JPH02465A - 新菌株 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はアゲ「１バクテリウム・ラジオバクター（Δ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｋ−±ｔ２
− ｒ ） Ｋ ８４のミコ、−タント株および該株
を用いて植物の病気を抑制する方法に閏イる。
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｋ−±ｔ２
− ｒ ） Ｋ ８４のミコ、−タント株および該株
を用いて植物の病気を抑制する方法に閏イる。
（従来の技術）
アゲ「１ハクテリ・′ツム・ラジオバクターに８，１は
、土壌中に生息するパテリアであり、アグロバクテリウ
ム・ラジオバクターのツメファシェンス（Ｌｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ）種により引き起こされる植物病であるクラ
ウンゴール（ｃｒｏｗｎ ｇａｌｌ）の生物学的抑制
のために、商業的に使用される非病原性の土壌生息バク
テリアである。このツメファシェンスは、傷口を通って
植物体内に侵入し、無調節な細胞分裂を誘発し、大きな
こぶ（ｇａｌｌ）の形成を引き起こす。
、土壌中に生息するパテリアであり、アグロバクテリウ
ム・ラジオバクターのツメファシェンス（Ｌｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ）種により引き起こされる植物病であるクラ
ウンゴール（ｃｒｏｗｎ ｇａｌｌ）の生物学的抑制
のために、商業的に使用される非病原性の土壌生息バク
テリアである。このツメファシェンスは、傷口を通って
植物体内に侵入し、無調節な細胞分裂を誘発し、大きな
こぶ（ｇａｌｌ）の形成を引き起こす。
オーストラリアにおいては、アーモンド、桃およびバラ
がクラウンゴールにより最も甚大な被害を受ける作物で
ある。最近まで、クラウンゴールの満足すべき抑制は、
栽培植物の栽培材料を、アグロバクテリウム・ラジオバ
クターに８４の細胞Ｑｉ液に浸漬することにより達成さ
れていた。アグロバクテリウム・ラジオバクターに８４
の作用は、Ａ、ツメファシェンスの抑制に関与する抗住
物竹であるアグロシン８４の合成によることが分かって
きた。
がクラウンゴールにより最も甚大な被害を受ける作物で
ある。最近まで、クラウンゴールの満足すべき抑制は、
栽培植物の栽培材料を、アグロバクテリウム・ラジオバ
クターに８４の細胞Ｑｉ液に浸漬することにより達成さ
れていた。アグロバクテリウム・ラジオバクターに８４
の作用は、Ａ、ツメファシェンスの抑制に関与する抗住
物竹であるアグロシン８４の合成によることが分かって
きた。
アグロシン抑制システムは有効ではあったが、野外での
抑制の失敗例も生じている。感受性株によるプラスミド
ｐＡｇＫ８４ （これはアグロシン８４抗生物質の合成
の遺伝子およびこれに対する免疫性をコードする遺伝子
を含んでいる）の獲得が最近報告されている。このこと
は、充分に１ｌｌｉ発住能を持ったアグロシン８４−耐
性株の出現を引き起こしうる。このことはまた、ｐＡｇ
Ｋ８４を明らかにプラスミドの移動および伝達により、
他のアゲロバクチリアに感染させうるという他の報告と
も一致する。上記抑制の失敗例は、クラウンゴールの生
物学的抑制を継続的に成功させるためには、重大な脅威
である。
抑制の失敗例も生じている。感受性株によるプラスミド
ｐＡｇＫ８４ （これはアグロシン８４抗生物質の合成
の遺伝子およびこれに対する免疫性をコードする遺伝子
を含んでいる）の獲得が最近報告されている。このこと
は、充分に１ｌｌｉ発住能を持ったアグロシン８４−耐
性株の出現を引き起こしうる。このことはまた、ｐＡｇ
Ｋ８４を明らかにプラスミドの移動および伝達により、
他のアゲロバクチリアに感染させうるという他の報告と
も一致する。上記抑制の失敗例は、クラウンゴールの生
物学的抑制を継続的に成功させるためには、重大な脅威
である。
（発明が解決しようとする問題点）
従って、本発明の目的は、前記従来技術に関連する問題
点を克服し、または少なくとも軽減することである。
点を克服し、または少なくとも軽減することである。
（問題点を解決する手段）
本発明で用いる材料の入手先と若干の用語の定義は次の
とおりである。
とおりである。
アグロバクテリウム・ラジオバクターに８４株は、ＮＣ
ＰＰＢ （英国、ハンチング・グリーン（Ｈａｔｃｈｉ
ｎ Ｇｒｅｅｎ）、ハーペンデン（Ｉｌａｒｐｅｎｄ
ｅｎ） Ｌ５ ２ＢＤ）に２４０７の寄託番号で寄託
されており、また、ＰＤＤＣＣにュージーランド、ＤＳ
ＩＲ、プライベート・バッグ（Ｐｒｉｖａｔｅ Ｂａ
ｇ）、オークランド（Ａｕｃｋｌａｎｄ））に３３７９
の寄託番号で寄託されている。この株は、また次の市販
経路からも入手可能である：オーストラリア、私書１３
６１． ウォイ・ウォイ、ニュー・サウス・ウェールズ
（Ｗａｙ Ｗａｙ、Ｎｅｗ ５ｏｕｔｈ Ｗａｉ
ｅｓ）、３３５６のＲｏｏＬ Ｎｏｄｕｌｅ Ｐｔ
ｙ、Ｌｉｍ１Ｌｅｄおよび米国、カリホルニア、オリン
ダ（Ｏｒｉｎｄａ）のＡｇＢ ｉ ｏ Ｃｈ ｅｍ
（ＥＰＡ９録番号Ｎｏ、３８０８７−２）。
ＰＰＢ （英国、ハンチング・グリーン（Ｈａｔｃｈｉ
ｎ Ｇｒｅｅｎ）、ハーペンデン（Ｉｌａｒｐｅｎｄ
ｅｎ） Ｌ５ ２ＢＤ）に２４０７の寄託番号で寄託
されており、また、ＰＤＤＣＣにュージーランド、ＤＳ
ＩＲ、プライベート・バッグ（Ｐｒｉｖａｔｅ Ｂａ
ｇ）、オークランド（Ａｕｃｋｌａｎｄ））に３３７９
の寄託番号で寄託されている。この株は、また次の市販
経路からも入手可能である：オーストラリア、私書１３
６１． ウォイ・ウォイ、ニュー・サウス・ウェールズ
（Ｗａｙ Ｗａｙ、Ｎｅｗ ５ｏｕｔｈ Ｗａｉ
ｅｓ）、３３５６のＲｏｏＬ Ｎｏｄｕｌｅ Ｐｔ
ｙ、Ｌｉｍ１Ｌｅｄおよび米国、カリホルニア、オリン
ダ（Ｏｒｉｎｄａ）のＡｇＢ ｉ ｏ Ｃｈ ｅｍ
（ＥＰＡ９録番号Ｎｏ、３８０８７−２）。
プラスミドｐＡｇＫ８４は、上記アグロバクテリウム・
ラジオバクターに８４株中に存在している。
ラジオバクターに８４株中に存在している。
アグロバクテリウム Ｃ５８ＮＴ１株は アグロバクテ
リウム Ｃ５８株からワトソン（ＷａＬｓｏｎ）ら、Ｊ
、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１２３゜２５５−２６．＋
（＋９８５３の方法に従って得られる。アグロバクテリ
ウム Ｃ１８株は、オランダ国、デ・ミトフ ３−５８
４ シーエッチ ュトレヒト （Ｄａ Ｍｉｔｈｏ
ｆ ３−５８４ ＣＨＵＴＲＥＣＨＴ）のファバー
ゲン・コレクション（Ｐｈａｂａｇｅｎ Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉ。
リウム Ｃ５８株からワトソン（ＷａＬｓｏｎ）ら、Ｊ
、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１２３゜２５５−２６．＋
（＋９８５３の方法に従って得られる。アグロバクテリ
ウム Ｃ１８株は、オランダ国、デ・ミトフ ３−５８
４ シーエッチ ュトレヒト （Ｄａ Ｍｉｔｈｏ
ｆ ３−５８４ ＣＨＵＴＲＥＣＨＴ）のファバー
ゲン・コレクション（Ｐｈａｂａｇｅｎ Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉ。
ｎ）の分子細胞生物学部（ＤｅｐａｒＬｍｅｎＬｏｆ
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｅ１ｌ Ｂｉ。
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｅ１ｌ Ｂｉ。
ｒｏＢｙ）から入手可能である６約、Ｃ５８ＮＴ１株は
、米国ワシントン ９８１９５． シアトル。
、米国ワシントン ９８１９５． シアトル。
ユニバーシティ・オブ・ワシントンのＤｅｐａｒＬｍｅ
ｎＬ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ
［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ等の多くの研究室から分譲を受け
ることもできる。
ｎＬ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ
［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ等の多くの研究室から分譲を受け
ることもできる。
プラスミドρＢＲ３２５は、米国、コネチカット ０６
５１０．ニューヘブン、私凹笛３３３３゜３３３セダー
ストリート（Ｃｅｄａｒ ５ＬｒｃｃＬ）、エール（
Ｙａｌｅ）ユニバーシティの大腸閉１４１伝子ストック
センター（Ｅ、ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃ
ｋ Ｃｅｒ＋ｔｅｒ）ヒト遺伝子部（ＤｅｐａｒＬｍｅ
ｎＬ ａ（Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＬｉｅｓ）等の多
くの実験室から入手できる。
５１０．ニューヘブン、私凹笛３３３３゜３３３セダー
ストリート（Ｃｅｄａｒ ５ＬｒｃｃＬ）、エール（
Ｙａｌｅ）ユニバーシティの大腸閉１４１伝子ストック
センター（Ｅ、ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃ
ｋ Ｃｅｒ＋ｔｅｒ）ヒト遺伝子部（ＤｅｐａｒＬｍｅ
ｎＬ ａ（Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＬｉｅｓ）等の多
くの実験室から入手できる。
本明細書において、「コインテグレート」の用語は二種
またはそれ以上のプラスミドの共有結合（物）を意味す
る。「トランスコンシュガント」の用語は、二つの細菌
株の交配（クロス）の結果プラスミドを受は取った細菌
をいう、［ミニ調製物」の用語は、小規８２培養即ち通
常１０ｍ！また６よそれ以下の培養から抽出したＤＮＡ
に対応する。
またはそれ以上のプラスミドの共有結合（物）を意味す
る。「トランスコンシュガント」の用語は、二つの細菌
株の交配（クロス）の結果プラスミドを受は取った細菌
をいう、［ミニ調製物」の用語は、小規８２培養即ち通
常１０ｍ！また６よそれ以下の培養から抽出したＤＮＡ
に対応する。
本発明の第一の観点じおいては、抗生物質アグロシン８
４の合成をコードするが、伝達領域の限定的欠損により
伝達が阻止されるように修飾された遺伝子を含むプラス
ミドが提供される。
４の合成をコードするが、伝達領域の限定的欠損により
伝達が阻止されるように修飾された遺伝子を含むプラス
ミドが提供される。
本発明のプラスミドは、プラスミドｐＡｇＫ８４の誘導
体でありうる０本発明のプラスミドはＥｃ ｏ Ｒｌフ
ラグメントのＤｌおよび［１が、ＰＡｇｋ１３１から実
質的に完全に除去されていることを特徴とし得る。プラ
スミドｐ Ａ Ｂ Ｋ ８４の制限酵素地図は第１図に
示す。
体でありうる０本発明のプラスミドはＥｃ ｏ Ｒｌフ
ラグメントのＤｌおよび［１が、ＰＡｇｋ１３１から実
質的に完全に除去されていることを特徴とし得る。プラ
スミドｐ Ａ Ｂ Ｋ ８４の制限酵素地図は第１図に
示す。
従って、本発明の好ましい態様においては、ＰΔｇＫ８
４ΔＥ ｃ ｏ ＲＩ Ｄ ｉ 十Ｈとして本明細書
に記載されているプラスミドｐＡｇＫ］０２６およびそ
の誘導体が提供される。
４ΔＥ ｃ ｏ ＲＩ Ｄ ｉ 十Ｈとして本明細書
に記載されているプラスミドｐＡｇＫ］０２６およびそ
の誘導体が提供される。
本発明の他の態様によれば、抗生物質アグロシン８４の
合成をコードし、伝達（トランスファー）領域の欠損に
より伝達が阻止されるように修飾された遺伝子を含むプ
ラスミドを持つアグロバクテリウム・・ラジオバクター
に８４の非病原性株、その誘導体およびミュータントが
提供される。
合成をコードし、伝達（トランスファー）領域の欠損に
より伝達が阻止されるように修飾された遺伝子を含むプ
ラスミドを持つアグロバクテリウム・・ラジオバクター
に８４の非病原性株、その誘導体およびミュータントが
提供される。
上記の株は、植物病のクラウンゴールを生物学的に抑制
するために適当な蚊補であることが、理解されるであろ
う。そのような株は、伝達領域の実質的部分が削除され
ていることを除けば、アグロバクテリウム・ラジオバク
ターに８．１株の全ての１．？徴を保持している。その
ため、アグロシン８４に感受性の病原性菌株がプラスミ
ドの移動むよび伝ｊ？によると思われるプラスミドｐ
Ａ 、、 Ｋ ８４の伝播による免疫を獲得する危険性
が減少または消失する。
するために適当な蚊補であることが、理解されるであろ
う。そのような株は、伝達領域の実質的部分が削除され
ていることを除けば、アグロバクテリウム・ラジオバク
ターに８．１株の全ての１．？徴を保持している。その
ため、アグロシン８４に感受性の病原性菌株がプラスミ
ドの移動むよび伝ｊ？によると思われるプラスミドｐ
Ａ 、、 Ｋ ８４の伝播による免疫を獲得する危険性
が減少または消失する。
好ましい態様では、アグロバクテリウム・ラジオバクタ
ーＫ ８ 、Ｉの非病原性株は、プラスミドｐＡｇＫ８
４の誘導体であるプラスミドを含む。
ーＫ ８ 、Ｉの非病原性株は、プラスミドｐＡｇＫ８
４の誘導体であるプラスミドを含む。
従って、好ましい態様では、アグロバクテリウム・ラジ
オバクターに８４の非病原性株に１０２６、その誘導体
およびミュータントが提供され、そのサンプルはオース
トラリア国、サウスオーストラリア、アゾレードのアゾ
レード大学、植物病理学部（Ｐｌａｎｔ ＰａＬｈｏ
ｌｏｇｙ ＤｅｐａｒＬｍｅｎＬ）のカルチャーコレ
クションに保存され−Ｃいる。
オバクターに８４の非病原性株に１０２６、その誘導体
およびミュータントが提供され、そのサンプルはオース
トラリア国、サウスオーストラリア、アゾレードのアゾ
レード大学、植物病理学部（Ｐｌａｎｔ ＰａＬｈｏ
ｌｏｇｙ ＤｅｐａｒＬｍｅｎＬ）のカルチャーコレ
クションに保存され−Ｃいる。
本発明の別の態様では、抗生物質アグロシン８４の合成
をコードするが、伝Ｗ’ｐＭ域を失うことにより伝達が
阻１１二されるように修飾された遺伝子を含むプラスミ
ドの製造方法が提供され、該方法はニ プラスミドＰΔｇＫ ８４およびｉｉ！ｉ当なプラスミ
ドクローニングベクターを用意し： 該プラスミドクローニングベクターにブラスミ１” ｐ
Ａ ［Ｋ ８４のＢａｍ１ｌｌフラグメントのＢ １
を挿入し；そして 挿入フラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩと接触させて、
ＥｃｏＲＩフラグメントのＤｌおよびＨを削除する； ことよりなる。
をコードするが、伝Ｗ’ｐＭ域を失うことにより伝達が
阻１１二されるように修飾された遺伝子を含むプラスミ
ドの製造方法が提供され、該方法はニ プラスミドＰΔｇＫ ８４およびｉｉ！ｉ当なプラスミ
ドクローニングベクターを用意し： 該プラスミドクローニングベクターにブラスミ１” ｐ
Ａ ［Ｋ ８４のＢａｍ１ｌｌフラグメントのＢ １
を挿入し；そして 挿入フラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩと接触させて、
ＥｃｏＲＩフラグメントのＤｌおよびＨを削除する； ことよりなる。
適するプラスミドクローニングベクターは、プラスミド
ｐＢＲ３２５である。このプラスミドの１３ ａ ｍ
ＨＩフラグメントＢｌからＥ ｃ ｏ Ｒｌフラグメン
ト）Ｉおよび＋１が削除されたとき形成されるプラスミ
ドは、プラスミドｐＭＨＲ１００と命名され、そのサン
プルはアゾレード大学、植物病理学部（ＰＩａｎＬ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｄａｐａｒｔｍｅｎｔ）のカル
チャーコレクシジンに保存されている。プラスミドｐＭ
ＨＲ１００は、削ド↑のそれぞれ側にプラスミドｐＡｇ
Ｋ８４の約３．７ｋｂおよび０．５ｋｂが残っているこ
とを特徴とする。従って、本発明の好ましい態様も二お
いては、ブラスミ）”ｐＭｌｌＲｌｏｏおよびイの誘導
体が提供される。
ｐＢＲ３２５である。このプラスミドの１３ ａ ｍ
ＨＩフラグメントＢｌからＥ ｃ ｏ Ｒｌフラグメン
ト）Ｉおよび＋１が削除されたとき形成されるプラスミ
ドは、プラスミドｐＭＨＲ１００と命名され、そのサン
プルはアゾレード大学、植物病理学部（ＰＩａｎＬ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｄａｐａｒｔｍｅｎｔ）のカル
チャーコレクシジンに保存されている。プラスミドｐＭ
ＨＲ１００は、削ド↑のそれぞれ側にプラスミドｐＡｇ
Ｋ８４の約３．７ｋｂおよび０．５ｋｂが残っているこ
とを特徴とする。従って、本発明の好ましい態様も二お
いては、ブラスミ）”ｐＭｌｌＲｌｏｏおよびイの誘導
体が提供される。
後の挿入に適当なサイズのフラグメントを与えるため、
削除の一方の側のＰ Ａ ｇ Ｋ ８ ／Ｉの０．５ｋ
ｂ部分は、ｐＡｇＫ８４のＢａｍＨＩフラグメントＣの
クローンからのＥｃｏＲ１フラグメントＤ２を付加して
、約３．３ｋｂに増大させてもよい。
削除の一方の側のＰ Ａ ｇ Ｋ ８ ／Ｉの０．５ｋ
ｂ部分は、ｐＡｇＫ８４のＢａｍＨＩフラグメントＣの
クローンからのＥｃｏＲ１フラグメントＤ２を付加して
、約３．３ｋｂに増大させてもよい。
従って、本発明のさらに別の態様においては、本発明の
方法はさらに、ｐＡｇＫ８４のＢａｍＨＩのフラグメン
トＣを含むプラスミドを用意し、そして削除の一方の側
に残っているｐＡｇＫ８４の約０．５ｋｂ残存部分にＥ
ｃｏＲ１フラグメントＤ２を付加し、該残存部分を約３
．３ｋｂに増大させることも含む。
方法はさらに、ｐＡｇＫ８４のＢａｍＨＩのフラグメン
トＣを含むプラスミドを用意し、そして削除の一方の側
に残っているｐＡｇＫ８４の約０．５ｋｂ残存部分にＥ
ｃｏＲ１フラグメントＤ２を付加し、該残存部分を約３
．３ｋｂに増大させることも含む。
適当なりローンはプラスミドｐＤＡＪ１０１と命名され
て、オーストラリア国、サウスオーストラリア、アゾレ
ードのアゾレード大学、植物病理学部（ＰＩａｎＬ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ＤｅｐａｒＬｍｅｎＬ）のカル
チャーコレクションに保存されているものである。混合
クローンはｐＤＡＪＩ０２と命名され、そのサンプルは
アゾレード大学、植物病理学部（Ｐｌａｎｔ ＰａＬ
ｈｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ）のカルチャー
コレクションに保存されている。従って、本発明のさら
に別の態様においては、プラスミドｐＤＡＪ１０２が提
供される。
て、オーストラリア国、サウスオーストラリア、アゾレ
ードのアゾレード大学、植物病理学部（ＰＩａｎＬ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ＤｅｐａｒＬｍｅｎＬ）のカル
チャーコレクションに保存されているものである。混合
クローンはｐＤＡＪＩ０２と命名され、そのサンプルは
アゾレード大学、植物病理学部（Ｐｌａｎｔ ＰａＬ
ｈｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ）のカルチャー
コレクションに保存されている。従って、本発明のさら
に別の態様においては、プラスミドｐＤＡＪ１０２が提
供される。
本発明の態様によれば、プラスミドを製造する方法は更
に、 抗生物質耐性マーカーを伝達領域の近くに挿入されて有
するプラスミドｐＡｇＫ８４を宿している第一のアグロ
バクテリウム株； プラスミドｐＡｇＫ８４を欠損した第二のアグロバクテ
リウム・ラジオバクターに８４株：および 伝達領域の限定的削除により伝達が阻止されるように修
飾された、ｐＡｇＫ８〆１の伝達領域を含ムフラスミド
クローニングベクターｐＢＲ３２５を宿している、大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）株を用意し； 抗生物質アグロシン日ぺの合成をコードし、ＥｃｏＲ］
フラグメントのＤｌおよびＨの削除によって抗生物質耐
性マーカー株へと修飾された遺伝子を含むプラスミドク
ローニングベクターを、移動および伝達させ；そして プラスミドｐＡｇＫ８４を持っていないアグロバクテリ
ウム・ラジオバクターに８４株へ結合して、コインテグ
レートを伝達することを含む。
に、 抗生物質耐性マーカーを伝達領域の近くに挿入されて有
するプラスミドｐＡｇＫ８４を宿している第一のアグロ
バクテリウム株； プラスミドｐＡｇＫ８４を欠損した第二のアグロバクテ
リウム・ラジオバクターに８４株：および 伝達領域の限定的削除により伝達が阻止されるように修
飾された、ｐＡｇＫ８〆１の伝達領域を含ムフラスミド
クローニングベクターｐＢＲ３２５を宿している、大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）株を用意し； 抗生物質アグロシン日ぺの合成をコードし、ＥｃｏＲ］
フラグメントのＤｌおよびＨの削除によって抗生物質耐
性マーカー株へと修飾された遺伝子を含むプラスミドク
ローニングベクターを、移動および伝達させ；そして プラスミドｐＡｇＫ８４を持っていないアグロバクテリ
ウム・ラジオバクターに８４株へ結合して、コインテグ
レートを伝達することを含む。
この観点によれば、本発明の方法はさらに上記トランス
コンシュガントを、削除−マーカー交換に付することも
含む。
コンシュガントを、削除−マーカー交換に付することも
含む。
第一アグロバクテリウム・ラジオバクターの株は、伝達
（Ｔｒａ）ｅｆｆ域のすぐ外側にＴｎ５挿入片を含んで
よい、この挿入片は抗生物質マーカーとしてＪ！Ｉ能す
るカナマイシン耐性を付与する。アグロバクテリウムの
Ｃ５８ＮＴ１株を使用することができる。
（Ｔｒａ）ｅｆｆ域のすぐ外側にＴｎ５挿入片を含んで
よい、この挿入片は抗生物質マーカーとしてＪ！Ｉ能す
るカナマイシン耐性を付与する。アグロバクテリウムの
Ｃ５８ＮＴ１株を使用することができる。
得られたＴｒａ−プラスミドはこのように形成された株
の中で安定であり、そして正常なアグロシン８４の生産
を示すと理解されるであろう。
の中で安定であり、そして正常なアグロシン８４の生産
を示すと理解されるであろう。
こうして形成されたプラスミドはρＡ３ＫＩ０２６と命
名され、ｐ Ａ ｇ Ｋ ８ ｔ１ΔＥｃｏＲＩ Ｄ
１＋Ｈである。上記抗生物質耐性を宿すアグロバクテリ
ウム・ラジオバクターに８４の株はＫＩＯ２６と命名さ
れ、そのサンプルは、アゾレードのアゾレード大学、植
物病理学部（Ｐ ｌ ａ ｎ Ｌ ＰａＬｈｏｌｏｇ
ｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ）のカルチャーコレクショ
ンに保存されている。
名され、ｐ Ａ ｇ Ｋ ８ ｔ１ΔＥｃｏＲＩ Ｄ
１＋Ｈである。上記抗生物質耐性を宿すアグロバクテリ
ウム・ラジオバクターに８４の株はＫＩＯ２６と命名さ
れ、そのサンプルは、アゾレードのアゾレード大学、植
物病理学部（Ｐ ｌ ａ ｎ Ｌ ＰａＬｈｏｌｏｇ
ｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ）のカルチャーコレクショ
ンに保存されている。
上記のとおり、伝達を阻止するように修飾されたアグロ
バクテリウム・ラジオバクターに８４株は、植物のクラ
ウンゴール病の抑制のため使用できる。従って、本発明
のさらに別の観点によれば、植物のクラウンゴール病を
抑制する方法が提供され、該方法は： 処理が求められる植物材料；および アグロシン８４の合成をコードし、伝達領域の欠１１１
により伝達が阻止されるように修飾された遺伝子を含む
プラスミドを含む、非病原性のアグロバクテリウム・ラ
ジオバクターに８４株を用意し； 前記植物材料を、アグロバクテリウム・ラジオバクター
Ｋ ８４の該非病原性株と直接または間接的に接触させ
る、 ことよりなる。
バクテリウム・ラジオバクターに８４株は、植物のクラ
ウンゴール病の抑制のため使用できる。従って、本発明
のさらに別の観点によれば、植物のクラウンゴール病を
抑制する方法が提供され、該方法は： 処理が求められる植物材料；および アグロシン８４の合成をコードし、伝達領域の欠１１１
により伝達が阻止されるように修飾された遺伝子を含む
プラスミドを含む、非病原性のアグロバクテリウム・ラ
ジオバクターに８４株を用意し； 前記植物材料を、アグロバクテリウム・ラジオバクター
Ｋ ８４の該非病原性株と直接または間接的に接触させ
る、 ことよりなる。
処理を求められる植物ｕ＄１４には、種子、市、成長中
の作物が含まれる０作物は任意の種類のものであってよ
く、核果類、サクラ（Ｐｒｕｎｕｓ）種、ゲーンベリー
（ｃａｎｅ ｂｅｒｒｙ）類、ニシキギ（ｅｕｏｎｙ
ｍｕｓ）属、タレマチス（ｃ ｌ ｅｍａ ｔ ｉ ｓ
）属および柿属であってよい。
の作物が含まれる０作物は任意の種類のものであってよ
く、核果類、サクラ（Ｐｒｕｎｕｓ）種、ゲーンベリー
（ｃａｎｅ ｂｅｒｒｙ）類、ニシキギ（ｅｕｏｎｙ
ｍｕｓ）属、タレマチス（ｃ ｌ ｅｍａ ｔ ｉ ｓ
）属および柿属であってよい。
アーモンド、ベカン、ウォルナフト、ポイセンベリー（
ｂｏｙｓｅｎｂｅｒｒｙ）およびラズベリ、核果類（桃
、チェリー、プラムおよびアプリコツトを含む）、およ
びバラの木が特に好ましい。
ｂｏｙｓｅｎｂｅｒｒｙ）およびラズベリ、核果類（桃
、チェリー、プラムおよびアプリコツトを含む）、およ
びバラの木が特に好ましい。
植物祠ｔ＋は、アグロバクテリウム・ラジオバクターに
８．１の株の細胞ｇ＜液に漬けることにより、Ｓ４株と
接触させてよい。
８．１の株の細胞ｇ＜液に漬けることにより、Ｓ４株と
接触させてよい。
アグロバクテリウム・ラジオバクターに８４の株は、１
１；１記のＫ１０２Ｇ株であってよい。
１；１記のＫ１０２Ｇ株であってよい。
以下に本発明を実施例および図面にもとすいて、より詳
細に説明する。しかしながら、以下の記載は説明のため
のものであり、本発明の一般的範囲の限定のためのもの
と解釈すべきではない。
細に説明する。しかしながら、以下の記載は説明のため
のものであり、本発明の一般的範囲の限定のためのもの
と解釈すべきではない。
第１図は、伝達領域（Ｔｒａ ｒｅｇｉｏｎ）、アグ
ロシン生産領域およびアグロシン免疫領域を示す、ｐＡ
ｇＫ８４のＢａｍＨＩおよびＥ ｃ ｏ Ｒ１制限酵素
地図である。
ロシン生産領域およびアグロシン免疫領域を示す、ｐＡ
ｇＫ８４のＢａｍＨＩおよびＥ ｃ ｏ Ｒ１制限酵素
地図である。
第２図は、Ｔｒａ領域とＡ−バーラップする削除を含む
中間体プラスミドＰＤＡＪ１０２の造成工程図である。
中間体プラスミドＰＤＡＪ１０２の造成工程図である。
ＢおよびＥは挿入片のＢ ａ ｍ Ｈ１およびＥ ｃ
ｏ ＲＩエンドをそれぞれ示す、ＥはＣｍ辺伝子内のＥ
ｃｏＲ１部位を示すためにも用いられている。
ｏ ＲＩエンドをそれぞれ示す、ＥはＣｍ辺伝子内のＥ
ｃｏＲ１部位を示すためにも用いられている。
第３図は、ｐＡｇＫ１０２６の造成の説明図である。説
明の便宜のため、欠を員−マーカカー交換へと導く相同
（ホモロガス）な組み換え現象は、先ずＩＥｃｏＲＩフ
ラグメントＤ２で生じて共組み込み体（コインテグレー
ト）を形成し、次いでその後Ｅ ｃ ｏ １１１フラグ
メントＢまたはｌ？に生じてそれが解離するように示さ
れているが、しかし、逆の順序でこれらが生じてもよい
。
明の便宜のため、欠を員−マーカカー交換へと導く相同
（ホモロガス）な組み換え現象は、先ずＩＥｃｏＲＩフ
ラグメントＤ２で生じて共組み込み体（コインテグレー
ト）を形成し、次いでその後Ｅ ｃ ｏ １１１フラグ
メントＢまたはｌ？に生じてそれが解離するように示さ
れているが、しかし、逆の順序でこれらが生じてもよい
。
第７１し１は、ｐ Ａ ｇ Ｋ Ｉ Ｏ２６の造成に関
与した各プラスミドのＥｃｏＲ１消化物を示す、これら
のフラグメントは、０．７％アガロースゲル上の電気泳
動により、１ＯＯＶ、３時間で分離された。
与した各プラスミドのＥｃｏＲ１消化物を示す、これら
のフラグメントは、０．７％アガロースゲル上の電気泳
動により、１ＯＯＶ、３時間で分離された。
泳動レーンの１と８とはＨｉｎｄ［［Ｉで消化しまたラ
ムダファージのＤＮＡを含んでおり；レーン２はＫ ８
．１株からのｐＡｇＫ８／１；レーン３はＡ２８株から
のｐＡｇＫ８４ ： ：Ｔｎ５Ａ２８ ；レーンノ１は
Ｋ１０２３株からのρＤ、ＡＪＩ０２；レーン５はＫ１
０２４株からのｐＡｇＫ８４ ： ：Ｔｎ５Ａ２８ ：
： ｐＤＡＪ １０２ ；レーン６はＫ１０２５株か
らのＰＡＫＫ８４ ： ：Ｔｎ５Ａ２８ ： ： ＰＤ
、ＡＪ］０２；レーン７はＫ１０２６株からのｐへｇＫ
１０２６を含む、レーン２，６．７は、ｐ、Ａ ｔ Ｋ
８１１ ｂからの制限フラグメントのハックグラウン
ドも含む。バンド／ｌ−ＣはｐＡｇＫ８４のｌミｃ ｏ
ＲＩフラグメントＡ−Ｃを；バンドＤは、レーン２で
はｐΔｇＫＢ／ｌのＥ ｃ ｏ ＲｌフラグメンＩ−Ａ
−ｃを含むがレーン３−７ではり ２のみを含む；ハ
ンドＬｉ −ＫはＰΔｇＫ８４のＦ、ｃｏＲＩフラグメ
ントＦミーＫを；バンドＬは、Ｅ ｃ ｏ Ｒ１部位を
持たない１゛０５を含むｐＡ）；に８４のＥＣｏ ＲＩ
フうグメントＤ１を；バンドＭは、１３ ａ ｍＨ１部
位によってｐへｇＫ８４のＢａｍＨｌフラグメントＢ１
内に含まれるＥｃｏＲＩフラグメントＢの一部に結合し
たｐ Ｂ Ｒ３２５のＥｃｏＲＩＢａｍｌｌｌの大フラ
グメントを含むｒミｃ ｏ Ｒ１フラグメントを含む。
ムダファージのＤＮＡを含んでおり；レーン２はＫ ８
．１株からのｐＡｇＫ８／１；レーン３はＡ２８株から
のｐＡｇＫ８４ ： ：Ｔｎ５Ａ２８ ；レーンノ１は
Ｋ１０２３株からのρＤ、ＡＪＩ０２；レーン５はＫ１
０２４株からのｐＡｇＫ８４ ： ：Ｔｎ５Ａ２８ ：
： ｐＤＡＪ １０２ ；レーン６はＫ１０２５株か
らのＰＡＫＫ８４ ： ：Ｔｎ５Ａ２８ ： ： ＰＤ
、ＡＪ］０２；レーン７はＫ１０２６株からのｐへｇＫ
１０２６を含む、レーン２，６．７は、ｐ、Ａ ｔ Ｋ
８１１ ｂからの制限フラグメントのハックグラウン
ドも含む。バンド／ｌ−ＣはｐＡｇＫ８４のｌミｃ ｏ
ＲＩフラグメントＡ−Ｃを；バンドＤは、レーン２で
はｐΔｇＫＢ／ｌのＥ ｃ ｏ ＲｌフラグメンＩ−Ａ
−ｃを含むがレーン３−７ではり ２のみを含む；ハ
ンドＬｉ −ＫはＰΔｇＫ８４のＦ、ｃｏＲＩフラグメ
ントＦミーＫを；バンドＬは、Ｅ ｃ ｏ Ｒ１部位を
持たない１゛０５を含むｐＡ）；に８４のＥＣｏ ＲＩ
フうグメントＤ１を；バンドＭは、１３ ａ ｍＨ１部
位によってｐへｇＫ８４のＢａｍＨｌフラグメントＢ１
内に含まれるＥｃｏＲＩフラグメントＢの一部に結合し
たｐ Ｂ Ｒ３２５のＥｃｏＲＩＢａｍｌｌｌの大フラ
グメントを含むｒミｃ ｏ Ｒ１フラグメントを含む。
第５図は、アグロバクテリウムのに８，１株、Ｋ４３４
株およびに１０２６株の中に含まれるプラスミドの説明
図である。未消化プラスミドを０゜７％アガロースゲル
上で１００Ｖ、３時間の電気泳動により分離した。レー
ンｌおよび５は未消化うＪ、ダファージＤＮＡを含む：
レーン２はに８／１株からの１ラスミド；レーン３ばＫ
４３４ 株カラのプラスミド；レーン４はに１０２６
株からのプラスミドである。バンドＡは未知プラスミド
；バンドＢはｌ１ｌＡＬＫ８４ｂ （ツバリン異化プラ
スミド）；ハンドＣはｐＡ［Ｋ８４．バンドＤはｐＡじ
Ｋ１０２６である。
株およびに１０２６株の中に含まれるプラスミドの説明
図である。未消化プラスミドを０゜７％アガロースゲル
上で１００Ｖ、３時間の電気泳動により分離した。レー
ンｌおよび５は未消化うＪ、ダファージＤＮＡを含む：
レーン２はに８／１株からの１ラスミド；レーン３ばＫ
４３４ 株カラのプラスミド；レーン４はに１０２６
株からのプラスミドである。バンドＡは未知プラスミド
；バンドＢはｌ１ｌＡＬＫ８４ｂ （ツバリン異化プラ
スミド）；ハンドＣはｐＡ［Ｋ８４．バンドＤはｐＡじ
Ｋ１０２６である。
第６図は、アグロバクテリウムに８４株およびに１０２
６株によるアグロシン８４の生産のバイオアッセイの説
明図である。アグロシンの生産は、ストニエルズ培地（
Ｓｔｏｎｉｅｒ ｓ ｍｅｄｉｕｍ）のに１９８オ
ーバーレイの増殖を抑制するゾーンとして示されている
。
６株によるアグロシン８４の生産のバイオアッセイの説
明図である。アグロシンの生産は、ストニエルズ培地（
Ｓｔｏｎｉｅｒ ｓ ｍｅｄｉｕｍ）のに１９８オ
ーバーレイの増殖を抑制するゾーンとして示されている
。
第７図は、ｐＡｇＫ８４およびその遺伝子工学的削除誘
導体であるｐＡｇＫ１０２６の伝達能力を説明する図で
ある。ｐＡｇＫ１０２６を含むに１０２７株およびｐＡ
ｇＫ８４を含むに１０２Ｂ株をに５１８株と接合（ｍａ
ｔｅ）させ、この接合混合物の１０倍段階希釈列のｌＯ
μｌ小滴を、トランスコンシュガントの選択のための培
地にスポットした。
導体であるｐＡｇＫ１０２６の伝達能力を説明する図で
ある。ｐＡｇＫ１０２６を含むに１０２７株およびｐＡ
ｇＫ８４を含むに１０２Ｂ株をに５１８株と接合（ｍａ
ｔｅ）させ、この接合混合物の１０倍段階希釈列のｌＯ
μｌ小滴を、トランスコンシュガントの選択のための培
地にスポットした。
底
ｐＡｇＫ８４のＢａｍＨ１ライブラリーを作成するため
、ｐＡｇＫ８４のＢａｍＨｌ消化フラグメントを、Ｂａ
ｍＨｌで切断しておいたｐＢＲ３２５に連結（ライゲー
ト）シ、大腸１ｉＨＢＩｏＩを形質転換した。形質転換
体を回収するため、ＬＢ″Ｘ天上で１１０ ｐｇ ／ｓ
ｌアンピシリン（八ρ）および２５μｇ／■１のクロラ
ムフェニコール（Ｃｍ）への耐性で選択し、そしてＬＢ
寒天上で１０μｇ／ｌテトラサイクリン（Ｔｃ）への感
受性で選Ｕ”ｓ ’−ｔた；何故なら、ｐＢＲ３２５の
ＢａｍＨ１部位へのクローニングは、テトラサイクリン
耐性遺伝子を不活性化するからである。ｐ Ａ ｇ Ｋ
８４のＴ ｒ ａ ｐｉ域がオーバーラツプする二つ
のクローン、 ｐＢＲ３２５： ：ＢａｍＨＩ
Ｂｌ （Ｋ８４０株中）およびｐＢＲ３２５： ：
ＢａｍＨＩ Ｃ（Ｋ１００８株中）（第２図参照）が
、プラスミドのミニ調製物をＢａｍｊｌｌ、ＥｃｏＲＩ
およびＳｍａｌでの単独および同時消化することにより
同定された。
、ｐＡｇＫ８４のＢａｍＨｌ消化フラグメントを、Ｂａ
ｍＨｌで切断しておいたｐＢＲ３２５に連結（ライゲー
ト）シ、大腸１ｉＨＢＩｏＩを形質転換した。形質転換
体を回収するため、ＬＢ″Ｘ天上で１１０ ｐｇ ／ｓ
ｌアンピシリン（八ρ）および２５μｇ／■１のクロラ
ムフェニコール（Ｃｍ）への耐性で選択し、そしてＬＢ
寒天上で１０μｇ／ｌテトラサイクリン（Ｔｃ）への感
受性で選Ｕ”ｓ ’−ｔた；何故なら、ｐＢＲ３２５の
ＢａｍＨ１部位へのクローニングは、テトラサイクリン
耐性遺伝子を不活性化するからである。ｐ Ａ ｇ Ｋ
８４のＴ ｒ ａ ｐｉ域がオーバーラツプする二つ
のクローン、 ｐＢＲ３２５： ：ＢａｍＨＩ
Ｂｌ （Ｋ８４０株中）およびｐＢＲ３２５： ：
ＢａｍＨＩ Ｃ（Ｋ１００８株中）（第２図参照）が
、プラスミドのミニ調製物をＢａｍｊｌｌ、ＥｃｏＲＩ
およびＳｍａｌでの単独および同時消化することにより
同定された。
削除の発生をおこさせるため、ｐＢＩ’？３２５：：Ｂ
ａｍＨＩ ＢＩ ＤＮＡの／Ｉａｇを１単位（７）
ＥｃｏＲｌで１時間部分消化し、アガロースゲル電気泳
動で消化度をチエツクした後、１．５μｇを再度連結（
ｒｅｌｉｇａｔｅ）Ｌ、その中から０．１５μｇを大腸
菌ＨＢＩＯＩへの形質転換に用いた。形質転換体は、Ｌ
Ｂ寒天上で２５ａｇ／ ｍ ＩのＣｍに対する抵抗で選
択し、クロラムフェニコール耐性遺伝子の中のｐＢＲ３
２５のＥｃ。
ａｍＨＩ ＢＩ ＤＮＡの／Ｉａｇを１単位（７）
ＥｃｏＲｌで１時間部分消化し、アガロースゲル電気泳
動で消化度をチエツクした後、１．５μｇを再度連結（
ｒｅｌｉｇａｔｅ）Ｌ、その中から０．１５μｇを大腸
菌ＨＢＩＯＩへの形質転換に用いた。形質転換体は、Ｌ
Ｂ寒天上で２５ａｇ／ ｍ ＩのＣｍに対する抵抗で選
択し、クロラムフェニコール耐性遺伝子の中のｐＢＲ３
２５のＥｃ。
Ｒ１部位を含む削除物が復帰していないことを確認した
。形質転換体は、ＥｃｏＲｌで消化したプラスミドミニ
調製物のアガロースゲル電気泳動で、ＥｃｏＲ１フラグ
メントの消失をスクリーニングした。一つの削除誘導体
であるｐＨＭＲＩｏｏ（Ｋ Ｉ ＯＯ７株中）（第２図
参照）は、隣接したＥｃｏＲ１フラグメントのＤｌおよ
びＨ（全部で５．９ｋｂ）を欠ｆｉｔしていたが、Ｅｃ
ｏＲＩフラグメントのＦおよびＢａｍＨｒフラグメント
Ｂｌの中に含まれるＥｃｏＲＩフラグメントＢの一部（
全部で３．７ｋｂ）を欠損の一方の側に保持しており、
ＢａｍＨＩフラグメントＢ１内のＥｃ。
。形質転換体は、ＥｃｏＲｌで消化したプラスミドミニ
調製物のアガロースゲル電気泳動で、ＥｃｏＲ１フラグ
メントの消失をスクリーニングした。一つの削除誘導体
であるｐＨＭＲＩｏｏ（Ｋ Ｉ ＯＯ７株中）（第２図
参照）は、隣接したＥｃｏＲ１フラグメントのＤｌおよ
びＨ（全部で５．９ｋｂ）を欠ｆｉｔしていたが、Ｅｃ
ｏＲＩフラグメントのＦおよびＢａｍＨｒフラグメント
Ｂｌの中に含まれるＥｃｏＲＩフラグメントＢの一部（
全部で３．７ｋｂ）を欠損の一方の側に保持しており、
ＢａｍＨＩフラグメントＢ１内のＥｃ。
Ｒ１フラグメントＤ２の一部（０，５ｋｂ）を他の側に
保持していた：このことは、ＢａｍＨｌ、ＥｃｏＲｌお
よびＳｍａ Ｉによるプラスミドミニ調製物の単独もし
くは同時消化物をアガロース電気泳動で分析して確認し
た。ＥｃｏＲ１フラグメントＤ２の０６５ｋｂ部分は、
相同組換え（ホモロガス・リコンビネーション）による
削除−マーカー交換を行うには不充分であることが確認
され、そのため後記するように、ｐＢＲ３２５： ：Ｂ
ａｍＨＩ ＣからのＥｃｏＲ１フラグメントＤ２の残
部を付加して、３．３ｋｂに増加させた。
保持していた：このことは、ＢａｍＨｌ、ＥｃｏＲｌお
よびＳｍａ Ｉによるプラスミドミニ調製物の単独もし
くは同時消化物をアガロース電気泳動で分析して確認し
た。ＥｃｏＲ１フラグメントＤ２の０６５ｋｂ部分は、
相同組換え（ホモロガス・リコンビネーション）による
削除−マーカー交換を行うには不充分であることが確認
され、そのため後記するように、ｐＢＲ３２５： ：Ｂ
ａｍＨＩ ＣからのＥｃｏＲ１フラグメントＤ２の残
部を付加して、３．３ｋｂに増加させた。
ｐＢＲ３２５：：Ｂａｍｊｌｌ ＣをＢａｍＨＩおよ
びＥｃｏＲＩで切断して５つのフラグメントを生じさせ
、これらを７ガロースゲル電気泳動で分離した。ｐＢＲ
３２５の大部分、即ちテトラサイクリン耐性遺伝子のＢ
ａｍＨ［部位からクロラムフェニコール耐性遺伝子中の
ＥＣＱＲ１部位まで、を含む１．４ｋｂフラグメント、
およびＢａｍ１１１フラグメントＣ中に含まれるＩＥｃ
ｏＲ１フラグメントＤ２の一部である２、８ｋｂフラグ
メントを回収した。この４．４ｋｂフラグメントをホス
ファターゼで処理し、２．８ｋｂフラグメントへ連結（
Ｉ ｉｍａｇｅ） し、大腸１２ｉ１１１３１０１へ形
質転換した。形質転換体をＬ Ｂ寒天Ｆで、４０μｇ／
ｍｌのＡＰに対する耐性で選択し、得られたプラスミド
ｐＤＡＪｌｏＩ （Ｋ１０２２株中）（第２図参照）
の同定は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｃＲＩでプラスミドミ
ニ調製物をＣＰ、独もしくは同時消化してアガロースゲ
ル電気泳動を行って確認した。
びＥｃｏＲＩで切断して５つのフラグメントを生じさせ
、これらを７ガロースゲル電気泳動で分離した。ｐＢＲ
３２５の大部分、即ちテトラサイクリン耐性遺伝子のＢ
ａｍＨ［部位からクロラムフェニコール耐性遺伝子中の
ＥＣＱＲ１部位まで、を含む１．４ｋｂフラグメント、
およびＢａｍ１１１フラグメントＣ中に含まれるＩＥｃ
ｏＲ１フラグメントＤ２の一部である２、８ｋｂフラグ
メントを回収した。この４．４ｋｂフラグメントをホス
ファターゼで処理し、２．８ｋｂフラグメントへ連結（
Ｉ ｉｍａｇｅ） し、大腸１２ｉ１１１３１０１へ形
質転換した。形質転換体をＬ Ｂ寒天Ｆで、４０μｇ／
ｍｌのＡＰに対する耐性で選択し、得られたプラスミド
ｐＤＡＪｌｏＩ （Ｋ１０２２株中）（第２図参照）
の同定は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｃＲＩでプラスミドミ
ニ調製物をＣＰ、独もしくは同時消化してアガロースゲ
ル電気泳動を行って確認した。
次いで、ｐＭＨＲｌｏｏをＢａｍＨＩで切断して２つの
フラグメントを生じさせ、これらをアガロースゲル電気
泳動で分離した。削除物を担う４゜２ｋｂＢａｍＨｌフ
ラグメントＢｌを回収し、Ｂａ ｍ ＨＩで切断しホス
ファターゼで処理しておいたｐＤＡＪｌｏＩに連結し、
ＨＢＩＯＩ内に形質転換した。形質転換体をＬ Ｂ寒天
−にで４０μ８／１のＡｐに対する耐性で選択し、Ｂａ
ｍＨ＋フラグメン） Ｂ ｌ挿入片の向きを、ＥｃｏＲ
ｌで消化したプラスミドのミニ調製物のアガロースゲル
電気泳動でチエツクした。これにより、ｐｌ）ＡＪ＋０
２ （Ｋ１０２３株中）（第２図参照）が得られ、これ
はｒ尤ｃ ｏ ＲＩフラグメントＩ） ２が再構成され
たため、削除物の両側に相同組換えによる削除マーカー
交換を可能にするに充分なりＮＡを有していた。
フラグメントを生じさせ、これらをアガロースゲル電気
泳動で分離した。削除物を担う４゜２ｋｂＢａｍＨｌフ
ラグメントＢｌを回収し、Ｂａ ｍ ＨＩで切断しホス
ファターゼで処理しておいたｐＤＡＪｌｏＩに連結し、
ＨＢＩＯＩ内に形質転換した。形質転換体をＬ Ｂ寒天
−にで４０μ８／１のＡｐに対する耐性で選択し、Ｂａ
ｍＨ＋フラグメン） Ｂ ｌ挿入片の向きを、ＥｃｏＲ
ｌで消化したプラスミドのミニ調製物のアガロースゲル
電気泳動でチエツクした。これにより、ｐｌ）ＡＪ＋０
２ （Ｋ１０２３株中）（第２図参照）が得られ、これ
はｒ尤ｃ ｏ ＲＩフラグメントＩ） ２が再構成され
たため、削除物の両側に相同組換えによる削除マーカー
交換を可能にするに充分なりＮＡを有していた。
ρＤＡＪ１０２は、大腸菌から接合により、三親接合で
ｐＡｇＫ８４ ： ：Ｔｎ５Ａ２８を担うアゲ［＋バク
テリウムＡ２８株に伝達させた。相同組み換えで形成さ
れたコインテグレートｐＡｇＫ８４：：Ｔｎ５Ａ２８：
：ｐＤＡＪ１０２（第３図参１１４ｊ）を担うトランス
コンシュガントであるに１０２４株は、大腸菌のドナー
株およびヘルパー株が成゛ａできないＹＡＭ−ヒで、１
００μｇ／−１カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｎ： Ｃｂ）および５０μｇ／麟ｌカナマイシン
（Ｋｍ）への耐性で選Ｉノ＜シて回収し、そして［７，
ｃ ｏ Ｒ１で消化したプラスミドミニ調製物のアガロ
ースゲル電気泳動で、共組み込み物の存在をチエツクし
た。
ｐＡｇＫ８４ ： ：Ｔｎ５Ａ２８を担うアゲ［＋バク
テリウムＡ２８株に伝達させた。相同組み換えで形成さ
れたコインテグレートｐＡｇＫ８４：：Ｔｎ５Ａ２８：
：ｐＤＡＪ１０２（第３図参１１４ｊ）を担うトランス
コンシュガントであるに１０２４株は、大腸菌のドナー
株およびヘルパー株が成゛ａできないＹＡＭ−ヒで、１
００μｇ／−１カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｎ： Ｃｂ）および５０μｇ／麟ｌカナマイシン
（Ｋｍ）への耐性で選Ｉノ＜シて回収し、そして［７，
ｃ ｏ Ｒ１で消化したプラスミドミニ調製物のアガロ
ースゲル電気泳動で、共組み込み物の存在をチエツクし
た。
Ａ２８Ｔ０５挿入片は、削除でカバーされる領域の中に
存在したが、Ｔｒａ領域のちょうど外側であり（第３図
参ＷＯ１従ってコインテグレートはＴ ｒ ａ ’であ
った。
存在したが、Ｔｒａ領域のちょうど外側であり（第３図
参ＷＯ１従ってコインテグレートはＴ ｒ ａ ’であ
った。
このコインテグレートを二親性接合用株ＫＩ０２５の中
のアグロバクテリウムに４３４株に接合で伝達し、コイ
ンテグレートを含むトランスコンシュガントを、次亜種
（ｂｉｏｖａ「）２レシピエンドは成育できるが次亜種
ｌドナーは成育出来ない０．２％酒石酸ナトリウム含有
ベルガーソンズ（Ｂｅｒｇｅｒｓｏｎ’ ｓ）培地で
、２００μｇ／ｍｌＫｍに対する耐性で選択して回収し
、コインテグレートの存在を未消化およびＥｃｏＲＩ消
化したプラスミドのミニ調製物のアガロースゲル電気泳
動でチエツクした。Ｋ１０２５株は、液体ＹＥＢで非選
択的に３回サブカルチャーして増殖さゼ、ＹＥＢ寒天に
約１５０〜２００コロニ／プレートのコロニー密度でブ
レーティングし、次いでＹＥＢ寒天および２００μｇ
／ ｍｉのＫｍを含むＹ ｒＥ ！３寒天にレプリカ・
ブレーティングした。
のアグロバクテリウムに４３４株に接合で伝達し、コイ
ンテグレートを含むトランスコンシュガントを、次亜種
（ｂｉｏｖａ「）２レシピエンドは成育できるが次亜種
ｌドナーは成育出来ない０．２％酒石酸ナトリウム含有
ベルガーソンズ（Ｂｅｒｇｅｒｓｏｎ’ ｓ）培地で
、２００μｇ／ｍｌＫｍに対する耐性で選択して回収し
、コインテグレートの存在を未消化およびＥｃｏＲＩ消
化したプラスミドのミニ調製物のアガロースゲル電気泳
動でチエツクした。Ｋ１０２５株は、液体ＹＥＢで非選
択的に３回サブカルチャーして増殖さゼ、ＹＥＢ寒天に
約１５０〜２００コロニ／プレートのコロニー密度でブ
レーティングし、次いでＹＥＢ寒天および２００μｇ
／ ｍｉのＫｍを含むＹ ｒＥ ！３寒天にレプリカ・
ブレーティングした。
削除−マーカー交換を起こすための相同組み換え（第３
図参照）でコインテグレートが解がされた、Ｋ１０２６
株（Ｋ Ｉ ０２５から天然に生じたカナマイシン感受
性誘導体）は、約７０００１０ニのレプリカから１つ得
られた。Ｋ１０２６株中のｐＡｇＫ８４ ＥｃｏＲＩ
Ｄｌ＋Ｈである、ｐＡ［ＫＩ０２６の同定は、Ｅｃ
ｏＲＩで消化したプラスミドニミ調製物のアガロースゲ
ル電気泳動で確認した。
図参照）でコインテグレートが解がされた、Ｋ１０２６
株（Ｋ Ｉ ０２５から天然に生じたカナマイシン感受
性誘導体）は、約７０００１０ニのレプリカから１つ得
られた。Ｋ１０２６株中のｐＡｇＫ８４ ＥｃｏＲＩ
Ｄｌ＋Ｈである、ｐＡ［ＫＩ０２６の同定は、Ｅｃ
ｏＲＩで消化したプラスミドニミ調製物のアガロースゲ
ル電気泳動で確認した。
Ｋ１０２６株中の、ｐ Ａ ｇ Ｋ １０２６と命名し
た１：記ミュータント株は、ＥｃｏＲＩ消化（第４図）
および未消化（第５図）のプラスミドニミ調製物で確認
した。後者からは、Ｋ１０２６株かに８４株のプラスミ
ド補鎖（ｐｌａｓｍｉｄ ｃ。
た１：記ミュータント株は、ＥｃｏＲＩ消化（第４図）
および未消化（第５図）のプラスミドニミ調製物で確認
した。後者からは、Ｋ１０２６株かに８４株のプラスミ
ド補鎖（ｐｌａｓｍｉｄ ｃ。
ｍｐｌｅｍｅｎｔ）を維持していることも、確認された
。
。
Ｋ１０２６株からベクターおよびＴｎ５配列が完全に消
失していることは、該ベクターに７０われているｃｂ耐
性および′「ｎ５に担われているＫｍ及びストレプトマ
イシン（Ｓｍ）耐性が消失していることから、准潤され
る。
失していることは、該ベクターに７０われているｃｂ耐
性および′「ｎ５に担われているＫｍ及びストレプトマ
イシン（Ｓｍ）耐性が消失していることから、准潤され
る。
Ｋ８Ａ株およびＫ１０２６株は、生産するアグロシンの
尾を手足Ｖするために、これら２株の細胞を同数用いて
、アグロシン８ 、Ｉの生産を試験した、Ｋ１０２６株
はアグロシン８４を生産しく第６図参照）、ｐＡｇＫ１
０２６が祖先であるｐＡｇＫ８４のアグロシン８４生合
成能を保持していることを示唆した。更にまた、Ｋ８４
株およびに１０２６株の阻止サイズは同程度であり（第
６図参照）、両者が同程度の量のアグロシン８４を生産
していることを示唆した。この結果は、ＰＡｇＪ１０２
６がｐＡｇＫ８４のものと同じコピー数を維持している
ことを間接的に証明するものである；何故なら、シム（
Ｓｈｉｍ）ら（１９Ｂ７）はコピー数の増加したｐ Ａ
［Ｋ ８４ミユータントは、アグロシン８４の生産量
が相応して増大することを見出しているからである。
尾を手足Ｖするために、これら２株の細胞を同数用いて
、アグロシン８ 、Ｉの生産を試験した、Ｋ１０２６株
はアグロシン８４を生産しく第６図参照）、ｐＡｇＫ１
０２６が祖先であるｐＡｇＫ８４のアグロシン８４生合
成能を保持していることを示唆した。更にまた、Ｋ８４
株およびに１０２６株の阻止サイズは同程度であり（第
６図参照）、両者が同程度の量のアグロシン８４を生産
していることを示唆した。この結果は、ＰＡｇＪ１０２
６がｐＡｇＫ８４のものと同じコピー数を維持している
ことを間接的に証明するものである；何故なら、シム（
Ｓｈｉｍ）ら（１９Ｂ７）はコピー数の増加したｐ Ａ
［Ｋ ８４ミユータントは、アグロシン８４の生産量
が相応して増大することを見出しているからである。
プラスミドの安定性および伝達能力を調べるため、ｐＡ
ｇＫ８４およびｐＡｇＫＩ０２６の両者をｐＢＲ３２５
のＣｍ１ｆｉ伝子およびｃｂｚ伝子で次のように標識し
た。ｐＢＲ３２５： ：ＢａｍＨＩ Ｃを、三親性接合
でに１００Ｂ株からＫＩＯ２６およびに８４の両株に伝
達し、ｐＢＲ３２５：：ＢａｍＨＩ Ｃと夫々ｐ Ａ
ｇ Ｋ ｌ ０２６およびｐＡ［Ｋ８４との共組み込
み体（コインテグレート）を、相同組み換えで形成した
。ｐＡｇＫ１０２１；：：ｐＢＲ３２５：：ＢａｍＨＩ
Ｃを含むトランスコンシュガントＫ１０２７株、お
よびＰΔｇＫＢ４：：ｐＢＲ３２５：：ＢａｍＨＩＣを
含むトランスコンシュガントに１０２Ｂ株は、ドナー大
腸菌およびヘルパー大腸菌が成育できないＹＭＡ上で、
ｌ ＯＯｐｇ ／ｓｌのＣｍおよび５００ ｐｇ ／ｍ
ｌのｃｂに対する耐性で選択して回収し、そしてＥｃｏ
ＲＩ消化物を用いて夫々のコインテグレートの存在をチ
エツクした（データは示されていない）。
ｇＫ８４およびｐＡｇＫＩ０２６の両者をｐＢＲ３２５
のＣｍ１ｆｉ伝子およびｃｂｚ伝子で次のように標識し
た。ｐＢＲ３２５： ：ＢａｍＨＩ Ｃを、三親性接合
でに１００Ｂ株からＫＩＯ２６およびに８４の両株に伝
達し、ｐＢＲ３２５：：ＢａｍＨＩ Ｃと夫々ｐ Ａ
ｇ Ｋ ｌ ０２６およびｐＡ［Ｋ８４との共組み込
み体（コインテグレート）を、相同組み換えで形成した
。ｐＡｇＫ１０２１；：：ｐＢＲ３２５：：ＢａｍＨＩ
Ｃを含むトランスコンシュガントＫ１０２７株、お
よびＰΔｇＫＢ４：：ｐＢＲ３２５：：ＢａｍＨＩＣを
含むトランスコンシュガントに１０２Ｂ株は、ドナー大
腸菌およびヘルパー大腸菌が成育できないＹＭＡ上で、
ｌ ＯＯｐｇ ／ｓｌのＣｍおよび５００ ｐｇ ／ｍ
ｌのｃｂに対する耐性で選択して回収し、そしてＥｃｏ
ＲＩ消化物を用いて夫々のコインテグレートの存在をチ
エツクした（データは示されていない）。
プラスミドの安定性をアッセイするため、Ｋ１０２７株
およびに１０２Ｂ株を、前記のようにして非選択的に１
０回サブカルチャーし、約４０コロニー／プレートのコ
ロニー密度でＹＥＢ寒天上にブレーティングした。得ら
れたコロニーは、ＹＥ Ｂ寒天および１００ μｇ／ｍ
ｌのＣｍおよび５゜（１＃ｇ／＋ｍｌのｃｂを含むＹＥ
Ｂ寒天に複写（ｒｅｐ ｌ ｉ ｃａ）ブレーティング
した。に１０２７株については、ブレーティングした１
４１２レプリカの中からＣｍおよび／またはｃｂに感受
性の２８コロニーが回収され、１０回のサブカルチャー
で１．９８％のマーカー損失を示した。同様に、Ｋ１０
２８株については、ブレーティングした１８３４レプリ
カの中からＣｍおよび／またはｃｂに感受性の３５コロ
ニーが回収され、１０回のサブカルチャーで１．９１％
のマーカー川失を示し、Ｋ１０２７株の結果と有意な相
違はなかった（ｐ＝０．８７）、抗生物質感受性の単離
コロニーをアグロシン８４の生産に関してアッセイし、
全てがこの抗生物質を生産することが判明し、各コロニ
ーともにアグロシンプラスミドを失っていないことが示
された。これらのコロニーは、アグロバタテリウム内で
独立に複製できないｐＢＲ３２５：：Ｂａｍ１４ Ｃの
１Ｂ失を同時に伴うコインテグレートの解Ｎｆによって
、そのマーカーを失ったものであろう、従って、１０回
のサブカルチャー後にもｐＡｇＫ１０２６またはｐＡ
、、 Ｋ ８４のＩ１１失は無く、このことからｐＡｇ
Ｋ＋０２（ｉは、先祖のρへｇＫＢ４の安定性を保持し
ていると示唆される。
およびに１０２Ｂ株を、前記のようにして非選択的に１
０回サブカルチャーし、約４０コロニー／プレートのコ
ロニー密度でＹＥＢ寒天上にブレーティングした。得ら
れたコロニーは、ＹＥ Ｂ寒天および１００ μｇ／ｍ
ｌのＣｍおよび５゜（１＃ｇ／＋ｍｌのｃｂを含むＹＥ
Ｂ寒天に複写（ｒｅｐ ｌ ｉ ｃａ）ブレーティング
した。に１０２７株については、ブレーティングした１
４１２レプリカの中からＣｍおよび／またはｃｂに感受
性の２８コロニーが回収され、１０回のサブカルチャー
で１．９８％のマーカー損失を示した。同様に、Ｋ１０
２８株については、ブレーティングした１８３４レプリ
カの中からＣｍおよび／またはｃｂに感受性の３５コロ
ニーが回収され、１０回のサブカルチャーで１．９１％
のマーカー川失を示し、Ｋ１０２７株の結果と有意な相
違はなかった（ｐ＝０．８７）、抗生物質感受性の単離
コロニーをアグロシン８４の生産に関してアッセイし、
全てがこの抗生物質を生産することが判明し、各コロニ
ーともにアグロシンプラスミドを失っていないことが示
された。これらのコロニーは、アグロバタテリウム内で
独立に複製できないｐＢＲ３２５：：Ｂａｍ１４ Ｃの
１Ｂ失を同時に伴うコインテグレートの解Ｎｆによって
、そのマーカーを失ったものであろう、従って、１０回
のサブカルチャー後にもｐＡｇＫ１０２６またはｐＡ
、、 Ｋ ８４のＩ１１失は無く、このことからｐＡｇ
Ｋ＋０２（ｉは、先祖のρへｇＫＢ４の安定性を保持し
ていると示唆される。
プラスミドの伝達能をアッセイするため、Ｋ１０２７株
およびＫ１０２８株を、後記［材料および方法］の項に
示すように、０．２％ツバリン（ｎｏｐａ Ｉ １ｎｅ
）を含むベティ７ト（Ｐｅｔｉｔ’ｓ）寒天上での二親
性液滴接合によりに５１８にクロスさせた。ドナーとレ
シピエンドの両株は、ツバリン異化プラスミドのｐＡｇ
Ｋ８４ｂを有するため、使用した接合培地で共に成育出
来る。ドナーの数は、５０ ｐｇ ／ｍｌのＣｍを含む
ＮＡ上で決定し、レシピエンドの数は５０μＢ／ｍｌの
りフ７ンビシン（Ｒ４ｆ）を含むＮＡ上で、そしてトラ
ンスコンシュガントの数は、５０μ８／−１のＲｉ ｆ
、 ５０μｇ ／ｍｌのＣｍおよびｔｏｏμＲ／ｓｌの
ｃｂを含むＮＡ上で決定した。ＫＩ０２７がドナーであ
るときは、クロス体からトランスコンシュガントは全＜
Ｗ察されなかった（第７図参照）、この試験では、伝達
頻度（トランスミッション・フリークエンシー）として
ドナー当たり＜３． ８４ ｘ Ｉ Ｏ−’、そしてレ
シピエンド当たり＜１．９６ｘｌＯ−’が得られた。に
１０２Ｂがドナーであるとき番よ、多くのトランスコン
シュガントが観察され（第７図参照）、伝達頻度（１−
ランスミッション・フリークエンシー）としてドナー当
たり３．３４ＸｌＯ−’、そしてレシピエンド当たり３
．９６ＸｌＯ−’が得られた。明らかに、ｐＡｇＫ１０
２６はｐＡｇＫ８４のＴｒａ−ミュータントである。
およびＫ１０２８株を、後記［材料および方法］の項に
示すように、０．２％ツバリン（ｎｏｐａ Ｉ １ｎｅ
）を含むベティ７ト（Ｐｅｔｉｔ’ｓ）寒天上での二親
性液滴接合によりに５１８にクロスさせた。ドナーとレ
シピエンドの両株は、ツバリン異化プラスミドのｐＡｇ
Ｋ８４ｂを有するため、使用した接合培地で共に成育出
来る。ドナーの数は、５０ ｐｇ ／ｍｌのＣｍを含む
ＮＡ上で決定し、レシピエンドの数は５０μＢ／ｍｌの
りフ７ンビシン（Ｒ４ｆ）を含むＮＡ上で、そしてトラ
ンスコンシュガントの数は、５０μ８／−１のＲｉ ｆ
、 ５０μｇ ／ｍｌのＣｍおよびｔｏｏμＲ／ｓｌの
ｃｂを含むＮＡ上で決定した。ＫＩ０２７がドナーであ
るときは、クロス体からトランスコンシュガントは全＜
Ｗ察されなかった（第７図参照）、この試験では、伝達
頻度（トランスミッション・フリークエンシー）として
ドナー当たり＜３． ８４ ｘ Ｉ Ｏ−’、そしてレ
シピエンド当たり＜１．９６ｘｌＯ−’が得られた。に
１０２Ｂがドナーであるとき番よ、多くのトランスコン
シュガントが観察され（第７図参照）、伝達頻度（１−
ランスミッション・フリークエンシー）としてドナー当
たり３．３４ＸｌＯ−’、そしてレシピエンド当たり３
．９６ＸｌＯ−’が得られた。明らかに、ｐＡｇＫ１０
２６はｐＡｇＫ８４のＴｒａ−ミュータントである。
アグロシン８４に感受性のアグロバクテリウム・ツメフ
ァシェンス 次亜種−２のに２Ｔ株で誘発されるクラウ
ンゴールをｌｆｌ？ ｉｌｌするため、アグロバクテリ
ウム・ラジオバクター・次亜種−２のに８４株およびＫ
１０２６株を用いて、アーモンドの苗の根を処理した。
ァシェンス 次亜種−２のに２Ｔ株で誘発されるクラウ
ンゴールをｌｆｌ？ ｉｌｌするため、アグロバクテリ
ウム・ラジオバクター・次亜種−２のに８４株およびＫ
１０２６株を用いて、アーモンドの苗の根を処理した。
鉢試験の前に、Ｋ２７培養物は、？−／カートニー瓶（
ＭａｅＣａｒｔｎｅｙｂｏＬＬＩｅ）９０本の中のｌ０
ｍ１イースト・マニトール寒天（ＹＭＡ）斜面に新たに
サブカルチャーし、Ｋ８４およびに１０２６の培養物は
、２００ｍ１薬用平容器内の４０＋ＩＹＭＡ斜而に新た
にサブカルチャーした。全ての培養物は２５°Ｃで３１
１間成ｆｔさセた。
ＭａｅＣａｒｔｎｅｙｂｏＬＬＩｅ）９０本の中のｌ０
ｍ１イースト・マニトール寒天（ＹＭＡ）斜面に新たに
サブカルチャーし、Ｋ８４およびに１０２６の培養物は
、２００ｍ１薬用平容器内の４０＋ＩＹＭＡ斜而に新た
にサブカルチャーした。全ての培養物は２５°Ｃで３１
１間成ｆｔさセた。
７−’Ｅ７１”ｉ領製
次に、新鮮なアーモンドの挿（カルチバー・チャレスト
ン（Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｃｈａｌｌｅｓｔｏｎ））を
、ＵＣ鉢用ミックスを入れた直径２Ｃｊｃｍの鉢に一抹
一粒ずつ蒔き、湿潤状態に保持した。Ｌ′Ｉｉは３〜４
週間後に出現した。鉢試験に先立ち、一つのバッチの苗
は２月間、そしてもう一つのバッチのｉ５はｌＯ月間成
育させた。鉢試験の２日前に、移植後の蒸散による水分
損失から来るストレスを軽減するため、ｍの葉を相当に
刈り取った。
ン（Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｃｈａｌｌｅｓｔｏｎ））を
、ＵＣ鉢用ミックスを入れた直径２Ｃｊｃｍの鉢に一抹
一粒ずつ蒔き、湿潤状態に保持した。Ｌ′Ｉｉは３〜４
週間後に出現した。鉢試験に先立ち、一つのバッチの苗
は２月間、そしてもう一つのバッチのｉ５はｌＯ月間成
育させた。鉢試験の２日前に、移植後の蒸散による水分
損失から来るストレスを軽減するため、ｍの葉を相当に
刈り取った。
土」良−の−調型
９０抹の直径２５ｃａ＋のポット内で、厚さ２ｃｍの検
反チップの層のトに無滅菌砂上を鉢当たり１０ＫｆＸＲ
，ｔｉＡした。この土壌に、処理したアーモンドのＷを
植えかえる２日前に、Ｋ２７の３日培養物９０本各々を
塩素を含まない水５００＋＋＋１に懸濁させ、一つのポ
ット当たり培養−本づつを土壌に性別した０次いでこの
懸濁物を土壌の１０ｃｍの深さまで混ぜ込み、水でしみ
こませた。に２７の懸濁物は、光学的測定で約２ＸＩＯ
’細胞をｍｌ当たり含むと推定され、土壌に均一に分散
したと仮定すると、最終濃度はＩｇあたり約１０６細胞
である。に２７の実際の土壌中の分布は試験しなかった
。
反チップの層のトに無滅菌砂上を鉢当たり１０ＫｆＸＲ
，ｔｉＡした。この土壌に、処理したアーモンドのＷを
植えかえる２日前に、Ｋ２７の３日培養物９０本各々を
塩素を含まない水５００＋＋＋１に懸濁させ、一つのポ
ット当たり培養−本づつを土壌に性別した０次いでこの
懸濁物を土壌の１０ｃｍの深さまで混ぜ込み、水でしみ
こませた。に２７の懸濁物は、光学的測定で約２ＸＩＯ
’細胞をｍｌ当たり含むと推定され、土壌に均一に分散
したと仮定すると、最終濃度はＩｇあたり約１０６細胞
である。に２７の実際の土壌中の分布は試験しなかった
。
アー二％乙下−面−ｇりき理
に８／ｉおよびＫＩ０２６の３日培養物を、塩素を含ま
ない水５Ｐに懸濁させた。この懸濁物は、光学密度によ
る測定で、Ｉ ｍ ｌ ”Ａたり約１０’の細胞を含ん
でいた。アーモンド苗をポットから抜き、土壌を根から
穏やかに振り落とし、主根および側根を約２０ｃｍｗの
長さにトリムした。この植物を組頭より少し上まで、水
、Ｋ８，１またはＫＩＯ２６の懸濁液のいずれかに、約
１０秒間浸漬した。
ない水５Ｐに懸濁させた。この懸濁物は、光学密度によ
る測定で、Ｉ ｍ ｌ ”Ａたり約１０’の細胞を含ん
でいた。アーモンド苗をポットから抜き、土壌を根から
穏やかに振り落とし、主根および側根を約２０ｃｍｗの
長さにトリムした。この植物を組頭より少し上まで、水
、Ｋ８，１またはＫＩＯ２６の懸濁液のいずれかに、約
１０秒間浸漬した。
その後植物を一本一抹ずつ、予めに２７で感染さゼで水
を注いだ土壌に植えかえた。根−に〇に８．１またはＫ
１０２６の分布は調べなかった。
を注いだ土壌に植えかえた。根−に〇に８．１またはＫ
１０２６の分布は調べなかった。
この植物を屋久で７月間１し、１９８７年６月（初冬）
から１９８８年１月（真夏）まで、６週間置きに適当な
肥料を施した。次に、植物をポットから取り出し、根か
ら土壌を軽く振り払い、根を静水に繰り返し浸漬して洗
浄した。根のこぶ（ゴール）の数を各植物ごとに記録し
た。
から１９８８年１月（真夏）まで、６週間置きに適当な
肥料を施した。次に、植物をポットから取り出し、根か
ら土壌を軽く振り払い、根を静水に繰り返し浸漬して洗
浄した。根のこぶ（ゴール）の数を各植物ごとに記録し
た。
ｉ９人−荻久少イーヱ盈−上
鉢試験は６本づつの植物を１５列に配置して１５連で行
った。各列は３種類の処理即ち、水、Ｋ８４およびＫＩ
０２６を６本の４ｊＹ＠／ｊに無作為に割り当て、その
際、各２本の苗の４令が２月および］５月となるように
した。各列の間には隙間をおかず、また各列内のポット
の間にも隙間をあけないようにした。バクテリアのポッ
トとポットの間の感染を防止する手段は特に設けなかっ
たが、それが問題となることは無いように見えた。
った。各列は３種類の処理即ち、水、Ｋ８４およびＫＩ
０２６を６本の４ｊＹ＠／ｊに無作為に割り当て、その
際、各２本の苗の４令が２月および］５月となるように
した。各列の間には隙間をおかず、また各列内のポット
の間にも隙間をあけないようにした。バクテリアのポッ
トとポットの間の感染を防止する手段は特に設けなかっ
たが、それが問題となることは無いように見えた。
統４Ｖ分１１
データには偏りが存在し、パラメーター変換後も非正規
分布を示し、変動係数のようなパラメーターへ変換して
分析するのは不適当であったため、データはパラメータ
ーにｆ模することなく、クルスカル〜ウナリス（Ｋｒｕ
ｓｋａ ｌ −Ｗａ Ｉ Ｉ ｉＳ）テストで分析した
。クルスカルーウォリステストは、２月および１０月の
苗に関し別々に行い、三種の処理間の比較およびに８４
処理とＫＩ０２６処理の間の比較を行った。
分布を示し、変動係数のようなパラメーターへ変換して
分析するのは不適当であったため、データはパラメータ
ーにｆ模することなく、クルスカル〜ウナリス（Ｋｒｕ
ｓｋａ ｌ −Ｗａ Ｉ Ｉ ｉＳ）テストで分析した
。クルスカルーウォリステストは、２月および１０月の
苗に関し別々に行い、三種の処理間の比較およびに８４
処理とＫＩ０２６処理の間の比較を行った。
Ｋ８４処理およびＫＩ０２６処理した１０月の苗各５本
から、接頭から１０ｃｍ以内の根５ｇを切り取った。各
根サンプルを滅菌した２回蒸留水にいれて、激しく振と
うし、４°Ｃに３時間保持したのち、再度激しく振とう
した。緩衝塩溶液でｌ／１０およびｌ／１００に希釈し
、アグロバクテリウム・次亜種２を単離するため、各希
釈物の１０μｍの液滴をニュー・アンド・カー培地（Ｎ
ｅｗａｎ Ｋｅｒｒ ｍｅｄｉｕｍ）プレート上に
置いた。これらのフ゛レートは２５°Ｃで４日インキエ
ヘートした。
から、接頭から１０ｃｍ以内の根５ｇを切り取った。各
根サンプルを滅菌した２回蒸留水にいれて、激しく振と
うし、４°Ｃに３時間保持したのち、再度激しく振とう
した。緩衝塩溶液でｌ／１０およびｌ／１００に希釈し
、アグロバクテリウム・次亜種２を単離するため、各希
釈物の１０μｍの液滴をニュー・アンド・カー培地（Ｎ
ｅｗａｎ Ｋｅｒｒ ｍｅｄｉｕｍ）プレート上に
置いた。これらのフ゛レートは２５°Ｃで４日インキエ
ヘートした。
水で処理した５木の１０月４の各々からのｔ〜２ ｇの
「健全なＪこふ５個をもぎとり、１，５％次亜塩素酸ナ
トリウムに２分間浸漬し、そして滅菌２回ノに留水で濯
いだ０次いで、この表面未感染こぶを、１ｏｓｔの２回
蒸留水に入れてつぶした。。
「健全なＪこふ５個をもぎとり、１，５％次亜塩素酸ナ
トリウムに２分間浸漬し、そして滅菌２回ノに留水で濯
いだ０次いで、この表面未感染こぶを、１ｏｓｔの２回
蒸留水に入れてつぶした。。
この混合物を１１℃で３時間放置し、激しく振とうし、
そして上清を２ル一プ分採取してニュー・アンド・カー
培地に、直線状に塗り、このプレートを前記同様にイン
キュベートした。同様にして、Ｋ８４またはＫＪＯ２６
で処理した０、７５．−の「健全なＪこぶ８個をそれぞ
れ採取した。
そして上清を２ル一プ分採取してニュー・アンド・カー
培地に、直線状に塗り、このプレートを前記同様にイン
キュベートした。同様にして、Ｋ８４またはＫＪＯ２６
で処理した０、７５．−の「健全なＪこぶ８個をそれぞ
れ採取した。
回収された全ての単離物は、ニュー・アンド・カー培地
に直線状に塗り、得られた単一コロニから単離された純
粋培養物は、後続の試験に使用するためＹＭＡ斜面に維
持した。
に直線状に塗り、得られた単一コロニから単離された純
粋培養物は、後続の試験に使用するためＹＭＡ斜面に維
持した。
アグロシン８１１のバイオアッセイは、カーおよびティ
（Ｋｅｒｒ ａｎｄ ＩＩＬａｙ）により改良され
たストニュル（Ｓｔｏｎｉｅｒ）（７）７７法で行った
１回収されたアグロバクテリウムは、Ｋ１９８をインデ
イケータ−として使用し、回収された細菌をプロデュー
サーとして使用するアグロシンのバイオアッセイ系で、
アグロシンの生産能を試験した。このに１９Ｂは、Ｋ２
７と同じアグロシン感受性Ｔ１−プラスミドを宿してい
る、Ａ。
（Ｋｅｒｒ ａｎｄ ＩＩＬａｙ）により改良され
たストニュル（Ｓｔｏｎｉｅｒ）（７）７７法で行った
１回収されたアグロバクテリウムは、Ｋ１９８をインデ
イケータ−として使用し、回収された細菌をプロデュー
サーとして使用するアグロシンのバイオアッセイ系で、
アグロシンの生産能を試験した。このに１９Ｂは、Ｋ２
７と同じアグロシン感受性Ｔ１−プラスミドを宿してい
る、Ａ。
ツメファシェンスの次亜種！株である。アグロシンを生
産しなかった株は、次に該株をインデイケータ−とし、
ＫＩ０２６をプロデューサーとして用いるアグロシンの
バイオアッセイ系で、アグロシンの感受性について試験
した。
産しなかった株は、次に該株をインデイケータ−とし、
ＫＩ０２６をプロデューサーとして用いるアグロシンの
バイオアッセイ系で、アグロシンの感受性について試験
した。
回収されたアグロバクテリウムは、６週令のトマトｍ（
カルチバー・ルーダ・ド・マーマント：ｃｕｌｔｉｖａ
ｒ Ｒｏｕｇｃ ｄｅ Ｍａｒｍａｎｄｅ）に、多
数の穿刺接種して狂瘍形成能を試験した。接種物はＹＡ
Ｍ斜面上の３［］培養物からＪｆｆｉした。、２ル一プ
分のバクテリアを採取し、滅ｌ？７医留水１簿１に３濁
させた。火炎で滅菌した針をこの懸濁液に浸液し、この
針でトマトの茎を各細菌株につき５回突き！すした。
カルチバー・ルーダ・ド・マーマント：ｃｕｌｔｉｖａ
ｒ Ｒｏｕｇｃ ｄｅ Ｍａｒｍａｎｄｅ）に、多
数の穿刺接種して狂瘍形成能を試験した。接種物はＹＡ
Ｍ斜面上の３［］培養物からＪｆｆｉした。、２ル一プ
分のバクテリアを採取し、滅ｌ？７医留水１簿１に３濁
させた。火炎で滅菌した針をこの懸濁液に浸液し、この
針でトマトの茎を各細菌株につき５回突き！すした。
ＩＱＩ ［れたアゲロバクチ１ウムのプラスミドＡ埜
回収されたアグロバクテリウムからのプラスミドのミニ
調製は、ファランド（Ｆａｒｒａｎｄ）らの記載した方
法で行い、プラスミドの含有型はマニアチス（Ｍａｎｉ
ａＬｉｓ）らの記載したアガロースゲル電気泳動で調べ
た。
調製は、ファランド（Ｆａｒｒａｎｄ）らの記載した方
法で行い、プラスミドの含有型はマニアチス（Ｍａｎｉ
ａＬｉｓ）らの記載したアガロースゲル電気泳動で調べ
た。
↑ｌ＋Ｌ果
鎌試騒
に８４またはＫ１０２６で処理した苗の根には、こぶは
稀にしか若しくは全く存在しなかったが、水で処理した
ものでは頻繁にこぶが存在した（第１表参！Ｌ’！ ）
。この相違は統計的確認が不要である稈に明白であった
。しかしながら、クルスカルウォリステストを用いて、
３種の処理を比較すると、イ１゛意差が確認された（２
月１°ηおよび１０月＾°１のそれぞれに関し、Ｈ（タ
イ（ｔｉｅｓ）にコ１４整）＝２９．００および３，１
．０２であり、両１■ともにｐ＜０．００１）、に８４
処理およびに１０２６処理の結果の類似性もまた、統計
的確認を不要とする程に明白であった。然し、これら２
種の処理間の比較をするため、再びタルスカルーウォリ
ステストを用い、類似性を確認した（２月苗および１０
０月苗それぞれに関し、Ｈ（タイ（（ｉｅｓ）に調整）
＝０．４１および０．３５であり、両画ともにＱ、５＜
ｐ＜０．７）。
稀にしか若しくは全く存在しなかったが、水で処理した
ものでは頻繁にこぶが存在した（第１表参！Ｌ’！ ）
。この相違は統計的確認が不要である稈に明白であった
。しかしながら、クルスカルウォリステストを用いて、
３種の処理を比較すると、イ１゛意差が確認された（２
月１°ηおよび１０月＾°１のそれぞれに関し、Ｈ（タ
イ（ｔｉｅｓ）にコ１４整）＝２９．００および３，１
．０２であり、両１■ともにｐ＜０．００１）、に８４
処理およびに１０２６処理の結果の類似性もまた、統計
的確認を不要とする程に明白であった。然し、これら２
種の処理間の比較をするため、再びタルスカルーウォリ
ステストを用い、類似性を確認した（２月苗および１０
０月苗それぞれに関し、Ｈ（タイ（（ｉｅｓ）に調整）
＝０．４１および０．３５であり、両画ともにＱ、５＜
ｐ＜０．７）。
したアゲロバクー ラム
に８４またはＫＩ０２６で処理した植物の根から回収さ
れたアグロバクテリウムは、アグロシン産生性−非ｊ！
１１瓜性アグロバクテリウムおよびアグロシン感受性−
腫瘍性アグロバクテリウムのみであった（第２表参照）
、非腫瘍性株の全ておよび腫１ａ性株の一部サンプル（
各処理から５株）について、プラスミド含有量を分析し
た。に８４およびＫＩ０２６は、各々３つのプラスミド
（大型潜在プラスミドＰＡｔＫ８４ａ、それより小型の
ツバリン異化プラスミドｐＡｔＫ８１ｂ、および更に小
型のアグロシン８４プラスミドの夫々ｐＡｇＫ８４およ
びｐＡｇＫ１０２６）を含んでいたが、こねに対してに
２７は２つのプラスミド（ρＡ（Ｋ８４ａより若干大型
の潜在プラスミドｐＡＬＫ２７、およびρＡ Ｌ Ｋ
８４ ａとｐ Ａ Ｌ Ｋ ８４ｂの中間のサイズのＴ
１プラスミドｐ Ｔ ｉ Ｋ ２７ ）を含んでいた。
れたアグロバクテリウムは、アグロシン産生性−非ｊ！
１１瓜性アグロバクテリウムおよびアグロシン感受性−
腫瘍性アグロバクテリウムのみであった（第２表参照）
、非腫瘍性株の全ておよび腫１ａ性株の一部サンプル（
各処理から５株）について、プラスミド含有量を分析し
た。に８４およびＫＩ０２６は、各々３つのプラスミド
（大型潜在プラスミドＰＡｔＫ８４ａ、それより小型の
ツバリン異化プラスミドｐＡｔＫ８１ｂ、および更に小
型のアグロシン８４プラスミドの夫々ｐＡｇＫ８４およ
びｐＡｇＫ１０２６）を含んでいたが、こねに対してに
２７は２つのプラスミド（ρＡ（Ｋ８４ａより若干大型
の潜在プラスミドｐＡＬＫ２７、およびρＡ Ｌ Ｋ
８４ ａとｐ Ａ Ｌ Ｋ ８４ｂの中間のサイズのＴ
１プラスミドｐ Ｔ ｉ Ｋ ２７ ）を含んでいた。
このプラスミド分析結果は、非腫瘍性株はもしに８４処
理植物から得られるときはに８４に相当し、もしＫＩ０
２６処理植物から得られるときはに１０２６に相当する
こと、および腫ｉ５性株はに２７に相当すること（デー
タは示していない）を意味する。に８４またはＫ１０２
６のに２７に対する数の比率は植物体によって大きな変
動があったが、全体としてに２７の数が多いことは明ら
かであった（第２表参照）。
理植物から得られるときはに８４に相当し、もしＫＩ０
２６処理植物から得られるときはに１０２６に相当する
こと、および腫ｉ５性株はに２７に相当すること（デー
タは示していない）を意味する。に８４またはＫ１０２
６のに２７に対する数の比率は植物体によって大きな変
動があったが、全体としてに２７の数が多いことは明ら
かであった（第２表参照）。
同様に、ＫＨ２またはに１０２６で処理した植物の根に
出現した少数のこぶからは、Ｋ８，１またはＫＩ０２６
、およびに２７のみしか回収されなかった（第２表参照
）、に８，１またはに１０２６とに２７との数の比率に
は、２様式の偏りが認められ、８つのこぶの５つは殆ど
全てに８，１またはＫＩ０２６のみであり、８つのうｆ
）２つは殆ど全てに２７を含んでいた。これとは対照的
に、水で処理した植物の根のこぶからはに２７のみしか
回収されなかった。
出現した少数のこぶからは、Ｋ８，１またはＫＩ０２６
、およびに２７のみしか回収されなかった（第２表参照
）、に８，１またはに１０２６とに２７との数の比率に
は、２様式の偏りが認められ、８つのこぶの５つは殆ど
全てに８，１またはＫＩ０２６のみであり、８つのうｆ
）２つは殆ど全てに２７を含んでいた。これとは対照的
に、水で処理した植物の根のこぶからはに２７のみしか
回収されなかった。
鉢試験の結果から明らかなとおり、Ｋ１０２６はクラウ
ンゴールの抑ル１のためにに８Ａと同程度に有効であっ
た０回収データから、ＫＨ２と比較してＫＩ０２６は根
においてコロニーを形成して生存する同等の能力、およ
びこぶにコロニーを形成して刺激性アグロバクテリウム
と置き変わる能力を持つことも明らかである。従って、
Ｋ１０２６はその先祖であるに８，１の生態学的能力を
留めていると思われる。
ンゴールの抑ル１のためにに８Ａと同程度に有効であっ
た０回収データから、ＫＨ２と比較してＫＩ０２６は根
においてコロニーを形成して生存する同等の能力、およ
びこぶにコロニーを形成して刺激性アグロバクテリウム
と置き変わる能力を持つことも明らかである。従って、
Ｋ１０２６はその先祖であるに８，１の生態学的能力を
留めていると思われる。
ＫＨ２またはＫＩ０２６で処理した植物のユニのこぶ中
のに８４またはＫｌ ０２６とに２７との集団比率に、
明白な二様式の偏りが存在したことは、興味深い、に８
４およびＫｌ ０２６の両者ともに、Ｋ２７−誘発こぶ
で合成されるオパインであるツバリン（ｏｐｉｎｅｓ
ｎｏｐａｌｉｎＣ）およびアグロシンピン（ａＨｒｏ
ｃｉｎｏｐｉｎｅ）を利用している。従って、オパイン
説（ｏｐｉｎｅ ｃｏｎｃｅｐｔ）と一致して、ＫＨ
２またはに１０２６が過剰に存在するこぶは、これらの
こぶではに８，１またはＫＩ０２６がコロニー化し、同
時にに２７（アグロシンビンの存在下では、アグロシン
８４に対してより感受性になる）に置換したことを反映
しているものであろう。
のに８４またはＫｌ ０２６とに２７との集団比率に、
明白な二様式の偏りが存在したことは、興味深い、に８
４およびＫｌ ０２６の両者ともに、Ｋ２７−誘発こぶ
で合成されるオパインであるツバリン（ｏｐｉｎｅｓ
ｎｏｐａｌｉｎＣ）およびアグロシンピン（ａＨｒｏ
ｃｉｎｏｐｉｎｅ）を利用している。従って、オパイン
説（ｏｐｉｎｅ ｃｏｎｃｅｐｔ）と一致して、ＫＨ
２またはに１０２６が過剰に存在するこぶは、これらの
こぶではに８，１またはＫＩ０２６がコロニー化し、同
時にに２７（アグロシンビンの存在下では、アグロシン
８４に対してより感受性になる）に置換したことを反映
しているものであろう。
Ｋ２７が過剰に存在したこぶは、おそらくコロニー化の
機会を消失した場合を反映しているものであろう。
機会を消失した場合を反映しているものであろう。
さらにに８４またはに１０２６のいずれも、ＫＨ２また
はＫ１０２６で処理した植物の、Ｋ２７による共コロニ
ー化を阻止しないことも興味深く、実際、ＫＨ２または
に１０２６に対して過剰のに２７が存在した。さらにま
た、Ｋ２７の過剰にもかかわらず、非常に僅かなこぶの
みが誘発された。
はＫ１０２６で処理した植物の、Ｋ２７による共コロニ
ー化を阻止しないことも興味深く、実際、ＫＨ２または
に１０２６に対して過剰のに２７が存在した。さらにま
た、Ｋ２７の過剰にもかかわらず、非常に僅かなこぶの
みが誘発された。
根でのコロニー化および増殖の抑制なしの腫瘍形成の抑
制という、この明白なｙシ現象は驚くべきことである。
制という、この明白なｙシ現象は驚くべきことである。
第１表
アーモンド苗を水、アグロバクテリウム・ラジオバクタ
ーに８．１株の＝Ｃ液またはアグロバクテリウム・ラジ
オバクターに１０２６の懸濁液で処理した場合の、Ａ、
ツメファシェンスに２７株により誘発されるクラウンゴ
ールに対する効果。
ーに８．１株の＝Ｃ液またはアグロバクテリウム・ラジ
オバクターに１０２６の懸濁液で処理した場合の、Ａ、
ツメファシェンスに２７株により誘発されるクラウンゴ
ールに対する効果。
第２表
に８４またはＫＩ０２６で処理された１０月アモンド、
ｌ、′ｉ′の根から、および水、Ｋ８４またはに１０２
６で処理された１０月アーモンド【■の根のこぶから回
収され、そしてアグロシンの産生および感受性に関して
調べられたアグロバクテリウムの敗 ２月 水 １２ に８４ １４ に１０２６１２ １０Ｊ１ 水 １５ に８４ １５ ＫＩ０２６１５ ９．３３ ０．２１ ０．３３ ４６．３３ ０．２０ ０．６７ ７．５ ３−２３ こぶ 根のこぶ 根のこぶ 最後に、本発明の範囲を外れることなく、種々の修正お
よび／また番よ変更法が可能であることは、理解されよ
う。
ｌ、′ｉ′の根から、および水、Ｋ８４またはに１０２
６で処理された１０月アーモンド【■の根のこぶから回
収され、そしてアグロシンの産生および感受性に関して
調べられたアグロバクテリウムの敗 ２月 水 １２ に８４ １４ に１０２６１２ １０Ｊ１ 水 １５ に８４ １５ ＫＩ０２６１５ ９．３３ ０．２１ ０．３３ ４６．３３ ０．２０ ０．６７ ７．５ ３−２３ こぶ 根のこぶ 根のこぶ 最後に、本発明の範囲を外れることなく、種々の修正お
よび／また番よ変更法が可能であることは、理解されよ
う。
第１図は、伝達領域（Ｔｒａ ｒｅｇｉｏｎ）、アグ
ロシン生産領域およびアグロシン免疫；ｆ［Ｊ！ｉを示
す、ｐ Ａ ｇ Ｋ ８４のＢａｍＨ［およびＥ ｃ
ｏ Ｒ１制限酵素地図である。 第２図は、Ｔｒａ領域とオーバーラツプする削除を含む
中間体プラスミドＰＤＡＪ１０２の造成工程図である。 第３図は、ｐＡｇＫ１０２６の造成の工程図である。 第４図は、ｐＡｇＫ１０２６の造成に関与したプラスミ
ドのＥｃｏＲＩ消化物の電気泳動図である。 第５図は、アグロバクテリウムのに８４株、Ｋ４３４株
およびＫ１０２６株の中に含まれるプラスミドを説明す
る電気泳動図である。 第６図は、アグロバクテリウム、Ｋ８４株およびに１０
２６株によるアグロシン８４の生産のパイオア７セイの
説明図である。 第７図は、ＰへｇＫ８４およびその遺伝子工学的削除誘
導体であるｐＡｇＫ＋０２６の伝達能力の比較図である
。 図面の浄ご（′内容に変更なし） １７パロシ〉ブｊ１ で） 手 続 補 正 書（犬べ） 昭和６３年特。′１願第２６５２１’３号２、を明の６
称 新菌株 ３゜ 捕Ｗをする石 １＋件との関係 特許出ぬ１１人 住所
ロシン生産領域およびアグロシン免疫；ｆ［Ｊ！ｉを示
す、ｐ Ａ ｇ Ｋ ８４のＢａｍＨ［およびＥ ｃ
ｏ Ｒ１制限酵素地図である。 第２図は、Ｔｒａ領域とオーバーラツプする削除を含む
中間体プラスミドＰＤＡＪ１０２の造成工程図である。 第３図は、ｐＡｇＫ１０２６の造成の工程図である。 第４図は、ｐＡｇＫ１０２６の造成に関与したプラスミ
ドのＥｃｏＲＩ消化物の電気泳動図である。 第５図は、アグロバクテリウムのに８４株、Ｋ４３４株
およびＫ１０２６株の中に含まれるプラスミドを説明す
る電気泳動図である。 第６図は、アグロバクテリウム、Ｋ８４株およびに１０
２６株によるアグロシン８４の生産のパイオア７セイの
説明図である。 第７図は、ＰへｇＫ８４およびその遺伝子工学的削除誘
導体であるｐＡｇＫ＋０２６の伝達能力の比較図である
。 図面の浄ご（′内容に変更なし） １７パロシ〉ブｊ１ で） 手 続 補 正 書（犬べ） 昭和６３年特。′１願第２６５２１’３号２、を明の６
称 新菌株 ３゜ 捕Ｗをする石 １＋件との関係 特許出ぬ１１人 住所
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、抗生物質アグロシン（ａｇｒｏｃｉｎ）８４の合成
をコードし、伝達領域の限定的欠損により伝達が阻止さ
れるように修飾された遺伝子を含むプラスミド。 ２、プラスミドが、プラスミドｐＡｇＫ８４からＥｃｏ
Ｒ１フラグメントのＤ１およびＨが実質的に完全に除去
された誘導体である、請求項１記載のプラスミド。 ３、プラスミドｐＡｇＫ１０２６またはその誘導体であ
る、請求項２記載のプラスミド。４、伝達領域の欠損に
より伝達が阻止されるように修飾された、アグロシン８
４の合成コード遺伝子を含むプラスミドを持つ、アグロ
バクテリウム・ラジオバクター（￥Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ￥￥ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ￥）Ｋ８４の非病
原性株。 ５、プラスミドが、プラスミドｐＡｇＫ８４からＥｃｏ
Ｒ１フラグメントのＤ１およびＨを実質的に除去した誘
導体である、請求項４記載の非病原性株、その誘導体な
らびに突然変異体。 ６、アグロバクテリウム・ラジオバクター（￥Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥￥ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ￥）Ｋ
８４の非病原性株であるＫ１０２６株、その誘導体なら
びに突然変異体。 ７、プラスミドｐＡｇＫ８４および適当なプラスミドク
ローニングベクターを用意し；プラスミドｐＡｇＫ８４
のＢａｍＨ I フラグメントのＢ１を該プラスミドクロ
ーニングベクターに挿入し；そして 挿入したフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲ１と接触させ
てＥｃｏＲ１フラグメントのＤ１およびＨを削除するこ
とよりなる； 抗生物質アグロシン（ａｇｒｏｃｉｎ）８４の合成をコ
ードし、伝達領域の欠損により伝達が阻止されるように
修飾された遺伝子を含むプラスミドの製造方法。 ８、プラスミドクローニングベクターが、プラスミドｐ
ＢＲ３２５である、請求項７記載の方法。 ９、ＥｃｏＲ１フラグメントのＤ１およびＨがＢａｍＨ
I フラグメントのＢ１から除去されたとき生じるプラ
スミドがプラスミドｐＭＨＲ１００であり、該プラスミ
ドｐＭＨＲ１００においてプラスミドｐＡｇＫ８４の約
３．７ｋｂおよび０．５ｋｂ部分が削除の夫々の側に残
されている、請求項８記載の方法。 １０、ｐＡｇＫ８４のＢａｍＨ I フラグメントＣを含
むプラスミドを用意し、そして削除の一方の側に残って
いるｐＡｇＫ８４の約０．５ｋｂの残存部分にＥｃｏＲ
１フラグメントＤ２を加えて、該残存部分を約３．３ｋ
ｂに増加させる、請求項９記載の方法。 １１、形成された組合わせプラスミドクローンがｐＤＡ
Ｊ１０２である、請求項１０記載の方法。 １２、さらに、 伝達領域の近くに挿入された抗生物質耐性マーカーを含
むプラスミドｐＡｇＫ８４を宿す第一のアグロバクテリ
ウム株、 プラスミドｐＡｇＫ８４を欠損している第二のアグロバ
クテリウム・ラジオバクター株、および伝達領域の限定
的削除により伝達が阻止されるように修飾されたｐＡｇ
Ｋ８４の伝達領域を含むプラスミドクローニングベクタ
ーｐＢＲ３２５を宿している大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ）株、 を用意し； 該限定的欠損を有するプラスミドクローニングベクター
を抗生物質耐性マーカー株に移動および伝達させ； このコインテグレートを接合によってプラスミドｐＡｇ
Ｋ８４を欠くアグロバクテリウム・ラジオバクターＫ８
４株に伝達し；そして このトランスコンジュカントを削除マーカー交換に付す
る； ことから成る、請求項７記載のプラスミドの製造方法。 １３、第一のアグロバクテリウム・ラジオバクターの株
が、伝達（Ｔｒａ）領域のすぐ外側にＴｎ５挿入片を有
し、該挿入片は該株にカナマイシン耐性を与えるもので
ある、請求項１２記載の方法。 １４、クラウンゴール病の抑制処理を受けるべき植物材
料、および 伝達領域の削除によって伝達が阻止されるように修飾さ
れたアグロシン８４の合成コード遺伝子を含むプラスミ
ドを持つ、アグロバクテリウム・ラジオバクターＫ８４
の非病原性株またはその誘導体もしくはミュータントを
用意し；そして、上記植物材料を上記非病原性のアグロ
バクテリウム・ラジオバクターＫ８４株と、直接的また
は間接的に接触させる； ことよりなる、植物のクラウンゴール病の抑制方法。 １５、プラスミドが、プラスミドｐＡｇＫ８４からＥｃ
ｏＲ１フラグメントのＤｌおよびＨが実質的に除去され
た誘導体またはその誘導体もしくはミュータントである
、請求項１４記載の方法。 １６、植物材料が、種子、苗および成長中の作物である
、請求項１６記載の方法。 １７、作物が、核果の木、サクラの種、ケインベリー（
ｃａｎｅｂｅｒｒｙ）類、ニシキギ属（ｅｕｏｎｙｍｕ
ｓ）、クレマチス属（ｃｌｅｍａｔｉｓ）および柿属（
Ｐｅｒｓｉｍｏｎ）から選択される、請求項１６記載の
方法。 １８、植物材料を、アグロバクテリウム・ラジオバクタ
ーＫ８４の株の細胞懸濁液に浸漬して該株と接触させる
、請求項１５記載の方法。 １９、アグロバクテリウム・ラジオバクターＫ８４の株
がＫ１０２６株である、請求項１８記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPI497787 | 1987-10-20 | ||
| AU4977 | 1987-10-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02465A true JPH02465A (ja) | 1990-01-05 |
| JP2790295B2 JP2790295B2 (ja) | 1998-08-27 |
Family
ID=3772506
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63265213A Expired - Fee Related JP2790295B2 (ja) | 1987-10-20 | 1988-10-20 | 新菌株 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5354684A (ja) |
| EP (1) | EP0313333B1 (ja) |
| JP (1) | JP2790295B2 (ja) |
| AU (1) | AU603318B2 (ja) |
| DE (1) | DE3853979D1 (ja) |
| ES (1) | ES2072865T3 (ja) |
| ZA (1) | ZA887732B (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2703996B1 (fr) * | 1993-04-16 | 1995-07-21 | Transgene Sa | Ensemble de transposition destine au transfert d'un gene d'interet dans le genome d'une cellule eucaryote. |
| WO1999020777A1 (en) | 1997-10-17 | 1999-04-29 | Cornell Research Foundation, Inc. | Bacterial resistance in grapevine |
| US7141395B2 (en) | 2000-08-11 | 2006-11-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Biological control of crown gall disease |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4588693A (en) * | 1983-02-28 | 1986-05-13 | Research And Development Institute, Inc. At Montana State University | Development of plant roots |
| BR8404834A (pt) * | 1983-09-26 | 1985-08-13 | Agrigenetics Res Ass | Metodo para modificar geneticamente uma celula vegetal |
| EP0157253A1 (en) * | 1984-04-05 | 1985-10-09 | Cyanotech Corporation | Comspositions and methods for dna cloning in cyanobacteria |
| EP0174166A1 (en) * | 1984-08-31 | 1986-03-12 | Lubrizol Genetics Inc. | Disarmed T-DNA |
-
1988
- 1988-10-17 ZA ZA887732A patent/ZA887732B/xx unknown
- 1988-10-19 ES ES88309807T patent/ES2072865T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-19 DE DE3853979T patent/DE3853979D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-19 EP EP88309807A patent/EP0313333B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-20 AU AU23480/88A patent/AU603318B2/en not_active Expired
- 1988-10-20 JP JP63265213A patent/JP2790295B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-05-26 US US07/890,393 patent/US5354684A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| AUSTRALASIAN PLANT PATHOLOGY * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2348088A (en) | 1989-04-20 |
| ZA887732B (en) | 1990-05-30 |
| AU603318B2 (en) | 1990-11-08 |
| EP0313333A3 (en) | 1990-12-19 |
| EP0313333B1 (en) | 1995-06-14 |
| JP2790295B2 (ja) | 1998-08-27 |
| EP0313333A2 (en) | 1989-04-26 |
| DE3853979D1 (de) | 1995-07-20 |
| ES2072865T3 (es) | 1995-08-01 |
| US5354684A (en) | 1994-10-11 |
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|---|---|---|---|
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