JPH02500325A - 斑入り - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 斑　入　り 技術分野 本発明は遺伝物質を操作することにより植物および動物に斑入り模様（ｖａｒ　 ｉｅｇａｔ　１ｏｎ）を導入する方法を提供する。

背景技術 観賞用植物および動物の新しい形態のものは商業的価値が大きいことが多い。注 目を集めている一つの新しい形態のものは斑入り模様である。斑入り模様は生物 の外観または色ならびに生物の生化学的特性の変化を包含する。

斑入り模様はいくつかの原因、すなわち：ａ、突然変異葉緑素と正常葉緑素との 分離（植物において） ｂ、核キメラ Ｃ０体細胞の突然変異を起すトランスポゾンの不安定ｄ、ウィルス感染 ｅ０位置効果による斑入り（ＰＥＶ） によって起る。

パターン遺伝子は扇形模様、水玉模様および他の可変模様を生じさせるが、通常 典型的な斑入り模様を生成しない。

ａ〜ｅのうちＰＥＶのみが遺伝的に安定である。ＰＥＶは染色体転位の切断位置 近くにおける遺伝子のモザイク発現である。これは従来ショウジヨウバエのいく つかの種、植物および真田について説明されている。このことはこの現象がおそ らくいたる所に見られることを示唆するものである。

ＰＥＶの分子的根拠は１９３０年にエッチ、ジュー。ミュラー（）１．Ｊ、　Ｍ ｕｌｌｅｒ）によってこの現象が発見されて以来未だ知られていない。

従来斑入りの開発は斑入りの自然発生に頼っていた。その理由は計画的な明確な 方法で斑入り模様を生成することが従来不可能であったからである。

最近本発明者はＰＥＶおよびいくつかの他の形態の斑入りはアンチセンス転写ま たはプロモーター・オフルージョン（読み過し転写）から生じ、前者は切断位置 が影響を受けた遺伝子の３′側に在る場合に作用し、後者は切断位置が影響を受 けた遺伝子の５′側に在る場合に作用する。実質的に偶発的な証拠のほかにこの ような仮説を支持する直接的な証拠がある。

本発明は斑入りの原因を理解することによって遺伝子工学を使用して斑入り模様 を計画的に生成する手段に到達するという認識から出発している。アンチセンス （ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）ＲＮＡを生成するかあるいはプロモーター・オフルー ジョン（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）をもたらす遺伝子構造体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ） は、生きている生物の任意の種の適当な遺伝子型中に挿入された場合に、斑入り 表現型を生成することができる。

（ａ）アンチセンス転写 アンチセンスＲＮＡは遺伝子の機能を変えるために従来広く使用されている（ア イデント（Ｉｚａｎｔ）およびワイントララブ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ）　、ｒサ イエンス」ン狙、３４５〜３５２（１９８５）　；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）　ら 、「アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリイ（Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ ｉｅｗ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　Ｊ　５５．５６９〜５９７　（１ ９８６）　）、　Ｌかし、アンチセンスＲＮＡ　は斑入り模様を生成するという 目的では従来使用されていない。

アンチセンス転写は、遺伝子工学を使用して、問題とする遺伝子に対してセンス （ｓｅｎｓｅ）　ｍＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡの両方を生成する遺伝子型 を生成することにより表現型斑入り模様を生成するために使用することができる 。アンチセンスＲＮＡは遺伝子のすべてまたは部分に対するものとすることがで きる。アンチセンスＲＮＡ転写はセンスｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有してい るため、これらはハイブリッドを形成し、従ってセンスｍＲＮＡの大部分または すべてを不活性化する。

表現型の斑入りは、すべてのセンスｍＲＮＡがいくつかの細胞においてハイブリ ッドを形成し、不活性化されるが、他のものにおいては十分なセンスｍＲＮＡが ハイブリッド形成を逃れて機能的生成物をもたらす限界値においてアンチセンス ／センス転写が行われる場合に生しる。

異なる遺伝子型の表現型発現はハイブリッドを形成していない野生型ｍＲＮＡの 量によって決まる。従って、前記発現はセンス転写対アンチセンス転写の比によ って決まる。

遺伝子の一部分にとってセンスｍＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡの両方を含む 斑入り突然変異の自然に起る例が、眼に斑点が付くように着色されているキイロ ショウジョウバエについて報告されている（キッド（Ｋｉｄｄ）およびヤング（ Ｙｏｕｎｇ）　、ｒネエイチャー」災、８９〜９１　（１９８６）　）、しかし 、この文献には斑入り表現型を生じる際に含まれる詳細な機構は記載されておら ず、また研究結果と斑入りの計画的な生成との関係についても言及されていない 。

（ｂ）プロモーター・オフルージョン プロモーター・オフルージョンは原核生物における遺伝子の機能を抑制するため の手段としてよく知られている（アドヒア（Ａｄｈｙａ）およびゴッテスマン（ Ｇｏ　ｔ　Ｌｅｓｍａｎ）、「セル（Ｃｅｌｌ）　」２９．９３９〜９４４　（ １９８２）　）。しかし、従来プロモーター・オフルージョンは斑入り表現型の 計画的生成に適用されたことがない。

プロモーター・オフルージョンは転写停止信号を有していない遺伝子が別の遺伝 子の上流で同じ転写配向に位置している場合に起る。上流のプロモーターからの 転写は、非機能的な読み過し転写産物を生成することにより、下流遺伝子の正常 な転写を妨害することがある。斑入り表現型は、下流遺伝子が時々正常な転写産 物を生成する場合に、偶然的にいくつかの細胞は転写産物を有していない（かつ 突然変位表現型を有している）が、他の細胞は機能的転写産物を有している（か つ野生型表現型を有している）ような結果をもたらすことがあ゛る。

この現象が自然に起ることは眼を斑点が付くように着色したキイロショウジョウ バエについて報告されている（キッド、ケリー（Ｋｅｌ　１ｅｙ）およびヤング 、「モレキュラー−アンド・セルラー・バイオロジ４−（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　 ａｎｄ　ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）　Ｊ　６−１３０９４〜３１０８　 （１９８６）　、関連する詳細な説明は第３１０４頁）。

しかし、この文献は斑入りを生成する詳細な機構については言及していない、さ らに、この文献は研究結果と斑入りの計画的生成との関連についても言及してい ない。　゛光１０１示 本発明は生存する生物の任意の種において安定で明確な斑入りを生成する遺伝子 操作方法を提供する。

第１の例においては、本発明は、少くとも１個の遺伝子の表現型発現が斑入りで ある遺伝子操作された生物において、少くとも１個の機能的遺伝子、および生物 に転写することができ、前記遺伝子が断続的に発現されるように前記遺伝子の発 現を妨害することができる少くとも１個の挿入されたＤＮＡ配列を有することを 特徴とする遺伝子操作された生物を提供する。

前記挿入されたＤＮＡ配列は前記遺伝子から転写されたｌｌｌＲＮＡの少くとも 一部分に相補的なｎ＋ＲＮＡに対する暗号づけを行うのが好ましく、また前記挿 入されたＤＮＡ配列がカリフラワー・モザイクウィルスの５３５プロモーターの ようなプロモーターを含むのが好ましい。

また、本発明の範囲内には、前記生物中に転写することができかつ少くとも１個 の機能的遺伝子の発現を妨害することができる少くとも１個のＤＮＡ配列を、前 記遺伝子が前記生物において断続的に発現されるように、前記生物またはその配 偶子中に挿入することを特徴とする遺伝子操作によって生物に斑を入れる方法が 含まれる。

本発明の他の面においては、問題とする種の染色体ＤＮＡ中に挿入するのに適し たレプリコン、遺伝子クローニング部位および該遺伝子クローニング部位に挿入 された少くとも１個の遺伝子の発現を妨害することができるＤＮＡ配列を′有す ることを特徴とするベクター系を提供する。

本発明の好ましい生物は少くとも１個の遺伝子を有し、該遺伝子はプロモーター と、該プロモーターが前記遺伝子のアンチセンスコピーの転写を促進して前記遺 伝子のセンスコピーから転写された＋ｎＲＮＡに対してハイブリッド形成可能な メツセージを発生するように配向するよう、前記遺伝子に対して３′において組 み合わせられているか、あるいは該遺伝子は前記プロモーターと、該プロモータ ーが前記遺伝子と組み合わされている任意のプロモーター配列の上流に位置し、 かつ読み過し転写によって細長い非機能的ｍ　ＲＮ　Ａを生じさせて、前記生物 において前記遺伝子の斑入り発現を生じることができるよう、前記遺伝子に対し て５゛において組み合わせられている。

本発明の一つの面においては、挿入されたＤＮＡ配列は機能的遺伝子のイントロ ン中に挿入することができる。

さらに、ある遺伝子構造体の場合には、転写しようとする配列を越えてプロモー ターに対して３′に転写停止配列を挿入するのが望ましい。

温度変動、光、極微量元素の濃度、栄養条件、重金属またはホルモンなどのよう な条件に応じて操作中に変動するプロモーターを選択することにより、このよう な外部刺激しだいで斑を入れることができる。

上述の方法は、微生物、植物または動物、特に商業的に成長させた花を持ってい る植物を含む生きている生物の任意の種における遺伝子に対して斑入れを行うこ とができる。

本明細書および請求の範囲において、生物は多細胞体またさらに、１個または２ 個以上の遺伝子を構造体中に入れることにより、異なる遺伝子を含む多数の構造 体を使用して形質転換することにより、あるいは一つの配置方向に在る遺伝子が センス転写およびアンチセンス転写を受け、反対の配置方向に在る別の遺伝子が プロモーター・オフルージョン（読み過し転写）を受けるように構造体を作るこ とにより、同時に多数の遺伝子を斑入りにすることができる。

Ｎ皿Ω呈垂星脱肌 第１図は、形質転換ベクターを使用して問題とする遺伝子の機能的形態に欠けて いる品種中に挿入した場合に、斑入りを生成するのに使用することができるセン ス構造体およびアンチセンス構造体を示す線図、 第２図は、形質転換ベクターを使用して問題とする遺伝子の機能的形態に欠けて いる品種中に挿入した場合に、斑入りを生成するのに使用することができるセン ス構造体およびアンチセンス構造体を一部分の長さについて示す線図、第３図は 、形質転換ベクターを使用して問題とする遺伝子の１個または２個以上の機能的 コピーを含む品種中に挿入した場合に、斑入りを生成するのに使用することがで きるアンチセンス構造体を示す線図、 第４図は、形質転換ベクターを使用して問題とする遺伝子の１個または２個以上 の機能的コピーを含む品種中に挿入した場合に、斑入りを生成するのに使用する ことができるアンチセンス構造体を示す線図、 第５図は、形質転換ベクターを使用して問題とする遺伝子の機能的対立遺伝子に 欠けている品種中に挿入した場合に、斑入りを生成するのに使用するこができる プロモーター・オフルージョン構造体を示す線図、第６図はｐＷ６　ｈｓｐ７０ −一エレメント形質転換ベクター・プラスミドを示す線図である。

日を　する最　の　法 二股的去汰 遺伝子クローニングおよび問題とする菌株（ｓｔｒａｉｎ）中に挿入するための 構造体の作成はマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）など（「コールド・スプリング ・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）　Ｊ　＋（１９８２）　 ）のような標準的な分子生物学のテキストに記載されている標準方法に従って行 う。

斑入り遺伝子発現を生成するのに使用することができる構造体に対する一般化し たモデルは第１図〜第５図に示されている。

第１図〜第４図はアンチセンスＲＮＡ　／センスｏ＋ＲＮＡハイブリッド形成タ イプの構造体を例示する。

第５図はプロモーター・オフルージョンタイプの構造体を例示する。

第１図、第２図および第５図に例示したタイプの構造体は、問題とする遺伝子の 正常な機能的形態が欠けている植物、微生物または動物の種牛に（適当なものと して）挿入することができる。

第３図および第４図に例示するタイプの構造体は、問題とする遺伝子の正常な機 能的形態を含んでいる植物、微生物または動物の種牛に（適当なものとして）挿 入することができる。これらの挿入は双子葉植物におけるＴｉプラスミドによっ て媒介された形質転換（ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｔ＋）ら、「サイエンス」淫Ｊ、 １２２９〜１２３１　（１９８５）　）　、咄乳動物の胎児へのＤＮＡの微量注 射法（パルミタ−（Ｐａｌｍｉｔｅｒ）ら、「ネエイチャー」更曵、６１１〜６ １５　（１９８２）　）、ショウジヨウバエにおけるＰエレメントで媒介された 形質転換（スプラドリング（Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ）　（１９８６）、「ドロソフ ィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）・ア・プラクティカル・アプローチ（Ａ　Ｐｒａ ｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）　Ｊディー、ビー、ロバーツ（Ｄ、Ｂ。

Ｒｏｂｅｒｔｓ）ｉ、アイアールエル・プレス・オックスフォード（ＩＲＬ　Ｐ ｒｅｓｓ　０ｘｆｏｒｄ）、第１７５〜１９９頁；カレス・アール。

イー、（Ｋａｒｅｓｓ　Ｒ，Ｅ、）　（１９８５）、「ディーエヌエー・クロー ニング（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　・第２巻」クロバー・ディー、ニー。

（Ｇｌｏνｅｒ　Ｄ、Ａ、）　号、アイアールエル・プレス・オックスフォード 、第１２１〜１４１頁）のような標準方法を使用して行う。

すべての図面において直線および破線はＤＮＡの二重らせんの２本の相補的スト ランドを示す。

すべての図面はプロモーター（Δ）および転写停止信号（ロ）を有する遺伝子を 示す。第２図および第４図は共にイントロンおよびエクソンを有する遺伝子を示 す。第１図、第３図および第５図において遺伝子はイントロンを有していること があり、また有していないことがある。

第１図は、形質転換ベクターを使用して問題とする遺伝子の機能的形態に欠けて いる品種中に挿入した場合に、斑入りを生成するのに使用することができるセン ス構造体およびアンチセンス構造体の一例を示す。

遺伝子構造体はセンスｍＲＮＡおよびアンチセンス転写の両方に導く。（ａ）で は、遺伝子構造体は、５゛プロモーターを有する問題とする遺伝子をとり、追加 のプロモーターを、これがアンチセンス転写を生じさせるような配向において遺 伝子の３′端を映えた位置に挿入することにより作られる。この転写はセンスス トランドから転写されたｍＲＮＡに加えられる。転写停止信号は、遺伝子の５′ プロモーターを越えた位置に挿入されてアンチセンス転写を停止している状態が 図示されている。これを使用するのは随意である。

（ｂ）に示す別の構造体はセンス配向およびアンチセンス配向の両方の位置に在 る問題とする遺伝子を有する。また、この構造体は問題とする遺伝子に対してセ ンスｍＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡの両方に導く。

第２図は、形質転換ベクターを使用して問題とする遺伝子の機能的形態に欠けて いる品種中に挿入した場合に、斑入りを生成するのに使用することができるセン ス構造体およびアンチセンス構造体の一例を一部分の長さにわたって示す。この 遺伝子構造体は長さの一部分に対して相補的であるＲＮＡの生成に導（。イント ロンおよびエクソンを有する遺伝子を上部に示す。

挿入断片はプロモーターおよび転写停止信号と、これらの間の転写可能なりＮＡ とからなる。

挿入断片を遺伝子自体とは反対の転写配向において遺伝子あイントロン中に入れ ると、遺伝子プロモーターは挿入断片のアンチセンスストランドの転写を指示す るが、挿入されたプロモーターは挿入断片のセンスストランドの転写を指示し、 部分的に相補的でありハイプリント形成することができる２個のＲＮＡ分子に導 く。

第３図は、形質転換ベクターを使用して問題とする遺伝子の１個または２個以上 の機能的コピーを含む品種中ム二挿入した場合に、斑入りを生成するのに使用す ることができるアンチセンス構造体の一例を示す。この構造体は、アンチセンス Ｉ’ｌＮＡが生成するように、プロモーターと転写停止信号との間に逆位の転写 された領域を有する。また、転写停止信号中にあるいはこれを越えて延在する大 きな逆位を有する構造体も適当である。また、転写の際に遺伝子の一部分に対し てアンチセンスであるＲＮＡを生じる逆位を遺伝子内に有する構造体も適当であ る。斑入りを生成するためにこのような挿入断片のいくつかのコピーを必要とす ることがある。

第４図は、形質転換ベクターを使用して問題とする遺伝子の１個または２個以上 の機能的コピーを含む品種中に挿入した場合に、斑入りを生成するのに使用する ことができるアンチセンス構造体の一例を示す。この遺伝子構造体は遺伝子の一 部分に対してアンチセンスＲＮＡを生成し、問題とする遺伝子からセンスｍｌ？ ＮＡまでハイプリント形成することができる。イントロンおよびエクソンを有す る遺伝子が図示されている。

この構造体はプロモーターおよび転写停止信号と、これらの間にアンチセンス配 向において挿入されたイントロン断片とからなる。遺伝子および構造体からの転 写は、これらが相補的塩基配列を有する領域を具えるようにハイブリッド形成し ているものとして図示されている。構造体がプロモーターと転写停止信号との間 に転写された遺伝子部分（エクソンの一部分またはすべて、あるいはエクソンお よびイントロンの両方の複数個の部分）を有している場合には、同じ目的を達成 することができる。

第５図は、形質転換ベクターを使用して問題とする遺伝子の機能的対立遺伝子に 欠けている品種中に挿入した場合に、斑入りを生成するのに使用することができ るプロモーター・オフルージョン構造体の一例を示す。この遺伝子構造体は問題 とする遺伝子からの極めて正常な転写を抑制することができる非機能的読み過し 転写を生じる。問題とする遺伝子を図面の上部に示し、転写可能なりＮＡに加え たプロモーターであって転写停止信号を有していないものを図面の中央部に示し 、これらの２個のＤＮＡ断片を結合することにより作られた構造体を図面の下部 に示す。遺伝子プロモーターが転写停止信号を有している場合には、異なる酵素 を使用し上流ブロモ°−ターを使用してこれ（例えば、ｒＲＮＡ遺伝子）を押え ることができる。

第６図はｐＷ６　ｈｓｐ７０−ｗＰエレメント形質転換ベクター・プラスミドの 顕著な特徴を示す図（一定の比に縮尺されてはいない）である。ｈｓｐ７０プロ モーター（Ｐ）およびリーダー配列の部分は截頭白色遺伝子（それ自身のプロモ ーターは存在していない）に融合され、Ｐエレメント形質転換ビヘクター・プラ スミド内に配置されている。白色遺伝子の截頭第１イントロンが図示され、白色 遺伝子の３′端にポリリンカー（ＰＬ）が図示されている＊　Ｎｄｅ　Ｉ　１Ｎ ｈｅ　Ｉ　％　５ｐｈ１　、Ａｃｃ　Ｉ　、、旧ｎｄｎｌ、Ｃ１ａ　Ｉ、Ｐｓｔ ｌ、５ｔｕｌおよびＢａｏ＋Ｈ■は実施例１〜３において言及されている制限部 位である。

Ｐエレメント配列（図示せず）はｈｓｐ７０プロモーターに対して５゛に位置し 、ポリリンカー（ＰＬ）に対して３′に位置する。

次の実施例は本発明方法を実施するのに使用することができるプロトコールを例 示する。　・ 災血勇上 白色突然変位ストック（ｍｕｔａｎｔ　５ｔｏｃｋ）に挿入したアンチセンス／ センス構造体を使用して白色遺伝子発現を斑入りにすることによりキイロショウ ジョウバエにおいて眼の色を斑入りにする方法。

第１工程はｐＷ６からｈｓｐ７０プロモーターを除去する工程である（　ｈｓｐ ７０−白色遺伝子Ｐエレメント・ベクタープラスミド（タレメンツ（Ｋ１ｅ＋ｍ ｅｎｚ）　、うエバー（１＋１ｅｂｅｒ）およびゲージング（Ｇｅｈｒｉｎｇ） 　’エヌエーアール（ＮＡＲ）　Ｊ　１５．３９４７〜３９５９　（１９８７） の第６図参照〕。これは、ｐ賀６ＤＮＡを制限酵素Ｎｈｅ　Ｉによって消化し、 切断されたプラスミドを再結合させ、これを使用して大腸菌を形質転換すること により達成された。生成したプラスミドはｐＷ６ｈＰ−であった。形質転換体か らのプラスミドＤＮＡをゲル電気泳動させて、大きさが８．３ｋｂから７．５ｋ ｂまで小さくなったことを確認した。

次いで、適当な形質転換体からのプラスミドＤＮＡを、ＣｓＣＩｔ密度勾配遠心 分離により精製した。

第２工程はｈｓｐ７０プロモーター断片を単離する工程である。　Ｎｈｅ　Ｉお よびＡｃｃ　ＩによるｐＷ６ＤＮＡの二重制限酵素消化を行い、次いでゲル電気 泳動および２３１ｂｐ断片（ｈｓｐ７０プロモーターおよびリーダー配列の一部 分を含む）の抽出を行った。シーンクリーン（Ｇｅｎｅ　ｃｌｅａｎ　、商品名 ）を使用して抽出断片を精製し、標準方法を使用して両末端を満たした（マニア チスら、「コールド・スプリング・ハーバ−」（１９Ｂ２）　）。

第３工程はｈｓｐ７０プロモーター断片をアンチセンス配向しているｐＷ６ｈＰ −プラスミド中に挿入する工程である。

ｐＷ６ｈＰ−ＤＮＡをＳｔｕ　Ｉによって３゛ポリリンカーにおいて切断し、ア ルカリ性ホスファターゼで処理し、上述の工程２で単離したｈｓｐ７０プロモー ターに連結した。このＤＮＡを使用して大腸菌を形質転換し、ＤＮＡをいくつか の形質転換体から単離した。これらの形質転換体の制限マツピング（ｒｅｓｔｒ ｉｃｔｉｏｎ　ｎ＋ａｐｐｉｎｇ）を使用してプラスミド（ｐＷ６Ａ）が白色遺 伝子断片に対して必要なアンチセンス配向をしているｈｓｐ７０プロモーター断 片と同一であることを確めた。５ｐｈ１およびＰｓｔ　Ｉを使用した二重消化に よって所望のプラスミドから約２５０ｂｐ断片を生成した。

第４工程は白色遺伝子プロモーターを第１イントロン中に入っている遺伝子の一 部分と共に単離する工程である。

Ｃ３Ｗ９　（完全な白色遺伝子の一層を有するＰエレメントベクター）を旧ｎｃ ｎおよび旧ｎｄＩ［［制限酵素によって二重消化し、次いでゲル電気泳動および １．６ｋｂ白色プロモーター断片の抽出を行った。ジーン・クリーン（商品名） を使用して抽出断片を精製し、上述のようにして両末端を満たした。

第５工程は白色遺伝子プロモーター断片をＰエレメント形質転換ベクター中の白 色遺伝子の正面に挿入する工程である。ＮｈｅＩを使用して工程３からの叶６＾ プラスミドＤＮＡを切断し、両末端を上述のようにして満たし、アルカリ性ホス ファターゼで処理し、上述の工程４からの白色遺伝子と連結した。生成したプラ スミドを使用して大腸菌を形質転換し、ＤＮＡをいくつかの形質転換体から単離 した。ＮｄｅＩおよびＮｈｅ　Ｉによる二重消化を使用する制限マツピングは正 しい意味の配向をしている遺伝子プロモーターを有するプラスミドから２．２５ ｋｂ断片を生成した。生成したＰエレメント形質転換ベクタープラスミド（ｐＷ ６ＡＳ）は、正常な白色遺伝子のセンス転写を行わせる位置に正常な白色遺伝子 プロモーターを有し、またそのアンチセンス転写を生じる位置にｈｓｐ７０プロ モーターを有する。

ｐＷＳＡＳ内のセンス／アンチセンス白色構造体を、Ｐエレメントで媒介された 形質転換を使用してキイロショウジョウバエのストックｗ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ｉ中に 挿入した（スブラドリング（１９８６）、「ドロソフィラ・ア・プラクティカル ・アプローチ」ディー、ビー、ロバーツ編、アイアールエル・プレス・オックス フォード、第１７５〜１９９頁；カレス・アール。

イー、　（１９８５）、「ディーエヌエー・クローニング・第２巻」クロバー・ ディー、ニー、号、アイアールエル・プレス・オックスフォード、第１２１〜１ ４１頁）。精製したｐＷ６ＡＳ　ＤＮＡを、ウィングスークリップド（ｗｉｎｇ ｓ−ｃｌｉｐｐｅｄ）　Ｐ　Ｘレメント・ヘルパー（ｐｒＴ２５．７ｗｃ）　Ｄ ＮＡによって、ディコリオネイトされた（ｄｅｃｈｏｒｉｏ’ｎａｔｅｄ）幼虫 中に同時注射した。得られた子孫を反対の性を有するｗＩ　Ｉ　Ｉ　＠ハエと交 配し、その子孫を正常な条件下に飼養した。成功した形質転換体をある程度眼に 色がついている（即ち、白色ではない）これらの子孫として選択した。スプラド リングおよびカレス（上述の文献を参照のこと）が記載しているような標準方法 を使用して、成功した形質転換体がホモ接合ストックまたは平衡型ストックであ ることを確かめた。若干のストックは生存しているホモ接合形質転換体を生成せ ず、平衡型ストックとして維持される。

斑入りの眼を生成するためにこれらのストックに必要な温度処理は、白色遺伝子 のセンス／アンチセンスＰエレメント構造体の挿入に関する染色体部位によって 左右される。

さなぎ期間中に熱ショックを加えるかあるいは一層高い温度に移行することによ りｈｓｐ７０プロモーターを誘発させた場合に、一層大きい割合の突然変異体（ 白色）細胞が見い出される。これらのストックをＸ染色体についてｗ　ｒ　＋　 ＋　８を使用して試験した。

実施ｍ 白色°ストックに挿入したアンチセンス構造体を使用して白色遺伝子発現を斑入 りにすることによりキイロショウジョウバエにおいて眼の色を斑入りにする方法 。

第１工程はｐＷ６からｈｓｐ７０プロモーターを除去する工程である（　ｈｓｐ ７０−白色遺伝子Ｐエレメント・ベクタープラスミド（タレメンツ（Ｋｌｅｍｅ ｎｚ）　、ウニバー（Ｗｅｂｅｒ）およびゲージング（Ｇｅｈｒｉｎｇ）　「エ ヌエーアール（ＮＡＲ）　Ｊ　１５．３９４７〜３９５９　（１９８７）の第６ 図参照〕。これは、ｐ警６ＤＮＡを制限酵素Ｎｈｅ　Ｉによって消化し、切断さ れたプラスミドを再結合させ、これを使用して大腸菌を形質転換することにより 達成された。生成したプラスミドはｐＷ６ｈＰ−であった。形質転換体からのプ ラスミドＤＮＡをゲル電気泳動させて、大きさが８．３ｋｂから７．５ｋｂまで 小さくなったことを確認した。

第２工程はｈｓｐ７０プロモーター断片を単離する工程である。Ｎｈｅｌおよび Ａｃｃ　Ｉによるｐｉ？６ＤＮＡの二重制限酵素消化を行い、次いで゛ゲル電気 泳動および２３１ｂｐ断片（ｈｓｐ７０プロモーターおよびリーダー配列の一部 分を含む）の抽出を行った。シーンクリーン（商品名）を使用して抽出断片を精 製し、標準方法を使用して末端を満たした（マニアチスら、「コールド・スプリ ング・ハーバ−Ｊ　（１９８２）　）。

第３工程はｈｓｐ７０プロモーター断片をアンチセンス配向しているｐＷ６ｈＰ −プラスミド中に挿入する工程である。

ｐＷ６ｈＰ−ＤＮＡをＳｔｕ　Ｉによって３′ポリリンカーにおいて切断し、ア ルカリ性ホスファターゼで処理し、上述の工程２で単離したｈｓｐ７０プロモー ターに連結した。このＤＮＡを使用して大腸菌を形質転換し、ＤＮＡをいくつか の形質転換体から単離した。これらの形質転換体の制限マツピングを使用してプ ラスミド（ｐＷ６Ａ）が白色遺伝子断片に対して正しいアンチセンス配向をして いるｈｓｐ７０プロモーター断片と同一であることを確めた。ｓｐｈ　Ｉおよび Ｐｓｔｌを使用した二重消化によって所望のプラスミドから約２５０ｂｐ断片を 生成した。

第４工程はｈｓｐ７０プロモーターと白色遺伝子断片の３゛端との間の断片を除 去する工程である。　ｐＷ６ＡからのＤＮＡをＰｓｔ　ＩおよびＣｊ２ａ　Ｉに よって二重消化し、制限ＤＮＡを３１ヌクレアーゼで処理して突出部を除去し、 再結合してｐＷ６Ａ２を生成した。

第５工程はバラ色の遺伝子を単離する工程である。プラスミド・プリル（ｐｌａ ｓｍｉｄ　ｐｒｙｌ）からのＤＮＡ　（ルピン（Ｒｕｂｉｎ）およびスプラドリ ング「サイエンス」幻工、３４８〜３５３（１９８２）　）をＨｉｎｄｌＩ［に よって消化し、制限ＤＮＡをゲル電気泳動させ、バラ色遺伝子座を有する７、２ ｋｂ断片を単離し、ジーン・クリーン（商品名）を使用して精製し、両末端を上 述のようにして満たした。

第６エ程はバラ色遺伝子を構造体中に３′ポリリンカーにおいて挿入する工程で ある。ｐＷＡ２からのＤＮＡをＢａｍＨｎによって消化し、制限ＤＮＡの両末端 を上述のようにして満たし、バラ色断片に結合させた。生成したＰエレメント形 質転換ベクター（ｐ　［Ｗ６Ａ２．　ｒｙ）　）は、アンチセンス配向において 断片の３′端に付着しているｈｓｐ７０プロモーター、白色遺伝子座（大部分の 暗号配列から構成されているが、第１エクソン、大部分のイントロンおよび最後 のエクソンの一部分に欠けている）のほかに完全に機能的なバラ色遺伝子を含む 。

Ｐエレメントで媒介された形質転換を使用して、アンチセンス白色構造体および ｐ　［Ｗ６Ａ２．　ｒｙａｌ内のバラ色遺伝子を、キイロショウジョウバエ・ス トックｒｙ５０６中に挿入した（スプラドリング（１９８６）　、ｒドロソフィ ラ・ア・プラクティカル・アプローチ」ディー、ビー、ロハーツ編、アイアール エル・プレス・オックスフォード、第１７５〜１９９頁；カレス・アール、イー 、　（１９８５）、「ディーエヌエー・クローニング・第２巻」クロバー・ディ ー、ニー、績、アイアールエル・プレス・オンクスフオード、第１２１〜１４１ 頁）。精製したｐ〔讐６Ａ２．　ｒｙ）　ＤＮＡを、ウィングスークリップドＰ エレメント・ヘルパー（ｐｎ２５．７ｗｃ）　ＤＮＡによって、ディコリオネイ トされた幼虫中に同時注射した。得られた子孫を反対の性を有するｒ　ｙ　Ｓ　 Ｏ６ハエと交配し、その子孫を正常な条件下に飼養した。成功した形質転換体を 通常の野生型の眼に赤色がついている（即ち、ｒｙ”　）これらの子孫として選 択した。スプラドリングおよびカレス（上述の文献を参照のこと）が記載してい るような標準方法を使用して、成功した形質転換体がホモ接合ストックまたは平 衡型ストックであることを確かめた。若干のストックは生存しているホモ接合形 質転換体を生成せず、平衡型ストックとして維持される。

通常、温度ショック（３７°Ｃ１１時間）または温度の移行（幼虫期間では１８ °Ｃで育て、さなぎ期間では２９°Ｃに移した）が、斑入りの眼を生成するため にこれらのストックに必要であり、その詳細は白色アンチセンスＰエレメント構 造体の挿入に関する染色体部位によって左右される。多くの場合に、斑入り白色 構造体を生成するにはアンチセンス白色構造体コピー数を増加する必要がある。

構造体コピー数の増加は、形質転換したストックの幼虫にヘルパーＰエレメント （ｐ　ｎ　２５．７ｗｃ）を微量注射し、子孫を飼養し、これらをｒ　ｙ　ＳＯ ＆に交配し、ストックを生成することによってＰエレメントアンチセンス白色遺 伝子構造体を再起動させることにより行った。これらのストックを、上述のよう に熱ショックおよびさなぎ期間中における一層高い温度への移行を利用して、斑 入りの眼について試験した。

１止±１ 白色突然変位ストックに挿入したプロモーター・オフルージョン構造体を使用し て白色遺伝子発現を斑入りにすることによりキイロショウジョウバエにおいて眼 の色を斑入りにする方法。

第１工程はプロモーターを含むｒＲＮＡ遺伝子スペーサーを単離する工程である 。ｐＤｍ２３８　（完全ｒＲＮＡ遺伝子を含むプラスミド）をＩ（ｉｎｄｌＩＩ によって切断し、制御ＤＮＡを電気泳動させ、５．４ｋｂのｒＲＮＡ断片を抽出 した。シーンクリーンを使用して抽出断片を精製し、上述のようにして両末端を 満たした。

第２工程はこのｒＲＮＡスペーサー断片をｐＷｓ　［５’端でポリリンクされて いるもの（ｔｈｅ　ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｄ）を有する点においてｐＷ６とは異な るｈｓｐ７０白色遺伝子Ｐエレメント・ベクタープラスミド（クレメンツ（Ｋｌ ｅｍｅｎｚ）　ら、「エヌエーアール」■、３９４７〜３９５９　（１９８７） 　）に挿入する工程である。

ｐＷ８からのＤＮＡをＳｔｕ　Ｉによって切断し、アルカリ性ホスファターゼで 処理し、ｒＲＮＡスペーサー断片と結合させた。

生成したプラスミドを使用して大腸菌を形質転換し、ＤＮＡをいくつかの変質転 換体から単離した。ＥｃｏＲＩ　、Ｈａｅ　ｍによる二重消化を利用する制限マ ツピングにおいて、正しい（センス）配向をしているｒＲＮＡスペーサー（プロ モーター）（ｐＷ８ｒＰｏ）によってプラスミドから約４．３ｋｂ　０）ｒＲＮ Ａスペーサー断片が生成した。

ｐＷｌＥｒＰＯ内の白色遺伝子プロモーター・オフルージョン構造体をキイロシ ョウジョウバエ・ストックｗ””中に、Ｐエレメントで媒介された形質転換を使 用して挿入した（スプラドリング（１９８６、「ドロソフィラ・ア・プラクティ カル・アプローチ」ディー、ビー、ロバーツ繁、アイアールエル・プレス・オッ クスフォード、第１７５〜１９９　頁；ｈレス・アール、イー、　（１９８５） 、「ディーエヌエー・クローニング・第２巻」クロバー・ディー、ニー、繁、ア イアールエル・プレス・オックスフォード、第１２１〜１４１頁）。精製したｐ Ｗ８ｒＰＯＤＮＡを、ウィングスークリップドＰエレメント・ヘルパー（ｐ　ｎ 　２５．７ｗｃ）　ＤＮＡによって、ディコリオネイトされた幼虫中に同時注射 した。得られた子孫を反対の性を有するｗ　Ｉ　Ｉ　１　ｍハエと交配し、その 子孫を幼虫段階からさなぎ段階まで１８〜２８°Ｃの温度移行を使用して飼養し た。

成功した形質転換体をある程度眼に色がついている（即ち、白色ではない）これ らの子孫として選択した。スプラドリングおよびカレス（上述の文献を参照のこ と）が記載しているような標準方法を使用して、成功した形質転換体がホモ接合 ストックまたは平衡型ストックであることを確かめた。若干のストックは生存し ているホモ接合形質転換体を生成せず、平衡型ストックとして維持される。

斑入りの眼を生成するためにこれらのストックに必要な温度処理は、白色遺伝子 プロモーター・オクルージョンＰエレメント構造体の挿入に関する染色体部位に よって左右される。斑入りはストックを１８°Ｃで込み合ってない理想的な条件 において飼養した場合に見い出される可能性が一層大きい。一層小さい割合の突 然変異（白色）細胞は、さなぎ期間中に熱ションクを加えるかあるいは一層高い 温度に移行することによりｈｓｐ７０ブ９モーターを誘発させた場合に、一層大 きい割合の突然変異体（白色）細胞が見い出される。これらのストックをＸ染色 体についてｗ　＋　＋　＋　８を使用して試験した。

工１劃ｂ１１１ 本発明は植物および動物の種において安定で明確な表現型斑入りを提供するのに 使用することができる。

これらの方法の最も重要な適用は植物において斑入りの葉および花を生成するこ とであり、ネコ、イヌおよび他の動物において斑入り毛皮を生成することである と思われる。

また本発明は動物界の他の門、特に鳥および昆虫に適用することができる。

アンチセンスＲＮＡ ＲＮＡ テン＋センスＲＮＡ ｒｒｒｍ Ｆ工απε１ ロゴＴｎ１ 饗 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成元年　２月 ２７日 特許庁長官　吉　１）　文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＡＵ　８７１０　Ｏ２９１ 、発明の名称 斑　入　リ ３、特許出願人 名称　マツコーリー・ユニバージティー代表者　ヤーベリー・ダイアン 国　籍　オーストラリア国 １９８８年　２月１９日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の写しく翻訳文）　１　通１、少くとも１個の遺伝子の表現型発現 が斑入りである遺伝子操作された多細胞生物において、 少くとも１個の機能的遺伝子、および生物において転写することができ、前記表 現型発現を前記生物内において斑入りを達成するよう変動させるために前記遺伝 子が断続的に発現されるよう前記遺伝子の発現を妨害することができる少くとも １個の挿入されたＤＮ＾配列を有することを特徴とする遺伝子操作された多細胞 生物。

２、前記挿入されたＤＮＡ配列は前記遺伝子から転写されたｍＲＮＡの少くとも 一部分に相補的なｍＲＮＡに対する暗号づけ配列を含む請求項１記載の遺伝子操 作された多細胞生物。

３、前記挿入されたＤＮＡ配列はプロモーターを含む請求項１または２記載の遺 伝子操作された多細胞生物。

４ｏ　前記挿入されたＤＮＡ配列は少（とも１個の機能的遺伝子を暗号づけする 配列を含む請求項１記載の遺伝子操作された多細胞生物。

５、　前記挿入されたＤＮＡ配列はプロモーターの制御下に前記遺伝子から転写 されたｍＲＮＡの少くとも一部分に相補的な＋ｎＲＮＡに対する暗号づけ配列を 含む請求項１記載の遺伝子操作された多細胞生物。

６、前記挿入されたＤＮＡ配列は少くとも１個の機能的遺伝子を暗号づけする第 １配列、および少くとも１個の機能的遺伝子から転写されたｍＲＮＡの少くとも 一部分に相補的なｍＲＮＡを暗号づけする第２配列を含み、前記第１および第２ の配列は別個のプロモーターの制御下にある請求項５記載の遺伝子操作された多 細胞生物。

７、　前記挿入されたＤＮＡ配列は第１プロモーターの制御下にある少くとも１ 個の機能的遺伝子を暗号づけする配列を含み、前記挿入されたＤＮＡ配列は前記 第１プロモーターに対して５′に位置しかつ少くとも１個の分別遺伝子と同じ方 向に転写される少くとも１個の追加プロモーターを含む請求項１記載の遺伝子操 作された多細胞生物。

８、少くとも１個の機能的遺伝子が前記生物またはその配偶子中に存在し、前記 挿入されたＤＮＡ配列は少くとも１個のプロモーターを含み、前記挿入されたＤ ＮＡ配列は前記少くとも１個の機能的遺伝子に対して５′に位置しかつ前記少く とも１個の機能的遺伝子と同じ方向に転写されている請求項１記載の遺伝子操作 された多細胞生物。

９、前記挿入されたＤＮＡ配列はプロモーターを含んでおり、前記挿入されたＤ ＮＡ配列の一方のストランドの転写が少くとも１個の機能的遺伝子のプロモータ の制御下にありかつ前記挿入された遺伝子の他方のストランドの転写が前記挿入 されたＤＮＡ配列中に存在するプロモーターの制御下にあるように、前記少くと も１個の機能的遺伝子のイントロン中に挿入されている請求項１記載の遺伝子操 作された多細胞生物。

１０、前記生物は植物である請求項１記載の遺伝子操作された多細胞生物。

１１、前記生物は動物である請求項１記載の遺伝子操作された多細胞生物。

１２、遺伝子操作によって多細胞生物に斑を入れるに当り、前記生物中に転写す ることができかつ少くとも１個の機能的遺伝子の発現を妨害することができる少 くとも１個のＤＮＡ配列を、前記表現型発現を前記生物において斑入りが達成さ れるよう変動させるために前記遺伝子が前記生物において断続的に発現されるよ うに、前記生物またはその配偶子中に挿入することを特徴とする遺伝子操作によ って多細胞生物に斑を入れる方法。

１３、前記挿入されたＤＮＡ配列は前記遺伝子から転写されたｍＲＮＡの少くと も一部分に相補的なｍＲＮＡに対する暗号づけ配列を含む請求項１２記載の方法 。

１４、前記挿入されたＤＮＡ配列は少くとも１個のプロモータ１５、前記挿入さ れたＤＮＡ配列は少くとも１個の機能的遺伝子を暗号づけする配列を含む請求項 １２記載の方法。

１６、前記挿入されたＤＮＡ配列はプロモーターの制御下に前記遺伝子から転写 されたｍＲＮＡの少くとも一部分に相補的なｍＲＮＡを暗号づけする配列を含む 請求項１２記載の方法。

１７、前記挿入されたＤＮＡ配列は少くとも１個の機能的遺伝子を暗号づけする 第１配列、および少くとも１個の機能的遺伝子から転写されたｍＲＮＡの少くと も一部分に相補的なｍＲＮＡを暗号づけする第２配列を含み、前記第１および第 ２の配列は別個のプロモーターの制御下にある請求項１６記載の方法。

１８、前記挿入されたＤＮＡ配列は第１プロモーターの制御下にある少くとも１ 個の機能的遺伝子を暗号づけする配列、および前記第１プロモーターに対して５ ′に位置しかつ少くとも１個の分別遺伝子と同じ方向に転写される少くとも１個 の追加プロモーターを含む請求項１２記載の方法。

１９、少くとも１個の機能的遺伝子が前記生物またはその配偶子中に存在し、前 記挿入されたＤＮＡ配列はプロモーターを含み、前記挿入されたＤＮＡ配列は前 記少くとも１個の機能的遺伝子に対して５゛に位置しかつ前記少くとも１個の機 能的遺伝子と同じ方向に転写される請求項１２記載の方法。

２０、前記挿入されたＤＮＡ配列はプロモーターを含んでおり、前記挿入された ＤＮＡ配列の一方のストランドの転写が少くとも１個の機能的遺伝子のプロモー タの制御下にありかつ前記挿入された遺伝子の他方のストランドの転写が前記挿 入されたＤＮＡ配列中に存在するプロモーターの制御下にあるように、前記少く とも１個の機能的遺伝子のイントロン中に挿入される請求項１３記戦の方法。

２１、少くとも１個の機能的遺伝子はその正常な制御配列を含んでいる請求項１ ５記載の方法。

２２、前記挿入されたＤＮＡ配列は少くとも１個の機能的遺伝子から転写された ｍＲＮＡの少くとも一部分に相補的なｍＲＮＡを暗号づけする配列に対して３′ に位置する転写停止信号を含む請求項１３記載の方法。

２３、前記プロモーターがカリフラワー・モザイクウィルスの３５５プロモータ ーである請求項１４記載の方法。

２４、少くとも１個の機能的遺伝子は制御するプロモーターを外部刺激によって 調節され、かつ／または前記挿入されたＤＮＡ配列は外部刺激によって調節され るプロモーターを含む請求項１４記載の方法。

２５、前記外部刺激が温度変動、光、極微量元素の濃度、栄養条件、重金属およ びホルモンからなる群から選定されている請求項２４記載の方法。

２６、前記多細胞生物が植物である請求項１２記載の方法。

２７、前記多細胞生物が動物である請求項１２記載の方法。

２８、請求項１２記載の方法゛によって生成した斑入り植物または動物の品種。

国際調査報告 −１＝−、、、、−、、、，１，、、、、、−＝、ＰＣτ／ノコ１Ｕεフ１００ ２９１＋２゛Ｉ′″パ６°Ｉ’ａｔｅ−１ｃｌ°”ＰＣＴ／ＡＵεフ１００２９ １Ａ、’１ＮＥＸ■７＝Ｐξロ廿込Ｔ’（（ａＬ酵スにΣ≠フゴσα；−α乱Ｍ 乙工λ＝Ｇ■す、にπ／λＵ３７００２９１ＡＵ　２４２０８／８４　ＤＫ　４ ９１／８４　り　１１８３９３　＋Ｐ５９１９２０９１・ＮＬ　１１８３９３　 Ｎ〕　８４０４１Ｂ　話　８４００８０１ＮＪ７０５９７／８７

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．少くとも１個の遺伝子の表現型発現が斑入りである遺伝子操作された生物に おいて、 少くとも１個の機能的遺伝子、および生物において転写することができ、前記遺 伝子が断続的に発現されるよう前記遺伝子の発現を妨害することがてきる少くと も１個の挿入されたＤＮＡ配列を有することを特徴とする遺伝子操作された生物 。
2. ２．前記挿入されたＤＮＡ配列は前記遺伝子から転写されたｍＲＮＡの少くとも 一部分に相補的なｍＲＮＡに対する暗号づけを行う請求項１記載の生物。
3. ３．前記挿入されたＤＮＡ配列はプロモーターを含む請求項１または２記載の生 物。
4. ４．少くとも１個の遺伝子を有し、該遺伝子はプロモーターと、該プロモーター が前記遺伝子のアンチセンスコピーの転写を促進して前記遺伝子のセンスコピー から転写されたｍＲＮＡに対してハイブリッド形成可能なメッセージを発生する ように配向するよう、前記遺伝子に対して３′において組み合わせられているか 、あるいは該遺伝子は前記プロモーターと、該プロモーターが前記遺伝子と組み 合わされている任意のプロモーター配列の上流に位置しかつ読み過し転写によっ て細長い非機能的ｍＲＮＡを生じさせて、前記生物において前記遺伝子の斑入り 発現を生じることができるよう、前記遺伝子に対して５′において組み合わせら れていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一つの項に記載の遺伝子操作 された生物。
5. ５．前記プロモーターおよび前記遺伝子の両方が前記生物またはその配偶子中に 挿入され、前記プロモーターはアンチセンス・ストランド中において前記遺伝子 に対して３′に位置している請求項４記載の生物。
6. ６．前記遺伝子は前記生物またはその配偶子中に存在していて機能的であり、前 記プロモーターは前記アンチセンス・ストランドにおいて前記遺伝子に対して３ ′に挿入されている請求項４記載の生物。
7. ７．前記遺伝子は前記生物またはその配偶子中に存在していて機能的であり、前 記プロモーターは前記遺伝子に対して５′に挿入されている請求項４記載の生物 。
8. ８．前記プロモーターおよび前記遺伝子の両方が前記生物またはその配偶子中に 挿入され、前記プロモーターは前記遺伝子に対して５′に位置している請求項４ 記載の生物。
9. ９．前記挿入されたＤＮＡ配列が前記アンチセンス・ストランドにおいて前記遺 伝子のイントロン中に挿入されている請求項２または３記載の生物。
10. １０．植物である請求項１〜９のいずれか一つの項に記載の生物。
11. １１．動物である請求項１〜９のいずれか一つの項に記載の生物。
12. １２．遺伝子操作によって生物に斑を入れるに当り、前記生物市に転写すること ができかつ少くとも１個の機能的遺伝子の発現を妨害することができる少くとも １個のＤＮＡ配列を、前記遺伝子が前記生物において断続的に発現されるように 前記生物またはその配偶子中に挿入することを特徴とする遺伝子操作によって生 物に斑を入れる方法。
13. １３．前記挿入されたＤＮＡ配列は前記遺伝子から転写されたｍＲＮＡの少くと も一部分に相補的なｍＲＮＡに対する暗号である請求項１２記載の方法。
14. １４．前記挿入されたＤＮＡ配列はプロモーターを含んでいる請求項１２または １３記載の生物。
15. １５．ａ）問題とする少くとも１個の遺伝子を含むＤＮＡ配列をクローニングし ； ｂ）プロモーターを前記ＤＮＡ配列中に、前記プロモーターが前記遺伝子のアン チセンスコピーの転写を促進して前記遺伝子のセンスコピーから転写されたｍＲ ＮＡに対してハイブリッド形成可能なメッセージを発生するように配向するよう 、前記遺伝子に対して３′において挿入するか、あるいは前記プロモーターが前 記遺伝子と組み合わされている任意のプロモーター配列の上流に位置しかつ読み 過し転写によって細長い非機能的ｍＲＮＡを生じさせることができるよう、前記 遺伝子に対して５′において挿入し； ｃ）形質転換ベクターを使用して前記遺伝子構造体を問題とする種中に挿入しす る ことを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか一つの項に記載の方法。
16. １６．前記プロモーターは前記遺伝子に対して３′に挿入されている請求項１５ 記載の方法。
17. １７．前記プロモーターは前記遺伝子に対して５′に挿入されている請求項１５ 記載の方法。
18. １８．前記遺伝子はその正常なコントロール配列を含んでいる請求項１２〜１７ のいずれか一つの項に記載の方法。
19. １９．さらに、前記遺伝子のセンスコピーまたはアンチセンスコピーのいずれか に対して３′に転写停止信号を挿入する請求項１２〜１８のいずれか一つの項に 記載の方法。
20. ２０．前記挿入されたＤＮＡ配列を前記遺伝子のイントロン中に挿入する請求項 １３または１４記載の方法。
21. ２１．前記挿入されたプロモーターがカリフラワー・モザイクウイルスのＳ３５ プロモーターである請求項１２〜２０のいずれか一つの項に記載の方法。
22. ２２．前記挿入されたプロモーターが外部刺激によって調節された促進能力を有 する請求項１２〜２１のいずれか一つの項に記載の方法。
23. ２３．前記外部刺激が温度変動、光、極微量元素の濃度、栄養条件、重金属また はホルモンを含む請求項２２記載の方法。
24. ２４．前記種が植物の種である請求項１２〜２３のいずれか一つの項に記載の方 法。
25. ２５．前記種が動物の種である請求項１２〜２３のいずれか一つの項に記載の方 法。
26. ２６．請求項１２〜２５のいずれか一つの項に記載の方法によって生成した斑入 りの植物または動物の種。
27. ２７．問題とする種の染色体ＤＮＡ中に挿入するのに適したレプリコン、遺伝子 クローニング部位および該遺伝子クローニング部位に挿入された少くとも１個の 遺伝子の発現を妨害することができるＤＮＡ配列を有することを特徴とするベク ター系。
28. ２８．前記遺伝子クローニング部位がポリリンカー配列である請求項２７記載の ベクター系。
29. ２９．さらに、前記クローニング部位に対して３′に転写停止配列を有する請求 項２７または２８記載のベクター系。