微
工研菌寄第820号として、微生物工業技術研究所
に寄託されている。これら微生物の菌学的性質は
下記に示す通りである。
(A) アミラーゼG2生産菌の菌学的性質
(1) 形態；巾0.7〜1.3×2.4〜5.0μ、通常２個以
上連なり、短鎖状に生成する。グラム陰性。
(2) 胞子；両末端近くに２個。胞子をもつ細胞
のふくらみは殆んど認められない。
(3) 生育；好気的に生育。嫌気下では殆もど生
育は認められない。
(4) 肉汁；混濁、沈降する。
(5) 肉汁寒天；生育良好、表面なめらか、淡褐
色を示すが、色素の生成なし。
(6) グルコース肉汁寒天；肉汁培地よりよく生
育する。
(7) グルコース硝酸塩寒天；よく生育する。表
面なめらか。淡褐色を示す。
(8) チロシン寒天；褐色色素を生成する。
(9) グルコース・アスパラギン寒天；かなりよ
く生育する。
(10) ポテト；生育良好、表面なめらかで、淡褐
色を示す。培地中に褐色色素を生成する。
(11) クエン酸の利用；陽性。
(12) 澱粉の加水分解；陽性。
(13) アセチルメチルカルビノール；生成しな
い。
(14) ゼラチン：分解する。
(15) ミルク；凝固し、ペプトン化する。
(16) 硝酸塩の還元；陽性。
(17) カタラーゼ；陽性。
(18) 炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−
フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マン
ノース、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｌ
−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マン
ニトール、Ｄ−ソルビトール、マルトース、
蔗糖などを利用し、いずれもガスを生成する
ことなく生酸する。
(19) 最適生育温度；40℃前後。
(20) 最高生育温度；約50℃。
(21) 死滅温度；100℃、20分間の加熱でも死
滅しない。
以上の菌学的性質について、バージエイス
マニユアル オブ デタミネーテイブ バクテ
リオロジー（Bergey′sMannual of
Determinative Bacteriology）の第７版及び
第８版（ザ ウイリアムス アンド ウイルキ
ンス カンパニー（The Williams and
Wilkins Company）、1957年及び1974年）を参
照し、本菌をバシルス メガテリウム
（Bacillusmegaterium）の菌株と同定するのが
適当と考えられ、本菌株をバシルス メガテリ
ウムＧ−２と命名した。
(B) アミラーゼG4生産菌の菌学的性質
(1) 形態；桿菌、0.5〜１×５〜6μ、運動性な
し、グラム陰性。
(2) 胞子；通常、未端近くに１個、胞子嚢のふ
くらみは認められない。
(3) 肉汁；混濁、沈降する。
(4) 肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐色、周辺
及び表面凹凸あり。
(5) グルコース肉汁寒寒天；生育良好、淡黄〜
淡褐色。
(6) グルコース硝酸寒天；生育悪い。
(7) ポテト；生育良好、乳白色に生育。
(8) グルコース・アスパラギン寒天；生育あま
り良くない。淡黄〜黄褐色。
(9) チロシン寒天；良く生育する、わずかに褐
色。
(10) ミルク；ゆつくり凝固、ペプトン化。
(11) インドール；生成しない。
(12) カタラーゼ；生成する。
(13) アセチルメチルカルビノール；生成しな
い。
(14) 硫化水素；生成しない。
(15) クエン酸；利用する。
(16) 硝酸塩の還元；陰性。
(17) クエン酸；利用する。
(18) 食塩肉汁；８％食塩含有培地までよく生
育し10％食塩でも少し生育する。
(19) 炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−
フラクトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アラビ
ノース、Ｄ−リボース、マルトース、シユー
クロス、澱粉などから酸を生成するが、ガス
の生成はない。Ｄ−キシロース、Ｌ−ラムノ
ース、Ｌ−ソルボースの利用性は良くない。
(20) 最適生育温度；26℃前後。
(21) 最高生育温度；約60℃
(22) 死滅温度；100℃、で30分間加熱しても
死滅しない。
以上の菌学的性質について、バージエイス
マニユアル オブ デタミネーテイブ バクテ
リオロジー（Bergey′s Mamnual of
Determinative Bacteriology）の第７版及び
第８版〔ザ ウイリアムス アンド ウイルキ
ンス カンパニー（The Williams and
Wilking Company）〕、（1957年及び1974年）
を参照し、本菌をバシルス サーキユランス
（Bacillus circulans）の一種と同定し、バシル
ス サーキユランスＧ−４と命名した。
アミラーゼG2及びアミラーゼG4を生産するた
めの培養は、通常、液体培地により通気、撹拌培
養より行われる。培地の窒素源としては、肉エキ
ス、ペプトン、酵母エキス、カゼイン、コーン
ステイープ リカー、大豆粕など、通常、微生物
の培養に際し、よく用いられる有機窒素源、及び
これに補足する窒素源として、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、硝酸塩などの無機窒素
源が用いられる。炭素源としては、澱粉、デキス
トリン、マルトース、グルコース、シユークロス
などが使用される。培養は、PH５〜９、温度20〜
60℃で好気的に行われる。
アミラーゼG2及びG4は、いずれも菌体外に生
産される酵母であるので、培養終了後、濾過また
は遠心分離により除菌し、上澄液を回収する。
培養上澄液は、必要により濃縮し、硫酸アンモ
ニウム、硫酸ナトリウムによる塩析によるか、ま
たは、アセトン、イソプロパノール、エタノー
ル、メタノールなどの有機溶剤を加えて、酵素を
沈澱物として収得し、乾燥、保存する。
アミラーゼG2及びアミラーゼG4を組合せて行
う澱粉の糖化反応は、次のようにして行う。
澱粉は、通常、あらかじめ酸または液化型α−
アミラーゼにより液化される。液化度はマルトー
スの収量に影響し、なるべく低DEであることが
望ましい。通常、DE5以下の液化澱粉が使用され
る。基質濃度は、通常５〜40％で行われ、反応
は、通常PH５〜８、温度は40℃〜60℃で行われ
る。アミラーゼG4はカルシウムイオンの存在に
より熱安定化されるので、糖化に際し、通常５×
10-4〜２×10-2M程度のカルシウム塩が添加され
る。
アミラーゼG2とアミラーゼG4は同時に澱粉に
作用させるのが望ましいが、あらかじめ、アミラ
ーゼG2で糖化し、反応途中でアミラーゼG4を添
加して反応を継続するか、あるいは、最初、アミ
ラーゼG4で反応を開始し、次いでアミラーゼG2
を添加して反応を行なう。
次に、実施例により、本発明の詳細を説明す
る。
実施例 １
(1) アミラーゼG2の生産
大豆タンパク２％、米ヌカ２％、
K2HPO40.3％、MgSO4・7H2O0.1％、可溶性
澱粉２％、CaCl21×10-3M、MnCl21×10-4M、
CuSO42.5×10-5M、FeCl22.5×10-5M、ラウリ
ル硫酸ナトリウム2.5×10-2％からなる培地
（PH7.0）30mlを200ml容三角フラスコに入れ、
120℃で15分間殺菌後、バシルス メガテリウ
ム（微工研菌寄第7978号）を接種し、30℃で３
日間振盤培養（160rpm）した。培養後、遠心
分離して得た上澄液について、生産されたアミ
ラーゼG2活性を測定した結果、培地１ml当り、
9.0単位であつた。
(2) アミラーゼG4の生産
ポリペプトン１％、リン酸２カリ0.3％、硫
酸マグネシウム（７水塩）0.1％、可溶性澱粉
１％からなる培地30mlを200容三角フラスコ
に入れ、120℃で10分殺菌したのち、バチルス
サーキユランスG4（微工研条寄第820号）を
接種し、30℃で４日間振盤培養（160rpm）し
た。
培養後、遠心分離して得た上澄液について、
生産されたアミラーゼG4を測定した結果、培
地１ml当り、6.4単位であつた。
バシルス・ズブチルスのα−アミラーゼを用い
て、常法により液化した、DE4.2のポテト液化澱
粉１ｇ（固形分として）に、アミラーゼG4を４
単位、又は／及びアミラーゼG2を４単位、
CaCl25×10-3M量を加え、水で全量10mlとし、PH
７付近、50℃で20時間反応を行つた。反応後、糖
化糖中の糖組成を液体クロマトグラフイ法により
測量した。得られた結果は第２表に示す通りであ
つた。
The present invention relates to a method for producing maltose, which is characterized by allowing amylase G2 and amylase G4 produced by Bacillus bacteria to act on starch or liquefied starch, which is a derivative thereof. The details of the present invention will be explained below. First, the amylase used in the present invention
Describe the enzymatic properties of G2 and amylase G4. (A) Enzymatic properties of amylase G2 (1) Action;
It hydrolyzes maltose units from less than its non-reducing capacity. Since the sugar produced is α-maltose, it is considered to be a type of α-amylase, but it does not show endo-type degrading action and leaves limit dextrin from amylopectin and glycogen. It does not decompose cyclodextrin, and its ability to decompose maltotriose is weak. It is similar to plant and bacterial β-amylases, except that the sugar produced is α-type, but its decomposition limit for amylopectin and starches containing it is 2 to 3% higher. (2) Action temperature range and optimum temperature: When allowed to act under 1% soluble starch and 0.05M phosphate buffer, it acts up to about 75°C, and the optimum temperature is about 60°C (Figure 1a). . (3) Effective PH range and optimal PH; wide range from about 3 to about 11
Acts on the PH range. The optimum pH is about 7-7.5 (works under 0.05M phosphate buffer, 1% soluble starch (Figure 1b)). (4) Thermal stability: 0.05M Tris buffer (PH7.0)
When heated at 50°C for 10 minutes, no deactivation is observed. Approximately 10% is inactivated by heating at 60°C for 10 minutes, and approximately 70% by heating at 65°C for 10 minutes.
The activity was inactivated, and more than 90% of the activity was lost by heating at 60°C for 10 minutes (Fig. 1c). (5) PH stability: under 0.1M buffer, room temperature (30℃)
After standing for 3 hours, residual activity was measured. As a result, it was stable in the pH range of 4.5 to 8 (Fig. 1d). (6) Stabilization: No increase in thermal stability due to calcium ions was observed. (7) Inhibitor: This enzyme is treated with 1×10 -3 M HgCl 2 ,
It was inhibited by about 85%, about 75%, about 70%, and about 60% by AgNO 3 , CuSO 4 , and NiSO 4 , respectively. Furthermore, it was inhibited by about 70% by 1×10 −3 M p-chloromercury benzoate. (8) Purification method: This enzyme was purified from the supernatant of the liquid culture by ammonium sulfate fractionation, DEAE-Sepharose column chromatography, re-chromatography using the same column, and column chromatography using Biogel A0.5m. It can be purified to homogeneity by disk electrophoresis. (9) Molecular weight: The molecular weight measured by Cephadex G-200 was about 60,000. (10) Titer measurement method: Add an appropriate amount of enzyme to 0.5 ml of 2% soluble starch dissolved in 0.1 M phosphate buffer, make the total volume 1 ml with water, and react at 40°C. Under these conditions, the amount of enzyme that produces a reducing power equivalent to 1 μmol of glucose per minute is 1
unit. Regarding the enzymatic properties described above, conventionally known plant-derived β-amylases and Bacillus β-amylases produce only β-maltose, whereas amylase G2 produces only α-maltose. Bacillus stearothermophilus amylase produces α-maltose like amylase G2, but in the early stage of the reaction it produces maltotetraose, maltotriose, and trace amounts of maltohexaose and maltopentaose. It is reported that it generates Therefore, these enzymes can be said to be essentially different enzymes from amylase G2. In addition, optimal PH, optimal temperature,
Since there are differences in properties such as molecular weight, amylase G2 can be considered a new enzyme. (B) Enzymatic properties of amylase G4 (1) Action: Decomposes α-glucans such as amylose, amylopectin, and glycogen into decomposition products whose main component is maltotetraose. This enzyme is a type of α-amylase that has an endo-type decomposition mode, and when it acts on liquefied starch, maltotetraose can be obtained with a yield of about 65-75%. (2) Action temperature range and optimum temperature: When allowed to act under 1% soluble starch and 0.05M phosphate buffer, it acts up to about 75°C, and the optimum temperature is about 50°C (Figure 2 a). . (3) Effective PH range and optimum PH: Acts over a wide range of about 4 to about 12. Optimal working pH is approximately 6-8.5 (0.05M acetic acid or phosphate buffer, 1%
Acts under soluble starch (Fig. 2b). (4) Thermal stability: When heated under 0.1M Tris buffer (PH7.0), heating at 50℃ for 10 minutes will result in approximately
The activity was inactivated by 40%, and about 85% was inactivated by heating at 55°C for 10 minutes [Figure 2c]. (5) PH stability; under 0.1M buffer at room temperature (25
℃) for 3 hours, residual activity was measured.
As a result, it was stable in the pH range of 6 to 9 [Fig. 2 d). (6) Stabilization: When calcium ions were present, an increase in thermal stability was observed [Figure 2c
dashed line]. (7) Inhibitor: This enzyme is treated with 5×10 -3 M HgCl 2 ,
It was inhibited by about 100%, about 95%, about 50%, and about 30% by CuSO 4 , ZnSo 4 , and AgNO 3 , respectively. (8) Purification method: This enzyme is purified from the centrifugal supernatant of liquid culture by ammonium sulfate fractionation, DEAE-Sepharose column chromatography and Biogel, A0.5m column chromatography and the same gel. can be electrophoretically purified to homogeneity by rechromatography. (9) Molecular weight: The molecular weight measured by gel filtration using Biogel A0.5m was approximately 10,000. (10) Titer measurement method; 0.1M phosphate buffer (PH7.0)
Add an appropriate amount of enzyme to 0.5 ml of 2% soluble starch dissolved in water, make a total volume of 1 ml with water, and react at 40°C. Under these conditions, the amount of enzyme that produced a reducing power equivalent to 1 μmol of glucose per minute was defined as 1 unit. Regarding the above enzymatic properties, when compared with the maltotetraose-producing amylase of Pseudomonas stutzeri, (1) the optimal action pH is
Whereas G4 has a wide PH range of PH6 to 8.5,
(2) When amylase G4 is applied to starch, maltotetraose can be obtained with a yield of approximately 65-70%;
(3) The molecular weight of amylase G4 is around 10,000, while the molecular weight of the Pseudomonas stutstueri enzyme is around 48,000 and 58,000 [Biochemistry and Biophysics Acta (Biochemistry and Biophysics Acta) 566
vol., p. 88 (1979)], amylase G4 and the Pseudomonas stutzeri enzyme are related to the yield of maltotetraose from starch, the optimal action pH,
There are significant differences in properties such as molecular weight, and it can be said to be a new enzyme. An example of a bacterium that produces amylase G2 is Bacillus megaterium.
Let me mention G-2. This strain has been deposited with the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology as Microbiological Research Institute No. 7978. In addition, Bacillus circilans G4 is cited as an exemplary bacterium that produces amylase G4. This strain has been deposited at the Institute of Microbial Technology as Microbiological Research Institute No. 820. The mycological properties of these microorganisms are shown below. (A) Mycological properties of amylase G2-producing bacteria (1) Morphology: Width: 0.7-1.3 x 2.4-5.0μ, usually two or more are connected and produced in short chain form. Gram negative. (2) Spores; 2 near each end. Swelling of cells containing spores is hardly observed. (3) Growth; aerobically grown. Almost no growth is observed under anaerobic conditions. (4) Meat juice; cloudy and sediment. (5) Meat juice agar: Good growth, smooth surface, light brown color, but no pigment formation. (6) Glucose broth agar; grows better than broth medium. (7) Glucose nitrate agar; grows well. Smooth surface. Shows light brown color. (8) Tyrosine agar; produces brown pigment. (9) Glucose-asparagine agar; grows quite well. (10) Potato: Good growth, smooth surface, light brown color. Produces a brown pigment in the medium. (11) Use of citric acid; positive. (12) Starch hydrolysis; positive. (13) Acetylmethylcarbinol; not produced. (14) Gelatin: Decomposes. (15) Milk; coagulates and peptonizes. (16) Nitrate reduction; positive. (17) Catalase; positive. (18) Carbohydrate utilization; D-glucose, D-
Fructose, D-galactose, D-mannose, D-ribose, L-rhamnose, L
-arabinose, D-xylose, D-mannitol, D-sorbitol, maltose,
Both methods use sucrose and other materials to produce raw acid without producing gas. (19) Optimal growth temperature: around 40℃. (20) Maximum growth temperature: approximately 50℃. (21) Killing temperature: Will not die even after heating at 100℃ for 20 minutes. Regarding the above mycological properties, Verge Eight
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology
7th and 8th editions of Determinative Bacteriology (The Williams and Wilkins Company)
Wilkins Company, 1957 and 1974), it was considered appropriate to identify this bacterium as a strain of Bacillus megaterium, and this strain was named Bacillus megaterium G-2. (B) Mycological properties of amylase G4-producing bacteria (1) Morphology: Bacillus, 0.5-1 x 5-6μ, non-motile, Gram-negative. (2) Spores: Usually one near the end, no swelling of the sporangia. (3) Meat juice; cloudy and sediment. (4) Juicy agar: Good growth, light yellow to light brown, with unevenness around the edges and surface. (5) Glucose juice agar; Good growth, light yellow ~
Light brown. (6) Glucose nitrate agar; growth is poor. (7) Potato: Good growth, milky white. (8) Glucose-asparagine agar; growth is not very good. Pale yellow to yellowish brown. (9) Tyrosine agar; grows well, slightly brown. (10) Milk; slow coagulation, peptonization. (11) Indole; not generated. (12) Catalase; produced. (13) Acetylmethylcarbinol; not produced. (14) Hydrogen sulfide; not generated. (15) Citric acid; use. (16) Nitrate reduction; negative. (17) Citric acid; use. (18) Salt broth: Grows well up to 8% salt in medium and slightly grows in 10% salt. (19) Carbohydrate utilization; D-glucose, D-
Acid is produced from fructose, D-mannose, L-arabinose, D-ribose, maltose, sucrose, starch, etc., but no gas is produced. The availability of D-xylose, L-rhamnose, and L-sorbose is not good. (20) Optimal growth temperature: around 26℃. (21) Maximum growth temperature: approximately 60°C (22) Death temperature: 100°C. Will not die even if heated for 30 minutes. Regarding the above mycological properties, Verge Eight
Bergey's Mamnual of Determinative Bacteriology
7th and 8th editions of Determinative Bacteriology (The Williams and Wilkins Company)
Wilking Company)], (1957 and 1974)
With reference to , this bacterium was identified as a type of Bacillus circulans and named Bacillus circulans G-4. Culture for producing amylase G2 and amylase G4 is usually carried out by aeration and stirring culture in a liquid medium. Nitrogen sources for the culture medium include meat extract, peptone, yeast extract, casein, and corn.
Organic nitrogen sources, such as staple liquor and soybean meal, are commonly used when culturing microorganisms, and inorganic nitrogen sources, such as ammonium chloride, ammonium phosphate, and nitrate, are used as supplementary nitrogen sources. As the carbon source, starch, dextrin, maltose, glucose, sucrose, etc. are used. Culture at pH 5-9, temperature 20-
It is carried out aerobically at 60°C. Since amylase G2 and G4 are both yeast produced outside the bacterial cells, after the culture is completed, bacteria are removed by filtration or centrifugation, and the supernatant is collected. The culture supernatant is concentrated if necessary, and the enzyme is obtained as a precipitate by salting out with ammonium sulfate or sodium sulfate, or by adding an organic solvent such as acetone, isopropanol, ethanol, or methanol, and then dried and stored. . The starch saccharification reaction using a combination of amylase G2 and amylase G4 is carried out as follows. Starch is usually pretreated with acid or liquefied α-
It is liquefied by amylase. The degree of liquefaction affects the yield of maltose, and it is desirable that DE be as low as possible. Typically, liquefied starch with a DE5 or lower is used. The substrate concentration is usually 5 to 40%, and the reaction is usually carried out at a pH of 5 to 8 and a temperature of 40°C to 60°C. Amylase G4 is thermostabilized by the presence of calcium ions, so during saccharification, it is usually
A calcium salt of about 10 −4 to 2×10 −2 M is added. It is desirable to have amylase G2 and amylase G4 act on starch at the same time, but either saccharify it with amylase G2 in advance and continue the reaction by adding amylase G4 in the middle of the reaction, or start the reaction with amylase G4 first. , then amylase G2
is added and the reaction is carried out. Next, the details of the present invention will be explained with reference to Examples. Example 1 (1) Production of amylase G2 2% soybean protein, 2% rice bran,
K 2 HPO 4 0.3%, MgSO 4 7H 2 O 0.1%, soluble starch 2%, CaCl 2 1×10 -3 M, MnCl 2 1×10 -4 M,
Put 30 ml of a medium (PH7.0) consisting of CuSO 4 2.5 × 10 -5 M, FeCl 2 2.5 × 10 -5 M, and sodium lauryl sulfate 2.5 × 10 -2 % into a 200 ml Erlenmeyer flask.
After sterilizing at 120℃ for 15 minutes, inoculate with Bacillus megaterium (Feikoken Bacteria No. 7978) and incubate at 30℃ for 3 minutes.
It was cultured on a shaking plate (160 rpm) for days. As a result of measuring the amylase G2 activity produced in the supernatant obtained by centrifugation after culturing, it was found that per ml of culture medium,
It was 9.0 units. (2) Production of amylase G4 Place 30ml of a medium consisting of 1% polypeptone, 0.3% dipotassium phosphate, 0.1% magnesium sulfate (heptahydrate), and 1% soluble starch in a 200-volume Erlenmeyer flask, and sterilize it at 120℃ for 10 minutes. Thereafter, Bacillus circulans G4 (Feikoken Joyori No. 820) was inoculated and cultured on a shaking plate (160 rpm) at 30°C for 4 days. Regarding the supernatant obtained by centrifugation after culturing,
The amylase G4 produced was measured and found to be 6.4 units per ml of medium. Amylase G4 was added to 1 g (as solid content) of DE4.2 potato liquefied starch, which was liquefied by a conventional method using Bacillus subtilis α-amylase.
units, or/and 4 units of amylase G2,
Add 5×10 -3 M of CaCl 2 , make up to 10 ml with water, and adjust the pH.
The reaction was carried out at 50°C for 20 hours at around 7°C. After the reaction, the sugar composition in the saccharified sugar was measured by liquid chromatography. The results obtained were as shown in Table 2.
【表】【table】
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
第１図ａ，ｂ，ｃとｄは、それぞれアミラーゼ
G2の最適PH、最適温度、熱安定性とPH安定性を
示している。第２図ａ，ｂ，ｃとｄはそれぞれア
ミラーゼG4の最適PH、最適温度、熱安定性とPH
安定性を示している。
Figure 1 a, b, c and d are amylases, respectively.
It shows the optimum PH, optimum temperature, thermal stability and PH stability of G2. Figure 2 a, b, c and d are the optimum PH, optimum temperature, thermostability and PH of amylase G4, respectively.
It shows stability.