JPH02273194A

JPH02273194A - ヒトモノクローナル抗体の安定な精製法

Info

Publication number: JPH02273194A
Application number: JP1095891A
Authority: JP
Inventors: Toru Nakanishi; 徹中西; Atsuko Higuchi; 樋口　敦子; Kazuhiko Horigome; 一彦堀込; Hiroshi Noguchi; 浩野口; Masazumi Terajima; 寺島　正純
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd; Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd; Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1989-04-14
Filing date: 1989-04-14
Publication date: 1990-11-07

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１１上立且里豆！本発明は、免疫グロブリン（抗体）のアフィニティクロ
マトグラフィーを用いた安定な精製法、すなわち具体的
には、免疫グロブリン結合物質を結合体とし安定化剤を
含む低ｐＨ溶液によって溶出を行う免疫グロブリン（抗
体）の精製法に関する。

免疫グロブリン結合特性を示すプロティンＡは、５ｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓの菌体膜より分
離された蛋白質である。（Ｋｒｏｎｖａｌ　ｌ、　Ｇ、
らＪ、Ｉｍｍｎｏｌ　１０４１４０（１９７０））。プ
ロティンＡは、様々な動物種由来のＩｇＧと特異的に結
合する性質をもっており、かつ単位蛋白量あたりのＩｇ
Ｇ結合量が多いため、血清、細胞培養液、腹水等からの
ＩｇＧ精製に用いられている。（Ｈｊｅｌｍ　Ｈ，らＦ
ＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　、　２８７３（１９７２）　）。又
、このプロティンＡは特定の種類のＩｇＭとも結合する
ことが知られている（Ｌｉｎｄ。

Ｉら　５ｃａｎｄ、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　　４　８４
３　　（１９７５）　）　、その他、プロティンＡと同
じ免疫グロブリン結合活性を持つ蛋白としては、プロテ
ィンＧが知られている。プロティンＧは、広い範囲の動
物由来のＩｇＧと特異的に結合する。（ＢｊＯｒｃｋ、
　ＬらＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｆユ３３９６９　（１９８４
））さらに同様な性質を示す蛋白質として免疫グロブリンの
し鎖に特異的に結合するプロティンＬ、　　１ｇＡに特
異的に結合するプロティンＡｒｐ、人由来のＩｇＧと特
異的に結合するプロティンＨがありそれぞれに固有の結
合特異性を示すため血清、細胞培養液、腹水からの免疫
グロブリンの精製に用いることができる。これらの蛋白
質は下記の文献に記載されている。

プロティンＬ；　　（ＢｊＯｒｃｋ、Ｌ　　Ｊ、Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、１４０１１９４プロティンＡ　ｒ　ｐ　；　
　（ＢｊＯｒｃｋ、Ｌら、ＢＰ　８７８５０１６０゜プ
ロティンＨ；　（岸本ら、特願昭６３−２９５５２７）
また、免疫グロブリン結合物質である抗免疫グロブリン
抗体は、免疫グロブリンを異種の動物に免疫することに
よって得られる抗血清（ポリクローナル抗体）またはモ
ノクローナル抗体を意味する。これらの抗体は選択的に
免疫グロブリンと結合するため免疫グロブリンの精製に
用いられる。

特に抗免疫グロブリンモノクローナル抗体については、
免疫グロブリンとの結合親和性が異なる各種クローンを
選択することが可能である。そして免疫グロブリンとの
結合におけるｐＨ依存性についても様々のものを得るこ
とができる。一般にはｐＨ２，０〜３．０の状態になる
と、結合した免疫グロブリンを遊離するものが多いが、
しかし中にはｐＨ３，０より高いｐＨでも結合した免疫
グロブリンを遊離する抗体もある。

及肌ｎ星１免疫グロブリン結合物質を用いて抗体を精製する場合、
多くはこの結合物質を不溶化担体に固定化し、その担体
をカラム等につめてアフィニティーカラムを作製し、そ
れを用いて精製操作を行う。

その方法として抗体を含む血清、細胞培養液、腹水等の
試料をこのカラムに通し、抗体のみを固定化された免疫
グロブリン結合物質に吸着させる。

さらに、このカラムに非特異的に吸着された蛋白を、適
当なバッファーで洗浄、除去した後、特異的に吸着され
た免疫グロブリンを適当な溶出剤で、結合物質より解離
させ、溶出分取する方法が用いられる。しかし、この際
の溶出剤としては、従来様々な方法が試みられてきたが
、免疫グロブリンと結合物質との吸着結合が非常に強い
ため、効率よく免疫グロブリンを解離させ回収しようと
した場合、しばしば免疫グロブリンの変性をまねき、こ
のことが、この方法の大きな欠点であった。現在、最も
効率よく免疫グロブリンを回収することができ、一般的
に用いられている方法は、低ｐＨ（ｐＨ４，０以下）溶
液を溶出剤とする方法であるが、この場合、溶出後ただ
ちに中和を行わなければ、多くの免疫グロブリンにおい
て短時間のうちに変性がひきおこされる。このような問
題は、工業的スケールでの精製で特に避けがたいもので
ある。なぜならば、大スケールすなわち容量の大きいカ
ラムを用いた場合、溶出に時間がががり、免疫グロブリ
ンは、長時間溶出剤にさらされるため免疫グロブリンが
変性をおこすからである。この変性を防ぐことは、大変
困難であり従って、これまで例外的に低ｐＨで長時間安
定な免疫グロブリン（抗体）を除いては、工業的スケー
ルで免疫グロブリン（抗体）の精製に免疫グロブリン結
合物質を用いることは不可能と考えられていた。こうし
た状況に鑑み−１本発明者らは、この問題点を改善すべ
く鋭意改良を加え、免疫グロブリン結合物質を結合体と
し、工業的スケールでも免疫グロブリンを効率よくかつ
安定に精製する方法を確立し、本発明を完成するに至っ
た。

本発明者らは、免疫グロブリン結合物質、特にプロティ
ンＡまたは抗ヒト免疫グロブリン抗体を固定化担体に結
合させたものをカラムにつめ、そこへヒトモノクローナ
ル抗体産生細胞の培養液を通すことにより、大量のヒト
モノクローナル抗体を特異的に、プロティンＡまたは抗
ヒト免疫グロブリン抗体に結合させた。そして、それら
を安定化剤を含む、低ｐＨ溶液にて溶出することにより
、第一に溶出特低ｐｔ＋溶液によるモノクローナル抗体
の変性を防ぎ、安定にただちに、抗原との結合活性を保
持した状態でモノクローナル抗体を、回収することを可
能とした。第二に結合物質に結合した、モノクローナル
抗体のほぼすべてを効率よく溶出し回収することを可能
とした。

このような安定化剤として、各種の物質について検討を
加えた。その結果、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
、ポリビニルピロリドン（Ｐ　Ｖ　Ｐ）、エチレングリ
コール（ＥＧ）等をもちいた時に良好な結果が得られた
。本精製法は、プロティンＡ以外にプロティンＧ、Ｌ、
ＡｒｐおよびＨなどの免疫グロブリン結合蛋白を用いた
精製に適用が可能である。また、本精製法は抗免疫グロ
ブリンを用いた精製全般に広く適用が可能であり、さら
にはアフィニティークロマトグラフィー全般に応用が可
能である。又、精製目的物に関しては、１ｇＭ以外のク
ラス（Ｉ　ｇＡ、Ｉ　ｇＧ、Ｉ　ｇ’Ｅ）のヒトモノク
ローナル抗体に応用が可能である。又、ヒト以外の種（
マウス等）のモノクローナル抗体、そして、ホルモン（
抗ホルモン抗体を固定化した場合）、さらには、低ｐＨ
溶液中で変性のおこりやすいすべての蛋白質の精製全般
に広く適用することが可能である。以下、本発明の詳細
な説明する。

まず、免疫グロブリン結合物質としてプロティンＡを使
用する際、不溶化担体に固定化されたプロティンＡとし
て、市販のアガロース担体結合プロティンＡを用いる。

本固定化プロティンＡをカラムに充てんする。又、これ
以外に市販のプロティンＡを用い、様々な方法で固定化
担体に結合させたものを用いる場合もある。その際、担
体としてはアガロースが望ましい。さらにプロティンＡ
の他、前記の免疫グロブリン結合物質が使用可能である
。

次に、精製目的物、ただちにヒトモノクローナル抗体を
含む培養上清をこのカラムに添加する。この培養上清は
ヒトモノクローナル抗体産生性細胞、すなわちヒトハイ
ブリドーマ、ＥＢウィルスにより形質転換されたリンパ
球、ヒト抗体遺伝子を導入した動物細胞などより得られ
るものである。

カラムのサイズは後述する通り、固定化プロティンＡの
抗体最大結合量と培養上清に含まれるモノクローナル抗
体の総量によって定められる。例えば、最大結合量が、
１０■／１ｎｌである場合、上清中抗体総量が１０■で
あれば、カラムサイズは、１１４以上のものが必要であ
る。又、単位体積のカラムに対し数百倍以上の体積の上
清を添加することができる。必要があれば、この上清を
−たん濃縮後、カラムに添加する場合もある。添加する
際の速度はカラム断面積１　ｃｒＩあたり６０ｍ／／ｈ
程度まで上げることが可能であり、これは、後述する洗
浄、溶出操作についても同様である。このようにして上
清を添加した後、結合蛋白に特異的にモノクローナル抗
体が吸着される（この時の吸着量は一担体あたり　Ｉｇ
Ｇで約２０■、ＩｇＭで約１５■である）が、それ以外
に結合蛋白および担体であるアガロースに非特異的に付
着している蛋白を除去するため、カラム体積の１０倍量
のＰＢＳをカラムに添加し、カラムを洗浄する。次に特
異的に吸着されたモノクローナル抗体の溶出を行う。

溶出液としては、クエン酸バッファー、グリシン塩酸バ
ッファー、酢酸バッファー等の低ｐＨ溶液（一般にｐＨ
２，０〜４．０が適当である）を用い、この溶液の中に
安定剤を添加する。安定剤とシテハ、Ｐ　Ｅ　Ｇ　１５
００〜６０００　（ｆｉ度０．１〜５％好ましくは１％
（ｗ／ｖ）　）　、ＰＶＰ　、（濃度０．　１〜５％好
ましくは１％（ｗ／ｖ）　）　、ＥＧ　（濃度１〜５０
％好ましくは１０％（Ｖ／Ｖ）　）が適当である。ここ
に上げた安定剤の他、糖類、ポリアルコール、界面活性
剤等が使用可能である（溶出効率または安定性の点で上
記の３種に及ばない）。これらの安定剤を含む溶出液（
カラム体積の５倍量）をカラムに添加し、特異的に結合
したモノクローナル抗体を溶出する。

これら一連の精製操作は低温条件下（２〜８℃前後）に
て行うことが好ましい。又、溶出したモノクローナル抗
体溶液はその変性を防ぐため高ｐＨ溶液（ＩＭＴｒｉｓ
など）の添加により、ただちに、中和をすることが望ま
しい。

ここで述べた精製法は、免疫グロブリン結合物質として
抗ヒト免疫グロブリン抗体を用いた場合にも同様に適用
される。

以上詳しく述べたように、本精製法によって、培養土浦
等より、モノクローナル抗体を効率よくかつ安定に精製
することができる。上記の安定剤を含む溶出剤を用いた
場合、低ｐＨ溶液中で抗体活性を長時間安定に保つこと
ができ、しかも、吸着物の８０％以上を溶出することが
できる。従って、従来多くみられるように低ｐＨ溶液で
失活をおこしやすく、アフィニティークロマトグラフィ
ーを精製法として、用いることができなかった物質、あ
るいは、低ｐＨ溶液との接触が長時間になるため、精製
物の失活がおこり、工業スケール（大スケール）での精
製にアフィニティークロマトグラフィーを使用できなか
った場合等に本性を適用することで、アフィニティーク
ロマトグラフィーが使用可能となり、精製の純度・効率
等に改善がもたらされることになる。

次に、実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれのみに限定されないことは言うまでも
ない。

（１）精製用試料の調整緑膿菌を特異的に認識するヒトモノクローナル抗体（Ｉ
ｇＭ抗体）産生株の無血清培養液（セルグロッサ−Ｈ（
住友製薬））を遠心（３０００ｐｒｎｌＯ分間）し、そ
の上清をメンブレンフィルター（ミリボア０．２２μｍ
）にてろ過して精製用試料とした。

（２）ヒトモノクローナル抗体の精製プロティンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ　（ファルマシ
ア、ウェットタイプ）７−を０．１Ｍリン酸バッファー
（ｐＨ８，０）およびＰＢＳで洗浄し、直径２　ｃｍの
ガラスカラムに充てんした。次にカラムサイズの１００
倍量ある７０−のＰＢＳを４０ｄ／ｈの流速でカラムに
添加しカラムを平衡化した。

平衡化したカラムへ（１）で調製した精製用試料を４０
Ｊ／ｈの流速で添加し、通過液を採取した（４℃で実験
を行った。以下同様）。

次に同じくカラムサイズの１００倍量ある７〇−のＰＢ
Ｓを４０１ｄ／ｈの流速でカラムに添加し、洗浄を行っ
た。（洗浄流を採取した）。さらに３５、ｌ＋／のｌＯ
％ＥＧ含有ＬＯＯｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ３゜Ｏ
）を４０ｉ／ｈの流速でカラムに添加し、溶出を行った
。溶出液はｌ／１０００の割合で、フラクションコレク
ターを、用いて分画した。（分画後ＩＭＴｒｉｓを添加
し、ただちに中和を行った）。

（３）精製したヒトモノクローナル抗体の抗原結合活性
測定酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、精製したヒト
モノクローナル抗体の抗原結合活性を測定し、精製前と
比較した。まず、抗原を付着させた塩化ビニル製９６穴
プレートを用意し、ここへ０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を
含むＰＢＳ　（以下、ＰＢＳＴと略す）にて適宜希釈し
た測定試料を１００μｌ／穴の割合で添加し、３７°Ｃ
２ｈｒインキユベートした。次に各式をＰＢＳＴにて３
回、洗浄した後、同じ＜ＰＢＳＴにてｌ／１０００に希
釈したアルカリフォスファターゼ標識ウサギ抗ヒト１ｇ
Ｍ抗血清（Ｍｉ　Ｉｅｓ−Ｙｅｄａ）を１００μｉ’／
穴の割合で、添加し、３７℃２ｈｒインキユベートした
。各式をＰＢＳＴにて３回洗浄した後、１０％（ｖ／Ｖ
）ジェタノールアミンバッフｙ−（ｐＨ９゜１）に溶解
したバラニトロフェニルリン酸（３■／ｄ半井化学）を
１００μｌ／穴の割合で添加し、３７℃１０分〜３０分
インキュベートした。酵素反応による呈色の度合いをマ
ルチスキャン（タイターラック）にて測定した。結果を
表１に示す。

（４）精製した標品中ヒトモノクローナル抗体量の測定
（純度検定）精製した標品の一部をメソブレンフィルター（ミソボア
０．２２μｍ）にてろ過し、そのうちの２０μｌをＨＰ
ＬＣにて分析した（高滓製作所ＬＣ−７Ａ）。カラムは
ファルマシア製スーパーロース６を使用し、２０μｌの
標品をカラムに添加後、ＰＢＳにて０．４ｄ／ｈの流速
で溶出した。溶出される蛋白の検出は２３０ｎｍにて行
った。この際、別に濃度のわかった標準ヒトモノクロー
ナルＩｇＭ（完全に精製されたもの）を同様の方法にて
分析し、１ｇＭ溶出溶出ピークの面積を測定、前述の標
品のＩｇＭ溶出ピークの面積と比較することにより、標
品中の１ｇＭ量を計算した。又、総溶出ピーク面積とＩ
ｇＭ溶出ピーク面積を比較することにより、標品中Ｉｇ
Ｍ純度を検定した。結果を表２に示す。

表２ヒトモノクローナル抗体の精製結果フラクシヨンＮα９抗体濃度（■／−）純度（％）１．７　　　　　　　　　９６５　　　　　　　　　　４．１　　　　　　　　　９８
６　　　　　　　　　　　１．９　　　　　　　　　９
６＊溶出液を分画した中のピーク部分実施例２−１安定化剤の選択一定量の精製ヒトモノクローナル抗体を添加した種々の
物質を含む低ｐＨ溶液（１００ｍＭクエン酸バッファー
ｐＨ３，０）を４℃に静置し、３０分後ＩＭＴｒｉｓに
より中和した。

次に実施例１．の（３）に示されている方法によりヒト
モノクローナル抗体の抗原結合活性を測定した。結果を
表３に示す。

表３ヒトモノクローナル抗体の抗原結合活性＊溶出液を分画した中のピーク部分（１）試験用サンプルの調製一定量の精製ヒトモノクローナル抗体を添加した種々の
安定剤を含む低ｐＨ溶液（１００ｍＭクエン酸バッファ
ーｐＨ３，０，ｐＨ３，５およびｐＨ４，０）を４℃に
静置し、３０分後ＩＭＴｒｉｓにより中和した。

（２）サンプル中ヒトモノクローナル抗体の抗原結合活
性および抗体量測定生菌凝集力価の測定により緑膿菌を特異的に認識するヒ
トモノクローナル抗体の抗原結合活性を検定した。表４
に列記しである緑膿菌の各菌株をハートインフュージョ
ン寒天培地を用いて培養し、培養後の、菌体を６００＋
＋＋ｍの吸光度が０゜２になる様にＰＢＳ（−）に懸濁
した。これを５０μβずつＵ字型９６ウエルマイクロプ
レート（住人ベークライト）に分注した。そこに４／３
倍希釈系列をとった前項（１）にて調製された精製ヒト
モノクローナル抗体溶液を５０μβずつ添加した。

反応液を４℃で一夜放置した後、凝集の有無を見た。結
果を表４に示す。

表４に示すように、（４）および（７）において、抗体
の失活のため、（１）に比較して最小生菌凝集濃度の上
昇をみたが、安定剤を添加（（５）（６）および（７）
（８））することによって抗体は安定化され、ヒトモノ
クローナル抗体の最小生菌凝集濃度は低下した。

又、抗体量について実施例１、（４）と同様の方法によ
り測定した。結果を表５に示す。

ｌ）測定数値はヒトモノクローナル抗体の最小生菌凝集
濃度を示す。

２）ヒトモノクローナル抗体を表に記載の各溶液中４°
０３０分静置し、ｐＨ３，０およびｐＨ３゜５について
は静置後ただちにＩＭＴｒｉｓにより中和を行った。（
「中和」と記載）結果を表５に示す。

表５　抗体量（相対値）測定Ｓａｍｐｌｅ抗体濃度（相対値）ＰＢＳｐｌ（３，０，中和ｐＨ３，５；中和ｐＨ４゜０；中和ｐＨ３，０−１０ＸＥＧ（ｖ／ｖ）；中和〃　−５０Ｘ
ＥＧ；　　　　　　” ！／　−ＩＸＰＥＧ。

〃　−５ＸＰＥＧ。

ｐＨ３，５−１０ＸＥＧ。

〃　−５０ＸＥＧ； ”　　−ＩＸＰＥＧ。

！！　−５ＸＰＥＧ；１）ｓａｎ＋ｐｌｅ処理については表３と同様２）抗体
濃度の数値はＨＰ　Ｌ　Ｃｐｅａｋ面積を示す（ＰＢＳ
の場合を１００とした）低ｐ　Ｈｂｕｆｆｅｒ中では、抗体が変性、分解するた
め、ＨＰＬＣにおける抗体ｐｅａｋ面積が減少するが、
安定剤を添加することによって抗体は安定化され、その
ｐｅａｋ面積はｃｏｎｔｒｏｌ　　（ＰＢＳ　）とほぼ
同等となる。

種々の安定剤が低ｐＨ溶液による溶出の際の溶出効率に
あたえる影響を調べるため、溶出効率検定試験を行った
。

プロティンＡセファロース（ウェットタイプ）を１Ｍリ
ン酸バッファー（ｐＨ８，０）およびＰＢＳにて洗浄後
１４体積／カラムとなるようエコツカラム（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ　）に充てんし、ｌＯｄのＰＢＳを添加して平衡化
した。５−のヒトモノクローナル抗体産生細胞の高密度
培養液をこのカラムに添加しく１２ｄ／ｈ）　、通過後
を採取した。次に１０ｄのＰＢＳを添加して洗浄しく１
２ｄ／ｈ）洗浄液を採取した。さらに、５７Ｉ７！の種
々の安定剤を含む低ｐＨ溶液（１００ｍＭクエン酸バッ
ファーｐＨ３，０）をカラムに添加して溶出（１７／ｈ
）し、溶出液を採取した。カラムは一種類の安定剤ごと
に１本ずつ用意し、各安定剤ごとに別々のカラムで検定
をおこなった。溶出液はただちに中和した。次に５艷の
低ｐＨ溶液（安定剤を含まない）にて同様に溶出を行っ
た。

カラム実験終了後、各ステップのサンプルの吸光度（Ａ
！、。）を測定し、吸着された抗体のうち、安定剤を含
む低ｐＨ溶液で溶出される抗体の割合を調べた。結果を
表６に示す。

１％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００．　１％（ｗ／ｖ）Ｐ　
Ｖ　Ｐ　。

１０％（ｖ／ｖ）ＥＣを安定化剤として用いた場合のヒ
トモノクローナル抗体の溶出効率は８５％以上と良好で
あった。一方、１０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００での回
収率は約２％と極めて悪い回収率を示すなど、濃度依存
性がみられた。

ツクローナル抗体の精製を行った。この精製ヒトモノク
ローナル抗体について実施例１．　　（３）（４）項に
記載のごとく抗原結合活性およびモノクローナル抗体量
を測定したところ、８５％以上の効率でヒトモノクロー
ナル抗体が回収され、抗原結合活性も８５％以上保持さ
れていた。

製法精製抗ヒト免疫グロブリン抗体（マウスモノクローナル
抗体、ＩｇＧ＋　クラス）を５■／ｌ−ゲルの割合で、
ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア）と混
合し、０．２ＭＮａＨＣＯ、−０，５ＭＮａＣ１ｐＨ８
，５バツフアー中で４℃、−夜インキユベートした。

さらに、翌日最終濃度０．２Ｍとなるようグリシンを添
加し、室温２時間反応させたものを固定化免疫グロブリ
ン結合体とした。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）免疫グロブリンを酸性溶出液を用いてアフィニテ
ィークロマトグラフィーで精製する免疫グロブリンの精
製方法において、安定化剤を含む酸性溶出液を用いるこ
とを特徴とする免疫グロブリンの精製方法
（２）該安定化剤がポリエチレングリコール、ポリビニ
ルピロリドン、エチレングリコールであることを特徴と
する特許請求の範囲第１項記載の方法
（３）該安定化剤の濃度がポリエチレングリコール又は
ポリビニルピロリドンの場合０．１〜５％（ｗ／ｖ）エ
チレングリコールの場合１〜５０％（ｖ／ｖ）である特
許請求の範囲第１項記載の方法
（４）該酸性溶出剤のｐＨがｐＨ３．０〜４．０である
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法
（５）アフィニティークロマトグラフィーに用いる固定
相において、免疫グロブリン結合能を持つ物質が、プロ
テインＡ、Ｇ、Ｌ、ＡｒｐあるいはＨであることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載の方法
（６）アフィニティークロマトグラフィーに用いる固定
相において、免疫グロブリン結合能を持つ物質が、抗免
疫グロブリン抗体であることを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の方法
（７）アフィニティークロマトグラフィーに用いる固定
相において、免疫グロブリン結合能を持つ物質が、ヒト
モノクローナル抗体であることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の方法