JPH02312591A - 超音波による酵素反応の制御法 - Google Patents
超音波による酵素反応の制御法Info
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- JPH02312591A JPH02312591A JP13388289A JP13388289A JPH02312591A JP H02312591 A JPH02312591 A JP H02312591A JP 13388289 A JP13388289 A JP 13388289A JP 13388289 A JP13388289 A JP 13388289A JP H02312591 A JPH02312591 A JP H02312591A
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Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、酵素反応若しくは微生物を用いた酵素反応に
おける反応速度、生成物分布を超音波を照射することに
より制御する方法に関する。
おける反応速度、生成物分布を超音波を照射することに
より制御する方法に関する。
更に詳しくは、本発明は、各種の酵素又は微生物に含有
されている酵素を利用した反応系に於いて溶媒として有
機溶媒を用い、反応開始前より反応終了直前までのいず
れかの段階で超音波照射し反応を制御することを特徴と
する酵素反応制御法である。
されている酵素を利用した反応系に於いて溶媒として有
機溶媒を用い、反応開始前より反応終了直前までのいず
れかの段階で超音波照射し反応を制御することを特徴と
する酵素反応制御法である。
〔従来の技術とその問題点）
酵素又は微生物を用いた反応は、化学的な触媒反応と比
較すると、次の様な特徴を有する。
較すると、次の様な特徴を有する。
■温和な条件（常温、常圧）で反応する。
■特殊な場合を除いて水溶液で反応する。
■各種特異性（反応特異性、基質特異性、位置特異性、
立体特異性）が高い。
立体特異性）が高い。
■反応効率が高い。
以上の様な特徴は、適切な基質及び反応条件を選へば目
的物のみを選択的に得る事が出来ることを示している。
的物のみを選択的に得る事が出来ることを示している。
一般に生化学反応、有機化学反応は、いくつかの素反応
からなり、ある反応条件下で生成物間及び反応中間体間
に平衡が成立している。化学的触媒または生化学的触媒
である酵素は、これら素反応の反応速度を増加または減
少させる。また、それぞれの反応には、至適の基質濃度
、反応溶媒、ｐＨ１温度が存在し、生成物の分布は、こ
れらの条件に依存している。これらの条件を一つまたは
複数変化させて目的物の収率を向上させることは、有機
合成分野での重要な課題である。
からなり、ある反応条件下で生成物間及び反応中間体間
に平衡が成立している。化学的触媒または生化学的触媒
である酵素は、これら素反応の反応速度を増加または減
少させる。また、それぞれの反応には、至適の基質濃度
、反応溶媒、ｐＨ１温度が存在し、生成物の分布は、こ
れらの条件に依存している。これらの条件を一つまたは
複数変化させて目的物の収率を向上させることは、有機
合成分野での重要な課題である。
従来、上記の至適条件を変化させずに生化学反応又は有
機化学反応を制御するのに、光照射や熱エネルギーの反
応系への付加が行われている。
機化学反応を制御するのに、光照射や熱エネルギーの反
応系への付加が行われている。
しかし光または熱などの外部エネルギーの酵素反応系へ
の導入は、上記素反応すべてを非特異的に促進または阻
害するため、これらの条件を変化させて目的物の収率を
コントロールすることは困卸である。また酵素あるいは
微生物が含有する酵素は一般的に熱に対して不安定であ
るため上記外部エネルギーの導入により失活することが
あり、そのため目的生成物の収率を低下させたりする。
の導入は、上記素反応すべてを非特異的に促進または阻
害するため、これらの条件を変化させて目的物の収率を
コントロールすることは困卸である。また酵素あるいは
微生物が含有する酵素は一般的に熱に対して不安定であ
るため上記外部エネルギーの導入により失活することが
あり、そのため目的生成物の収率を低下させたりする。
本発明者らは酵素の至適反応条件を維持したまま酵素反
応をコントロールし目的とする反応生成物を効率良く得
る方法を鋭意検討してきた。その結果、酵素反応系に超
音波を照射する方法に思い至った。
応をコントロールし目的とする反応生成物を効率良く得
る方法を鋭意検討してきた。その結果、酵素反応系に超
音波を照射する方法に思い至った。
超音波の照射が各種有機合成反応の促進に効果があるこ
とは比較的古くから知られている。応用例は、いくつか
の総説に開示されている様に金属単体を用いたＢａｒｂ
ｉｅｒ反応、Ｗｕｒｔｚ型カップリング反応、 Ｂｏｕ
ｖｅａｕｌｔ反応、Ｒｅｆｏｒｍａｓｋｙ反応、ハロゲ
ン化物の還元、アニオンラジカルの調製、Ｄｉｅｃｋｍ
ａｎｎ縮合、活性金属や金属カルボニルの調製などがあ
る。反応形態も固−液二相反応、液−液二相反応、均一
反応で行われる。これらの応用例は、有機化学的な触媒
反応とくに不均一反応に効果的であるとされている。し
かし、超音波を酵素反応に応用した例は現在までに報告
されていない。その理由としてタンパク分子よりなる酵
素は、超音波照射によるキャビテーション効果という機
械的、熱的外部エネルギーに対して不安定であると考え
られていたからである。しかし、実施例でも明らかにす
るように酵素分子自身は、有る程度の超音波照射に十分
耐えうることが明らかになった。本発明は超音波照射を
酵素反応に適用したはじめての報告である。
とは比較的古くから知られている。応用例は、いくつか
の総説に開示されている様に金属単体を用いたＢａｒｂ
ｉｅｒ反応、Ｗｕｒｔｚ型カップリング反応、 Ｂｏｕ
ｖｅａｕｌｔ反応、Ｒｅｆｏｒｍａｓｋｙ反応、ハロゲ
ン化物の還元、アニオンラジカルの調製、Ｄｉｅｃｋｍ
ａｎｎ縮合、活性金属や金属カルボニルの調製などがあ
る。反応形態も固−液二相反応、液−液二相反応、均一
反応で行われる。これらの応用例は、有機化学的な触媒
反応とくに不均一反応に効果的であるとされている。し
かし、超音波を酵素反応に応用した例は現在までに報告
されていない。その理由としてタンパク分子よりなる酵
素は、超音波照射によるキャビテーション効果という機
械的、熱的外部エネルギーに対して不安定であると考え
られていたからである。しかし、実施例でも明らかにす
るように酵素分子自身は、有る程度の超音波照射に十分
耐えうることが明らかになった。本発明は超音波照射を
酵素反応に適用したはじめての報告である。
（課題を解決するための手段）
本発明は、下記（１）の構成を有する。
（１）各種酵素または合成高分子により修飾された酵素
を有機溶媒に分散させ、該有機溶媒分散物に超音波を該
超音波の周波数、強度、照射時間を調節し、連続または
、パルスとして照射し、前記酵素反応の速度、生成物の
分布を制御し、目的物を収率良く得ることを特徴とする
超音波照射による酵素反応の制御方法。
を有機溶媒に分散させ、該有機溶媒分散物に超音波を該
超音波の周波数、強度、照射時間を調節し、連続または
、パルスとして照射し、前記酵素反応の速度、生成物の
分布を制御し、目的物を収率良く得ることを特徴とする
超音波照射による酵素反応の制御方法。
本発明方法の実施は、種々の酵素反応系と超音波照射装
置により構成される。
置により構成される。
本発明に用いられる超音波はｌ０ＫＩ−１ｚ以上の周波
数のものであれば良く、照射方式は外部照射方式、内部
照射方式のいずれでも良い。超音波発生装置としては個
々の周波数、出力を連続的またはパルス状に発生するこ
との出来る装置であれば良く、市販の超音波洗浄器、超
音波細胞破砕器（ソニケーター）も使用することが出来
るが、これらを使用する場合適切な温度制御をする必要
がある。
数のものであれば良く、照射方式は外部照射方式、内部
照射方式のいずれでも良い。超音波発生装置としては個
々の周波数、出力を連続的またはパルス状に発生するこ
との出来る装置であれば良く、市販の超音波洗浄器、超
音波細胞破砕器（ソニケーター）も使用することが出来
るが、これらを使用する場合適切な温度制御をする必要
がある。
本発明においては好ましくは強制攪拌と超音波照射を組
み合わせて使用するのが好ましい。
み合わせて使用するのが好ましい。
本発明の超音波照射の強度（照射−５ｔ）は、同一照射
装置、同一周波数のものであれば、Ｗａｔｔ／ｃｍ’／
）Ｉｒで表わすことができる。好ましい該強度は、個々
の酵素反応と反応の目的（収率向上、反応促進又は反応
遅延）によって容易に実験的に決定できる。
装置、同一周波数のものであれば、Ｗａｔｔ／ｃｍ’／
）Ｉｒで表わすことができる。好ましい該強度は、個々
の酵素反応と反応の目的（収率向上、反応促進又は反応
遅延）によって容易に実験的に決定できる。
本発明方法で超音波照射される被照射体の温度範囲は、
通常の酵素反応の温度範囲と特に異るものではない。具
体的には０〜７０℃、好ましくは１５〜５０℃である。
通常の酵素反応の温度範囲と特に異るものではない。具
体的には０〜７０℃、好ましくは１５〜５０℃である。
適用しつる酵素反応としては広範囲のものが相当するが
反応形態としては均−系よりも不均一系の反応にたいし
て効果が大きい。たとえば、実施例に示すプロテアーゼ
によるペプチド合成、リパーゼによる光学活性アルコー
ルの製造などに適している。その他、酸素添加酵素、脱
水素酵素によるステロイド、ステロールの変換、アミダ
ーゼによる抗生物質の合成、フマラーゼ、レダクターゼ
、酸素添加酵素による有機酸の合成、グルコースイソメ
ラーゼによるグルコースの異性化、プロテアーゼによる
タンパク、ペプチド合成、ホスポリラーゼ、リン酸基転
穆酵素、ビロリン酸転穆酵素などによるヌクレオチド、
ヌクレオシドの合成、アスパルターゼ、トリプトファナ
ーゼ、アスパラギン酸脱炭酸酵素等によるアミノ酸の合
成、脱炭酸酵素によるアミンの合成、酸素添加酵素によ
るアルケノキシトの合成、２級アルコール脱水素酵素に
よるケトンの合成、脱炭酸酵素によるピロガロールの合
成、ニトリルヒドラターゼによるアミドの合成等の有機
溶媒中での不均一反応に適用出来る。
反応形態としては均−系よりも不均一系の反応にたいし
て効果が大きい。たとえば、実施例に示すプロテアーゼ
によるペプチド合成、リパーゼによる光学活性アルコー
ルの製造などに適している。その他、酸素添加酵素、脱
水素酵素によるステロイド、ステロールの変換、アミダ
ーゼによる抗生物質の合成、フマラーゼ、レダクターゼ
、酸素添加酵素による有機酸の合成、グルコースイソメ
ラーゼによるグルコースの異性化、プロテアーゼによる
タンパク、ペプチド合成、ホスポリラーゼ、リン酸基転
穆酵素、ビロリン酸転穆酵素などによるヌクレオチド、
ヌクレオシドの合成、アスパルターゼ、トリプトファナ
ーゼ、アスパラギン酸脱炭酸酵素等によるアミノ酸の合
成、脱炭酸酵素によるアミンの合成、酸素添加酵素によ
るアルケノキシトの合成、２級アルコール脱水素酵素に
よるケトンの合成、脱炭酸酵素によるピロガロールの合
成、ニトリルヒドラターゼによるアミドの合成等の有機
溶媒中での不均一反応に適用出来る。
以下本発明の制御方法を実施する装置の例を図面に基づ
いて説明する。
いて説明する。
第１図中１は、ホーンを示す。ホーンより照射される超
音波の出力、照射時間およびパルス間隔は、２のソニケ
ータ部で制御する。ホーンの先は、反応溶液に浸け、反
応器４は、適当な温度に調節した循環水により温度調節
する。この時、反応液の温度を熱電対６によりモニター
し、循環水の温度を一定に保つ。また反応溶液は、攪拌
子で強制攪拌する。なお、３は恒温層、５はスターラー
、７は循環水ポンプ、８は攪拌子である。
音波の出力、照射時間およびパルス間隔は、２のソニケ
ータ部で制御する。ホーンの先は、反応溶液に浸け、反
応器４は、適当な温度に調節した循環水により温度調節
する。この時、反応液の温度を熱電対６によりモニター
し、循環水の温度を一定に保つ。また反応溶液は、攪拌
子で強制攪拌する。なお、３は恒温層、５はスターラー
、７は循環水ポンプ、８は攪拌子である。
第２図中１は、超音波洗浄器を２は循環水ポンプを３は
恒温層を４は反応液を示す。この中を温度一定とした循
環水をポンプにより循環させる。
恒温層を４は反応液を示す。この中を温度一定とした循
環水をポンプにより循環させる。
実施例１ （超音波照射によるペプチド合成反応の促進
） ベンゾイルアラニンメチルエステル −ＯＭｅ）の８０ｍＭ酢酸エチル溶液０．５ｍＩｌとＬ
−ロイシンメチル□エステル（ Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＭａ
）の９２ｍＭ酢酸エチル溶液０．５ｍＩＬを混合し、こ
の混合溶液に、あらかじめ調製した１ ｍｇ／ｍｊ２パ
パインを０．５ｍ文を加え、第２図に示した装置を用い
て５０℃、超音波照射下で反応を高速液体クロマトグラ
フィーで追跡した。
） ベンゾイルアラニンメチルエステル −ＯＭｅ）の８０ｍＭ酢酸エチル溶液０．５ｍＩｌとＬ
−ロイシンメチル□エステル（ Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＭａ
）の９２ｍＭ酢酸エチル溶液０．５ｍＩＬを混合し、こ
の混合溶液に、あらかじめ調製した１ ｍｇ／ｍｊ２パ
パインを０．５ｍ文を加え、第２図に示した装置を用い
て５０℃、超音波照射下で反応を高速液体クロマトグラ
フィーで追跡した。
反応開始後６０分で生成物であるベンゾイルアラニルロ
イシンメチルエステル １、１２ｍＭ，ベンゾイルアラニルロイシルロイシンメ
チルエステル 成した。比較のため超音波を照射しないこと以外は同じ
条件で上記の反応を行ったところ、６０分後の生成物は
、Ｂｚ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＭｅは０．７６ｍＭ， Ｂ
ｚ−＾１ａーＬｅｕーＬｅｕ−ＯＭｅはＯ．１８ｍＭで
あった。本実施例では、超音波照射によりＢｚ−Ａｌａ
−Ｌｅｕ−ＯＭｅに対しては４７％、Ｂｚ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−ＯＭｅに対しては６７％の収率増加が観
測された。
イシンメチルエステル １、１２ｍＭ，ベンゾイルアラニルロイシルロイシンメ
チルエステル 成した。比較のため超音波を照射しないこと以外は同じ
条件で上記の反応を行ったところ、６０分後の生成物は
、Ｂｚ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＭｅは０．７６ｍＭ， Ｂ
ｚ−＾１ａーＬｅｕーＬｅｕ−ＯＭｅはＯ．１８ｍＭで
あった。本実施例では、超音波照射によりＢｚ−Ａｌａ
−Ｌｅｕ−ＯＭｅに対しては４７％、Ｂｚ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−ＯＭｅに対しては６７％の収率増加が観
測された。
実施例２
（超音波照射によるエステル交換反応の促進）２級アル
コールである（Ｒ，Ｓ）−ｓｅｅ−オクタツール１．９
５ｇとラウリン酸ビニルエステル１．８９ｇからなる混
合系に対してリパーゼ（リパーゼβ）１００ｍｇを添加
し、第２図に示した装置を用いて３５℃、超音波照射下
で反応を行なった。反応開始後３時間での反応系内の成
分をガスクロマトグラフィーを用いて定量したところ、
ｓｅｃ−オクタツール３４．６％、ｓｅｅ−オクチルラ
クレ−１− ５９．７％、ラウリン酸ビニルエステル１
．１％、ビニルアルコール４１％であった。
コールである（Ｒ，Ｓ）−ｓｅｅ−オクタツール１．９
５ｇとラウリン酸ビニルエステル１．８９ｇからなる混
合系に対してリパーゼ（リパーゼβ）１００ｍｇを添加
し、第２図に示した装置を用いて３５℃、超音波照射下
で反応を行なった。反応開始後３時間での反応系内の成
分をガスクロマトグラフィーを用いて定量したところ、
ｓｅｃ−オクタツール３４．６％、ｓｅｅ−オクチルラ
クレ−１− ５９．７％、ラウリン酸ビニルエステル１
．１％、ビニルアルコール４１％であった。
比較として、本反応を超音波を照射しないこと以外は全
て同じ条件で行なったところ反応系内の各成分は、ｓｅ
ｃ−才クタノール４５．６％、ｓｅｃ−オクチルラウレ
ート３１７％、ラウリン酸ビニルエステル２０、５％、
ビニルアルコール１７％であった。
て同じ条件で行なったところ反応系内の各成分は、ｓｅ
ｃ−才クタノール４５．６％、ｓｅｃ−オクチルラウレ
ート３１７％、ラウリン酸ビニルエステル２０、５％、
ビニルアルコール１７％であった。
本実施例ではリパーゼによる５ｅｃ−オクタノールとラ
ウリン酸ビニルエステルのエステル交換反応により得ら
れるオクチルラウレートの収量が２８％上昇した。
ウリン酸ビニルエステルのエステル交換反応により得ら
れるオクチルラウレートの収量が２８％上昇した。
イ図面の簡単な説明
第１図および第２図は、本発明の方法に使用する装置の
使用方法の説明図である。
使用方法の説明図である。
以 上
Claims (1)
- （１）各種酵素または合成高分子により修飾された酵素
を有機溶媒に分散させ、該有機溶媒分散物に超音波を該
超音波の周波数、強度、照射時間を調節し、連続または
、パルスとして照射し、前記酵素反応の速度、生成物の
分布を制御し、目的物を収率良く得ることを特徴とする
超音波照射による酵素反応の制御方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13388289A JPH02312591A (ja) | 1989-05-26 | 1989-05-26 | 超音波による酵素反応の制御法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13388289A JPH02312591A (ja) | 1989-05-26 | 1989-05-26 | 超音波による酵素反応の制御法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02312591A true JPH02312591A (ja) | 1990-12-27 |
Family
ID=15115296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13388289A Pending JPH02312591A (ja) | 1989-05-26 | 1989-05-26 | 超音波による酵素反応の制御法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02312591A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1018015A1 (en) * | 1997-09-18 | 2000-07-12 | Meso Scale Technologies LLC | Assay sonication apparatus and methodology |
| DE102006032637A1 (de) * | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Qiagen Gmbh | Vorrichtung zum Aufschluß einer biologischen Probe |
-
1989
- 1989-05-26 JP JP13388289A patent/JPH02312591A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1018015A1 (en) * | 1997-09-18 | 2000-07-12 | Meso Scale Technologies LLC | Assay sonication apparatus and methodology |
| EP1018015A4 (en) * | 1997-09-18 | 2005-10-19 | Meso Scale Technologies Llc | METHOD AND APPARATUS FOR ANALYSIS WITH A SONICATION DEVICE |
| US7008796B2 (en) | 1997-09-18 | 2006-03-07 | Mesoscale Technologies, Llc. | Assay sonication apparatus and methodology |
| DE102006032637A1 (de) * | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Qiagen Gmbh | Vorrichtung zum Aufschluß einer biologischen Probe |
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