JPH0245761A - 蛍光消去に基づく蛍光免疫検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、概して蛍光免疫検定を行う方法に関するもの
である。免疫検定法は、免疫反応が非常に特異であり、
且つ高感度で測定できるので定性的測定および定量的測
定に最も有効な方法の一つである。

（従来技術および発明が解決しようとする課題）近年、
古典的な放射線免疫検定（ＲＩＡ）の一部は、放射線活
性物質の使用を避ける為に蛍光免疫検定（ＦＩＡ）に移
行しつつある。　ＦＩＡがＲＩＡはど高感度ではないが
、蛍光免疫検定は、蛍光スペクトルが検定において最も
多用途の方法であるので迅速に発展しつつある。以下に
代表的文献を挙げる。

Ｇ、Ｃ，ＶｉｓｏｒおよびＳ、Ｇ、　Ｓｃｈｕｌｍａｎ
、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍ。

Ｓｃｉ、　７０．４６９　（１９８１年）；Ｒ，Ｐ、　
ＥｋｉｎｓおよびＳ、Ｄａｋｕｂｕ＋″Ｔｈｅ　Ｄｅｖ
ｅｌｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｖｉｔｙ
Ｐｕｌｓｅｄ−Ｌｉｇｈｔ、　Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖ
ｅｄ　ＦＩＡ’、　Ｐｕｒｅ　＆Ａｐｐ１．　Ｃｈｅｗ
、　５７４７３（１９８５年）；　Ｔ、Ｓ、　Ｓｎ＋ｉ
ｔｈ、　Ｍ。

Ｉｔ　ａ　ｓ　ｓ　ａ　ｎおよびＲ，Ｄ、　Ｎａｒｇｅ
ｓｓｙ＋　”Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅ　ａｎｄＰｒａｃｔｉ
ｃｅ　　ｏｆ　　ＦＩＡ　　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　　
　ｉｎ　　：ＭｏｄｅｒｎＦｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ　５
ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、　ｖｏｌ　３　（Ｅ、Ｌ、　
ＷｅｂｒｙＷ）Ｐｌｐｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　
Ｙｏｒｋ、（１９７８１年）：Ｎ、Ｊ、　５ｅａｒｅ、
　”ＩＩＩＩｍｕｎｏａＳｓａｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ　、　ｉｎ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｅｎｓｏｒｓ　（
Ｔ、Ｅ、　Ｅｄｍｏｎｄｓ　Ｗ）、Ｃｈａｍｐａｔ＋ａ
ｎｄ　Ｈａｌｌ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、（１９８８年）
；１、　　Ｋａｒｕｂｅ、　　・Ｎｏｖｅｌ　　Ｉｍｍ
ｕｎｏｓｅｎｓｏｒｓ　　、１ｎＢｉｏｓｅｎｓｅｒｓ
　２．３４３．　（１９８６年）、Ｊ、Ｓ、　Ｗｏｏｄ
ｈｅａｄおよび夏、　Ｗｅｅｋｓ＋　”Ｃｈｅｍｉｌｕ
ｍｉｎｅｓｃｓｎｅｃｅｆｍｕｎｏａｓｓａｙ　　、Ｐ
ｕｒｅ　　＆　Ａｐｐｌ、ＣｈｅＩＩ＋、５７＋　　５
２３（１９８５年）； Ｍ、Ｇ、　　Ｇｒａｙｅｓｋｉ＋　　Ｃｈｅｍｉｌｕ＋
＋＋ｔｎｅｓｃｓｎｅｃｅ１ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　　
、　　Ａｎａｌ、　　Ｃｈｅｗ、　　５９＋　　１２５
ＯＡ　　（１９８５年）。

全てのこれらの技術において、抗体（Ａｂ）または抗原
（Ａｇ）が蛍光分子で標識され、抗体抗原結合の結果と
しての蛍光特性の変化が研究されている。

相同性ＦＩＡと異種性ＦＩＡとを識別することが共通で
ある。相同性Ｆｌ＾は、未標識蛋白質からの標識蛋白質
の分離を必要としないという利点がある。

しかしながら、これは、感応性が低い。顕微鏡法による
別のＦ（Ａが記載されている。

１、強度測定に基づく蛍光免疫検定法 この方法は、抗体に結合した後の蛍光標識された配位子
の蛍光強度の減少または増加に基づくものである。この
強度の変化の理由は未知であるが、染料の電子構造の変
化が生じるものと予想される。

得られる結合・標識された配位子の電子分布の変化は、
励起分子の放射線不活性化を増強することができる。

別の解釈としては、結合によって生じる蛍光標識環境の
極性変化が予測される。従って、発蛍光団の量子効率は
、おそらく溶媒和発色のために、特徴的に改質される。

蛍光の減少および増加の両者が生じ得るが、変化の方向
に関する予測は、不可能である。

２、エネルギー転移蛍光免疫検定法 第一の発蛍光団（いわゆるアクセプター）の吸収バンド
が他の発蛍光団（いわゆるドナー）の吸収バンドとオー
バーラツプする場合、ドナーからアクセプターへの電子
エネルギー転移（［ＥＴ）が起こり得る。公知の例とし
ては、発蛍光団対であるフルオレセイン／ローダミンが
挙げられる。２種類の染料の混合物におけるフルオレセ
インの励起により、ローダミン蛍光の放射が生じる。

ＥＴの効率は、発蛍光団の距離の６乗に反比例する。抗
原（ローダミンにより標識され得る）が抗体（フルオレ
セイン標識された）に結合されない限り、ＥＴは生じな
い。ＥＴは、抗体と抗原とが結合された場合にだけ、す
なわち、近距離の場合だけ観察される。上記のような検
定に関する具体例は、Ｆｉｓｈｅｒ等によるＣｌ１ｎ、
　Ｃｈｅｍ、　２６．９８７（１９８０年）に記載され
ている。

ところで、エネルギーアクセプターは、蛍光しない。そ
の吸収スペクトルがドナーの放射スペクトルとオーバー
ラツプするので、非蛍光染料は、抗原と抗体が近接した
際に、蛍光体の蛍光を減じる。

上記の両方法は、抗体と抗原の両方を標識する必要があ
るので、複雑である。具体例は、Ｖｅｌｉｃｈ等による
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　４６
＋　１４６０（１９６９年）に記載されている。

３、蛍光極性免疫検定法 小さい高速回転分子の蛍光放射は、全分子が励起状態の
際に統計的にスピンするので極性化されない。従って、
全方向に放射する。しかしながら、蛍光極性は、抗原と
抗体との複合体の場合に、その寸法および低い回転速度
のために生じる。

標識された抗原と抗体との結合の結果として蛍光極性化
が増加することを観察できる。極性の程度は、＋１／２
〜−１７３の範囲であることが知られている。Ｐ値が配
位子の結合の範囲で変化するので、Ｐ対未標識配位子の
プロットにより相同性免疫検定に利用することのできる
検量線が作成できる。具体例は、１ｕ−５ｊｅｆｆｅｓ
等によるＣ１ｔｎ、　Ｃｈｅｗ。

２８、２２７８　（１９８２年）に記載されている。上
記の方法とファイバーオプチックス導波管惑応機構（ｆ
ｉｂｅｒ　ｏｐｔｉｃａｌ　ｗａｖｅｇｕｉｄｅ　ｓｅ
ｎｓｉｎｇ　ｓｃｈｅｍｅｓ）との組合せは、米国特許
第４．４５Ｌ　１４９号に記載されている。

４、時間分解蛍光免疫検定法 抗原−抗体複合体の形成に従って、蛍光強度およびその
極性が変化するだけでなく、蛍光減衰時間も変化する。

複合体の形成による蛍光減衰時間を測定することによっ
て、抗体の量を決定することができる。

具体例は、異常に長い減衰時間による蛍光レベルを利用
するドイツ特許公開筒２，６２８．１５８号から知られ
ている。詳細な説明は、Ｈｅｍ１等によるＡｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３７３３５　（１９８４年）に記
載されている。

この方法は、Ｒｏｍａｎ　ａｎｄ　Ｒａｙｌｅｉｇｈ　
５ｃａｔｔｅｒにより生じた背景蛍光を完全に支持する
という利点がある。しかしながら、上記の方法は、複合
体の減衰時間と遊離配位子との相違用の複雑な電子処理
装置を必要とし、安定剤等の補足的な試薬を要するとい
う欠点がある。

５、酵素結合蛍光免疫検定法 酵素が抗体と共有結合された際にも、酵素基質を加水分
解することができる。蛍光加水分解産生物は、酵素作用
の結果として、非蛍光酵素基質から生成される。しかし
ながら、抗体−抗原複合体の生成の後は、この酵素は、
分裂がゆっくり進行するかあるいは、総じて抑制される
ので、もはや基質として適用できない。従って、加水分
解の減少速度は、生成された抗体−抗原複合体の測定で
ある。

この方法の具体的適用は、Ｗａｒａｈ等によるＣｌ１ｎ
。

Ｃｈｅｍ、　２７．６７３　（１９８２年）に記載され
ている如くＩｇＭの決定である。蛍光消去法に基づく比
較的に複雑な別の免疫検定法がヨーロッパ特許出願筒１
０４．９２６号に提出されている。例えば、薬剤の免疫
原性基質の決定に関して、先ず、この基質を巨大蛋白質
に結合させ、次いで、相当する抗体を単離し、蛍光的に
標識されたナフタレンとともに免疫検定に用いる。この
方法は、長時間を要し、且つ困難である。

上記に記載した方法以外に、種々の異種ＰＴＡ法がある
が、これらの方法は、より複雑で良好な感応性であるこ
とを特徴とするものである。このような方法において、
先ず、抗体−抗原複合体を、遊離配位子から分離し、次
いで、消去させる。この方法の主要な利点は、背景蛍光
の完全な放射およびそれゆえに感応性の著しい増加にあ
る。

（課題を解決するための手段） 本発明は、外部添加消去剤による蛍光性抗体または蛍光
標識された抗体の蛍光を消去することに基づくものであ
る。

すなわち、本発明は、 （ａ）限定された濃度で添加された外部消去剤によって
減少された、場合により抗原または抗体の蛍光強度また
は蛍光減衰時間を先ず測定し、（ｂ）抗原または抗体を
均一溶液または固定された形で検体の対応する抗原また
は抗体と反応させ、（ｃ）外部添加された消去剤によっ
て発蛍光団の蛍光消去の程度を結合反応の後に測定し、 （ｄ）予め計算されたまたは経験的に測定された検量線
によって未知検体中に存在する抗原または抗体の量を測
定する、 ことを特徴とする蛍光免疫検定を行う方法に関するもの
である。

一定の発蛍光団の蛍光がいわゆる消去分子の添加によっ
て消去されることは公知である。この現象は、作用の機
構により静電または動摩擦消去といわれており、蛍光量
の低減を示す。動摩擦消去の場合、発蛍光団の平均寿命
も、消去剤の添加によって減じられる。

静電消去は、電子的に基底状態において未蛍光発蛍光団
−消去剤複合体の生成によって引き起こされる。動摩擦
消去は、しばしばその寿命（０，１〜１０００ｎｓ）の
際の第一励起状態における電子転移によるものであり、
非蛍光分子を導く。代表的な発蛍光団と消去剤との組合
せを、第１表に示す。

シュテルンーフォルマー式は、蛍光強度と消去濃度との
関係を式： １（１／Ｔ＝１＋Ｋ　［Ｑ］　　・・・（式１）で表す
。ここで、Ｉｏおよび■は、各々濃度［Ｑ］　で存在す
る消去剤の存在または不存在における発蛍光団の蛍光強
度である。には、発蛍光団−消去剤対に特異ないわゆる
消去定数であり、温度、粘度および溶媒に依存する。

ｔｏ／ｌ＝１十Ｋ　（口１　　・　・　・　（式２　）
（ここで、ｔｏおよびｔは、各々濃度［Ｑ］　で存在す
る消去剤の存在または不存在における発蛍光団の減衰時
間である）の関係にあるので動摩擦消去の場合には、強
度■の代わりに、発蛍光団の寿命を用いてもよい。

本明細書に開示する新規の蛍光免疫検定法は、抗原−抗
体複合体の生成の前または後に、外部消去剤による標識
または未標識抗体あるいは抗原の蛍光消去の測定に基づ
くものである。

蛍光蛋白質に関して記載すると、二種類の蛍光性抗原と
抗体とを区別しなければならない。すなわち、第一グル
ープは、固有の蛍光性を示すものからなり、第ニゲルー
プは、発蛍光団で標識されたものである。自己蛍光は、
分子がトリプシン（Ｔｒｙ）またはトリプトファン（Ｔ
ｒｐ）を含有する場合に観察される。この場合、蛍光は
、各々２８０または２９５ｎｍで励起され、３００ない
し３５０ｎｍで放射極大を有する。

しかしながら、フルオレセインまたはローダミンまたは
それ以外の消去性で、低波長励起性の蛍光発色原子団等
の合成発蛍光団で標識された抗原または抗体がより普通
である。

標識は、標準方法であるとみなすことができる。

方法の種々の要素は、ＲｏＰ、　５ｔｅｉｎｅｒ　　に
おける”Ｃｏｖａｌｅｎｔ　Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ　Ｐ
ｒｏｂｅｓ　　：”ＥｘｃｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ　ｏｆ
　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ”Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ
、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　１９８３年においてＲ，Ｐ、　
Ｈａｕｇｌａｎｄにより見出されている。最も共通のラ
ベルとしては、蛍光イソチオシナネート（末端アミノ基
と反応）、蛍光塩化硫酸（アミノ基および水酸基と反応
）およびヨードアセトアミド（ＳＨ基に選択的）等が挙
げられる。標識された抗原および抗体も市販されている
。

本発明の方法の必須的な基準は、消去剤が溶媒中に存在
し、無視できる蛍光性を有するかあるいは全く存在しな
いということである。自己蛍光性の場合は（例えば、消
去剤レゾルシンの場合）、その蛍光強度の測定を干渉し
ないために、標識と全く異なる波長におけるものである
。具体的消去剤は、特許請求しないが完全である第１表
に記載されるものである。通常は、相違は、例えば、ハ
リド等のイオン性消去剤と例えば、酸素、アクリルアミ
ド、ピリジンまたはレゾルシン等の非イオン性消去剤と
の間になされる。

抗体または抗原が溶媒に溶解される限りは、その蛍光は
、該溶媒中に存在する消去剤によって消去される。抗体
−抗原複合体が生成した後、発蛍光団は、多くの衝突を
減少させ、消去効率を減少し、蛍光強度または寿命を増
加させるように消去剤分子から遮蔽される。

以下の図面は、本発明を説明し、本発明以外の方法と比
較して本発明方法の利点を強調する役割を果たすもので
ある。

第１図は、抗原（Ａｇ）に結合する前（１ａ）後（１ｂ
）の代表的Ｖ字型抗体（Ａｂ）の概略図である。抗原が
抗体に結合されない限り、溶解した消去剤が蛋白質にお
けるチロシンまたはトリプトファン（１で表示）をより
効率的に消去することができることは、明白である。こ
の方法の利点は、この方法が抗原または抗体を標識しな
くてよく、消去剤が充分に限定された濃度で加えること
ができるということである。抗原および抗体の両方を標
識しなければならない複雑な方法と対照的である。

第２図は、抗原（Ａｇ）に結合する前（２ａ）後（２ｂ
）の蛍光標識された抗体の概略図である。発蛍光団（°
で表示）は、抗体と共有結合される。抗原が抗体に結合
されない限り、溶解した消去剤（Ｑ）が発蛍光団をより
効率的に消去することができることは、明白である。こ
の場合において、パートナ−と結合したものが標識しな
ければならないが、この標識は、適切な（長波長）スペ
クトルの性質を有する種々の消去剤から選択することが
できる。

さらに、この消去剤を、充分に限定された濃度の溶媒に
加えることができる。

第３図は、抗体（Ａｇ）に結合する前（３ａ）後（３ｂ
）の蛍光標識された抗原の概略図である。

第４図は、抗原の比較蛍光強度（式１における■）また
は比較減衰時間（式２におけるｔ）対添加された抗体の
増量をプロットすることによって得られた代表的曲線を
表す図面である。本発明の方法は、明らかに強度または
減衰時間の測定に減じたという点で簡単である。極性化
剤を必要とせず、また抗体−抗原複合体の単離を必要と
しない。

第５図は、光学的に透明な支持体またはファイバー導波
管に固定された抗原または抗体の蛍光強度を測定する実
験装置の概略図である。抗体は、ファイバーの末端にま
たは該ファイバーのコアに固定することができる。別法
として、固体支持体（例えば、ポリマー膜）に結合させ
て、次いで、低価格材料から組み立てることもでき、そ
れゆえに使い捨て支持体に最適である。最終的に、ファ
イバー導波管の補助により、移植性 （ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ）　ファイバーオブチック酸
素センサーの場合に、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ等によりＡｎａ
ｌ、　Ｃｈｅｍ、５６．６２（１９８４年）に示されて
いるような本体における免疫測定を直接行うことができ
る。

第６図は、総内部反射技術を用いて標識された抗原また
は抗体の蛍光測定がどのようになされるかを説明する説
明図である。各々ｎ、およびｎ２の反射指数を有する二
種類の媒体の界面における総反射に関して、光りが界面
で反射しないが、低反射指数の相に数ｎ１１進入［消去
（ｅｖａｎｅｓｅｃｅ）　１することが知られている。

従って、導波管によって外部に移動される蛍光を励起す
ることができる。これに関する文献については、Ｐｌａ
ｃｅ　Ｊ、Ｆ等のＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ　１＋　３２１
　（１９８５年）を参照のこと。

本発明の方法の利点は、光学的に不透明のサンプル（血
液等）が光学的混乱を生じることなしにサンプル（この
場合は、抗原または抗体）上に配置することができるよ
うに充分に限定された侵入の深度（反射指数および光の
波長のみに依存）によって提供されるということである
。

具体的方法を、血清中の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の
決定によって説明する。抗ヒトＩｇＧ（シープからの）
を、２２°Ｃにて２４時間ｐＨ９，５の重炭酸緩衝液４
ｍｌ中ツルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）
でインキュベートする（５０■ｔｇｃおよび４■ＦＩＴ
Ｃ）。

セファデックスＧ−２５カラム（１０ＣＩＩＸ２　ｃｍ
　）でクロマトグラフィーにより遊離ＦＩＴＣから標識
抗体を単離した後、標識蛋白質を０．１χ乳化剤含有０
．１規定臭化カリウム水溶液に溶解して、蛋白質濃度０
．１〜１．０■／ｌの溶液を得る。臭化カリウムの代わ
りに、臭化ナトリウム、沃化ナトリウムまたはアジ化ナ
トリウムを使用することもできる。

沃化物、アジ化物または臭化化物は、蛍光ＦＩＴＣの強
力な消去剤である。ＩｇＧの表面に結合されたフルオレ
セインが溶液にさらされている限りは、その蛍光強度は
、溶媒中のハリトイオンにより強力に消去される。また
、発蛍光団の減衰時間は、この段階においてやや短い。

該溶媒に増加量のＩｇＧ含有血清を加えた場合に、複合
体は、ＩｇＧと抗１ｇＧとの間に形成される。従って、
抗体表面に結合されたフルオレセインが増加する程、蛍
光が容易に消去しにくくなる。そこ結果、蛍光の増加（
強度および寿命の両方）が全抗１ｇＧがＩｇＧに結合さ
れるまで観察される。第４図に示されるような検量線が
得られる。標識さた抗ＩｇＧの蛍光を血清サンプル含有
溶液のものと比較することによって、ＩｇＧは、検量線
を介して定量的に検定可能である。

ＦＩＴＣ以外に、種々の別の消去性発蛍光団を標識に用
いることができる。アクリジニウム（ａｃｒｉｄｉｎｕ
ｍ）　　イオンおよび６−ミドキシキノリニウムイオン
の比較的特異な消去が塩化物、臭化物および沃化物によ
ってなされることを言及する。塩化物は、約１００モル
／ｌの濃度のヒト血液に生じる。従って、血液塩化物は
、生体内測定における消去剤に使用することができる。

蛋白質の固有蛍光の消去（ＴｒｙおよびＴｒｐによる）
は、例えば、ピリジン、アクリルアミド、プロミド、ヨ
ーダイトまたは水銀（ＩＩ）等の重金属を用いて可能で
ある。

この方法の特定の変更において、抗原または抗体は、光
学的に透明なポリマー性支持体の表面に固定される。具
体的支持体としては、平板状の石英またはガラス製スラ
イド、ポリアクリルアミドスライドまたはファイバーオ
プチック導波管が挙げられる。表面固体化抗体または抗
原の蛍光強度または寿命は、溶液における実験に関して
前述のごとく検査される。

蛍光は、また、総内部反射顕微鏡に共通の消去波（ｅｖ
ａｎｅｓｃｅｎ　を讐ａｖｅ）技術によって検査される
１（第５図）　上記光学的方法は、 ”０ｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｉｍｍｕｎｏｓｅｎ
ｓｏｒｓ：＾Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆＯｐｔｔｃａｌ　Ｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ　ａｔ　Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　５
ｕｒｆａｃｅｓ　＋Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ　１．３２１
　（１９８５年）においてＪ、Ｆ。

Ｐｌａｃｅ等により記載されている。また、米国特許筒
４，４４７，５４６（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ）は、消去
波技術を充分に限定されたサンプル容量における免疫検
定に関する方法を教示している。しかしながら、Ｈｉｒ
ｓｃｈｆｅｌｄは、競合結合というこの方法を越える固
有の利点を有する蛍光消去免疫検定法の可能性を認識し
損なっている。

同様に、ファイバーオプチックス導波管を用いる場合、
外部消去剤による遅延消去の結果としての蛍光の変化は
、導波管により観察される。標識蛋白質は、また消去波
技術によって蛍光変化測定を認めるファイバーの末端に
またはファイバーコアに直接配してもよい。

消去波技術は、内部総反射光が短距離（具体的には１０
０〜２００ｎｍ　）で異なる反射指数を有する蛋白質表
面に進入するので血液等の濃色溶液を研究することがで
きるという利点がある（第６図）。

従って、Ｔｒｙおよびｔｒｐのかなり選択的な励起が可
能である。加えて、抗体層の上に位置する（および消去
波の到達しない）サンプルからの背景の蛍光の強度を低
く保つことができる。

ファイバー導波管の末端に抗原または抗体を固定するこ
とによって、免疫検定がファイバー導波管を介して直接
行うことができる。導波管を用いた最も重要な方法のリ
ストを上記のＰｌａｃｅ等による文献に見出すことがで
きる。ハリ上感応性インデイケータ−は、血液中に約１
００ｍモル／ｌの消去剤クロリドが存在するという観点
から侵略的免疫カテーテルの場合に好ましい。

長期間溶液中で安定であり、抗原−抗体結合に影響を及
ぼさない理想的外部消去剤を、充分に限定された濃度で
サンプルに加えることができる。

具体的には、ハリド、擬似ハリド、ピリジンおよびピリ
ジニウムイオン、アクリルアミド、ヒドロキノンおよび
遷移金属カチオンが挙げられる。また、分子酸素および
二酸化硫黄（または硫化物）は、一定の芳香族炭化水素
に対する強力な消去剤として知られている。

エネルギー転移法に関する第（２）節に記載されたＦＩ
Ａに比較して、本発明の新規な方法においては、二重標
識を必要としない。さらに、消去剤の吸収が標識の蛍光
スペクトルに調和するかどうかに無関係にどのような消
去剤を利用することができる。

また、本発明方法における消去メカニズムは、放射性エ
ネルギー転移（ＥＴ）のメカニズムと異なるものである
。これは、また、エネルギー転移と外部消去の異なる数
学的処理によって証明される。すなわち、ＥＴ消去法は
、Ｒ−６に依存するＥＴ効率を用いたフォスター理論（
Ｒは二種間の距離である）に従う。添加された消去剤に
よる蛍光の消去は、シュテルンーフォルマー理論（式１
および式２）に従う。

【図面の簡単な説明】

以下の図面は、本発明を説明し、本発明以外の方法と比
較して本発明方法の利点を強調する役割を果たすもので
ある。 第１図は、抗原（Ａｇ）に結合する前（１ａ）後（１ｂ
）の代表的Ｙ字型抗体（Ａｂ）の概略図である。。 第２図は、抗原（Ａｇ）に結合する前（２ａ）後（２ｂ
）の蛍光標識された抗体の概略図である。 第３図は、抗体（Ａｇ）に結合する前（３ａ）後（３ｂ
）の蛍光標識された抗原の概略図である。 第４図は、抗原の比較蛍光強度（式１におけるりまたは
比較減衰時間（式２におけるｔ）対添加された抗体の増
量をプロットすることによって得られた代表的曲線を表
す図面である。 第５図は、光学的に透明な支持体またはファイバー導波
管に固定された抗原または抗体の蛍光強度を測定する実
験装置の概略図である。 第６図は、総内部反射技術を用いて標識された抗原また
は抗体の蛍光測定がどのようになされるかを説明する説
明図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）（ａ）限定された濃度で添加された外部消去剤によ
   って減少された、場合により抗原または抗体の蛍光強度
   または蛍光減衰時間を先ず測定し、 （ｂ）抗原または抗体を均一溶液または固定された形で
   検体の対応する抗原または抗体と反応させ、 （ｃ）外部添加された消去剤によって発蛍光団の蛍光消
   去の程度を結合反応の後に測定し、 （ｄ）予め計算されたまたは経験的に測定された検量線
   によって未知検体中に存在する抗原または抗体の量を測
   定する、 ことを特徴とする蛍光免疫検定を行う方法。 ２）消去可能な発蛍光団は、抗原または抗体中のチロシ
   ンまたはトリプトファンである請求項１に記載の方法。 ３）消去可能な発蛍光団は、共有固定化によって抗原ま
   たは抗体に結合された消去可能な蛍光体である請求項１
   に記載の方法。 ４）消去可能な発蛍光団をハロゲン化物または擬似ハロ
   ゲン化物によって消去し、かつ溶剤に添加された外部消
   去剤はハロゲン化物または擬似ハロゲン化物イオンであ
   る請求項１に記載の方法。 ５）２つ結合成分の一つは、固形の支持体に固定されて
   いる請求項１に記載の方法。 ６）抗原または抗体は、オプチックス導波管またはファ
   イバーオプチックス導波管に固定され、蛍光消去を、オ
   プチックス導波管またはファイバーオプチックス導波管
   によって追跡する請求項１に記載の方法。 ７）蛍光免疫検定は、血清、血漿または全血において行
   われ、消去剤は、血清、血漿または全血である請求項１
   に記載の方法。