JPH02283285A - ヒトビリンの遺伝子の特異的核酸フラグメント及び診断用としてのその使用 - Google Patents

ヒトビリンの遺伝子の特異的核酸フラグメント及び診断用としてのその使用

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JPH02283285A
JPH02283285A JP1282817A JP28281789A JPH02283285A JP H02283285 A JPH02283285 A JP H02283285A JP 1282817 A JP1282817 A JP 1282817A JP 28281789 A JP28281789 A JP 28281789A JP H02283285 A JPH02283285 A JP H02283285A
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Monique Arpin
モニツク・アルパン
Eric Pringault
エリツク・プランゴール
Alphonse Garcia
アルフオンス・ガルシア
Daniel Louvard
ダニエル・ルーバール
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Institut Pasteur de Lille
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、゛ヒトビリン（ｖｉｌｌｉｎｅ）の遺伝子の
特異的配列を有する核酸フラグメントに係る。
「ヒトビリンの遺伝子の特異的配列」なる用語は、この
遺伝子のコーディング配列に含まれる全配列、該コーデ
ィング配列の転写産物であるメツセンジャーＲＮ＾に含
まれる全配列、又はこれらの配列の相補的配列を意味す
る。
本発明は更に、ヒトビリンの遺伝子の発現を検出するた
めのこれらの核酸フラグメントの使用にも係る８本発明
の核酸フラグメントをこの目的に適用すると、特に、消
化器即ち腸領域以外の器官のレベルの患者から採取した
生物学的試料（生物学的組織又は流体）から、胃腸領域
の原発性ｍ瘍に由来する腫瘍細胞又は転移の存在をｉｎ
　ｖｉｔｒｏで検出することができる。これらのフラグ
メントの他の適用例は、ヒトゲノムの制限フラグメント
の多形性の検出である。
今日までの研究によると、とリンは消化器即ち腸領域以
外の組織の転移のマーカーとして有用であることが報告
されている。この点に関して、１９８６年４月３０日付
はヨーロッパ特許出願第０２０６８４９号は、消化器即
ち胃腸段階以外の器官から採取した生物学的試料からビ
リンを検出するための手段について記載している。ヨー
ロッパ特許出願第０２０６８４９号は、とリンが一般に
、より特定的には腸細胞の表面に見られる刷子縁、腸の
内壁と同一面に伸びる細胞の先端ｐｆ１　（ｐ６１ｅ　
ａｐｉｃａｌ）のレベル及び腎臓傍管の細胞内に存在す
るという事実を利用している。一方、とリンは肺、脳等
のような他の器官では検出されない。消化器即ち腸腫瘍
の転移時に、ビリンを産生ずる細胞は種々の器官に転移
し得る。従って、これらの転移中にとリンを検出し、消
化器即ち腸起源の原発性腫瘍を診断することができる。
上記ヨーロッパ特許出願第０２０６８４９号に記載され
、メツセンジャーのタンパク質又は該タンパク質３コー
ドする遺伝子を検出するために使用されるこれらの診断
手段は、ビリンに対して指向される抗体、又はヒトビリ
ンの完全＋ａＲＮ＾に対応するＤＮＡの全部もしくは一
部、又はヒトビリンのＣ０ＯＨ末端のアミノ酸をコード
するヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むｃＤＮＡ
ＤＮＡメントにより夫々構成される。
従来、とリンの核酸のこのＣ０ＯＨ末端部分のみが配列
決定されている。
ビリンは一般に、アクチンの結合活性を有するタンパク
質の類に属する。ビリンはアクチンに結合することが可
能なタンパク質の類に固有の特異性を有する。この特異
性は、媒質のカルシウム濃度に応じたｉｎ　ｖｉｔｒｏ
での二重作用と、非常に特異的な組織分布とに関する。
一方、とリンはアミノ酸配列の所定の領域において、高
等真核生物に存在する他のタンパク質であるゲルゾリン
とある程度相同の配列を有する。
特に、これらのタンパク質のアミノ酸配列を比較した結
果、該配列は末端ＣＯＯ１１部分を除き、３つが相同で
あるような４つのモチーフの重複領域を含むよく似た総
合構造機構を有することが判明した。即ち、とリンとゲ
ルゾリンとはその共通部分において約５０％のアミノ酸
の相同度を示し、この相同度は領域によってはそれ以上
である。ビリンがゲルゾリンと区別されるのは主に、特
に「ヘッドピース（ｈｅａｄ−ｐｉｅｃｅ）」（末端領
域）と呼称される末端Ｃ００）１部分のレベルである。
本発明は、とリンをコードする領域の配列決定後、予想
外にも、ビリンとゲルゾリンとの８！構の共通性及びそ
れらのアミノ酸配列の相同性が夫々ビリン及びゲルゾリ
ンをコードする核酸のレベルでは得られないという事実
の発見に基づくものである。
本発明者らは、ヒトビリンをコードする遺伝子の発現を
特異的に検出するための新規手段を実現するためにこれ
らの研究結果を利用した。これらの手段は特に、ヒトビ
リンの遺伝子の転写産物であるメツセンジャーＲＮＡ（
ｍＲＮＡ）の存在を早期に検出することが可能である。
ヒトビリンをコードする遺伝子の発現を検出するための
本発明の手段は、ヒトビリンの遺伝子のコーディング配
列又はこの遺伝子の転写（産物）の特異的な核酸フラグ
メントにより構成される。
本発明者らは、少なくとも８個のヌクレオチドを含み且
つヒトビリンをコードするＤＮＡ又はこのコーディング
ＤＮ八から転写されたメツセンジャーＲＮ＾に由来する
核酸フラグメントが、ゲルゾリンをコードするＤＮＡの
対応するフラグメントから特に区別されるヒトビリンの
遺伝子の特異的フラグメントであり得ることを確認し、
従って、本発明はこの事実の発見に基づく。
従って、本発明は８〜４０、好ましくは２０〜４０個の
ヌクレオチド連鎧を含む全核酸フラグメントに係り、そ
の配列は第１図に示すヒトビリンの遺伝子のコーディン
グＤＮＡの配列に含まれることを特徴とする０本発明は
更に、上記フラグメントの１つに［密に相補的であり、
従って同一数のデオキ゛シリボヌクレオチドを含む全核
酸フラグメント、及び同一数のリボヌクレオチドを含む
対応する全核酸フラグメントにも係る。
本発明は特に、８〜４０個のヌクレオチドを含んでおり
、その配列が上記のようなヒトビリンの遣伝子の特異的
ＤＮＡ又はＲＮへの「ヘッドピース」の外部に含まれる
ことを特徴とする全核酸フラグメントに係る。
本発明はより特定的には、１本鎖の形態であるが、ＤＮ
への場合には２本鎖の形態でもよい上記配列に係る。
上記フラグメントはヒトビリンをコードする遺伝子、又
はこの遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡから得られるｃ
ＤＮＡから、切断により、場合によっては適当な酵素（
例えばＢａ１３１）でさらに処理することにより単離さ
れ得る。これらのフラグメントは、ヒトビリンの遺伝子
のコーディング配列を示す第１図の配列から、化学的又
は酵素的に合成することらできる。
フラグメントの１つを化学的に合成するには、以下に要
約するような段階を含む「ホスホジエステル」法を使用
することができる。
官能基の保護後、ヌクレオチドの１つの５′−ホスフェ
ート末端を、ジシクロへキシルカルボジイミド又はアリ
ールスルホニルクロリドを使用することにより、同様に
保護された他のヌクレオシド又はヌクレオチドの３゛−
ヒドロキシル末端と反応させる（縮合反応）、こうして
類似の縮合段階を実施することによりヌクレオチド鎖を
伸長する。
ヌクレオチドの官能保護基は例えばモノメトキシトリチ
ル（ＭＭＴｒ）基、アセチル（＾Ｃ）基又はアニソイル
（＾ｎ）基から構成され得る。
化学的合成は同様に、配列の合成の進行中にヌクレオチ
ド間の各ホスホジエステル官能基を３！！断（ブロック
）し得る「ホスホトリエステル」法によっても実施され
得る。
この方法を実施するためには、完全に保護され且つ遮蔽
した３″−ホスホトリエステル基を含むモノヌクレオチ
ドを使用する。
核酸フラグメントの化学的合成を可能にする第３の方法
は、「亜リン酸トリエステル」法である。
好ましくはこの方法は、合成すべきオリゴヌクレオチド
の３′末端が固定された不溶性支持体を使用して行う。
このように結合によりオリゴヌクレオチドを固定すると
、各縮合サイクル後の精製段階を省くことができる。こ
の方法を実施するためには、予め遮断された適当なモノ
ヌクレオチドを逐次的に加え、不要の試薬、出発物質を
一過により除去する。
合成された核酸の保護基を反応の終わりに除去し、その
後Ｊ核酸を支持体から分離し、電気泳動又はＩＩＰＬｃ
により精製する。
合成されたオリゴヌクレオチドをカラム内でポリマー型
の支持体に固定する場合、ｒ過段階に代えて洗浄を実施
してもよい。
上記化学的合成方法は、Ｅ、Ｌ、　１４１ＮＮＡｃＫＥ
Ｒの著書”Ｆｒｏｍ　Ｇｅｎｅｓ　ｔｏ　ｃｌｏｎｅｓ
”の第２章”ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ。
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃ
ｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ　ｏｒ　ＤＮΔｆｒａｇｍｅｎｔ
ｓ”の教示を参考にすることができる。
ビリンのコーディングＤＮＡ又はｍＲＮＡに対するフラ
グメントのヌクレオチド連鎖の特異性を考慮するならば
、当然のことながら、コーディング配列又は対応するｍ
ＲＮＡの全領域はこれらの配列と同−又は相補的な本発
明の核酸フラグメントを得るためのベースとして機能し
得る。
本発明は、所定の条件下でとリンの遺伝子の特異的核酸
の全部又は一部の合成の開始を誘導することが可能なヌ
クレオチドプライマー（単にプライマーとも呼称する）
を構成するために、本発明の核酸フラグメントを使用す
るような特定の適用にも係る。
プライマーなる用語は、有利には上記核酸フラグメント
、特に、有利には８〜４０個のヌクレオチド、好ましく
は２０〜４０個のヌクレオチドを含み、且つ以下の特性
に一致する全フラグメントにより構成されるヌクレオチ
ド（オリゴヌクレオチド）連鎖を意味する。
一種類に応じて、ビリンの遺伝子のコーディングＤＮＡ
、又はこの遺伝子に対応するｍ　ＲＮ　Ａ、又はこれら
の配列に相補的な配列の対応する相補的配列と１キ異的
にハイブリダイズすることが可能である。
−１１街溶液中、この合成に適当なｐｌ＋及び温度条件
下で、合成誘導剤（特にポリメラーゼ又は逆転写酵素）
の存在下且つ適当なヌクレオチドの存在下で核酸＜ｎ型
又はマトリックスと呼称する）とハイブリダイズする該
核酸の相補的核酸の合成を誘導し得る。
プライマーとして機能するフラグメントから得られる合
成生成物をプライマーの伸長生成物（ｐｒｏｄｕｉｔ　
ｄ’ａｌｌｏＢｅｍｅｎｔ）と呼称する。
「プライマーの伸長生成物」の生成に適当な榎街溶′ａ
詑びにｐＨ及び温度条件は、本願の開示内容に含まれる
米国特許第４６８３２０２号及び同４６８３１９５号の
教示に基づいて決定することができる。
プライマーは２本鎖又は１本鎖の形態である。プライマ
ーから伸長生成物の合成を開始できるようにするために
必要な核酸とのハイブリダイゼーション品質、及び鋳型
の接触には、−ｍに１本鎖のほうが好ましい。
ハイブリダイゼーション段階以前に変性された２本鎖プ
ライマーを使用すると、プライマーと相補的鎖とのリハ
イブリダイゼーションと、プライマーの鎖の１つと対合
し得る鋳型核酸との間に競合が生じ得る。
本発明はより特定的には、検出するのに十分な量のプラ
イマーの伸長生成物の合成を開始するための、本発明の
プライマーの適用に係る。このような合成は、第１図の
配列中に存在するヒトビリンをコードする核酸に接触し
て、又はヒトビリンの遺伝子の転写ｍＲＮＡの配列から
出発して、又は上記配列の相補的配列から出発して行わ
れる。このような適用は生物学的試料中に存在する前記
配列を検出するためのものであり、この場合、それらの
配列はプライマーの夫々相補的鋳型として機能する。
このような適用は、例えばプライマーの伸長生成物を構
成する核酸フラグメント上の変性（突然変異、欠失等）
を検出することができる。
上記記載にｒＷＪ連して、本発明は、ヒトビリンをコー
ドする核酸又はヒトビリンの遺伝子の転写ｍＲＮＡの存
在を、これを含む疑いのある生物学的試「■中で社ｄ鯰
禽＃＃専ｉｎ　ｓづ一、ｔｒ見で検出するための方法に
係り、該方法は、 ａ／ヒ）・ビリンの遺伝子の転写ｍＲＮＡを含む疑いの
ある生物学的試料を、予め第１のプライマーにアクセス
できるようにしておき、ヌクレオシド三リン酸及び重合
誘導剤の存在下、プライマーと所望のｍＲＮＡとがハイ
ブリダイズできるような条件下で、該生物学的試料を該
プライマーに接触させ、吐貼にハイブリダイズした第１
のプライマーからｍＲＮＡの相補的核Ｍ（ｃＤＮＡ）を
重合し、ヒトビリンをコードする核酸鎖又は生物学的試
料中に対応する一ＲＮ＾が存在する場合はこのようなｍ
ＲＮＡとハイブリダイズしたプライマーの伸長生成物か
ら形成される二重型（ｄｕｐｌｅｘ）を生成する段階と
、ｂ／検出すべき鴨ＲＮへからプライマーの伸長生成物
を「分離」するように、段ｔｇａ／で得られた二重型を
変性させる段階と、 Ｃ／得られた伸長生成物を、（１）第１の１ライマーと
非相補的であり且つ（２）先に形成された伸長生成物の
配列と相補的なヌクレオチド配列を有する第２のプライ
マー（上記に説明した用語の意味）と接触させる段階と
、 ｄ／堝合によって、過剰に使用される第１及び第２のプ
ライマーと、追加合成用ｎ型として使用される新しい伸
長生成物の生成に必要な試薬との存在下で、使用される
プライマーの伸長生成物が検出するに十分な量で得られ
るまで段Ｈａ／、ｂ／及びＣ／を反復する段階と、 ｅ／ヒトビリンのＩ）Ｎ＾又はＩ！ＩＲＮへの存在、を
特徴１寸ける伸長生成物の存在を検出する段階と を含む。
腫瘍細胞もし７くは腫瘍又は腫瘍の転移の存在は、ヒト
ビリンのｍＲＮへの異常な存在により特徴付けられるの
で、このような方法は例えば腫瘍細胞もしくは腫瘍、又
は腫瘍の転移の存在をｉｎ　ｖｉｔｒｏで検出するため
に使用され得る。−例として、腸又は腎ｆＪ１１１の腫
瘍形成に由来する細胞を挙げることができる。
上記検出方法は、患者から採取され、例えば生検試料、
手術片、生物学的流体から構成される生物学的試料で実
施される。
上記方法の１態様によると、生物学的試料中にもともと
存在するｖａＲＮ＾の所望の増幅レベルを得るように、
上記方法の段階を実施することにより伸長生成物の複数
の合成サイクルを実施するために十分な量のプライマー
又は第１及び第２のプライマーとヌクレオチドとを第１
の段階に加える。
該方法の１変形例によると、これらの成分を方法の段階
を実施する間に必要な頻度で配合する。
上記検出方法の初期段階に導入されるヌクレオチドは、
夫々ＤＮＡ又はＲＮＡにより構成されるプライマーを使
用するかに従って、デオキシヌクレオチド又はオキシリ
ボヌクレオチドにより構成される。
鋳型として機能する核酸にハイブリダイズしたプライマ
ーから重合を誘導する誘導剤は一般に、ＤＮＡの合成を
誘導する場合はＤＮＡ−ポリメラーゼ、ＲＮへの鋳型か
らＤＮＡを合成する場合は逆転写酵素により構成される
。使用可能なポリメラーゼの例としては、大腸面のＤＮ
Ａポリメラーゼ、このＤＮＡポリメラーゼのフレノウフ
ラグメント、Ｔａｇポリメラーゼ又は逆転写酵素を挙げ
ることができる。具体例は当然のことながらこれに止ど
まらない。それどころか、本発明は重合触媒として使用
可能な全システム、全酵素を包含する。
プライマーの伸長生成物及び合成鋳型が異なる種類のと
き、即ちｍＲＮＡが生物学的試料中にもともと存在して
いるときに７ライマーがら重合後に得られる二重型は、
ＤＮＡのプライマーの伸長生成物がｎＲＮ＾の相補的な
ｃＤＮＡである場合、ヘテロ二重型である。
上記検出方法に関する技術の詳細を理解するため、又は
該方法の変形例を考案するためには、当業者は米［ＥＩ
特許第４６８３２０２号及び同４６８３１９５号に記載
の原理を参考にすると有用である。
上記方法は、必要に応じてとリンの遺伝子の転写ｍ　Ｒ
Ｎ　Ａの配列の決定された部分の増幅に使用することが
できる。４の場合、増幅すべき配列の５°及び３゛末端
を形成する２つの特異的プライマーを使用することがで
きる。
増幅すべき配列の寸法は、所望のｍＲＮへの存在を検出
できるように選択される。従って、プライマーからの重
合は適当な全手段により任意に制限され得る。
プライマーの伸長生成物の検出は、従来の検出方法によ
り実施され得る０本発明の１態様によると、ｍＲＮＡの
存在の検出方法は、方法の実施の際に取り込まれるヌク
レオチドを放射性物質で標識し、所望のｍＲＮＡの存在
の検出が、プライマーからの重合時に取り込まれなかっ
たヌクレオチドの除去後に合成された伸長生成物の放射
活性の検出に対応することを＊ｍとする。
本発明のフラグメントの別の適用は、ヒト遺伝的多形性
の検出のための使用に関する。
ヒト遺伝的多形性の検出なる＃１語は、個体の遺伝的同
定と、とリンの遺伝子又は遺伝的に結合された遺伝子に
間する遺伝的ｆＩＩＮに関連する所定の病理の検出とを
同時に意味する０Ｍ本の同定にはビリン遺伝子の全部又
は一部を含有する制限フラグメントの解析が含まれる。
この適用の範囲では、上記核酸フラグメントはプローブ
として使用される。
これらのプローブは、生物学的試料（例えば該プローブ
にアクセスできるように準備された組織又は流体）に対
して使用される。
これらのプローブの使用にあたっては、本願の開示内容
の一部に含まれるヨーロッパ特許出願第０１８６２７１
号を参照されたい。
本発明の他の特徴及び利点は以下の実施例及び添付図面
に明示される。
イソチオシアン酸グアニジン法（Ｃｈｉｒｌ１ｗｉｎ他
、１９７９）により細胞系１１Ｔ−２９（［１Ｔ２９−
１８−Ｃ１；　ｌ１ｕｅｔ他、１９８７）のサブクロー
ンから全ＲＮへを単離し、オリゴ（ｄＴ）セルロースの
カラム（＾ｖｉｖ及びＬｅｄｅｒ、１９７２）に通すこ
とによりポリアデニル化ＲＮ＾（ポリ（＾）。
ＲＮ八）を富化した。
５％〜２０％のスクロース勾配でポリアデニル化ＲＮ＾
をサイズ分画し、ヒトビリンのカルボキシ末端部分（Ｐ
ｒｉｎｇａｕｌＬ他、１９８６、参考資料１）に対応す
るｃＲＮ＾ＲＮＡブ（相補的ＲＮ＾）を使用することに
より、ビリンのｍＲＮＡを含むフラクションをノーザン
プロット分析により同定した。
ｃＤＮＡは、Ｇｕｂｌｅｒ及びＨｏｆｆｍａｎｎ（１９
８３）に記載の方法に従って、１目のポリアデニル化Ｒ
Ｎ＾から合成した。ｃＤＮＡをＥｃｏＲ１メチラーゼで
メチル化後、ＥｃｏＲ１リンカ−をｃＤＮＡの自由な末
端に結合し、ＥｃｏＲｌで消化し、緩衝液ＴＥ（Ｔｒｉ
ｓ　２０＋１Ｍ、ＥＤＴ＾１ｍＭ）を用いて旧Ｌｒｏｇ
ｅｌ＾Ｃ＾３４カラム（ＬＫＢ）で分離した。３０ｎｇ
のｃＤＮＡを、ＥｅｏＲｉにより消化したベクターλｇ
Ｌ１０のＤＮＡ１■と連結し、粒子をｉｎ　ｖｉｔｒｏ
でキャプシドに封入しくｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージン
グ）、独立した１０’ｌｌｌの組換体を含むｃＤＮＡバ
ンクを得た。
ビリンのｃＤＮＡから５′部分を単離するために、ビリ
ンのｍＲＮＡの相補的オリゴヌクレオチド配列を使用す
ることにより、連続的プライマーから３回延長した。オ
リゴヌクレオチドプローブは第２図中に下線で示した。
オリゴヌクレオチドをサイズに従って分画した２ＩＩｌ
Ｆのポリ＾’ｍＲＮＡと１０＝１のモル比でハイブリダ
イズした１次に、既に記載した条件に従ってｃＤＮＡを
合成した。既に同定したｃＤＮＡＤＮＡンのｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏ転写（Ｍｅｌｔｏｎ他、１９８４、参考資料２）
により得られるｃＲＮ＾ＲＮＡブでバンク＾ｇｔｌＯを
スクリーニングした。
ノーザンプロット 細胞系１１Ｔ２９−１８−Ｃ１から単離したポリ（八）
　”ＲＮＡ（１，５ｕｇ）を、ＩＭのホルムアルデヒド
（Ｌｅｈｒａｃｈ他、１９７７、参考資料３）の存在下
で１％のアガロースゲル上で電気泳動により分画し、ニ
トロセルロースに移した。二Ｉ〜口セルロースフィルタ
ーを５０％のホルムアミド、４　ｘ　５ＳＣ１Ｉ　Ｘ　
Ｄｅｎｂａｒｄｔ溶液中の０．０５ｊ１のＮａ２１１Ｐ
０４、ｐ１１７．４．２５０ｕｙ／ｚ１の変性サケ精子
ＤＮＡ及び５００ｐｇ／ｘｌのＬＲＮ＾内で５５℃で１
６時間プレハイブリダイズした。Ｐ”（２ｘ　１０’ｃ
、ｐ、ｍ、／ｉ１）で標識したＲＮ＾プローブとのハイ
ブリダイゼーションは、ｔＲＮ＾を含まない同一溶液中
で５５℃で２４時間行った。
フィルターをｔｘｓｓｃ、０．１％ＳＤＳ中で２回、６
５℃で０．２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＯＳ中で１回洗浄し
、最後に７０℃で３０分間０．ｌＸ５ＳＣ１０，１％Ｓ
ＤＳ中で１回洗浄した。
配置ノと１五− ｃＤＮへの制限フラグメントを誘導体Ｍ１３＋＋ｐ１８
−精ｐ１９中でサブクローニングし、５ＡＮＧＥＲ他（
１９７７、参考資料４）により記載されているチェーン
ターミネータ−法（ｍａｔｈｏｄｅ　ｄｉｄ！ｏｘｙ−
ｄｅ　Ｌｅｒｎ＋１ｎａｉｓｏｎ　ｄｅｃｂａｉｎｅ）
により配列決定した。２本鎖の配列のデータは一致した
。
ンバ　　　　の ヒトビリンは、Ｃｏｌｅｍａｎ及びＭｏｏｓｅｋｅｒ（
１９８５、参考資料６）により記載されている方法に従
ってヒトから単離した刷子縁細胞（Ｃａｒｂｏｎｉ＠、
１９８７、参考資料５）からＢ、　Ｈｅ５Ｌ、Ｌ、　Ｗ
ｅｓｔ及びＮ、　Ｍｏｏｓｅｋｅｒ（エール大学、生物
学部）により精製されている。配列決定前に、２５μｓ
のビリンを１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電
気泳動にかけ、ポリ（４−ビニル−トメチルピリジン）
で被覆したガラスファイバーメンプラン（Ｗｈａｔｍａ
ｎ　ＧＦ／Ｃ）に移した。この方法の詳細はＢＡｔｌＷ
他（１９８７、参考資料７）により与えられている。固
定したタンパク質をフルオレサミン（アセトン中の１ａ
ｇ７１）の希釈着色剤により検出し、メンプランから分
離し、気相タンパク質シークエンサー（製造業者の指示
に従って運転する＾ｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
　４７０＾）の反応室に移した。
初期配列決定により、ゲルに付着したタンパク質的１０
％が得られる。タンパク質の転移量が多量であることは
稀であり（最大で６０〜９０％）、ゲル電気泳動中にア
ーチファクトに起因するＮＨ２末端の遮断が生じる（は
とんどの場合、タンパク質の５００≦以ヒが遮断される
）ことは知られている（Ｍｏｏｓ他、１９８８、参考資
料８）。従−って、得られた値が異常に小さいというこ
とではなく、Ｎ１１２末端が遮断されるビリン分子のフ
ラクションのＮＨ，末端部分の近伊のタンパク質分解切
断の結果というよりもむしろ、とリン分子の大部分のＮ
ａｔ、末端配列を反映していると考えられる。
釡」＝え月− （１）　Ｆ’ｒｉｎｇａｕｌｔ、　Ｅ、　ａｔ　ａｍ　
１９８６．　Ａ　ｈｕｍａｎ　ｖｉｌｌｉｎｃＤＮＡ　
ａｌｏｎｅ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆｉｎｔｅｓｔｉ
ｎａｌ　ａｎｄ　ｋｉｄｎｅｙ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖ
ｉｖｏ　ａｎｄ　１ｎｃｕｌｔｕｒｅ、　ＥＭＢＯＪ、
５：３１１９−３１２４゜（２）　Ｍｅｌｔｏｎ、　Ｄ
、Ａ　、　ｅｔ　ａｌ１９８４．　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
　ｉｎ　ｖｉｔｒ。
５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｉ）ｌｏ１０９１ｃａｌ１
７　ａｃｔｉｖｅ　ＲＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡｈｙｂｒｉ
ｄｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｂｅｓ　ｆｒｏｍ　ｐｌａｓ
ｍｉｄｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ａｂａｃｔｅｒｉｏ
ｐｈａｇｅ　ＳＦ３　ｐｒｏｍｏｔｅｒ＋Ｎｕｃｌ＋Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。
１２　ニア０３５−７０５６゜ （３）　Ｌｅｈｒａｃｈ、　Ｈ，ｅｆ：　ａｌ　１９７
７、　Ｒ１１１Ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ　　　ｂｙ　　　ｇｅｌ
　　　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　　　ｕｎｄｅ
ｒｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ、　ａ
　ｃｒｉｔｉｅａｉ　ｒａｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１６：４７４３−４７Ｓ
Ｌ（４）　　Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、　１
９７７、　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈｃ
ｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　　１ｎｈｉｂｉｔ
ｏｒｓ、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ、　　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、７４：５４６３−５４６７゜ （５）　Ｃａｒｂｏｎｉ、　Ｊ、Ｍ、　ａｔ　ａｉｍ、
　１９８７．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉ、ｏｎｏ
ｆ　　１ｎｔｅｓｔｉｎａｌ　　ｂｒｕｓｈ　　ｂｏｒ
ｄｅｒ　　ｃｙｔｏｓｋａｌｅｔａｌ　　ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓｏｆ　ｎｏｒｍａｌ、　ａｎｄ　ｎｅｏｐｌａｓｔ
ｉｃ　ｈｕｍａｎ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ
；ａ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ａｖ
ｉａｎ　ｂｒｕｓｈ　ｂｏｒｄａｒ、　Ａｍ、　Ｊ。
Ｐａｔｈｏｌ、１２９：　　５８９−６００゜（６）　
　Ｃｏｌｅｍａｎ、　　Ｔ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、　　１９
８５．　　ＥｆｆｅＣｔｓ　ｏｆ　ａｃｔｉｎｆｉｌａ
、ｍｅｎｔ　　ｃｒｏｓｓ−１ｉｎＪｃｉｎｇ　　ａｎ
ｄ　　ｆｉｌａｍｅｎｔ　　ｌｅｎｇｔｈ　　ｏｎａｃ
ｔｌｎ−ｍｙｏｓｉｎ　　１ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ、　
　Ｊ、　　Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏｌ、　　１０１：１８５
０−１８５７゜ （刀　Ｂａｕｗ、　　Ｇ、　　ａｔ　ａｌ、　　１９８
７．　　Ａｌｔａｒａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｓｐｈｅ
ｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｐｌａｎ　ｃｅｌ、Ｌｓ　５ｔｕ
ｄｉｅｃｉ　ｂｙ　ＮＨ２−ｔｓｒｒｎｉｎａｌａｍｉ
ｎｏ　　ａｃｉｄ−ｓｅｑｕａｎｃｅ　　ａｎａｌｙｓ
ｉｓ　　ｏｆ　　ｐｒｏ＋、ｅｉｎｓｅｌｅｃｔｒｏｂ
ｌｏｔｔｅｄ　　　ｆｒｏｍ　　　ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎ
ａｉｏｎａｌ　　　ｇｅｌ−ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｔｏ
ｔａｌ　ｅｘｔｒａｃｔｓ、　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ。
８４；４８０６−４８１０゜ （８）　　Ｍｏｏｓ、　　Ｍ、　Ｊｒ、　　ａｔ　ａｌ
、　　１９８Ｂ、　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ　ｈｉｇ
ｈｙｉｅｌｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ　ｅｌａｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃａｌｌ、Ｙ
ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ
　ｔｏ　　ａｎ　１ｎｅｒｔ　５ｕｐｐｏｒｔ。
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３：　　６００５−６０
０８゜
【図面の簡単な説明】
第１図はヒＩ−ビリンの遺伝子ＤＮＡのコーディング配
列図、第２図はヒトビリンのアミノ酸配列に対応する第
１図のコーディング配列を含む配列図、第３図はビリン
及びゲルゾリンのコーディング配列の比較図、第４図は
ビリン、ゲルゾリン、及び下等真植生物に存在する預縁
タンパク質の比較構造図である。 Ｊ≦１りしく（７ン入１イフ羞−一・　ｌ（乃トゴシー
４し−１＊　　　　＊ ＭＥ−ｒ　　ＴＨＲＬ−ＹＥ３ ＣＡＴＴＣＴＣＣＣＣＣＡ口ＧＣＴＣＡｃＴｃＡｃｃ　
　ＡＴＧ　　ＡＣＣ／、）ＡＧ＊　　　　　＊　　　　
　木　　　　　本１１／ＡＬ　　ＬＹ！Ｂ　　ＧＬＹ　
　ＳＥＲＬ−ＥＵ　　ＡＳＮ　　ＩＬＥ　　ＴＨＦで　
１−ＨＲＰＲＯＧＬＹＧＴＣＡＡＡ　　ＧＣ３ＣＴＣＴ
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＊＊＊＊ ＬＥＵ　　ＥｉＥＲ八り、＾　ＧＬＩ＼４ＣＴＧ　　ｌ
’＋（ＥＣＧＣＣＣＡＡ ＬＥｔＪ　　ＯＬＮ　　ＩＬＥ　　ＴＲＦ’ＣＴＣ３Ｃ
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ＧＬＬＩ　　＾Ｌ−＾　１ｙはミＴ　　（Ｅｌ−Ｎ　　
ヒＩＥＴ　’、／’凸Ｌ　　ＰＲＯ’、／＾Ｌ　　ＰＲ
（：ｌ　　Ｅ３ＥＦで　Ｃ１ＥＲ’丁）−（ＲＰＩ・−
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Ｃ＾ＣＬＹＳ　ＴＨＲＡＬＡ　　ＳＥＲＳＥＲＬＥＬＩ
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＾ＣＣＴ＾　ＧＡＧ　　ＣＴ’Ｇ　（３″［＾　ＣＣＴ
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　Ｌ−ＥＥＵ　口Ｌ−Ｙ　　）→工：ヨ　Ｆ＋（Ｅ　　
ＴＹＲＧＬＹ　　ＧＬＹ　　〆）ＳＦ’　　ＣＹＳ　　
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ＬＮ　　ＧＬＹ　　ＳＥＦで　Ｇ＋−１慢　＾ＬＡ　　
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Ｇｃ−ｒＨＲＦ３ＥＲＡＲＧ３　　ＴＨＲＡＥｉＮ　　
ＡＥｉＮ　　ＬＥＬＩ　　ＧＬＬＩ　　ＴＨＲＣ１ＬＹ
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ＡＧ　　ＡＣＣＧＧＧ　ＣＣＣＴＣＣＡＣＡ　ＣＧＧ　
ＣＴＧｉｇｕｒｅ （ｆの 〕 Ｆ’ＨＥＥ　　ＧＬＮ　　ＶＡＬ　　ＧＬＮ　　ＧＬＹ
　　Ｔ）ｎＲＧＬＹ　　ＡＬＡ　　ＡＥｉｉＮ　　ＡＳ
Ｎ　　Ｔ’ＨＲＬＹＥ３　　ｒ３＋ＬＡ　　ＰＨＥ　　
Ｌ３ＬＵＴ−ｒＣＣＡＧ　Ｃ３ＴＣＣ／−’ＩＧ　ＧＧ
Ａ　ｉへＣ１−ＧＧＣＧＣＣＡハＣＡＡＣＡＣＣ〆狛Ｇ
　ＧＣＣ”ｒＴＴ　ＧｎＧ−ノρ＋Ｌ　　Ｆ’ＲＯρイ
Ｌ＾　ハＲＧ　　ＡＬＡ　　ＡＳＮ　　Ｆコ）・４Ｅ　
　ＬＥＬＩ　　ＡＳＮ　　ＥｌｉＥＲＡＥｉＮ　　ｆご
唱ＳＦ’　　Ｓノｔゝ＋ｔ−Ｆ“Ｈ［二　（〕ρ＋ＬＧ
”「ＣＣＣＡ　ＧＣＧ　ＣＧＧ　ＧＣＣＡＡＴ　ＴＴＣ
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Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）８〜４０個のヌクレオチドを含んでおり、その配
    列がヒトビリンの遺伝子のコーディングＤＮＡ配列、又
    は該配列のフラグメントの１つに厳密に相補的であり、
    従って同一数のデオキシヌクレオチドを含むＤＮＡフラ
    グメント、又は同一数のリボヌクレオチドを含む対応す
    る全ＲＮＡフラグメントに含まれることを特徴とする核
    酸フラグメント。
  2. （２）配列が２０〜４０個のヌクレオチドを含むことを
    特徴とする請求項１に記載の核酸フラグメント。
  3. （３）配列がヒトビリンの遺伝子の特異的ＤＮＡ又はＲ
    ＮＡの「ヘッドピース」の外部に含まれることを特徴と
    する請求項１又は２に記載の核酸フラグメント。
  4. （４）第１図に示すコーディング配列中に存在するヒト
    ビリンをコードする核酸に接触して、又は、ヒトビリン
    の遺伝子の転写、ＲＮＡ配列から、又は、生物学的試料
    中に存在する上記配列の相補的配列から、検出するに十
    分な量のプライマー伸長生成物の合成を開始するための
    プライマー（この場合上記の配列はプライマーの夫々相
    補的鋳型として機能する）としての、請求項１から３の
    いずれか１項に記載の核酸フラグメントの適用。
  5. （５）ヒトビリンをコードする核酸、又はヒトビリンの
    遺伝子の転写ｍＲＮＡを含有する疑いのある生物学的試
    料中に存在する該ｍＲＮＡ鎖の存在を￥ｉｎｖｉｔｒｏ
    ￥で検出するための方法であって、ａ／ヒトビリンの遺
    伝子の転写ｍＲＮＡを含む疑いのある生物学的試料を、
    予め請求項１から４のいずれか１項に記載の核酸フラグ
    メントにより構成される第１のプライマーにアクセスで
    きるようにしておき、ヌクレオシド三リン酸及び重合誘
    導剤の存在下、該プライマーと所望のｍＲＮＡとがハイ
    ブリダイズできるような条件下で、該生物学的試料を該
    プライマーと接触させ、ｍＲＮＡにハイブリダイズした
    このプライマーから、ｍＲＮＡの相補的核酸（ｃＤＮＡ
    ）を重合し、ヒトビリンをコードする核酸鎖又は生物学
    的試料中に対応するｍＲＮＡが存在する場合はこのよう
    なｍＲＮＡと、これとハイブリダイズした該第１のプラ
    イマーの伸長生成物との間に形成される二重型を生成す
    る段階と、 ｂ／検出すべきｍＲＮＡからプライマーの伸長生成物を
    「分離」するように、段階ａ／で得られた二重型を変性
    させる段階と、 ｃ／得られた伸長生成物を、（１）第１のプライマーと
    非相補的であり且つ（２）先に形成された伸長生成物の
    配列と相補的なヌクレオチド配列を有する第２のプライ
    マー（上記の意味の用語）と接触させる段階と、 ｄ／場合によって、過剰に使用される第１及び第２のプ
    ライマーと、追加合成用鋳型として使用される新しい伸
    長生成物の生成に必要な試薬との存在下で、使用される
    プライマーの伸長生成物を検出するに十分な量で得るま
    で段階ａ／、ｂ／及びｃ／を反復する段階と、 ｅ／ヒトビリンのＤＮＡ又はｍＲＮＡの存在を特徴付け
    る伸長生成物の存在を検出する段階と を含む方法。
  6. （６）ヌクレオシド三リン酸を放射性標識すること、及
    び所望のｍＲＮＡの存在の検出が、プライマーからの重
    合時に取り込まれなかったヌクレオシド三リン酸の除去
    後、合成された伸長生成物の放射活性の検出に対応する
    ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. （７）ヌクレオシド三リン酸がデオキシリボヌクレオシ
    ド三リン酸であり、誘導剤がＤＮＡポリメラーゼ又は逆
    転写酵素であることを特徴とする請求項５に記載の方法
    。
  8. （８）腫瘍又は転移の検出のために生検を実施し、該生
    検試料中に場合によって含まれるビリンの遺伝子の転写
    ｍＲＮＡを使用されるプライマーにアクセスできるよう
    にしておくことを特徴とする請求項５又は６に記載の方
    法。
  9. （９）請求項１から３のいずれか１項に記載の核酸フラ
    グメントを含むことを特徴とするヒトゲノムの制限フラ
    グメントの多形性の検出用プローブ。
JP1282817A 1988-10-28 1989-10-30 ヒトビリンの遺伝子の特異的核酸フラグメント及び診断用としてのその使用 Pending JPH02283285A (ja)

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