JPH02216462A - Amebocyte lysate having high specificity to endotoxin - Google Patents
Amebocyte lysate having high specificity to endotoxinInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、カブトガニから得られるアメボサイト・ライ
セートに係わり、特に、エンドトキシンに対する特異性
の高いアメボサイト・ライセートに関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Application Field] The present invention relates to an amebocyte lysate obtained from horseshoe crabs, and particularly to an amebocyte lysate with high specificity for endotoxin.
カブトガニの血リンパ液より取得されるアメボンドトキ
シン」 （す＋ポリサッカライド）による凝固現象は、
「リムルステスト」の−船名でエンドトキシン特異的検
出法として医学、薬学の領域で広く利用されている。こ
の様なアメボサイト・ライセートの凝固を起こす物質と
しては、エンドトキシン以外にトリプシン様プロテアー
ゼ（トリプシン、トロンビン等）及びβ−グルカン類（
β一結合を有するグルコースポリマー及びその誘導体）
が知られている。The coagulation phenomenon caused by "Amebondo toxin" (su+polysaccharide) obtained from the hemolymph of horseshoe crabs is
It is widely used in the medical and pharmaceutical fields as an endotoxin-specific detection method under the ship's name, ``Limulus Test.'' In addition to endotoxin, substances that cause coagulation of amebocyte lysate include trypsin-like proteases (trypsin, thrombin, etc.) and β-glucans (
Glucose polymers with β-bonds and derivatives thereof)
It has been known.
アメボサイト・ライセートのエンドトキシンによる凝固
現象は、エンドトキシン性凝固酵素前駆体活性化因子に
よる凝固酵素前駆体の活性化と、活性型凝固酵素の働き
によるコアギュローゲンの繊維状コアギュリンへの転換
により起こることが明らかにされている。一方、アメボ
サイト・ライセートのβ−グルカンによる凝固現象がβ
−グルカン性凝固酵素前駆体活性化因子による凝固酵素
前駆体の活性化と、活性型凝固酵素の働きによるコアギ
ュローゲンの繊維状コアギュリンへの転換により起こり
、アメボサイト・ライセートに含まれるエンドトキシン
性凝固酵素前駆体活性化因子とβ−グルカン性凝固酵素
前駆体活性化因子が異なるものであることがＭｏｒｉｔ
ａらにより報告された（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、
１２９．２．３１８−３２１）。硫酸化多糖類を担体と
する液体クロマトグラフィーを用いたβ−グルカン性凝
固酵素前駆体活性因子の除去を特徴とするエンドトキシ
ンに対する特異性の高いアメボサイト・ライセートの調
整力が着氷らにより開示されている。（特開昭５９−２
７８２９号）〔発明が解決しようとする課題〕
公知の硫酸化多糖類を液体クロマトグラフィーを用いた
β−グルカン性凝固酵素前駆体活性化因子の除去を特徴
とするエンドトキシンに対する特異性の高いアメボサイ
ト・ライセートの調整法に従って調製したアメボサイト
・ライセートには凝固成分であるコアギュローゲンがβ
−グルカン性凝固酵素前駆体活性化因子と共に除去され
るため操作の煩雑な合成基質法による測定にしか用いる
ことができない。また高価で調製の面倒な、硫酸北条ｍ
Ｍを吸着担体とする液体クロマトグラフィー用充填剤を
使用しなければならないという欠点があった。The coagulation phenomenon of amebocyte lysate caused by endotoxin is thought to occur due to the activation of the coagulation enzyme precursor by an endotoxic coagulation enzyme precursor activator and the conversion of coagulogen to fibrous coagulin by the action of activated coagulation enzyme. It has been revealed. On the other hand, the coagulation phenomenon of amebocyte lysate due to β-glucan is
- An endotoxic coagulase contained in amebocyte lysate that occurs due to the activation of a coagulase precursor by a glucan coagulase precursor activator and the conversion of coagulogen to fibrous coagulin by the action of an activated coagulase. Morit indicates that the precursor activator and the β-glucan coagulation enzyme precursor activator are different.
(FEBS Letters,
129.2.318-321). Freezing et al. have disclosed the ability to adjust amebocyte lysate with high specificity to endotoxin, which is characterized by the removal of β-glucan coagulase precursor activator using liquid chromatography using a sulfated polysaccharide as a carrier. There is. (Unexamined Japanese Patent Publication No. 59-2
No. 7829) [Problems to be Solved by the Invention] Amebocytes with high specificity for endotoxin, which is characterized by the removal of β-glucan coagulation enzyme precursor activator using liquid chromatography using known sulfated polysaccharides. Amebosite lysate prepared according to the lysate preparation method contains β coagulogen, a coagulation component.
- Since it is removed together with the glucan coagulation enzyme precursor activator, it can only be used for measurements using the synthetic substrate method, which requires complicated procedures. In addition, Hojo m sulfate is expensive and troublesome to prepare.
There was a drawback that a packing material for liquid chromatography using M as an adsorption carrier had to be used.
本発明は、上述した従来技術の問題点を解決するために
従業されたもので、その目的は、カブトガニの血リンパ
液より取得されるアメボサイト・ライセートにβ−グル
カン類を適当量含有させることによりβ−グルカンに対
する感受性を消失せしめ、エンドトキシンに対する特異
性の高いアメボサイト・ライセート及びβ−グルカン類
に対する感受性を消失させたアメボサイト・ライセート
の調整方法を提供することである。すなわち、本発明者
らはアメボサイト・ライセート中にβ−グルカン類を過
剰量含有させることによりアメボサイト・ライセートの
β−グルカン類に対する感受性が消失するという新規事
実を見いだし本発明に到達したのである。The present invention was made in order to solve the above-mentioned problems of the prior art, and its purpose is to add β-glucans to the amebocyte lysate obtained from the hemolymph of horseshoe crabs. - To provide a method for preparing an amebocyte lysate which eliminates sensitivity to glucan and is highly specific to endotoxin, and an amebocyte lysate which eliminates sensitivity to β-glucans. That is, the present inventors have discovered the novel fact that the sensitivity of amebocyte lysate to β-glucans disappears by containing an excessive amount of β-glucans in the amebocyte lysate, and has thus arrived at the present invention.
るＣ因子のＣ因子への活性化がトリガーとなる。The activation of factor C to factor C is the trigger.
また、β−グルカンによっても凝固する。このときＣ因
子が関与する。It is also coagulated by β-glucan. At this time, the C factor is involved.
アメボサイト・ライセートの凝固機構を次に示す。The coagulation mechanism of amebosite lysate is shown below.
（来貢以下余白）
血球に触れることによって起因される。この反応は血球
中の３種のセリンプロテアーゼ前駆体とコ前述したよう
に、アメポサイト・ライセード中には、エンドトキシン
で活性化され凝固する経路と、β−グルカンによって活
性化され凝固する経路との二経路が存在する。すなわち
、アメボサイト・ライセートは、エンドトキシン又はβ
−グルカンの存在によって凝固するものである。したが
って、アメボサイト・ライセートがある試料との接触に
よって凝固した場合に、その試料中にエンドトキシン、
β−グルカンのどちらか存在していたのかを特定するこ
とはできない。(Leave space below) Caused by contact with blood cells. This reaction involves three types of serine protease precursors in blood cells.As mentioned above, there are two pathways in amepocyte lysate: one that is activated by endotoxin and coagulates, and the other that is activated and coagulated by β-glucan. A route exists. That is, amebocyte lysate contains endotoxin or β
-Coagulates due to the presence of glucan. Therefore, when amebocyte lysate solidifies upon contact with a sample, endotoxin,
It is not possible to determine whether either β-glucan was present.
しかしながら、本発明のアメボサイト・ライセートはエ
ンドトキシンに対する特異性を示すものであるので試料
中にエンドトキシンが存在することが確定できる。However, since the amebocyte lysate of the present invention exhibits specificity for endotoxin, it can be determined that endotoxin is present in the sample.
本発明は、カブトガニの血リンパ液より取得されるアメ
ボサイトの抽出液であるアメボサイト・ライセートにβ
−グルカン類に対する感受性が消失する十分な量のβ−
グルカン類を存在させるものである。過剰に存在するβ
−グルカン類は、β−グルカン類によって活性化され凝
固する経路をブロックする能力を有する。The present invention provides β
- Sufficient amount of β to eliminate sensitivity to glucans
It allows glucans to exist. β present in excess
- Glucans have the ability to block the clotting pathway activated by β-glucans.
次に本発明で用いるカブトガニのアメボサイト・ライセ
ートについて説明する。Next, the horseshoe crab amebosite lysate used in the present invention will be explained.
アメボサイレライセートは、カブトガニ、たとえば北米
産カブトガニ学名Ｌｉｍｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕ
ｓ。Amebosaile lysate is produced from horseshoe crabs, such as the North American horseshoe crab (scientific name: Limulus polyphemu).
s.
日本産カブトガニ 学名Ｔａｃｈｐｌｅｕｓ Ｌｒ１ｄ
ｅｎｔａｔｕｓ等と称する各種のカブトガニの血液リン
パ液より取得されるアメボサイトを水系の抽出液で抽出
して得られる。たとえばイオン強度０．０５以下の塩溶
液、好ましくはＮａＣ１を含むトリス−塩酸緩衝液を使
用して抽出する。Japanese horseshoe crab Scientific name: Tachpleus Lr1d
It is obtained by extracting amebocytes obtained from the blood and lymph fluid of various horseshoe crabs, such as L. entatus, with an aqueous extract. For example, extraction is performed using a salt solution with an ionic strength of 0.05 or less, preferably a Tris-HCl buffer containing NaCl.
本発明で用いるβ−グルカン類とはβ一結合を有するグ
ルコースポリマー及びその誘導体であり、例えば、カル
ボキシメチル化カードラン、ルテアン力ルボキシメチル
化バキマン等が含まれ、それらは本発明のβ−グルカン
に対する感受性を消失させたアメボサイト・ライセート
の成分として有効である。また、β−グルカン類、例え
ばカルボキシメチル化カードランの使用濃度はアメボサ
イトの個体差により異なるが一般的には１μｇ／ｄから
１００μｇ／ｍ１程度が適当である。それぞれのアメボ
サイトに対最適な濃度を求めるためには小量のアメボサ
イトを用いて予備実験を行うことが望ましい。The β-glucans used in the present invention are glucose polymers having β-bonds and derivatives thereof, and include, for example, carboxymethylated curdlan, lutean carboxymethylated bakiman, etc. It is effective as a component of amebosite lysate that eliminates sensitivity. Furthermore, the concentration of β-glucans, such as carboxymethylated curdlan, varies depending on individual differences in amebocytes, but is generally about 1 μg/d to 100 μg/ml. In order to determine the optimal concentration for each type of amebosite, it is desirable to conduct a preliminary experiment using a small amount of amebosite.
次に本発明のβ−グルカン類に対する感受性を消失させ
たアメポサイト・ライセードの調整法について説明する
。Next, the method of preparing amepocyte lysate in which sensitivity to β-glucans of the present invention has been eliminated will be explained.
本発明のβ−グルカン類に対する感受性を消失させたア
メボサイト・ライセートは、カブトガニから得られるア
メボサイト・ライセー；・に、このアメボサイト・ライ
セートにβ−グルカン類に対する感受性を消失せしめ得
るに十分な量のβ−グルカン類を共存させることにより
調整できる。すなわちアメボサイト・ライセートと過剰
量のβグルカン類とが共存していればよい。その調整法
は特定の方法によらなければならないものではないが、
代表例を次に挙げ説明する。The amebocyte lysate with reduced sensitivity to β-glucans of the present invention is obtained from horseshoe crabs; - Can be adjusted by coexisting glucans. That is, it is sufficient that the amebosite lysate and an excessive amount of β-glucans coexist. The adjustment method does not have to be a specific method, but
Representative examples will be listed and explained below.
その調整法には、カブトガニの血液リンパ液により取得
されるアメボサイトを水系の抽出剤で抽出してアメボサ
イト・ライセートを得る際の該水系抽出剤中にβ−グル
カン類を添加しておく方法がある。この方法では、アメ
ボサイトからアメボサイト・ライセートを得る抽出と同
時に、β−グルカン類を添加・共存させることができる
ので効率的な調整方法である。抽出に際してβ−グルカ
ン類が共存していても抽出工程上なんら障害は無く、抽
出率等は良好である。しかも得られたアメボサイト・ラ
イセートのβ−グルカン類に対する感受性の消失特性に
もなんら影響を与えない。One method for its preparation is to extract amebocytes obtained from horseshoe crab hemolymph with an aqueous extractant to obtain an amebosite lysate, in which β-glucans are added to the aqueous extractant. This method is an efficient preparation method because β-glucans can be added and allowed to coexist at the same time as the extraction to obtain amebosite lysate from amebosite. Even if β-glucan coexists during extraction, there is no problem in the extraction process, and the extraction rate is good. Moreover, it does not have any effect on the ability of the obtained amebosite lysate to lose its sensitivity to β-glucans.
抽出剤には、たとえばイオン強度０．０５以下の塩溶液
、好ましくはＮａＣ１を含むトリス−塩酸緩衝液が使用
される。As the extractant, for example, a salt solution having an ionic strength of 0.05 or less, preferably a Tris-hydrochloric acid buffer containing NaCl, is used.
また他の調整方法としては、カブトガニの血液リンパ液
により取得されるアメポサイトを水系の抽出剤で抽出し
て得たアメポサイト・ライセードに、β−グルカン類を
添加混合する方法がある。Another preparation method is to add and mix β-glucans to amepocyte lysate obtained by extracting amepocytes obtained from horseshoe crab blood lymph using an aqueous extractant.
以下に本発明の実施例を示すがこの実施例により本発明
の内容は拘束されるものでない。Examples of the present invention are shown below, but the content of the present invention is not restricted by these examples.
アメリカ産カブトガニの血リンパ液よりアメボサイトを
無菌的に採取し、このアメボサイトを１０μｇ／ｍｆｌ
のカルボキシメチル化カードラン及び１２ｍＭのＭｇＣ
ｌ２を含むｐＨ７，２の２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液で
抽出することにより、β−グルカンに対しては反応せず
エンドトキシンに対しては感受性を示すアメボサイト・
ライセートが得られる。Amebocytes were collected aseptically from the hemolymph of American horseshoe crabs, and the amebocytes were collected at 10 μg/mfl.
of carboxymethylated curdlan and 12mM MgC
By extracting with 20mM Tris-HCl buffer at pH 7.2 containing L2, ameboocytes, which do not react to β-glucan but are sensitive to endotoxin, were extracted.
Lysate is obtained.
この調整したアメボサイト・ライセートを用いてのβ７
グルカンに対する感受性の消失すなわちエンドトキシン
に対する特異性の試験は次のごとく行なった。β7 using this adjusted amebosite lysate
A test for loss of sensitivity to glucan, that is, specificity for endotoxin, was conducted as follows.
本アメボサイト・ライセート０．１７と既知濃度のエン
ドトキシン又は既知濃度のβ−グルカンを含む試料をエ
ンドトキシンフリーの水で希釈して得た種々の既知濃度
からなるエンドトキシン又はβ−グルカン水溶液０．１
−とを内径０．７ｍｍの試験管中で混合し振動を避けて
３７“Ｃで静置する。反応開始後１時間後に試験管を静
かに１８０度転倒させ内容物が落下しないものを土、内
容物が落下するものを−と判定する。Aqueous endotoxin or β-glucan solutions with various known concentrations obtained by diluting samples containing this amebocyte lysate 0.17 and known concentrations of endotoxin or β-glucan with endotoxin-free water 0.1
- in a test tube with an inner diameter of 0.7 mm, and leave it at 37"C while avoiding vibration. One hour after the start of the reaction, gently invert the test tube 180 degrees, and if the contents do not fall out, soil, A case where the contents fall is judged as -.
第１表に上記の方法でエンドトキシンあるいはβ−グル
カンを本アメボサイト・ライセートと反応せしめた結果
をしめす。本結果より明らかなように本アメボサイト・
ライセートはエンドトキシンには感受性を示すがβ−グ
ルカンには感受性を示さない。過剰のβ−グルカンの存
在かエンドトキシンの検出濃度限界（ＩＸ２−６）には
なんら影響しないことは２表の結果と比較すればあきら
かである。Table 1 shows the results of reacting endotoxin or β-glucan with the present amebocyte lysate using the method described above. As is clear from these results, this amebo site
The lysate is sensitive to endotoxin but not β-glucan. It is clear from comparison with the results in Table 2 that the presence of excess β-glucan has no effect on the detection concentration limit (IX2-6) of endotoxin.
第１表 既知濃度のエンドトキシン、あるいはβ−グル
カンと本アメボサイト・ライセートとの反応結果第２表
にカルボキシメチル化カードランを含まない緩衝液で抽
出したアメボサイト・ライセートを同じ反応方法でエン
ドトキシンあるいはβ−グルカンと反応せしめた結果を
示す。本結果より明らかなようにβ−グルカンの一種で
あるカルボキシメチル化カードランをアメボサイト・ラ
イセート中に含ましめることよりβ−グルカンに対する
感受性が消失する。Table 1: Reaction results of known concentrations of endotoxin or β-glucan with this amebocyte lysate. Table 2 shows the results of the reaction between endotoxin or β-glucan of a known concentration and amebocyte lysate extracted with a buffer solution that does not contain carboxymethylated curdlan. The results of reaction with glucan are shown. As is clear from the present results, sensitivity to β-glucan disappears by including carboxymethylated curdlan, which is a type of β-glucan, in amebosite lysate.
第２表 既知濃度のエンドトキシン、あるいはβ−グル
カンと本アメボサイト・ライセートとの反応結果ず、エ
ンドトキシンに対して特異的に高いアメボサイト・ライ
セートを容易に得ることができる。Table 2 Results of the reaction of the present amebocyte lysate with known concentrations of endotoxin or β-glucan, making it possible to easily obtain an amebocyte lysate that is highly specific to endotoxin.
本方法により取得されるアメポサイト・ライセードは、
β−グルカシに対しては反応せずエンドトキシンに対し
ては濃度依存的に反応するため、エンドトキシンに対す
る特異性の高い定量用試薬として利用できる。さらに、
エンドトキシンはグラム陰性菌の菌体成分であるので、
エンドトキシンの定量による敗血症の診断薬としても利
用できる。Ameposite lysade obtained by this method is
Since it does not react with β-glucashi but reacts with endotoxin in a concentration-dependent manner, it can be used as a quantitative reagent with high specificity for endotoxin. moreover,
Endotoxin is a bacterial component of Gram-negative bacteria, so
It can also be used as a diagnostic agent for sepsis by quantifying endotoxin.
Claims (5)
トにβ−グルカン類を共存させることを特徴とするβ−
グルカン類に対する感受性を消失させたエンドトキシン
に対する特異性の高いアメボサイト・ライセート。(1) β-glucan coexists in amebosite lysate obtained from horseshoe crabs
Amebocyte lysate with high specificity for endotoxin that has lost sensitivity to glucans.
ポリマー又はその誘導体であることを特徴とする請求項
１記載のアメボサイト・ライセート。(2) The amebocyte lysate according to claim 1, wherein the β-glucan is a glucose polymer having a β-bond or a derivative thereof.
ンであることを特徴とする請求項１記載のアメボサイト
・ライセート。(3) The amebocyte lysate according to claim 1, wherein the β-glucans are carboxymethylated curdlan.
、次いで該アメボサイトをβ−グルカン類を含有する抽
出剤で抽出することを特徴とするβ−グルカン類に対す
る感受性を消失させたエンドトキシンに対する特異性の
高いアメボサイト・ライセートを調製する方法。(4) Ameboocytes with high specificity for endotoxin that have lost sensitivity to β-glucan, characterized by collecting amebocytes from horseshoe crab hemolymph and then extracting the amebocytes with an extractant containing β-glucans. - How to prepare lysate.
、次いで該アメボサイトを抽出剤で抽出することにより
得たアメボサイト・ライセートに、β−グルカン類を添
加することを特徴とするβ−グルカン類に対する感受性
を消失させたエンドトキシンに対する特異性の高いアメ
ボサイト・ライセートを調製する方法。(5) Eliminate sensitivity to β-glucan by adding β-glucans to the amebocyte lysate obtained by collecting amebocytes from horseshoe crab hemolymph and then extracting the amebocytes with an extractant. A method for preparing amebocyte lysate with high specificity for endotoxin.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3639289A JPH02216462A (en) | 1989-02-17 | 1989-02-17 | Amebocyte lysate having high specificity to endotoxin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3639289A JPH02216462A (en) | 1989-02-17 | 1989-02-17 | Amebocyte lysate having high specificity to endotoxin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02216462A true JPH02216462A (en) | 1990-08-29 |
Family
ID=12468584
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3639289A Pending JPH02216462A (en) | 1989-02-17 | 1989-02-17 | Amebocyte lysate having high specificity to endotoxin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02216462A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0330991A2 (en) * | 1988-02-27 | 1989-09-06 | Wako Pure Chemical Industries Ltd | Process for measuring endotoxin |
| EP0638396A2 (en) | 1989-12-19 | 1995-02-15 | Amada Company Limited | A rapid attachment device for a manipulator head |
| US5702882A (en) * | 1993-09-30 | 1997-12-30 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Reagent for endotoxin-specific assay |
-
1989
- 1989-02-17 JP JP3639289A patent/JPH02216462A/en active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0330991A2 (en) * | 1988-02-27 | 1989-09-06 | Wako Pure Chemical Industries Ltd | Process for measuring endotoxin |
| EP0638396A2 (en) | 1989-12-19 | 1995-02-15 | Amada Company Limited | A rapid attachment device for a manipulator head |
| US5702882A (en) * | 1993-09-30 | 1997-12-30 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Reagent for endotoxin-specific assay |
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