JPH02227094A - インターロイキン―１βに対する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）に対
する抗体、詳しくはＩＬ−１βの免疫学的精製、測定等
を可能とする新しいヒトＩＬ−１βに対するモノクロー
ナル抗体及びその製造法に関する。

従来の技術 ヒトＩＬ−１は、マクロファージや単球のみならず、多
くの細胞から産生され、多様な分子形態と生物活性とを
示すことが知られている。現在、該ヒトＩＬ−１には等
電点が異なる２種のもの、即ちＩＬ−１α及びＩＬ−１
βが知られており、それらはそれぞれ−次構造も明らか
にされている（Ｎａｔｕｒｅ、３１５．　　ｐ　６４１
　（１９８５）　　；　Ｊ、　　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、、１６４．　ｐ２３７　（１９ｇＢ）等〕。

上記ＩＬ−１は、医薬品としての応用が種々研究されて
いると共に、例えば各種の免疫欠損病や異常免疫応答の
研究並びに之等の臨床上の診断のために、殊に臨床サン
プルにおけるその測定が着目されている。

しかして、現在数ＩＬ−１の測定技術としては、バイオ
アッセイ（生物学的検定法）が知られており、この方法
においてＩＬ−１は被検サンプルの活性量として測定さ
れている。しかしながらこの方法は、操作性及び精度に
劣り、常に測定値を干渉する成分の存在を考慮する必要
がある。しかも上記方法では、ＩＬ−１α及びＩＬ−１
βが同一活性を示すことから、之等を区別して測定でき
ないという大きな欠点があった。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、上記ヒトＩＬ−１βに対する新規抗体
を提供することにある。

また、本発明の目的はヒトＩＬ−１βをヒトＩＬ−１α
と区別して測定でき、しかも生物活性を有するＬ−１β
のみを選択的に測定できる新しい免疫学的測定手法に利
用できるヒトＩＬ−１βに対する抗体を提供することに
ある。

また、本発明の目的は、ＩＬ−１βの異常産生を伴う各
種疾患において、上記ＩＬ−１βの作用の抑制（中和）
に利用できるヒトＩＬ−１βに対する抗体を提供するこ
とにある。

本発明の他の目的は、上記抗体の製造技術を提供するこ
とにある。

問題点を解決するための手段 本発明によれば、ヒトＩＬ−１βに特異反応性を有する
ことを特徴とするヒトＩＬ−１βに対するモノクローナ
ル抗体及びその製造法が提供される。

本発明抗体の利用によれば、生物活性を有するヒトＩＬ
−１βをＩＬ−１αと区別して、高感度、高精度でしか
も簡便に測定可能な新しい免疫検定法（イムノアッセイ
法）が提供される。

また、本発明抗体はヒトＩＬ−１βに特異的であるため
、その利用によれば、例えばアフィニティークロマトグ
ラフィー等の手法による、その特異的精製手段も提供さ
れる。

更に本発明抗体には、ヒトＩＬ−１βの生物活性に対し
て中和活性を有するタイプの抗体が包含され、かかる抗
体は、ＩＬ−１βの異常産生を伴う各種の疾患、例えば
慢性関節リウマチ、甲状腺炎、肝炎、腎炎等の慢性炎症
性疾患、動脈硬化、川崎病等の血管炎、汎発性血管向凝
固症候群、血液ガン等において、その異常産生に基づく
先進されたＩＬ−１βの生物活性を、抑制乃至中和する
ために有用であり、かかる各種疾患の治療上極めて価値
ある医薬が提供される。

本発明抗体は、ヒトＩＬ−１βを免疫抗原として利用し
て製造できる。より具体的には、例えば上記免疫抗原で
免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と哺乳動物の
形質細胞腫細胞との融合細胞（ｈｙｂｒ１ｄｏａ＋ａ　
）を作成し、これよりヒトＩＬ−１βを認識する所望抗
体を産生ずるクローンを選択し、該クローンの培養によ
り製造できる。

上記方法において用いられる免疫抗原としてのヒトＩＬ
−１βとしては、特に限定はなく、既に公知のインビト
ロで誘導されたヒトＩＬ−１βを含有する培養上清乃至
その精製標品、遺伝子組換え技術に従い製造されたヒト
Ｉ　Ｌ−１β及びそれらの一部のアミノ酸配列を有する
合成ペプチド等のいずれでもよい。

また、上記方法において免疫抗原で免疫される哺乳動物
としては、特に制限はないが、細胞融合に使用する形質
細胞腫細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく
、一般にはマウス、ラット等が有利に用いられる。

免疫は一般的方法により、例えば上記免疫抗原を哺乳動
物に静脈内、陵内、皮下、腹腔内注射等により投与する
ことにより実施できる。より具体的には、免疫抗原を、
所望により通常のアジュバントと併用して、供試動物に
２〜１４日毎に数回投与し、例えばマウスの場合には、
総投与量が約１００〜５００μｇ／マウス程度になるよ
うにするのが好ましい。免疫細胞としては、上記最終投
与の約３日後に摘出した牌臓細胞を使用するのが好まし
い。

更に、上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての
哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の種々の
もの、例えばｐ３　（ｐ３／ｘ６３−Ａｇ８）（Ｎａｔ
ｕｒｅ、２５６，４９５−４９７（１９７５）　）　、
ｐ　３−Ｕ　１　（Ｃｕｒｒｅｎｔ　　Ｔｏｐｉｃｓ　
ｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉ　ｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ　、　８１　、　１−７（１９７ｇ）　）　
、Ｎ５−１　［Ｅｕｒ、　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、
６゜５１１−５１９　（１９７６））　、ＭＰＣ−１１
（Ｃｅｌｌ　、　８．４０５−４１５　（１９７Ｂ）　
）　、５Ｐ２１０　（Ｎａｔｕｒｅ、２７６．２６９−
２７０（１９７８）　）　、ＦＯ［Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、　Ｍｅｔｈ、、　３５゜１−２１　（１９８０）
　）　、Ｘ６３−６．　５．　３．　　（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２３．　１５４８−１５５０　（
１９７９）　）Ｓ１９４　［Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１
４８，３１３−３２３　（１９７８）　３等や、ラット
におけるＲ２１０（Ｎａｔｕｒｏ、２７７．１３１−１
３３　（１９７９）　３等の骨髄腫細胞等を使用できる
。

上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反応は、公知の
方法、例えばＭｉｌｓｔｅｉｎらの方法［Ｍｅｔｈｏｄ
　　１ｎ　　　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、　　
　７３．　　　ｐｐ３（１９８１）　）等に準じて行な
うことができる。より具体的には、上記融合反応は、通
常の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等の存在下に、通常
の培地中で実施され、培地には更に融合効率を高めるた
めにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添
加することもできる。免疫細胞と形質細胞腫細胞との使
用比は、通常の方法と変りはなく、例えば形質細胞腫細
胞に対して免疫細胞を約１〜１０倍程度用いるのが普通
である。融合反応時の培地としては、形質細胞腫細胞の
増殖に通常使用される各種のもの、例えばＲＰＭＩ−１
６４０培地、ＭＥＭ培地、その他のこの種細胞培養に一
般に利用されるものを例示でき、通常２等培地は牛胎児
血清（Ｆ　ＣＳ）等の血清補液を抜いておくのがよい。

融合は上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との所定量を、上
記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥ
Ｇ溶液、例えば平均分子量１０００〜６０００程度のも
のを、通常培地に約３０〜６０ｗ／ｖ％の濃度で加えて
混ぜ合せることにより行なわれる。以後、適当な培地を
逐次添加して遠心し、上清を除去する操作を繰返すこと
により所望のハイブリドーマが形成される。

得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用
培地、例えばＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテ
リン及びチミジンを含む培地）で培養することにより行
なわれる。該ＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブ
リドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充
分な時間、通常数日〜数週間行なえばよい。かくして得
られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的
とする抗体の検索及び単一クローン化に供される。

目的抗体産生株の検索は、例えばＥＬ　Ｉ　ＳＡ法（Ｅ
ｎｇｖａｌｌ、　Ｅ、、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、
７０．４１９−４３９　（１９８０）　）　、プラーク
法、スポット法、凝集反応法、オクテｏ＝　−（Ｏｕｃ
ｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ　
Ａ）法等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方
法〔「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式
会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０−５３頁、昭和５７
年３月５日〕に従い実施することができ、この検索には
前記免疫抗原が利用できる。

かくして得られるヒトＩＬ−１βを認識する所望のモノ
クローナル抗体を産生ずるハイブリドーマは、通常の培
地で継代培養することができ、また液体窒素中で長期間
保存することができる。

上記ハイブリドーマからの所望抗体の採取は、該ハイブ
リドーマを、常法に従って培養してその培養上清として
得る方法やハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動
物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等が採
用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適し
ており、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

また上記のごとくして得られる抗体は、更に塩析、ゲル
濾過法、アフイニテイクロマトグラフイー等の通常の手
段により精製することができる。

かくして得られる本発明のモノクローナル抗体は、ヒト
ＩＬ−１βに特異反応性を有するものである。

また本発明抗体の内、ヒトＩＬ−１βの生物活性に対し
て中和活性を有するタイプの抗体は生物活性のあるヒト
ＩＬ−１βを特異的に測定するのに好適である。またか
かる中和活性を有するタイプの抗体、殊にＩＬ−１β分
子上のＩＬ−１受容体との結合に関与する部位を認識す
るタイプの抗体は、前記したＩＬ−１βの異常産生を伴
う各種疾患への適用に好適であ”る。

発明の効果 本発明によれば、ヒトＩＬ−１βに特異的なモノクロー
ナル抗体が提供され、この本発明抗体の利用によれば、
測定感度が極めて高く、特異性に優れ、従って、例えば
臨床サンプル等の極めて低濃度のヒトＩＬ−１βを含有
する検体中の、生物活性を有するヒトＩＬ−１βを、正
確に測定可能な免疫検定法による測定手法が提供される
。

実　　施　　例 以下、本発明をより詳しく説明するため実施例を挙げる
が、本発明は之等に限定されない。

実施例　１ 本発明抗体の製造及びその性状 遺伝子組換え技術に従い製造したヒト［５ｅｒ７１］Ｉ
Ｌ−１β〔生化学、５８．８号、ｐ８４０（１９８６）
、ＥＰ０１８７９９１号〕の１〜１０μｇを、Ｂ　Ａ　
Ｌ　Ｂ　／　Ｃ７ウスに、４週間に亘って連日腹腔内投
与し、最終免疫の３〜４日後に、常法に準じて、細胞融
合を行なった（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎＥｎｚｙｒｓｏＩｏ
ｇ７．７３．　ｐｐ３　（１９８１）等参照〕。

即ち、該細胞融合は、上記免疫された牌細胞と骨髄腫細
胞（Ｎ　Ｓ−１、Ｅｕｒ、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．、６゜
５１１−５１９　（１９７６）］とを５＝１の割合で用
い、ポリエチレシグリコール（ＰＥＧ−１５００）を用
いて行なった。

ハイブリドーマを、ＨＡＴ培地で選別後、その上清を上
記ヒトＩＬ−１βをコートした９６穴マイクロプレート
及びパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスグロブリン抗体
〔イー、グイ。ラブ（Ｅ。

Ｙ、　ｔａｂ、　）社製〕を用いた酵素免疫測定法によ
り試験して、目的のヒトＩＬ−１βに対する抗体産生株
を検出した。

限界希釈法によりクローニングを繰返して、所望の抗体
産生クローンを得た。

該クローン（本発明抗体産生ハイブリドーマ）は、通産
省工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に、ｒＡ
ｎｔｉ　０ＣＴ−４３ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａｅｅｌ　１　＜　００Ｍ４３−４　＞　Ｊなる
表示で、微工研条寄第２５６５号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−
２５６５）として寄託されている。

このクローンから得られた本発明抗体（この抗体をｒＧ
ＯＭ４３−４４と命名する）の特性を以下に示す。

■　抗体のサブクラス マウス抗体サブクラス検出キット（バイオ・ラッド（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）社製）を用いて決定した上記抗体のサブ
クラスは、Ｉ　ｇ　Ｇ　Ｉｋａｐｐａであった。

■抗体産生レベル ハイブリドーマが最大細胞密度になった時の培養上清中
のＩｇＧ量は約４０μｇ／ｍＱであった。

■力価 以下の方法で測定したＥＩＡ力価はＸ２０００であった
。

即ち、９６穴マイクロプレートに２００μｇ／或に調製
したヒトＩＬ−１βを分注（５０μｍ２／ウエル）し、
４℃下に一晩放置し、ＰＢＳ−トウィーン２０で洗浄し
、希釈したハイブリドーマの培養上清を分注（５０μＱ
／ウエル）し、４℃で一晩反応させた後、洗浄し、更に
パーオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン（カペル
社製、Ｘ２０００）を５０μＱ／ウェル加え、同様に反
応させる。洗浄後、結合した酵素活性を比色分析し、Ｏ
Ｄ４゜２＝０．５をとる培養上清の希釈倍率をもってＥ
ＩＡ力価とする。

■　分子量 ハイブリドーマをマウスの腹腔内で培養した後、ＩｇＧ
精製キット（ＭＯＰＳ　　Ｋｉｔ、バイオ・ラッド社製
〕により、ＩｇＧ、に精製したものの分子ｆｔ　（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによる重鎮と軽鎖の分子量の和を抗体の分
子量とする〕は１．７Ｘ１０２ｋｄであった。

■　交叉反応性 前記■に示した方法においてヒトＩＬ−１βに代えて２
０μｇ／ｍＱに調製したヒトＩＬ−１αを用いて同様に
して試験した結果、発色値はＩＬ−１を加えずに同様に
して求めたブランク値と変化せず、このことから本発明
抗体はヒトＩＬ−１αとは交叉反応性を示さないことが
明らかとなった。

■　中和活性 腫瘍細胞増殖抑制活性（ＧＩＦ活性）　　（ＧａｎｎＭ
ｏｎｏｇｒａｐｈ　ｏｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ、　３４　、　１５５（１９８８））により中和活
性を測定した。

ＵＶ法にて蛋白量を算出した００Ｍ４３−４を、培養液
で希釈して１００μｇ／ｍに調製した。次にこれを９６
穴マイクロプレート上において５０μＱ／ウエルの培養
液を用いて２段階希釈した。

ここに４０単位／ｍＱに調製した！Ｌ−１β５０μＱず
つを分注添加した（ＩＬ−１βの最終濃度は１０単位／
戒）。最後にヒトメラノーマＡ３７５細胞を２Ｘ１０’
細胞／ｍ１２に調製し、各ウェルに１００μＱずつ添加
した。これを３７℃下に５％Ｃ０２インキユベーター中
で４日間培養し、Ｇ。

Ｍ４３−４の抗ＧＩＦ活性を測定した。

その結果、ＩＬ−１βのＧＩＦ活性１０単位を１単位に
中和するに要する００Ｍ４３−４の量は、２．５μｇで
あった。

■　結合部位の決定 ヒトＩＬ−１βの製造［ＥＰ０１８７９９１号〕に準じ
て、下記に示すヒトＩＬ−１βの各フラグメントを製造
した。

くフラグメント〉 １−１５３：ヒトＩＬ−１βポリペプチド１−１５０：
ヒトＩＬ−１βのアミノ酸番号１〜１５０からなるポリ
ペプチド １−１４４：ヒトＩＬ−１βのアミノ酸番号１〜１４４
からなるポリペプチド １−１４０　：ヒトＩＬ−１βのアミノ酸番号１〜１４
０からなるポリペプチド ４−１５３：ヒトＩＬ−１βのアミノ酸番号４〜１５３
からなるポリペプチド ７−１５３：ヒトＩＬ−１βのアミノ酸番号７〜１５３
からなるポリペプチド １７−１５３：ヒトＩＬ−１βのアミノ酸番号１７〜１
５３からなるポリペプチド ヒトＩＬ−１β及び上記各フラグメントを発現している
それぞれの大腸菌に、５０ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ８，
０）（２５ｍＭ　　ＥＤＴＡ及び０．１％リゾチームを
含む）６０−０μＱを加えて振盪後、氷水中で１５分間
放置し、これに１５０ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ８，０）
（０，３％トリトンＸ１００及び１９０ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａを含む）５００μＱを加え更に振盪させた後、遠心分
離し、上清をＰＢＳ−０，１％ＢＳＡで５０倍に希釈し
て、試料溶液とし、以下の通りインヒビションアヅゼイ
を行なった。

即ち、９６穴マイクロプレートに１０μｇ／１Ｉ１１２
に調製した本発明抗体を１００μＱ／ウェルとなる量で
分注し、４℃で一晩放置した。水で洗浄後、非特異的吸
着を防ぐためにＢＳＡでブロックし、水で洗浄した。こ
れに試料溶液１００μＱ／ウエルを分注し、室温で２時
間反応させた後、更にビオチンラベルしたＩＬ−１β（
３０ｎｇ／　ＩｎＱ）を１００μＱ／ウェル分注し、４
℃で一晩放置した。

ＰＢＳ−）ウィーン２０で洗浄後、パーオキシダーゼ標
識ストレプトアビジン（ベテスタ・リサーチ（Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ、）社製、Ｘ１０
０Ｏ）を１００μＱ／ウェル加えて反応させた。洗浄後
、結合した酵素活性を比色分析した。

上記試験結果を第１図及び第２図に示す。各図は、横軸
に各ポリペプチドの濃度を、縦軸に４９２βｍにおける
吸光度をとり、ビオチンラベルしたＩＬ−１βの本発明
抗体への結合を各ポリペプチドがどのように阻害するか
を示すものである。

第１図及び第２図よ゛す、本発明抗体は、ヒトＩＬ−１
βのＣ末端付近及びＮ末端付近から構成される１つの構
造を認識するものと推定できる。

実施例　２ ■　ＥＬ　Ｉ　ＳＡ系での測定感度 ９６六マイクロプレートの各ウェルに１０μｇ／ＩＩＩ
Ｑ１．：調製した本発明抗体（ＧＯＭ４３−４）を１０
０μＱ／ウェルとなる量で分注し、４℃下に一晩放置し
た。水で洗浄後、非特異吸着を防ぐために１％ＢＳＡ−
５％ＦＣ８／ＰＢＳ　（４００μＱ／ウエル）でブロッ
キングし、水で洗浄した。

これに０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した試料溶液を１
００μＱ／ウェル加えて、４℃で一晩放置し、ＰＢＳ−
）ウィーン２０で洗浄後、ウサギ抗ＩＬ−１β抗体（５
μｇ／脱、１００μＱ／ウェル）を分注し、室温で２時
間放置した。ＰＢＳ−トウィーン２０で洗浄後、パーオ
キシダーゼ標識ヤギ抗つサギＩｇＧ抗体（バイオラッド
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、）社製、Ｘ２００００．１００．ｃ
ｌ／ウェル）を分注し、室温で２時間反応させ、洗浄後
、結合した酵素活性を０−フ二二レンジアミンを基質と
して比色分析した。

その結果、吸光度（ＯＤ４゜２βｍ）が０．１をとる試
料濃度を測定感度として、ＩＬ−１βに対する本発明抗
体の測定感度は８０　ｐｇ／　ｍＱであった。

また同一試験により［５ｅｒ７１］　　ＩＬ−１βに対
する測定感度を求めたるその結果は上記と同程度であっ
た。

■　生物活性との相関性 ０、２ｍｇ／ＩＩＱ　［５ｅｒ７１］　Ｉ　Ｌ−１β（
２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，０）を、５０℃、５５
℃、６０℃及び６５℃で、０〜２４時間加熱した溶液に
ついて、上記■に記載のＥＬ　Ｉ　ＳＡ系及び前記実施
例１の■に示したＧＩＦ活性を測定し、両者の相関性を
求めた。

その結果は第３図に示す通りである。読図は横軸にＥＬ
　Ｉ　ＳＡ系での測定値（ｍｇ／１ｌＱ）を、縦軸にＧ
ＩＦ活性測定値（Ｘ　１０−’Ｕ／ｍ１２）をとり、両
者の相関を調べたグラフである。

また、読図より両者の相関係数を算出した結果、０．９
８８であった。

上記と同様にして本発明抗体につき、ＩＬ−１βの生物
活性とＥＬ　Ｉ　ＳＡとの相関を調べた結果も、上記と
略同程度であった。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、実施例１に従い本発明抗体の結合
部位を調べた結果を示すグラフである。 第３図は、実施例２に従い本発明抗体についての［５ｅ
ｒ７１］　　Ｉ　Ｌ−１βの生物活性とＥＬ　Ｉ　ＳＡ
測定値との相関を調べた結果を示すグラフである。 （以　上）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトインターロイキン−１βに特異反応性を有す
   ることを特徴とするヒトインターロイキン−１βに対す
   るモノクローナル抗体。
2. （２）ヒトインターロイキン−１βを免疫抗原として使
   用することを特徴とする請求項１記載の抗体の製造法。
3. （３）上記免疫抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞と哺
   乳動物の形質細胞腫細胞との融合細胞を作成し、これよ
   り請求項１記載の抗体を産生するクローンを選択し、該
   クローンを培養して目的とするモノクローナル抗体を得
   ることを特徴とする請求項２記載の製造法。