JPH02500686A - 導波管センサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 導波管センサー 主班皇公立 本発明は、試料中の化学的、生化学的または生物学的種の定性的および／または 定量的検出が達成され得るような分析技術に関し、そしてそのような技術におけ る利用に適するセンサーにも関する。

光肌Ω宜且 本出願に関連する分析技術は、分析すべき種（以下“リガンド”と称する）と、 特定のタイプの表面にコーティングされる該リガンドに特異的な結合剤（以下パ 特異的結合相手′。

と称する）との間の親和力に基づいている。国際特許公開ＷＯ３４１０２５７８ および−０８６１０１９０１は、（ａ）特異的結合相手の１膜で支持体の表面の 少なくとも一部分（予備成形されたレリーフ面のある）をコーティングし、前記 表面部分はある波長のバンドを超える輻射線に関して光学的に活性であり、そし て（ｂ）そのコートされた表面を試料と接触させ、そして該表面上の特異的結合 相手の薄膜へのりガントの結合の結果として光学的性質の定性的および／または 定量的変化を測定するために、該表面の前記部分の光学的性質を観察する；こと を含んで成る方法を記載してし）る。

上記の刊行物に記載されているように、予備成形されたレリーフ面は、典型的に は単純な単一格子または２つ以上交差した格子であることのできる光格子の形で あり、それのりソジは、例えば正方形、正弦または三角形の横断面形を有するこ とができ、そして本明細書において格子のことを言及する時には、そのような格 子全てを包含するつもりである。

ｈｏ８４　／　０２５７８の刊行物では、分析すべきリガンド（例えば血清中の 特異的抗原）の結合の結果としての格子の光学的性質の変化は、本質的に（１） 結合したりガントの質量または嵩および（２）それの誘電特性の結果として引き 起こされる。

ＷＯ３６１０１９０１刊行物では、結合の結果がセンサー表面に付着された色素 標識された結合相手の蛍光特性の変化によってモニターされている。

本発明の目的は、代わりの分析方法およびこの分析技術が達成され得るようなよ り怒受性のタイプのセンサーを提供することである。

発ｙじど【絢 従って、最も広い態様においては、本発明は試料中のリガンドについて分析する 方法を提供し、この方法は、ａ）試料を光学構造の表面と接触させてインキュベ ートし、前記光学構造は第一の屈折率Ｎ１を有する支持体および第二の屈折率Ｎ ２を有する表層を含んで成り、前記表層は使用の際には共鳴輻射線の誘導波モー ドがその中に伝達され得るようなものであり、そして前記表層は、検出を所望す るりガントに対する特異的結合相手を直接的または間接的に吸着しているかまた は結合しており； ｂ）法線に対しである角度またはある範囲の角度において前記光学構造を照射し ；そして Ｃ）前記リガンドと前記特異的結合相手との間の複合体の形成により誘導波モー ドの特徴が変化するかどうか、そして所望によりその範囲および／または速度を 測定するために、反射光、透過光および／または伝達光を分析する；ことを含ん で成る。

表層の内側に誘導波モードを伝達させるためには、Ｎ２がＮ１よりも大きいこと が望ましいであろう。しかしながら、屈折率Ｎ１とＮ２が近僚しており（ただし 正確には等しくない）、且つ約１．５であるのが特に好ましい。

好ましくは、光学構造は、透明なプラスチック、例えばポリカーボネート、また はガラスの支持体、および成る適切な屈折率の表層を有する回折格子である。本 発明に従った方法においては、表層が厚さ７００ｎｍよりも薄い光学構造を利用 することが有利である。

屈折率Ｎ２の表層は１層の材料を含んで成ってもよい。例えば、光学構造の支持 体がプラスチックである場合にはその上の１層材料がガラスまたはシリカである ことができ、そして支持体がガラス、例えばホスフェートガラスである場合には 、１層材料がシリカまたはスパンコートされたポリマー、例えばポリスチレンで あることができる。しかし、光学構造の支持体がガラスであり、そして屈折率Ｎ ２の表層が金属イオン、例えば銀および／または鉛イオンで含浸された前記支抗 体の表面を含んで成るのが特に好ましい。従って、本発明のさらなる観点は、本 明細書中に定義されるような光学構造上に屈折率Ｎ２の表層を形成せしめる方法 を提供し、該方法は、該光学構造の表面を硝酸銀および／または硝酸鉛に暴露す ることを含んで成る。

本発明はさらに、試料中のリガンドを検出するためのセンサーを提供し、このセ ンサーは、第一の屈折率Ｎ１を有する支持体および第二の屈折率Ｎ２を有する表 層を有する光学構造を含んで成り、前記表層は、使用時に共鳴輻射線の誘導波モ ードがその中に伝達され得るようなものであり、そして前記表層は、検出を所望 するリガンドに対する特異的結合相手を、直接的または間接的に、吸着している かまたは結合している。

本発明に従って製造されたセンサーは、特に抗体または抗原の検出に有用である 〔この場合の特異的結合相手はそれぞれ抗原または抗体（モノクローナルもしく はポリクローナル）であろう〕が、以後に論議されるように、他のリガンドも他 の特異的結合相手の利用により検出され得る。しかしながら、本発明に従って製 造されたセンサーは、バイオセンサーに限定されるものではなく、例えば、表層 上への特異的吸着または表層内部への特異的吸収が起こり得る気体の化学検出器 、といった化学センサーを含むことができる。

本発明は、抗体または抗原に関して特異的結合相手またはリガンドとして詳細に 記載されるであろう。しかしながら、本発明は、抗体または抗原の分析方法に限 定されるものとして解釈してはならず、試料中のあらゆる化学的、生化学的また は生物学的種を検出するために利用され得るアッセイをその範囲内に包含する。

本発明に従って光学構造上に固定され得る適当な結合相手の例、および本発明の 方法により分析され得るリガンドの例を下の第１表に示す。

リガンド　特異的結合相手 抗原　特異的抗体 抗体　抗原 ホルモン　ホルモン受容体 ホルモン受容体　ホルモン ポリヌクレオチド鎖　相補的なポリヌクレオチド鎖プロティンＡ　免疫グロブリ ン 免疫グロブリン　プロティンＡ 酵素　酵素のコファクター（基質） またはインヒビター レクチン　レクチンの特異的炭水化物 レクチンの特異的炭水化物　レクチン 本発明の方法は非常に広い適応性を有するが、特に次のアッセイに利用すること ができる：ペプチドホルモン〔例えば、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形 成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）　、濾胞刺激ホル モン（ＦＳＨ）、インシュリンおよびプロラクチン〕および非−ペプチドホルモ ン〔例えば、コルチゾール、エストラジオール、プロゲステロンおよびテストス テロンのようなステロイドホルモン、またはチロキシン（Ｔ４）およびトリョー ドチロニンのようなチロイドホルモン〕を包含するホルモン、タンパク質〔癌胎 児性抗原（ＣＥＡ）およびαフェトロブロチイン（ＡＦＰ）　）　、薬剤（例え ばジゴキシン）、糖類、毒素、ビタミン、ウィルス、バクテリアまたは微生物。

本明細書中で使用する”抗体”という用語は、次の範囲内のものを包含すると解 釈されるだろう。

ａ）常用の動物のいずれか、例えば羊、ウサギ、ヤギまたはマウスから由来する 免疫グロブリンの糧々のクラスまたはサブクラスのいずれか、例えばＩｇＧ　、 　ＩｇＡ　、　ｘｇｈまたはＩｇＥ　。

ｂ）モノクローナル抗体、 Ｃ）モノクローナルまたはポリクローナルの抗体の完全な分子または“断片”、 断片は抗体の結合性領域を含むもの、例えばＦｃ部分の欠けている断片〔例えば Ｆａｂ　＋　Ｆａｂ　’Ｆ（ａｂ’　）２：ｌまたは完全な抗体中の重鎮成分を 結合しているジスルフィド結合の還元的開裂により得られる“半分子”と称され る断片である。

抗体の断片の調製方法は当業界においてよく知られており、本明細書中では記載 しない。

本明細書中で使われる“抗原”という用語は、抗原性の種（例えば、タンパク質 、バクテリア、バクテリア断片、細胞、細胞断片およびウィルス）および適当な 条件下で抗原性になり得るハブテンを共に不変的に包含すると解釈されるだろう 。

本発明は、光学構造が回折格子であるような好ましい態様例えば光学導波管、光 学繊維およびコーティングされたプリズムといった他の光学構造も、正確な配列 （ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）において、本発明の範囲内に含まれるであろう 。

本発明は、系のゼロオーダーの回折効率を観察する時、本明細書中ム：記載の光 学構造、例えばコートされた回折格子と、前記光学構造の表層に接触した試料と の闇で形成される三層の誘電性配置中での誘導波の励起のためのシャープな共鳴 の異変にその効果を頬っている。理論上この共鳴が観察されることが予想されな かったが、実際は、通常その現象を観察するのに十分な入射光の減衰があるであ ろう。しかしながら、ある状況においては、その配置の１つまたは複数の層の適 当な変更により、カップルされた輻射線の吸収を促進させることが望ましいかも しれない。そのような配置は、空気またはさらなる屈折率Ｎ３の液体と接触して 屈折率Ｎ２の相似被覆でコートされた屈折率Ｎ１の支持体から成るであろう。格 子の深さ、Ｎ１およびＮ２、並びに格子間隔（リッジ間）の適当な選択により、 ０．１ｎｍのオーダーのごく狭いスペクトル幅を有する共鳴が可能である。

共鳴における導波管として作用する、コーティングの厚さの変化は、ガイドのモ ード構造の変化を引き起こし、そして入射の角度または励起が要求される波長の 対応するシフトを引き起こす。

カンブリングしている共鳴の角度の手中値（約０．１°）に対応するシフトのた めには、屈折率Ｎ２のコーティング（導波管）が厚さ約２ｎｍまで変化しなけれ ばならないことが示され得る。これは、生化学的反応、例えばバイオアッセイに おける抗原と抗体との特異的結合の結果として付着するであろう物質の厚さに一 致する。

Ｎ１およびＮ２の値をより接近させ、そしてコーティング−導波管の厚さを減ら すことにより、感度は増加され得る。

これは、コーティングの厚さを減らすとコーティングの厚さの与えられた変化に 対する内側への伝達速度の変化の割合が増加するために起こり、そしてこれは厚 さの変化に関連して入射光（与えられた波長について）のＲｎ界角のシフトを増 加せしめる。

従って、本説明の一態様は、センサーを提供し、このセンサーは、Ｎ１とＮ２が 近似しており且つ共に１．５に等しく、約０．１ミクロンの格子の深さ、約０， ３ミクロンの格子間隔、および約０．７ミクロンのコーティング−導波管を有す る回折格子を含んで成る。国際特許公開ＷＯ３４１０２５７８に記載されている ようなセンサーのものと同様な感度を有する。コーティング−導波管の厚さが０ ．７ミクロン以下に減少されると、この感度が４または５倍に増加され得る。

回折格子は、いかなる常用の手段によっても調製され得る。

従って、例えばプラスチックの格子は、レーザー干渉計により製造された格子の 原型から注入成形により作成され得る。

本発明に係るセンサーは、格子上へ誘電材の１層を付着せしめることにより、例 えばそれぞれスパッターまたは真空蒸発によるガラスまたはＳｉＯ□の付着によ り、合成され得る。

また、ガラスの回折格子は、光学的に平らなガラスの表面に線を描くことにより 、または光学的に平らなガラスの表面上にフォトレジストをスピンニングし、干 渉パターンにそれを暴露し、そして該レジスト中の干渉パターンを反応性イオン に暴露することによりガラス表面をエツチングすることにより、製造され得る。

本発明に従ってイオン−含浸された表面を有するガラス格子が作成され得る。例 えば、表面を硝酸銀および／または硝酸鉛に暴露することにより、銀および／ま たは鉛イオンを該格子の表層に結合することができる。これはガラス表面内への 銀および／または鉛イオンの移動を許容し、かくしてガラスの残部とわずかに異 なる屈折率を有するごく薄い表面領域を確立する。該表層の１さおよび基質と表 層の屈折率の近似が、ともに優れた感度を与えるだめの必要条件である。

特異的結合相手でコーティングされた光学構造の光学的性質は、特異的結合相手 と相補的なりガントとの間の複合体形成により変化し、本発明の一態様において は、該表面の標準の（未処理の）領域の光学的性質と処理済のテスト領域のもの との比較により、該テスト領域において結合反応が起こったかどうかを定性的ま たは定量的に測定することができる。

例えば、特異的結合相手が抗体であるような他の−Ｂ様においては、テストされ るべき抗原に特異的な抗体が光学構造の表面上の少なくとも１つの分離したテス ト領域上に吸着されるかまたは結合される。そしてテストされるべき試料中に存 在するであろういずれのりガントに対しても特異的結合相手とならないタンパク 質（本明細書中では“非−特異的タンパク質”と表示される）が、前記表面上の 少なくとも１つの分離した対照領域上に吸着されるかまたは結合される。この非 −特異的タンパク質は、例えば、不活性化された抗体またはテストされる試料中 に存在しないリガンドに対して誘起された抗体であり、例えばテストされるべき 試料がヒト血清である場合は、非−特異的タンパク質が抗−マウス抗体であって もよい。例えば試料中に存在するタンパク質の、特異的抗体または非−特異的タ ンパク質への非−特異的結合のあらゆる差異は、テストされるべき抗原を含まな い試料に暴露した後にテスト領域の光学的性質を対照領域と比較することにより 測定され得、必要であれば、適当な補正を行うことができる。

テストされるべき試料への暴露の間または後１°め同じバイオセンサーのテスト 領域と標準領域との比較は、テストされるべき抗原とそれの特異的抗体との間の 複合体形成の測定を提供することができる。各領域が特異的結合相手の連続層を 含んで成ってもよく、または各結合相手がある与えられた領域内で分離した間隔 で存在して不連続層を形成してもよい。

本発明の−Ｂ様においては、光学構造を固定した入射角において多色光で照射し 、そして反射光および／または透過光を分析して誘導された波の共鳴のために吸 収される光の波長を測定する。

反射光または透過光を分析するだめの手段はスペクトル検出器であることができ 、これは照射光と比較して反射光または透過光から消失しているある波長を測定 し、そして消失波長を示すシグナルを発生させる。シグナル発生手段の目盛を定 めて直接の読取りを提供してもよい。

もしコートされた格子面に試料を接触させる前と後のスペクトルの消失部分の間 に有意な波長のシフトが認められるならば、相補的物質の結合がその表面に起こ っており、従って試料が、その特異的結合相手のコーティングに結合することが わかっている特異的リガンドを含んでいたことが推測され得る。

もう一つの態様においては、光学構造を１または複数の入射の角度において、単 色光または半一単色光で照射し、そして反射光、透過光および／または伝達光を 分析して、入射光の特定の角度において、共鳴光の誘導波モードが伝達されるか どうかを決定する。

国際調査報告 １Ｍ１ｍ＋ｎ＋鵞１１ＭＩＡ紳１１Ｌａ＋□ｍｋｌｐ：’−／ＱｐεＥ１００４ ’ア１国際調査報告

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．試料中のリガンドについて分析する方法であって、ａ）試料を光学構造の表 面と接触させてインキュベートし、前記光学構造は第一の屈折率Ｎ１を有する支 持体および第二の屈折率Ｎ２を有する表層を含んで成り、前記表層は使用の際に は共鳴輻射線の誘導波モードがその中に伝達され得るようなものであり、そして 前記表層は、検出を所望するリガンドに対する特異的結合相手を直接的または間 接的に吸着しているかまたは結合しており； ｂ）法線に対してある角度またある範囲の角度において前記光学構造を照射し； そして ｃ）前記リガンドと前記特異的結合相手との間の複合体の形成により誘導波モー ドの特徴が変化するかどうか、そして所望によりその範囲および／または速度を 測定するために、反射光、透過光および／または伝達光を分析する；ことを含ん で成る方法。
2. ２．前記光学構造が回折格子である、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記特異的結合相手が抗原または抗体である、請求項１または２に記載の方 法。
4. ４．前記屈折率Ｎ１およびＮ２が近似しており（ただし正確には等しくない）且 つ両方とも約１．５である、上記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
5. ５．屈折率Ｎ２の前記表層が薄層の材料を含んで成る、上記の請求項のいずれか 一項に記載の方法。
6. ６．前記光学構造の支持体かガラスであり、そして薄層の材料がシリカである、 請求項５に記載の方法。
7. ７．前記光学構造の支持体がプラスチックであり、そして薄層の材料がガラスま たはシリカである、請求項５に記載の方法。
8. ８．屈折率Ｎ２の前記表面が金属イオンで含浸された支持体の表面を含んで成る 、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
9. ９．前記光学構造の支持体がガラス製であり、そして前記表層が銀および／また は鉛イオンで含浸された前記支持体の表面を含んで成る、請求項８に記載の方法 。
10. １０．屈折率Ｎ２の前記表層が７００ｎｍよりも簿い厚さである、上記の請求項 のいずれか一項に記載の方法。
11. １１．前記光学構造を、固定された入射の角度において多色光で照射し、そして 反射光および／または透過光を分析して誘導波の共鳴のために吸収される光のあ らゆる波長を測定する、上記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
12. １２．前記光学構造を、１または複数の入射の角度において単色光または半−単 色光で照射し、そして反射光、透過光および／または伝達光を分析して入射光の 特定の角度において共鳴の光の誘導波モードが伝達するかどうかを測定する、上 記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
13. １３．試料中のリガンドを検出するためのセンサーであって、第一の屈折率を有 する支持体および第二の屈折率を有する表層を有する光学構造を含んで成り、前 記表層は使用の際には共鳴輻射線の誘導波モードがその中に伝達され得るような ものであり、そして前記表層が、検出を所望するリガンドに対する特異的結合相 手を直接的または間接的に吸着しているかまたは結合している、センサー。
14. １４．前記光学構造が、請求項２〜１０のいずれか一項において定義されるもの である、請求項１３に記載のセンサー。
15. １５．請求項９において定義される光学構造上に屈折率Ｎ２の表層を形成せしめ る方法であって、該光学構造の表面を硝酸銀および／または硝酸鉛に暴露するこ とを含んで成る方法。
16. １６．試料中のリガンドについて分析する方法における請求項１３または１４に 記載のセンサーの利用。