JPH02182125A - レタスの改良されたクローン増殖法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は一般的には組織培養物から植物体を増殖する方
法に関し、より詳細には、正常な表現型のレタスクロー
ンを工業的規模での生産に十分な数で、組織培養により
生産する方法に関する。

〔発明の背景］ 多数の植物の種について、細胞あるいは組織培養物から
の植物体の再生に関し報告が既になされている。組織培
養技術を実施する一般的手法は、ドナー植物から適切な
組織片を切除する工程、ならびに、切片を試験管内の増
殖培地中で培養することにより、未分化の細胞塊、すな
わちカルス、の増殖を誘導する工程を包含する。増殖培
地は一般に無機塩、ビタミン、ホルモン、シュークロー
ス等の炭素源を含有する。カルスの生長に伴って培地中
の資源が涸渇するので、定期的に培地補給を行うか、カ
ルスを新しい培地上に移植し、細胞を継続して生長させ
る。未分化のカルスからの組織化された植物体の分化、
すなわち再生は自発的に起ることもあれば、異なる培地
（しばしば、ホルモンを欠く培地）への移植を必要とす
ることもある。

あるいは、カルスをほとんど又は全く経ることなく、外
植片から直接植物の全個体を増殖することが可能な場合
もある。いずれの手法によっても、遺伝子型の相違、外
植片組織の採取源、培地の組成および用法、培養条件な
どによって、種毎にその結果が異なってくる。植物の組
織培養は、植物の生長、二次代謝、遺伝子型の保存、長
期貯蔵、種の改良のための遺伝的変異の誘発、ユニーク
で望ましい遺伝子型のクローン増殖などの研究に利用す
ることができるＣＤ、八、エノマンス、Ｗ、Ｒ，シャプ
、ｐ、ｖ、アミラド編、［樅吻則胞羞雀ｐツ１１′Ｌ久
」第１〜４巻、ニューヨーク、マクミラン出版社発行（
１９８３−１９８６）　、　Ｔ、Ａ、ソープ編、」１１
＠法および　　への　　」、ニューヨ ク、アカデミツクプレス発行（１９８１）　；およびＷ
、Ｒ，シャープ、Ｐ、０．ラルソン、Ｅ、Ｆ、バトック
、■。

ラガーハン編、「　　　　および 本末つ息朋」、コロンブス、オハイオ州立大学出版部発
行（１９７９）参照〕。

組織培養物からの植物の再生は、明確に異なる一つの手
法、すなわち、不定胚形成および器官形成、のいずれか
によって行うことができる。ドナ植物の特性を備えた成
熟植物個体に生長し得る不定胚および再生器官は、植物
が増殖・繁殖する上で、通常の種子および栄養分体（球
根、塊根、挿し木など）に代替し得るものである。

組織培養によって再生された幼植物体は、合糸細胞分裂
により生じたものである点で種子より有利である。合糸
細胞分裂は、複製された染色体が分裂した細胞に均等に
分配されるプロセスである。

不定胚、再生器官などの合糸細胞分裂を経て再生された
植物体は、ドナー植物の正確な遺伝的コピーである潜在
的可能性を有する。

これと対照的に、種子中の接合胚は、減数分裂の産物で
ある一倍体花粉と卵核との融合によって生成する。減数
分裂は、非対染色体間の遺伝子交換、対立遺伝子の分離
、孤立染色体などの要因により、配偶子中に新しい遺伝
子の組を作るプロセスである。有性繁殖の配偶子融合に
より、接合体中に遺伝子の新しい組が形成される。この
ため、有性繁殖は、予測可能な一様性が往りにして要求
される、商業作物生産に使用される多くの種子に必要な
レベルの遺伝的−様性を与えない。植物生産者は、同系
交配によるホモ接合、戻し交配による親植物系統への回
帰などの手法により、種子からの植物の遺伝的均一性を
高めることができる。

しかしながら、これらの手法は、往々にして、手間がか
かり、同時に選択できるファクターの数が限られ、しか
も得られる植物の活性に悪影響を及ぼす。それ故、組織
培養によって得られる不定胚または不定器官は、植物の
種子による増殖を実施した場合には、通常、減数分裂に
よって失われることとなる、交雑、突然変異、遺伝子的
形質転換等に起因する優れた植物の特性を保存しつつ、
クローン増殖を行うのに有用である。

ジャガイモやニンニクの生産で実施されている、植物の
栄養繁殖も合糸細胞分裂によるものである。

しかしながら、組織培養による増殖は、栄養繁殖よりは
るかに生産力が高く、かつ低コストである。

これは、栄養繁殖を容易には行い難い多くの種において
、特にそうである。組織培養による増、殖は、幼植物体
が小さくかつ軽量であり、しかも輸送、生産、貯蔵、植
付けに際し、より効率的に取扱い得るとの利点をも有し
ている。さらに、組織培養によって誘導された幼植物体
は、栄養繁殖による植物を苦しめる多くの病気に罹患し
ないように保つことが可能である。

器官形成は、いくつかの重要な点で不定胚形成と異って
おり、植物の大量増殖には、一般に不利である。第１に
、不定胚は通常、芽組織および根組織の両者を有する二
極構造を有する。そのため、不定胚中には全植物体が同
時に存在し、正常な生長を続けることにより、完全な植
物個体が直接生成する。これに対し、再生器官は不完全
な植物体、通常芽または根、から成っており、不完全部
を形成しつつ生長することにより完全な植物個体を形成
する。植物体全体を構成するに至る各器官は、時間的に
離れて再生する。もちろん、器官再生の時間間隔は短縮
可能であるが、全植物体の再生に必要なステップ数が多
く、コスト高となる。さらに、不定胚は通常、互いに分
離し、かつ周囲の組織とも分離した、単体形態で発達す
る。このことは、組織培養物からの不定胚の採取、およ
び不定胚の種子代替物としての使用を容易にする。これ
に対し、器官形成では、芽または根が他の器官または周
辺の組織に付着したものが生成する。そのため、幼植物
体を分離し、植付けに際し、適切に分布するよう工夫し
なければならない。現在、これは時間がかかるだけでな
く、コストが高い手作業によって行われている。他の相
違点は、器官形成による植物の再生は、通常、不定胚形
成よりも効率が低いことである。例えば、レタスの器官
形成においては、カルス１グラム当りの発芽数はせいぜ
い１８であると報告されているのに対し、不定胚形成で
は、カルスｌグラム当り１０，０００個以上の胚が生成
することが報告されている（Ｄ、Ａ、スチュアートよび
Ｓ、Ｇ、ストリンクランド、「アルファルファの細胞培
養による不定胚形成−アミノ酸とアンモニウムとの相互
作用」、Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、Ｌｅｔｔ、、３４ｐ、　
１７５−１８１　（１９８６）　；Ｈ，カマダおよびＬ
ハラダ、「ニンジンの組織培養における器官形成−不定
胚形成に対するアミノ酸および無機窒素化合物の効果」
、Ｚ、Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ、Ｂｄ、、９１
．　ｐ、４５３−４６３（１９７９）参照］。多くの種
において、不定胚および接合胚は器官形成性植物組織が
生産しない特定の蛍白を生産する。これは、不定胚形成
と器官形成との間の生化学的および発生学的差異を示し
ている。これらの理由により、一般に、作物およびその
他の商業植物の大量生産において、器官形成の効率は、
不定胚形成の場合より低いと考えられている。しかしな
がら、器官形成は、多くの植物種において不定胚形成よ
り、しばしば容易に達成される。したがって、器官形成
による植物の再生は、工業的生産が可能な程度に効率が
高い場合には、不定胚形成に代る、生産方法となり得る
。

不定胚形成および器官形成の両者において、組織培養に
よる体細胞クローンの変異の抑制および再生時の発育の
同時性の確保は、これらの技術を、食用作物等、商業的
価値を有する植物の大量生産に実際に適用する上で、解
決しなければならない課題である。組織培養による理想
的な植物増殖システムにおいては、多数の許容しうる植
物が、比較的少量の組織から短期間内に生長しなければ
ならない。その理由は、材料およびエネルギーの投入量
、培養操作のための労力は、生産コスト増に直結するか
らである。組織培養による増殖システムのコスト増は、
改良された遺伝子型の植物を利用することによってもた
らされる生産上の利点を損なうこととなる。

レ　スの　　°立　の１ 栽培レタス（Ｌａｃｔｕｃａ　　５ａｔｉｖｉａ　Ｌ、
）はキク科植物であり、その葉を食するため世界中で広
く栽培されている。４．バセット編「嵜１変り１陪」（
１９８５年、コネティカット州ウェストポートのアビ出
版社発行）中のＥ、Ｊ、ライダーの「レタス栽培」の章
にレタスの栽培に関する総合的な解説が含まれている。

レタスは、そのほとんどが自家受粉である。

したがって、限定された規模で交雑を行うことは可能で
あるが、現在のところレタス雑種の種子を大量に生産す
る方法は知られていない。また、自発的突然変異または
誘発突然変異によるユニークな遺伝子型を有するレタス
を大規模に増殖することも不可能である。病気に対する
耐性、より高い均一性、成熟期間の短縮につながるより
高い生長力、その他の新しい資質等は、生産者および消
費者の双方にとって大きい利益となる。現在まで商業生
産されているレタスの品種への新しい遺伝的特性の導入
は、戻し交雑および系統選択を行い、これによって、既
存品種に類似した特性を有する改良品種を創生ずること
によって行われている。

レタスに早咲きの特性（これによって、１年間に行い得
る戻し交雑の回数が増加する）を備えさせるここができ
たとしても、その通常の栽培法は、なお長期間を要し、
また、種子を大規模に商業生産し得る品種をもたらす可
能性は限られている。

組織培養は、改善された新しい特性を有する雑種等の植
物を増殖する新たな手段を提供する可能性を有する。し
かしながら、現在までのところ、レタスの不定胚を高頻
度で誘導する方法については全く報告されていない（Ｒ
，Ｗ、ミラエルモアおよびＪ、Ａ、イーシュ、［植物細
胞培養ハンドブック第４巻−第１８章：レタス」、アビ
出版社発行（１９８６）参照］。これに対し、レタスの
組織培養の器官形成については、数多く報告されている
。しかしながら、それらは次に述べるような欠点を有し
ている。

すなわち、レタスの組織培養の培地に関し、種々の培地
が報告されているが、植物体の再生率が低い点で共通し
ている（第１表参照）。例えば、米国特許第４，０３８
，７７８号では、サマービプ（ＳｕｍｍｅｒＢｉｂｂ）
と呼ばれる品種を用いた場合、子葉外植片１個当りの芽
の形成の最大数は２０である。同様に、その後発表され
た論文ではその数は１８である（Ｄ。

Ｔ、ウェブおよびり、Ｄ、　）レス、「試験管内でのレ
タス子葉からの器官形成を制御する生長調節剤、外植片
の齢および培養条件の相互作用」Ｃａｎ、Ｊ、Ｂｏｔ、
＋貝、　ｐ、５８６−５９０　（１９８４）参照〕。他
の文献では、もっと低い効率が報告されている〔Ｌササ
キ「試験管内培養によるレタスの胚軸組織からの不定芽
形成に対する温度および光の影響Ｊ　Ｊ、Ｊａｐａｎ、
Ｓｏｃ。

Ｈｏｒｔ、Ｓｃｉ、、５１（２）、　ｐ、１８７−１９
４　（１９Ｂ２）　；　Ｋ、ケバリー他、「球レタスの
組織培養による増殖Ｊ　１ｏｒｔｓｃｉｅｎｃｅ、　１
３（ＩＬ　ｐ、３９−４１　（１９７Ｂ）　；Ｍ、Ｒ，
デルシュグおよびＣ１０，ミラー、［ラフトウ力・サテ
イバ（ＬａｃｔｕｃａＳａｔｉｖａ）の外植片からの不
定器官形成の化学的コントロール」Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｂａ
ｔ、、　５４（４）、ｐ、４１０−４１３　（１９６７
）参照］。子葉またはその他の外植片からの増殖に関す
るその他の報告では、再生の効率について全く触れてい
ないか、芽を形成した外植片の率だけが記載されている
（Ｈ，ササキ、「野菜の生育の生理学的および形態学的
研究■−レタスの胚軸から誘導されたカルス組織からの
不定芽形成ＪＪ。

Ｊａｐａｎ　Ｓｏｃ、Ｈｏｒｔ、Ｓｃｉ、、４４（２）
、　ｐ、１３８−１４３　（１９７５）　；Ｈ，ササキ
、「野菜の生長の生理学的および形態学的研究■−試験
管内での培養されたレタスの胚軸組織からの不定芽形成
に対する種々の培地の影響」Ｊ、Ｊａｐａｎ　Ｓｏｃ、
Ｈｏｒｔ、Ｓｃｉ、、４７（４）、　　ｐ、４７９−４
８４　　（１９７９）　；■、ササキ、「野菜の生育に
関する生理学的および形態学的研究Ｖ−レタス胚軸組織
からの不定芽形成に対する２４−Ｄおよびカイネチンの
影響ＪＪ。

Ｊａｐａｎ　Ｓｏｃ、）ｌｏｒｔ、ｓｃｉ、、４８（１
）、　ｐ、６１−６６　（１９７９）　；　Ｈ。

ササキ、「野菜の生育の生理学的および形態学的研究■
−試験管内で培養されたレタスの胚軸組織からの不定芽
形成に対するいくつかのオーキシン、サイトカイニンお
よびサイトカイニンリボサイドの影響」Ｊ、Ｊａｐａｎ
　Ｓｏｃ、Ｈｏｒｔ、Ｓｃｉ、、’　４７（４Ｌ　ｐ、
６７−７２（１９７９）　；　Ｄ、Ｔ、ウェブおよびり
、Ｄ、　）レス、「試験管内でのレタス子葉からの器官
形成を制御する生長調節剤、外植片の齢および培養条件
の相互作用」Ｃａｎ、Ｊ、Ｂｏｔ、、　６２．　ｐ、５
８６−５９０　（１９８４）参照〕。既報のどの報告も
、商業的作物生産を可能とする程高いレタスの組織培養
における再生効率を報告していない。

実生個体の子葉、胚軸等の外植片から生成した芽の直接
増殖が、多数の研究者によってレタスの栽培の研究に利
用されている。しかしながら、そのような外植片の使用
は、少なくとも２つの理由により、雑種またはその他の
ユニークな遺伝子型を有するレタスの実用的大量増殖に
は適していない。第１に、あるＦ１雑種等の植物の特性
が優れたものであり、組織培養による増殖に望ましいも
のであるか否かは種子期をある程度過ぎてから、はじめ
て判断できるようになる。耐病性、収穫量、品質等の特
性は、種子の段階では判断できない。

それ故、組織培養のための外植片は成熟した植物から採
取すべきである。しかしながら、成熟した植物体の組織
からの増殖については全く報告が存在しない。第２に、
実生個体から採取できる外植片の量は極めて限られてい
る。それ故、そのような系では、再生可能な組織を大量
に生産する手段が存在せず、外植片１個当りの出芽数が
２０程度にとどまることとなる。上記特許を含め、種子
の外植片からの再生に関する報告は、いずれも多数の芽
を容易に生産し得るだけの期間にわたって増殖すること
については何ら触れていない。

カルスからの再生は、植物１個体から、多数のレタスを
増殖する可能性を提供する。しかしながら、レタスの再
生に関する既報においては、いずれもその生産効率が低
く、小面積の畑または温室に十分な量を供給するのにさ
え、大量のカルスの培養が必要である。Ｒ，アルコンセ
ロの論文、’Ｌａｃｔｕｃａ　ｓａ旦■紅Ｌａｃｔｕｃ
ａ　５ａｔｉｖａおよびＬａｃｔｕｃａ　５ｅｒｒｉｏ
ｌａの細胞懸濁液からの植物体の再生Ｊ　　（Ｈｏｒｔ
　５ｃｉｅｎｃｅ、　１８（３）、　ｐ、３０５−３０
７　（１９８３））では、カルス３ｍ１（約３ｇ）当り
わずか１８個の出芽数しか報告されていない。Ｐ、カド
ケートおよび■。

サイパートは、「レタスの組織培養におけるフィトクロ
ーム制御器官形成Ｊ　　（Ｎａｔｕｒｅ、　′Ｌ！ｉＬ
ｐ、４９５０　（１９７７年１１月３日号）〕において
、カルス１グラム当り５．２の出芽数を報告している。

カルスからの再生について報告している他の研究者は、
再生効率については触れていない〔米国特許筒４，０３
８．７７８号；Ｃ，ブラウン他、「体細胞クローンレタ
ス（Ｌａｃｔｕｃａ　５ａｔｉｖａ）およびその子孫の
遺伝的変異性の評価ＪＡｎｎ、Ａｐｐ１．Ｂｉｏ１．、
１０９　　ｐ、３９１−４０７（１９８６）、　Ｍ、Ｒ
，デルシュグおよびＣ４０，ミラーの前記文献；に、ケ
バリー他の前記文献、　Ｒ，ｗ、　ミラェルモアおよび
Ｊ、Ａ、イーシュの前記文献；Ｈ，ササキの前記文献（
１９７５年）　；　１１．ササキの同一タイトルの論文
、Ｊ、Ｊａｐａｎ　Ｓｏｃ、Ｈｏｒｔ、Ｓｃｉ、、４７
（４）、　ｐ、４７９−４８４（１９７９）；Ｌサザキ
の同一タイトルの論文、Ｊ、ＪａｐａｎＳｏｃ、Ｈｏｒ
ｔ、Ｓｃｉ、、　４８（ＩＬ　ｐ、６１−６６　（１９
７９）；Ｈ，ササキの同一タイトルの論文、Ｊ、Ｊａｐ
ａｎ　Ｓｏｃ、Ｈｏｒｔ、Ｓｃｉ、。

４７（４Ｌ　ｐ、６７−７２　（１９７９）；　ｔｌサ
サキの前記論文（１９８２）：およびり、シビ、「優性
植物の系統遺伝の概要」　Ａｎｎａｌｅｓ　　Ａｍｅｌ
ｉｏｒａｔｉｏｎ　　ｄｅｓ　　Ｐｌａｎｔｓ＋　　２
６（４）＋　　ｐ。

５２３−５４７　（１９７６）参照）。

これまでに報告されたレタスの再生システムの多くは、
表現型が変異する植物体しか生成できないため、これら
は選定された表現型を有する植物の大量クローン増殖に
用いるには適さない〔Ｃ，ブラウン他の前記文献（１９
８６）；　ｃ、ブラウン他、「野生レタス種（Ｌａｃｔ
ｕｃａ　ｓａｌｉｇｕａ　Ｌ）のプロトプラストからの
植物個体の再生Ｊ　　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏ
ｒｔｓ６、　ｐ、１８０−１８２　（１９８７）；　Ｄ
、Ｅ、イングラ−およびＲｌＧ、グロガン、［レタスの
葉肉プロトプラストの単離、培養および再生Ｊ　　Ｐｌ
ａｎｔ　Ｓｃｉ、Ｌｅｔｔ、、　２８＋　ｐ。

２２３−２２９　（１９Ｂ２／８３）；Ｄ、Ｅ、イング
ラ−およびＲ，Ｇ、グロガン、「プロトプラストから再
生されたレタス個体の変異ＪＪ、Ｈｅｒｅｄｉｔｙ、″
７５．　ｐ、４２６−４３０　（１９８４）；Ｒ，Ｗ、
ミラヱルモアおよびＪ、＾、ベイ−ュの前記文献；Ｎ、
シビの前記文献参照〕。Ｋ、ケバリー他の前記文献（１
９７Ｂ）は、再生された植物を土壌に移植した後の一時
的変異について報告しているＣＫ、ケハリー他の前記文
献（１９７８）参照〕。組織培養からの体細胞変異を避
けるため、腋芽を用いる低効率マイクロ増殖法が特に開
発され、収穫後のレタスの告殖細胞の保存に用いられた
（Ｌ、Ｎ、ブロークスバーグおよびＭ、Ｅ、サルトバイ
）　（Ｊｒ、）、「収穫・貯蔵された露地栽培アイスバ
ーブレタス球の腋芽からの植物体の再生Ｊ　Ｈｏｒｔ　
５ｃｉｅｎｃｅ、　２１（５）、　ｐ、１２０１−１２
０３　（１９８６）参照〕。このマイクロプロパゲーシ
ョンは、レタスの大量増殖に用いるには、あまりにも労
働集約的である。その他の報告は、変異の問題について
触れていない。

何人かの著者は、レタスの試験管内培養における生長の
困難性について報告している。この問題は、カルスの黄
変または壊死、低生長および再生率の減少をもたらす培
地ｐＨの低下を特徴としている（Ｓ、Ｆ、ベリー他、「
レタス（Ｌａｃｔｕｃａ　５ａｔｉｖａＬ、）のプロト
プラストからの植物個体の再生」、Ｚ、Ｐｆｌａｎｚｅ
ｎｐｈｙｓｉｏｌ、Ｂｄ、、１０８　　ｐ、３１−３８
　（１９８２）；Ｃブラウン他の前記文献（１９８７）
、　Ｄ、Ｅ、イングラ−およびＲ，Ｇ、グロガンの前記
論文（１９８２／８３）；　Ｒ，ｗ。

ミラェルモアおよびＪ、Ａ、イーシュの前記文献参照］
。

Ｂｅｒｒｙ他は、プロトプラスト培養物の培地の一部を
低浸透圧の新しい培地と継続的に置換すると共に、濾紙
上で培養を行うことによりこの問題を克服している。ブ
ラウン他は、アガロース・ビーズでの培養、および培地
濃度の漸減によってこの問題を軽減している。これらの
方法は、いずれも大規模に適用するのはコストも高く困
難である。イングラ−およびグロガンは、１〜５ｍｙＩ
のコハク酸ナトリウムを添加することにより、プロトプ
ラスト培養中のｐＨ低下および組織の黄変の問題が軽減
できることを見出している。ミラェルモアおよびイーシ
ュは、シェンク・ヒルデブランド培地中の方が、ムラシ
ゲ・スクーグ培地中より黄変が起り易いことを見出して
いる。

レタスの芽の大規模な再生、ならびに再生された芽の効
率的な選別・収集法についての報告は全く存在しない。

先に引用した低い再生効率に関する報告に加え、種々の
レタス外植片において仮導管または根の分化を導くファ
クターについていくつかの報告がなされている（Ｗ、Ｅ
、ポルトンおよびＧ、Ａ、ボザルス、［無菌レタスの組
織培養の確立」Ｐｈｙｔｏｎ、　３２（１）、　ｐ、７
７−８０　（１９７４ｈ　Ｇ、ダレスサンドロおよびり
、ロバーツ［レタス（Ｌａｃｔｕｃａ）の髄の柔組織の
外植片からの木質形成の誘導Ｊ　Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｂｏｔ
。

巽（５）、　ｐ、３７Ｂ−３８５（１９７１）；　Ｆｌ
、Ａ、コルダン、［レタスの胚軸中の不定根原基の内生
的発育Ｊ　Ａｎｎａｌｓｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ、５５．　
ｐ、２６７−２６８　（１９８５）；　Ａ、Ｒ，ミラー
他、「オーキシンおよびサイトカイニンの存在下に試験
管内で培養されたレタスの髄の外植片のリグニン化およ
び木質化−内生エチレンの役割」Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｂｏｔ、、　３６（１６２）、　ｐ、１１０−１１８　
（１９８５）；　Ａ、Ｒ，ミラーおよびＬＪｌ．ロバー
ツ、［オーキシンおよびサイトカイニンの存在下に試験
管内で培養されたレタスの髄の外植片のエチレン生合成
および木質化−エチレンの前駆体および抑制剤の効果Ｊ
　Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．。

剥（１５４）、　ｐ．６９１−６９８　（１９８４）　
；　Ｌ．Ｗ．ロバーツおよびＳ．パパ、［レタスの外植
片の木質化を誘導するための炭素源としてのグリセロー
ルおよびミオイノシトールＪ　　Ｃａｎ，Ｊ．Ｂｏｔ．
＋則，　１２０４　〜１２０６（１９Ｂ２）；Ｌ．Ｗ．
ロパーツおよびＳ．パパ、「オーキシンにより誘発され
たレタス外植片の木質化がカルモジュリンを要求する証
拠」Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｅｘｐｅｒ．Ｂｏｔ．＋２７（３
）＋ｐ．２８９−２９５　（１９８７）参照〕。

ある報告中において、ラフトウ力・サテイバ（Ｌａｃｔ
ｕｃａ　　ｓａｔｉｖａ）のり、サリグナ　（Ｌ．ｓａ
土１ルαおよびし．ビロサ（Ｌ．ｖｉｒｏｓａ）との種
間交雑による接合胚の試験管内での培養について記載さ
れている（Ｂ．メゾネーブ、Ａｇｒｏｎｏｍｉｅ，　７
　（５Ｌ　ｐ．３１３−３１９　（１９８７）参照〕。

しかしながら、これは、植物の増殖を目的とするもので
はなく、また、これによって植物の増殖が達成されるも
のでもない。

これら文献中に記載されている報告によれば、均一であ
ると同時に、親植物の特性を保有するレタスの大量増殖
を可能とする組織培養システムの必要性がなお存在する
ことは明らかである。これに加えて、幼植物体の効率的
な取り扱い法および幼植物体の完全植物個体へのコンバ
ージョン法についても確立することが必要である。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、雑種またはその他の好ましい遺伝子型
のレタスから多数のクローンレタスを生産するための材
料および方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、これまでに報告された最良の結果
より少なくとも１０倍以上生産数が多く、しかも従来技
術に比して十分に高いクローンの表現型の均一性を保証
する組織培養法により、クローンレタスを製造するため
の材料および方法を提供することにある。

本発明のもう１つの目的は、単一植物体の移植を容易化
するため、組織培養により誘導されたしタスの芽を機械
的に分離する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、効率的かつタイムリーに幼
植物体を完全植物個体にコンバージョンするため、再生
された幼植物体を発根させ、かつ栄、速に発育させる方
法を提供することにある。

本発明のさらにもう１つの目的は、クローンレタスの芽
を、その移植前、最長４ケ月程度の期間にわたって生長
率を低下させた状態で貯蔵し、かつ適切な生育環境に一
移植するに際し、速やかに根を形成し、すみやかに生長
するよう順化する方法を提供することである。

本発明の他、の目的は、選定された遺伝子型のレタスの
組織培養物から、均一なレタスクローンを大規模に生産
することを可能とする効果的な方法を提供することであ
る。

〔発明の説明］ 上記目的およびその他の目的は、本発明により達成され
る。本発明は主として分化した芽茎分裂組織（ｓｈｏｏ
ｔ　ｍｅｒｉｓｔｅｍｓ）と表皮組織（ｅｐｉｄｅｒｍ
ａｌｔｉｓｓｕｅ）との混合物からなる器官化した急速
に増殖する組織（ｏｒｇａｎｉｚｅｄ　ｒａｐｉｄｌｙ
　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｔｉｓｓｕｅ）を、雑種
または有用な遺伝子型を有するその他のレタスから誘導
し、かつ維持する方法を提供する。本発明はまた、従来
の手による分離法よりコストを低減し得る機械化された
方法によって単体化することが可能であり、しかも、組
織培養の源となったドナー植物を、裔活力かつ忠実に再
生し得る芽を、該組織から形成する方法を提供する。さ
らに、本発明は、根を形成しつつ速やかに生長し得る適
切な環境下に芽を移植するに先立って、生長を抑制した
状態、すなわち、低生長状態で４ケ月までの期間、貯蔵
する方法を提供する。

本発明により提供されるシステムは、この再生されたレ
タスの芽を、温室または野外栽培のための移植片または
人工種子として使用することにより、レタスの大量生産
を可能とする。

〔詳細な説明〕

今般、主として分化した発条分裂組織および表皮組織と
の混合物からなる、器官化した急速に増殖する組織を、
雑種または有用な遺伝子型を有するその他のレタスから
誘導・維持することにより、極めて効率的に大量生産す
る、改良された方法が見出された。

本発明はまた、組織培養の培地の組成の最適化によって
改善されたレタスの生産効率を提供する。

本発明はまた、均一なりローン大量増殖法、およびその
移植前４ケ月までの期間、特定の均一サイズの芽を保存
する方法を提供する。

下記の用語は、本明細書中において、他に断わらない限
り、次の意味を有する。

「貯蔵培地」には本明細書中において「培地５」と称す
る培地を含む。

「培養」とは、植物の組織または材料のサイズまたは数
を増加させる処理を言う。

「サイトカイニン」には、標準サイトカイニン（例えば
カイネチン）およびサイトカイニン様ホルモン（例えば
６−ベンジルアミノプリン）の両者が含まれる。

「誘導培地」には、本明細書中において「培地■」、［
培地２ＡＪ、「培地２ＢＪ、「培地２ＣＪと命名・記載
される培地が含まれる。

「再生培地Ｊには、本明細書において「培地３」、「培
地４」と命名・記載されている培地が含まれる。

本発明の実施により、器官化した増殖組織１グラムから
８００個以上の芽が再生する。これは、これまでに報告
されているレタスの再生効率の約４０倍以上に相当する
。

上述のとおり、本発明は、不定芽形成を経由するレタス
の生産に適用可能である。ここで、しレタス」とは、例
えば、ｎ、バセット編、「見采例育種、」〔コネティカ
ット州ウェストポートのＡｖｉ出版社発行（１９８５）
　）中の「レタスの育種Ｊ　（Ｅ、Ｊ。

ライダー執筆）の項で定義されているとおり、キク科（
恒肚匹旦朋）のレタス属（ｇｅｎｕｓ　Ｌａｃｔｕｃａ
）に属する植物を言う。出発材料としては、胚軸、子葉
、頂芽、腋芽、Ｆｌすなわち交雑による次世代の葉片、
誘発または自然突然変異種、遺伝子工学技術によりその
ゲノムを修飾した植物、あるいはその物理的、化学的ま
たは園芸学的特性がクローン増殖に有用であると考えら
れるその他の選定された植物体等が利用可能である。

好ましい実施態様において、本発明の方法は、外植片か
らの、主として分化した分裂組織と表皮組織との混合物
からなる、器官化した増殖性組織培養物の形成、を誘起
する培地中への、外植片の導入を包含する。

続いて、培地の組成を維持し、組織培養物の持続的成長
により、その体積を連続的に増加させるため、器官化し
た増殖性組織培養物は、新鮮な培地中に定期的に移植さ
れる。

器官化した増殖性組織、カルスおよび外植片からの直接
器官形成により生成した芽は、周囲の組織に付着してい
る。再生した芽が、種子の実用的な代替物であり得るた
めには、取り扱いが容易であり、かつ１個体づつ植え付
は可能でなければならない。それ故、再生した芽を、効
率的に単体化（各個体に分離）する手法が望まれる。器
官形成システムにおいて、再生物のそのような単体化に
伝統的に用いられている手段は、手作業による分離であ
って、これは、多くの場合、メスによる切断またはピン
セットによる引き離しによって行われている。

本発明においては、器官化した増殖性組織を、芽を再生
させる能力を有する培地に移植した後、例エバ、ブレン
ダーを用いてホモジナイズ（均一に分散）することによ
り、再生する芽の単体化を促進する。あるいは、ますを
増殖性組織（これはホモジナイズされたものであっても
よい）がら芽を再生し、ついで再生した芽を、例えばブ
レングー中でバラバラに分離することにより、単体化し
たレタスの生産効率を高めることができる。この幼植物
体の単体化法については、米国特許箱４．ｏ３８．７７
８号にも、レタスの組織培養に関するその他のどの報告
にも記載されていない。

続いて、レタスの芽が採取され、発根およびその生長を
促進する培地で処理される。任意ではあるが、芽を培地
と共に４℃で貯蔵し、植付けまでの最長４ケ月程度の期
間、その生長を阻止あるいは遅らせることが望ましい場
合がある。

上記方法によって生産されたレタスの芽は、適当な媒体
に移植することにより、レタスの生産に用いられる。レ
タスの実地の栽培法は周知であり、本発明の構成外の事
項である。

本発明の実施に際し、３μ員のｐＣＰＡ　（ｐ−クロロ
フェノキシ酢酸）および１０μＮのカイネチンを含む培
地上で、表植片から増殖性培養物が形成されるが、この
培養物はカルス組織ではなく、器官化した増殖性の芽の
分裂組織（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｓｈｏｏｔｍ
ｅｒｉｓｔｅｍｓ）と表皮組織との混合物である。

該培地は、器官化した組織の増殖を支持すると同時に、
根、成長葉等のより成熟した器官の生成を妨げる。組織
培養によるレタスの再生に関する既報のレポートは、全
て、増殖段階を「カルス」と記載している。

例えば、米国特許箱４，０３８，７７８号は、２つのレ
タス再生システム：すなわち、■子葉外植片からの芽と
根の同時増殖、および■必要時に植物の再生に利用でき
る、組織の貯蔵・増殖用「左ル久培用」の製造：につい
て開示している。本発明はこれら両システムと実質的に
相違する。上記特許中では、カルスは［未分化の細胞の
塊Ｊと記載されており、これは、ここに開示する本発明
を実施した場合に形成される「高度に器官化した増殖性
組織（ｈｉｇｈｌｙ　ｏｒｇａｎｉｚｅｄ　ｐｒｏＨｆ
ｅｒａｔｉｎｇｔｉｓｓｕｅ）とは明確に相違する。

レタスのクローニングのため、カルスではなく、器官化
した増殖性組織を使用することは、ドナー植物の忠実な
りローンである均一な植物を再生する上で重大な意味を
有する。再生の前にカルスを形成すれば、遺伝子異常が
誘起され、再生物の均一性が減じることを示す証拠は、
植物の組織培養の分野において広（知られている。既に
引用した文献中において、何人かの研究者は、カルスか
ら再生されたレタスの体細胞クローンの変異について論
じている。本発明は、植物を再生し得る［高度に器官化
し、部分的に分化した増殖性組織」を使用することによ
り、該変異を軽減する法をも提供する。

したがって、本発明は、米国特許第４，０３８，７７８
号に記載されている外植片からの直接再生システムとは
、植物を再生する（外植片から誘導される）器官化増殖
組織を使用する点で相違している。両者の方法を実施し
た場合に形成される芽の数を比較すれば明らかなように
、上記特許に記載されている、植物の外植片からの直接
再生法では、ここに記載する本発明における様な植物の
効率的大量増殖を行うことはできない。

本発明はまた、レタスの不定芽を誘導、増殖、再生、貯
蔵するための新規な培地を提供する。器官化した増殖性
レタス組織の生育を促進する、ｐＣＰＡおよびカイネチ
ン（又は６−ベンジルアミノプリン）を含有する培地、
あるいはＬ−グルタミンを唯一の窒素源とする培地、な
どの使用については、従来全く開示されていない。

本発明に用いられる培地は、一般に、無機塩（多量成分
および微量成分）、ビタミン、資化容易な炭素源、およ
びいくつかの例においては、１種またはそれ以上のホル
モンを、レタス組織の生育を維持し得る量で含有する。

レタスの培養培地に用いられる無機塩（多量成分および
微量成分）は、一般に、周知である。レタスの組織培養
に用いられる無機塩の組合せとしては、例えば「ムラシ
ゲ−スクーグ（ＭＳ）　Ｊ　　（Ｔ。

ムラシゲおよびＦ、に、スクーグ＋　Ｐｈｙｓｉｏｌ、
Ｐｌａｎｔ、。

１５、　ｐ、４７３−４９７　（１９６２））、「ジエ
ンクーヒルダープラント（ＳＨ）　Ｊ　　［：Ｒ，Ｕ、
シェンクおよび＾、Ｃ，ヒルダープラント、　Ｃａｎ、
　Ｊ、　Ｂｏｔ、、　５０．　ｐ、１９９−２０４　（
１９７２）］、ｒＢ５Ｊ　　（０，ガムボルグ他、Ｅｘ
ｐ、Ｃｅ１１．Ｒｅｓ、＋父、ρ、１５１−１５８　（
１９６８）Ｅなどが知られており、例えば、ＳＲ無機塩
は下記組成を有する（■／ｆ！、）。

硝酸カリウム（２５００） 塩化カルシウム三水塩（２００） 硫酸マグネシウム七水塩（４００） リン酸二水素アンモニウム（３００） ヨウ化カリウム　（１，０） 硼酸（５，０） 硫酸マンガン−水塩（１０） 硫酸亜鉛上水塩（１，０） モリブデン酸ナトリウム三水塩（０，１）硫酸第二銅五
本塩（０，２） 塩化コバルト六水塩（０，１） 硫酸筒−鉄七水塩（１５） エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム（２０）他の
例において、ＭＳ無機塩は下記の組成を有する（ｍｇ／
／２）。

硝酸アンモニウム（１６５０） 硝酸カリウム（１９００） 塩化カルシウム三水塩（４４０） 硫酸マグネシウム七水塩（３７０） 硫酸第二銅五本塩（０，０２５） 硫酸マンガン−水塩（１６，９） 硫酸亜鉛上水塩（８，６） リン酸カリウム（１７０） 硼酸（６，２） ヨウ化カリウム（０，８３） モリブデン酸ナトリウム三水塩（０，２５）塩化コバル
ト六水塩（０，０２５） エチレンジアミンテトラ酢酸ニナトリウム（３７，３）
硫酸筒−鉄七水塩（２７，８） レタスの組織培養用のその他の公知の培地を第１表にま
とめて掲げる。

（来夏以下余白） 組織を良好に生長されるため、本発明で用いられる培地
中には種々の炭素源、典型的には炭水化物（例えば、シ
ュークロース、果糖、グルコース、マルトース等）を、
約５〜１００ｇ／　ｉ！、の濃度で添加することができ
る。２０〜６０ｇ／　ＩＶ、のシュークロースまたはマ
ルトースが炭素源として好ましい。

一般にビタミン類も培地中に含有される。イノシトール
、ニコチン酸、ピリドキシン塩酸塩等の典型的ビタミン
類、特にチアミン塩酸塩が、公知技術に従って、植物の
組織培養培地に添加される。

さらに、選定された特定のホルモン、例えばオーキシン
類、を試験管内での組織培養培地に用いることも知られ
ている。そのような用途に用い得る代表的なオーキシン
類の例として、インドール３−酢酸（Ｉ＾八）、α−ナ
フタレン酢酸（ＮＡＡ）、２．６ジクロロー０−アニス
酸（ＤＩＣＡ門ＢＡ）、４−クロロフェノキシ酢酸（ｐ
ＣＰＡ）、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−
Ｄ）および２．４．５−　トリクロロフェノキシ酢酸（
２，４，５−Ｔ）を挙げることができる。本発明の実施
に好適なオーキシンの例としては、ｐクロロフェノキシ
酸（ｐＣＰＡ）を挙げることができる。ｐＣＰＡは、約
０．１〜１０μＭ　、最適には０．５〜５μＮの濃度範
囲で、単独、もしくは他のオーキシン類と組合せて、使
用され、はとんどのレタスの品種に対し有効である。

その他のホルモン、例えばサイトカイニンも、本発明で
用いられる培地中に、組織培養物の生長を促進するに十
分な量、含有せしめられる。典型的には、カイネチン（
シグマ化学、ヘキスト社等より入手可）が濃度的０．１
〜２０μＭ　（通常、最適濃度的５〜１５μＭ）の範囲
内で用いられる。これに加えて、レタスの組織培養物の
成長を促進するため、６−ベンジルアミノプリンを、用
いることができる。該化合物は一般に、濃度０．１〜２
０μＮ（通常、最適濃度０．５〜１０μＭ）の範囲で用
いられる。

さらに、培地には、植物細胞の生長、発達に望ましいと
考えられるその他の有益な物質、例えばアンモニウムを
添加することができる。本発明に用いられる少なくとも
１つの培地中においては、アンモニウムは代替窒素源、
すなわちアミノ酸の１種であるＬ＝グルタミン、で置換
される。

Ｌ−グルタミンを唯一の窒素源として含有する培地中で
のニンジン（Ｄａｕｃｕｓ　　ｃａｒｏｔａ　Ｌ、）の
組織培養により、カルスの生長および体細胞胚形成が起
こることが知られている（Ｄ、Ｌ、ウェザ−エルおよび
り、に、トウーガル、「培養された野生ニンジン組織中
での生長及び胚形成を支持する窒素源」、Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ、　Ｐｌａｎｔ、、３７．　ｐ、９７−１０３（１９
７６）；　Ｈ，カマダおよびＨ，ハラダ、［ニンジンの
組織培養における器官形成の研究■−アミノ酸および無
機窒素化合物の体細胞胚形成に対する影響Ｊ　、Ｚ、Ｐ
ｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｂｄ、、　９１．　
ｐ、４５３−４６３　（１９７９）参照〕。Ｌグルタミ
ンを唯一の窒素源として含有する培地により、アルファ
ルファ（肚戯並脛５ａｔｉｖａ　Ｌ、）の体細胞胚形成
が支持されることも知られている（Ｄ。

Ａ、スチュアートおよびＳ、Ｇ、ストリックランド、「
アルファルファの細胞培養物からの体細胞胚形成　■−
アミノ酸とアンモニウムとの相互作用」Ｐｌａｎｔ　Ｓ
ｃｉ、　Ｌｅｔｔ、、　３４．　ｐ、１７５−１８１　
（１９８４）参照〕。

しかしながら、レタスの組織培養の培地において、Ｌ−
グルタミンを唯一の窒素源として使用することについて
は、これまでどの文献にも開示されていない。驚くべき
ことに、そのような培地は、レタスの組織培養における
周知の問題である「褐変（ｂｒｏｗｎｉｎｇ）　Ｊを、
これまで達成されたことのない態様で軽減する。

もし望むならば、本発明に用いる培地は、寒天、ゲルラ
イト（Ｋｅｌｃｏ　Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔ社の商標名）等のゲル化剤を用いて固化ま
たは半固化して用いることができる。

本発明の実施には、複種の手法が採用可能である。これ
らは、レタスの品種に応じ、いずれかより良い結果を与
える方が採用される。

（来夏以下余白） 穿−ヱＬ二表 ニコチン酸 ピリドキシン塩酸塩 シュークロース ｐＨ ＮＯ３ Ｍｇ５Ｏａ　　４Ｆ１２Ｏ ＮＩＩ４Ｈ２ＰＯ４ ＣａＣ１ｚ　　・２ＨｚＯ Ｎａ２−ＥＤＴＡ ＦｅＳＯ４４ＨｚＯ ＭｎＳＯ４・　Ｈ２Ｏ １（、ＢＯ３ ＺｎＳＯｓ　　・７ＬＯ ｌ ＣｕＳＯ４・５ＨｚＯ Ｎａ２ＭｏＯ４・２ＨＪ ＣＯＣｌ２　　・６Ｈ２０ イノシトール サイアミン塩酸塩 ２４９７．０ ３９４．０ ３００．０ ２２０．０ ２０．０ １５．０ １０．０ ５．０ １．０ １．０ ０．２ ０．１ ０．１ １０００．０ ５．０ 陪発」罎　０．５〜１■／Ｉ！、のＩＢＡまたは１．５
〜２■／！のＩＡＡ　、および３％のシュークロースを
含有する１００ＯＸハイボネツクス（Ｈｙｐｏｎｅｘ社
製） Ｃａ（ＮＯ＋）ｚ　　・４ｎ２゜ ＮＯ３ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２０ ＫＦｌ、ＰＯ４ ■３Ｂ０３ ＭｎＳＯ，−Ｈ，０ ５９０，０ ２５３，０ ２４７，０ ６８，０ １，４３ １，０６ ｚｎＳＯ４・７１（２０ ＣｕＳＯａ　　・５ＨｚＯ ＮａＪｏ０４　・２ＨｚＯ セケステレ：ｚ（Ｓｅｑｕｅｓｔｒｅｎｅ）３３０ＢＡ ｐＨ ０，１１ Ｏ８０４ ０，０１５ ０，００２５ ０，２０３ ５，８ 本発明の１つの実施態様において、雑種レタスの若い成
長中の葉がドナー植物から採取される。

組織培養を開始し、これを操作する全ての仕事は、好ま
しくは無菌状態で行われる。採取された葉の表面は、０
．５２５％次亜塩素酸水溶液（市販の１０％漂白剤の稀
釈物）に、１００咄当り２滴の界面活性剤（例えばＴｗ
ｅｅｎ　２０（商品名）〕を加え、６ＮＨＣ１を用いて
ｐＨを７．５に調節した溶液中に０．５〜３分間浸漬す
ることにより、殺菌される。この次亜塩素酸液を捨て、
葉を直ちに過剰の殺菌水で洗浄する。この殺菌水を捨て
、葉を、さらに２回殺菌水で洗浄する。

最終洗浄後、葉をペトリ皿等の殺菌済み表面に置き、殺
菌済みのメスを用いて約３ｍｍＸ１０ｍｍのサイズの片
に切断する。このように切断した葉の外植片は、本発明
書中において培地１と称する培地の表面に置床される。

培地１の組成は第２表および第３表中に詳しく記載され
ている。同培地中の、Ｌ−グルタミンを除く全ての成分
は、オートクレーブ殺菌されたものである。Ｌ−グルタ
ミンは、濾過により除菌され、他の培地成分がオートク
レーブ殺菌された後、ペトリ皿への注入・固化前に培地
中に添加される。該培地は０．８％の寒天により固化さ
れる。

１００髄Ｘ　１５ｍｍのペトリ皿１個に対し、約５個の
外植片が植付けられる。培地および外植片を含むペトリ
皿は、バラフィルム（商品名）により封をされ、暗所に
て１５〜３０℃１好ましくは２０〜２４℃で、２１日間
培養される。この間に、外植片からまず器官化した、増
殖性組織が形成される。これを新鮮な培地１に移植し、
同一条件でさらに２１日間培養する。この間、カルスお
よび増殖性組織は、引き続き増殖する。

次に、この器官化した増殖性組織の塊を、ペトリ皿等の
硬い無菌表面にスパチュラ等を用いて弱く押し付けるこ
とにより、バラバラにする。ついで、このバラバラにし
た組織をペトリ皿１個当り０．５〜１ｇの量で新鮮な培
地１中に分散し、同一条件で培養する。この器官化増殖
性組織を、２８日間隔で継代培養する。

芽の形成およびその単体化を行うため、得られた器官化
増殖性組織、例えばブレンダー〔例えば、８４Ｂ−３１
Ｌ型０ｓｔｅｒｉｚｅｒ　（商標名）］中に、シューク
ロース３％を添加したＳｌ（処方から成る過剰量の液体
培地（容量比−約１：１２）と共に、入れる。

これを約４〜１０℃冷却し、１０〜１８０秒間、好まし
くは３０〜４０秒間ブレンド（攪拌）する。その際、ブ
レンダーの速度を低速にセットすると共に、電源電圧を
２に落して供給する（例えば、標準電源電圧がＡＣ１２
０ボルトの場合、ＡＣ６０ボルトとする）ことにより、
攪拌速度を制御する。この電圧制御は、例えば、ブレン
ダーを可変トランス（例えば、米国オハイオ州５ｔａｃ
ｏ　Ｅｎｅｒｇｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製３ＰＮ１０１
０型トランス）に接続することによって行い得る。

このホモジナイズ処理後、８０メツシユのスクリーン上
で、液体培地を分離し、３％のシュークロースを含有す
る新鮮なＳＨ培地を注くことにより、組織を洗浄する。

この組織を、約３３ｍ！の培地３（第２表および第３表
）を含む１００ｍｍ　Ｘ　１５ｍｍのベトリ血中に、ベ
トリ皿１個当り５ｇの割合で移植する。培地３中の、マ
ルトースを除く全ての成分は、オートクレーブ殺菌され
たものである。マルトースは、濾過により除菌され、他
成分のオートクレーブ殺菌後、培地に添加される。培地
３も寒天０．８％により固化されている。ついで、該組
織は、温度２０〜２４℃１照射１２時間／Ｂの条件で、
１４〜４２日間、好ましくは２１日間培養される。照射
強度は、１０〜２００μＥｍ−２ｍｉｎ−’、好ましく
は５０〜１００μＥｍ−”ｍ１ｎ−’である。光源とし
て蛍光灯が使用可能である。

再生した芽は、種々の方法により採取できる。

例えば、ビンセットを用いる手選別により、あるいは複
数の芽を含む大小の塊を適当な、メツシュサイズのふる
い上に乗せ、液体培地で洗浄し、個々の芽に分離するこ
とによって行い得る。あるいは、発芽した組織を適当な
比重の液体培地中に懸濁し、浮力の小さい組織および低
質芽を異なる浮遊状態とすることによって行い得る。

得られた芽は、種々の方法により、完全植物体にコンバ
ージョン可能である。例えば、芽を適当な生長媒体〔例
えば、野外の土壌、鉢植え用混合土壌、Ｒｏｃｋｉｙｏ
ｏｌ　（商標名）　、０ａｓｉｓ（商標名）等のフェノ
ール樹脂製人工媒体、あるいはその他公知の植物生育支
持材〕に直接植付けることができる。

あるいは、米国特許第４５６２６６３号および４，５８
３，３２０号に記載されているような方法により、芽を
カプセル化してもよい。あるいは、適当な条件下に配送
または生産し得るように、流体播種用のゲルスラリーに
懸濁することも可能である。これらは、芽から植物体へ
の生長を許容する適切な条件下に、例えば水耕栽培、温
室栽培、野外栽培により栽培することにより、完全植物
体とすることができる。

他の実施態様では、外植片はまず培地２Ａ上で培養され
、ついで培地２Ｂ、最後に培地２Ｃ上で２〜４週間のサ
イクルで培養される。培地２Ｃからの器官化した増殖性
組織は、まず、上記の方法でブレンド（攪拌）すること
により再生される。

ブレンド（攪拌）処理に用いるシェークロース（３％）
含有Ｓｌ（培地は、０．５Ｍのマンニトールを添加した
１／２希釈ＭＳ培地の大量要素（ｈａｌｆ−ｓｔｒｅｎ
ｇｔｈＭＳ　ｍａｊｏｒ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ）で代替す
ることができる。

また、ブレンドした組織の洗浄には、１／２希釈ＭＳ培
地の大量要素を代替使用することができる。

ついで該組織を、培地４を収用した三角フラスコ中に、
培地１ｉ！、当り１０〜１５ｇの量で植え付ける。

組織含有培地と三角フラスコとの容量比は１：５である
。培地および組織を収用した三角フラスコを上記と同じ
培養条件の下に、１４〜４２日間、好ましくは２１日間
、１１００ｒｐで回転し、培養に必要な通気を行う。

あるいは、代替実施態様として、ブレンドされた組織を
、再生のため、培地３に、培地１リットル当り１５ｇ　
（最適値）の濃度で植え付ける。培養条件は上記と同一
である。組織含有培地は、その収用容器が三角フラスコ
である場合、１００ｒｐｌＩ＋で回転される。組織含有
培地とフラスコとの容量比は、この場合にも１：５であ
る。

もう１つの代替実施態様においては、器官化した増殖性
組織からの芽の再生は、組織のブレンド（あるいはその
他の手段によるホモジナイズ化）を行い、あるいは行う
ことなく、器官化増殖組織を直接再生培地（液体または
固体の培地３または培地４）に移植することによって行
われる。１４〜４２日間、好ましくは２１日間、の再生
培養後、芽を含む培養物は、単体化（個々の個体への分
離）を行うため、ブレンドまたはその他の処理に付され
る。

この単体化処理の後、芽を含む組織は、固体または液体
の培地３または培地４に再び移植され、上記再生条件と
同一の条件で培養される。培養期間は５〜１４日間であ
る。この期間内に、芽は、ふるい選別、浮遊選別、手選
別等により目的でない組織およびその他の破片から容易
に選別し得る大きさである３〜５［ＩＴｆｆｌに成長す
る。

芽は、本発明のある実施態様では、植物体に生長し得る
条件下への移植に先立つ期間、その生長を遅らせ、又は
阻止するような条件下に、移される。そのような条件下
に芽を置くことにより、植物体への生長に適する条件下
にそれを移植した場合の生長率を、そのような処置を取
らなかった芽と比較して、高めることができる。この場
合、芽は、例えば、１００ｍｍ　Ｘ　１５ｍｍのペトリ
皿に収用された、シュークロース３〜２０％（好ましく
は７％）を含有し、寒天０．８％で固化されたＳＲ培地
（第４表記載の培地５）３３ｄに植付けられる。植付は
量は、ペトリ皿１個当り、５ｇ程度である。これらは、
ついで４℃前後で貯蔵される。ベトリ皿は、乾燥および
微生物の混入を防止するため例えばパラフィルム（商品
名）によりシールされる。

芽はこの条件で、最長１年間、好適には１〜６ケ月間貯
蔵可能である。この期間内であって、芽から植物体への
生長が望まれる任意の時期に、貯蔵条件から生長に適す
る条件に芽を移すことにより、その生長を誘導すること
ができる。このような芽の処理は、適切な生長条件に移
した際に、芽のより速い生長をもたらす。

貯蔵が望まれる場合の他の実施態様においては、芽は、
上記と同じ組成の液体培地中において上記と同じ条件下
に貯蔵される。

レタス植物体の植付けに関する本発明の１実施態様にお
いて、再生培地または貯蔵培地から、植物生産に適する
条件に芽を移植する際、発根を促進するため、芽を処理
することができる。この処理は、例えば、１リットル当
り　ＩＢＡ　０．５〜１■、又はＩＡＡ　１．０〜２．
０　ｍｇを含有する溶液で芽を処理することによって行
われる。この溶液は、さらに、濃度１〜１０％、好まし
くは２〜３％の炭水化物、ならびに本技術分野において
レタスを含む種々の植物の成長を支持または促進するこ
とが公知である各種生長の肥料を含有することができる
（例えば、第４表の培地６および培地７）。芽は、植物
生産に適する条件に移植する前に、３日程度上記のよう
な液体培地に浸漬される。

上記発根促進処理の代替手段として、炭水化物を含有せ
ず、１／２希釈ホーグラン溶液（ｈａｌｆｓｔｒｅｎｇ
ｔｈ　Ｈｏａｇｌａｎｄ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）その
他の液体肥料と、液体肥料１リットル当り、０．５〜ｌ
ｌｌ１ｇのＩＢＭとからなる溶液を用いて、芽を処理す
ることもできる。この溶液は、植物体の生産に適する条
件下に芽を植付けた後、土壌その他の媒体を該溶液で湿
すことにより、芽に適用することも可能である。

この場合、土壌またはその他の媒体は、発根するまで該
溶液により湿潤状態に維持され、その後該湿潤化溶液に
はＩＢＭが省かれる。

本発明の他の実施態様において、芽は、上記液体培地中
または固体培地上で貯蔵される間に１１Ｊットル当り０
．１〜５．０■（好ましくは１．０ｍｇ）のＩＢＡで、
適宜期間（最適には３日間）処理される。

この処理は、芽を植物体の生産に適する条件下に移植す
る前に、培地５、培地６、培地７のいずれを用いて行っ
てもよい。

さらに他の実施態様において、器官化した増植性組織を
培養するために出発材料として実生個体（ｓｅｅｄｌ　
ｉｎｇ）外植片が使用され、上記と同じ条件で取り扱わ
れる。この実施態様において、外植片は、葉組織の調製
に用いた殺菌方法と同一の方法で、その表面が殺菌され
、殺菌済みペトリ皿中に封入された、殺菌済み湿潤フィ
ルター上に移される。

種子は、暗所にて４〜６日間２０〜２７℃で培養され、
その間に発芽する。

この実生個体の子葉、上胚軸および／または下胚軸が切
取され、培地ｌまたは培地２Ａに接種され、続いて上記
の如き各種操作が行われる。その際、器官化した増殖性
組織が形成され、これから多数の芽を再生することが可
能である。これら多数の芽はさらに、均一かつ正常なり
ローン植物に生長させることができる。

本発明の種々の実施態様を説明するため、下記実施例お
よび実験を実施した。

下記実施例および実験は、本発明の好ましい実施態様お
よび好適な側面を例示するためのものであり、本発明の
範囲を限定するものと解すべきではない。

下記実施例中において、特に断わらない限り、全ての重
量はグラム（ｇ）またはミリグラム（ｆｆ１ｇ）、全て
の濃度はミリモル（ｍＭ）またはマイクロモル（８Ｍ）
、全ての容量はリットル（ｆ）またはミリリットル（Ｉ
ｎｌ）で示されている。

高い芽再生能力を有する器官化した増殖性レタス組織の
誘導・生長に最も適するホルモン条件を次のようにして
決定した。

発芽４日目の無菌のバンガードア５　（Ｖａｎｇｕａｒ
ｄ７５）の実生個体から切取した子葉サンプルを異なる
ホルモン組成を有する種々の培地に植付けた。各培地は
、３％シュークロースを含有し、０．８％のシュークロ
ースで固化したＳＨ塩から構成されたものを用いた。各
培地を、直径６０ｍｍ、深さ１０ｍｍのベトす皿（培地
収用能力的１０ｄ）に注入した。各培地は、それぞれオ
ーキシン類（ＩＡＡ、　ＮＡＡ、　ｐＣＰＡ、　２゜４
−Ｄまたは２．４．５−Ｔ）およびカイネチンを第５表
記載の濃度で含有していた。各ペトリ皿には、それぞれ
異なる３種の実生個体から採取した、３個の子葉片を植
付け、暗所にて２４℃で培養した。

４週間後に、組織の増殖を確認した。ついで、各条件の
増殖性組織を、３％のシュークロースを添加したＳＨ培
地に移植し、明所（１６時間／日、蛍光灯）で３週間培
養した後、器官形成の程度について評価した（第５表）
。器官化した増殖性組織の生長およびそれに続く芽の再
生の両者において最高レベルを示すものは、ｐＣＰＡお
よびカイネチンを含有する培地に集中していた。他のホ
ルモンおよび濃度より効率が高いことから、ｐＣＰＡ　
３ＭＭおよびカイネチン１０μＨの組合せを、器官化し
た増殖性レタス組織の誘導・生長の標準条件に選定した
。

本実験等で見出されたような、高い芽の再生率は、レタ
スの組織培養では、これまで報告されたことかない。し
かも、その際、カルス組織とは明確に異なり、かつ従来
報告されている直接器官形成とも異なる、器官化した新
しい形態のレタスの増殖性組織が形成された。最後に、
オーキシンの１種、ｐＣＰＡが、高い再生能力を有する
レタス組織の器官化増殖に最適であるとの発見は、これ
まで全く報告されていないものである。

（来夏以下余白） 第」コ（表 ハンガード（Ｖａｎｇｕａｒｄ　７５）ビブ（Ｂｉｂｂ
） エンバイア（Ｅｍｐｉｒｅ） シグナル（Ｓｉｇｎａｌ） グリーンリーフ（Ｇｒｅｅｎｌｅａｆ）（注１）平均上
標準偏差（ｎ＝５） １３２±３５ ３５４±９９ １７３±６５ １５８±６０ ３３２±１７ 理に対し、同様の反応を示した（第７表参照）。

実施例ＩＡの方法は一般に、ビブ（ｂｉｂｂ）、コス（
ｃｏｓ）　、リーフィ（Ｌｅａｆｙ）およびクリスプヘ
ッド（ｃｒｉｓｐｈｅａｄ）種のものを含む、一連の種
のレタスに適用可能である。従来のレタスの組織培養は
、それぞれ特定の品種にその有効性が限定されていた。

しかも、従来技術は、葉の外植片には、適用不能であっ
た。本願発明は、葉の外植片にも適用可能であり、この
ことは、本願発明を実施する上で、極めて重要である。

実Ｊ！１ｎＬＬ八 追加テストにおいて、バンガードア５の胚軸外植片、な
らびにビブ、シグナル、エンバイアおよびグリーンリー
フの各品種の子葉および胚軸の外植片は、ｐＣＰＡ　３
μ台およびカイネチン１０μＮを含む培地に対し、いず
れもバンガードア５の子葉外植片と同様に反応した（第
５表参照）。Ｆ１雑種レタス（ＬＣ−８と命名）の若葉
の円板状外植片も、開始ホルモンの適性化に加え、培地
中の窒素源を変更することにより更なる改善が達成され
た。■ｐＣＰＡ３μＨ、カイネチン１０ＩＩＭおよびシ
ュークロース３％を含有するＭＳ培地上、および硝酸塩
およびアンモニウムを除き２０ｍＭのＬ−グルタミンを
唯一の窒素源とする修飾ＭＳ塩培地（ｐＣＰＡ　３μＮ
、カイネチン１０μＨおよびシュークロース３％をも含
有）上に、生育４日目のバンガードア５の若苗の子葉お
よび胚軸の外植片を植付け、器官化増殖性組織の生長お
よび再生能力の比較を行った（培地１、第２表および第
３表参照）。

両培地共、寒天０．８％を用いて固化した。いずれも、
カルスは４週間間隔で、新鮮な培地に３回継代培養した
。培養物の生長率は第３サイクルにおいて比較した。さ
らに、第３サイクル後、それぞれの培養物を、３％のシ
ュークロースを含有するＳｌｌ培に移植し、各培地上で
生長した組織からの再生芽を比較した。組織は、培地ｌ
上において、標準ＭＳ上での増殖と比較して、１．７５
倍増殖した。

培養の全期間にわたって、組織は白色ないし緑色を保っ
た。ＳＨ培地上での芽の再生に際し、培地１上で生長し
た組織は、ＭＳ培地上で生長した組織に比較し、６，８
倍の芽を再生したく第６表）。引き続き、一連のテスト
を行うことによりＬ−グルタミンは上記以外の濃度にお
いても、レタスの器官化した増殖性組織のための唯一の
窒素源として好適であることが確認できた。

レタス組織培養用の培地において、唯一の窒素源として
Ｌ−グルタミンを使用することについては、これまで全
く報告されていない。そのような培地は、器官化した増
殖性レタス組織の生長率を改善し、レタス組織の公知の
問題である褐変を軽減する。また、そのような培地は、
芽の再生数を増加させる。

本発明の他の実施例においては、実施例１および２に記
載したレタスの芽の再生法は、代替手法に置き換えて実
施される。

尖旌尉↓人 まず第１に、シュークロースおよびホルモンと共に１０
ｍＭのコハク酸塩を含有する６７％耶塩培地上において
、レタスの器官化した増殖性組織が象、速に成長し、該
組織は、培養中白色ないし緑色を保ち、褐変しないこと
を確認した。イングラ−およびグロガンは前記文献中に
おいて、レタスのプロトプラストからカルスを誘導する
ための培地中で、５ｍＭのコハク酸ナトリウムを使用し
たことを報告している。しかしながら、この場合、コハ
ク酸ナトリウムはカルス維持培地には添加されていない
。

実１■東本川 まず、レタスの適当な外植片を培地２Ａ上で約３週間培
養することにより、培地１上で形成するものとその形態
および再生能力において類似する、器官化増殖性組織を
形成した。ついで、該組織を培地２Ｂに移植して５週間
最適条件に維持し、最後に、培地２Ｃ上に移植し、維持
した。

培地１の場合と同様、この実施態様においても、カルス
ではなく、芽の分裂組織（ｓｈｏｏｔ　ｍｅｒｉｓｔｅ
ｍｓ）および表皮組織（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｔｉｓｓ
ｕｅ）からなる高度に器官化した組織（ｈｉｇｈｌｙ　
ｏｒｇａｎｉｚｅｄ　ｔｉｓｓｕｅ）が増殖した。最良
の結果は、次の場合に得られた。

（１）培地２　Ａ　：　　ｐｃＰＡ　５．３８μＮと共
に、シュークロース３％およびカイネチン２．３３μｇ
を含む６７％ＭＳ培地。（２）培地２　Ｂ　：　　ｐＣ
ＰＡ　２．６８μ門と共に、シュークロース３％および
６−ベンジルアデニン（ＢＡ）、４．４　ｔｔ　Ｍを含
有する６７％ＭＳ培地。（３）培地２　Ｃ：　ｐＣＰＡ
ｏ、５４μＨと共にシュークロース３％およびＢＡｏ、
８８μＮを含有する６７％ＭＳ培地（第２表および第３
表参照）。

培地２Ａ上で培養した組織から再生した芽は、培地１か
らのものと同等であった。再生数は、再方法とも同程度
であった（第５Ａ表および第６表参照）。

器官化増殖性組織のｇ導・維持のための代替培地が存在
することは、本発明を全ての遺伝子のものに適用する上
で重要である。なぜならば、特定のレタス品種の培養に
、いずれかの培地が最良の結果を与えることとなるから
である。従来のレタスの組織培養法は、レタスの通常の
品種の組織培養による増殖に広範に適用することは不可
能である。

実＆ さらに別の態様を実施した。本実施例においては、液状
の培地３（炭水化物３％含有ＳＨ培地）を用いて芽の再
生を行うことにより、前記固体培地を用いた場合と同様
の結果が得られた（第７表参照）。このような液体培地
中での芽の再生はこれまで全く報告されていない。また
、従来技術には、レタス再生システムをスケールアップ
する方法が存在していなかった。本願発明によれば、植
物細胞培養システムのように、液体培地を用いてレタス
の組織培養による増殖を、大規模にスケールアップする
ことができる。

尖施尉主用 つぎに、代替培地として培地４（組成については第２表
および第３表参照）を使用して芽の再生を行ったところ
、培地３と同等の結果が得られた（第７表）。

夫施拠主旦 最後に、実生個体の子葉、胚軸などの外植片に加え、開
放受粉した成熟レタスまたは成熟ハイブリッドレタスの
葉の外植片も、多数の植物体を再生し得る、器官化増殖
性組織の形成に適していることを確認した。第７表に、
葉の外植片の利用可能性を、培地１、培地２Ａ、ならび
に液体または固体の培地２を使用した場合について示す
。

葉の外植片を起源とする組織培養物からの芽の大量再生
については、これまで全く報告されていない。葉の外植
片からの再生が可能であることは、従来技術からの重要
な進歩である。なぜならば、雑種その他の植物が優れた
資質を有するか否かは、その植物が成熟してから初めて
判断できることであり、幼芽段階では不可能である。し
たがって、組織培養は、成熟した植物体から取得した組
織からスタートすべきである。

培地１　５．８Ｘ　　　白／緑　　　３６３±９８Ｍ５
　　３．３Ｘ　　　黄／褐色　　　５３＋２１（注１）
表示の数字は平均値上標準誤差（ｎ・５）である。

第ユニし一表− ５：葉の円板状外植片から器官化増殖性組織培養物を誘
導した。再生期間は２１日。

６：葉の円板状外植片から器官化増殖性組織培養物を誘
導した。再生期間は２１日。

再生に用いた培地は培地４゜ （注）１：平均上標準誤差。フラスコｎ−５；固体ｎ＝
５゜ ２ニゲリーンリーフは、オープン受粉タイプの葉レタス
である。葉の円板状外植 片から器官化増殖性組織培養物を誘導 した。再生期間は１５日。

３：ＬＣ−８はＦ１雑種植物である。葉の円板状外植片
から器官化増殖性組織培養物 を誘導した。再生期間は１５日。

４：ｎ＝１０ グリーンリーフ種のレタスの器官化増殖性組織から芽を
再生させた。その際第８表記載の方法のいずれかを用い
て組織をホモジナイズし、生成した単体弁の数を、ホモ
ジナイズしない場合と比較した。

（来貢以下余白） 芽□」し−表 一分散度）の差に基づくものであり、ブレンダーを用い
てホモジナイズすることにより、単体弁を最も高い率で
形成することができる（第８表）。

（注１） 接種組織１グラム当りの発芽総数の平均値。カッコ内は
、芽の総数に対する単体弁の割合（パーセント）を示す
。

三番目の数字は、接種組織１グラム当りの単体弁の平均
数を示す（ｎ＝１０）。

ホモジナイズ処理により、再生する芽の総数は減少した
が、ホモジナイズ処理した組織がらは、より多くの単体
弁が再生した。ふるいによりホモジナイズしたものと、
ブレンダーによりホモジナイズしたものとの間に見られ
る単体化率の差は、ふるいとブレンダーとの間のホモジ
ナイズ度（均ブレングーによるホモジナイズ化の程度は
、ブレードの回転速度および処理時間によって変化する
ので、ブレンダー処理の最適条件を定めるための実験を
行った。ブレンドしていない器官化増殖性組織を培地３
上で２１日間培養し、接種組織１グラム当りの単体弁形
成数を求めた。ついで、この再生した培養物を、ブレン
グー中で、種々の量の、シュークロース（３％）含有、
液体ＳＨ培地と共に、種々の期間ブレンドした。１回に
ブレンドする器官化増殖性組織の量は常に２５グラムと
した。ブレンド後、培養物を再び培地３上に植付け、２
１日間追加培養した。再び芽の数を数え、ブレンドしな
かったものに対する、単体弁の増加率を計算した（第９
表参照）。

３０〜４０秒間ブレンドした場合に、最大数の単体芽が
生成した。本実験は、実施例４で行った、芽が再生する
前の器官化増殖性（ｉ１１織のブレンドに加え、芽が再
生した後の組織をブレンドすることによっても、単体化
を効果的に行い得ることを示している。

この再生したレタスの芽の、ブレンダーまたは類イ以手
段による大量単体化は新規な手法であり、そのような苛
酷な処理は、幼植物体を破壊することも予測されること
から、決して自明ではない。

芽の再生前にカルスをホモジナイズするためにふるいを
使用することは当業者によく知られている。

しかしながら、ブレンダーを使用した場合には、ふるい
を用いた場合に比し、単体芽の割合が増加する。加えて
、再生後の器官形成性幼植物体の大量単体化は新規であ
り、低コストでの効率的生産および種子代替物としての
使用を可能とする。このような方法による芽の再生後の
単体化はこれまで全く報告されていないばかりでなく、
レタスに関する従来技術からは全く予測されないもので
ある。

実省ｌ矩戊 促進 再生したレタスの芽が視認可能となった時点以降も、そ
れら（芽）は中断することなく生長・拡大する。組織培
養クローニングに基づく大量生産システムにおいて、再
生芽を、その植付け・生産前の一定期間貯蔵することは
有用である。植付は用の芽は、均一でその大きさが３〜
５ｍｍである場合、常法による植付けに最も適する。

再生した芽の一時的生長抑制を行うためには、多量のシ
ュークロース（または他の炭水化物）を含む液体培地ま
たは寒天固化培地と、低ｍ（最適範囲：２〜１０℃）と
の組合せが最も有効であり、これにより、最長６ケ月程
度、芽を生育可能な状態に維持可能であることが見出さ
れた。この期間中、芽は極めてゆっくりとしか生長しな
いため、望ましいサイズを越えて大きくなり過ぎること
を防止することができる。植付は前の再生芽を、植付は
可能な特定サイズで貯蔵することは、従来波術にはない
、本発明による大量増殖法の重要な特徴である。

そのような貯蔵条件下から、生長可能条件下に移植され
た芽は、そのような貯蔵を行わなかった芽に比し、生長
率が大いに高まることが見出された。種々のシュークロ
ース濃度で貯蔵したグリーンリーフ種の芽の生長率を、
水耕栽培系にて比較テストしたく第１０表参照）。

（来夏以下余白） 第一」Ｌ−表 ８〇− ５０ｄ ００ｄ ０ｄ ４７５　χ ２７５　χ ７２５　χ ６００　χ ３６７　χ （注）いずれも、接種組織１グラム当りの平均単体弁数
を示す。各処理ともｎ＝１０ （来夏以下余白） 第１１Ｗ−表 （注） 数字は植物体の平均体長（ｃｍ）士標準誤差。カッコ内
の数字は、芽の植付は数（１処理１５個）に対する生存
率（％）を示す。

シュークロース７％を含むＳＨ培地上で貯蔵した芽が最
も高い生長率を示した。この場合の生長率は、種子から
の芽の生長率とほとんど同程度であった（栽培期間中の
平均植物体長に基づく）。

水耕栽培系で２８日間栽培後、比較的高いシュークロー
ス濃度で貯蔵した芽は、生存率および生長率の両者にお
いて、非貯蔵芽あるいはシュークロース濃度Ｏ〜１．５
％の条件で貯蔵された芽に比し、高い率を示した。長期
貯蔵およびその後の生長促進の観点から、通常、シュー
クロースを７％含有するＳｔ（培地（これを第４表に「
培地５」として掲載）を使用する。

この点も、組織培養によるレタスの生産に関する従来技
術からは自明でない、進歩である。野菜の商業的生産に
おいて、野菜が収穫可能な程度に成熟するのに要する期
間は、生産コストに直接影響する。それ故、組織培養に
よるレタスの生産に当り、それを速い速度で生長させる
方法を開発し、確立したことは重要である。

実１１浄比 再生芽は、貯蔵処理を経ることなく、試験管内条件から
、土壌または水耕栽培媒体に移植された場合、ゆっくり
としか生長しない。これは、根の生長速度が遅いことに
起因する。

ＩＢＡ、　ＩＡＡ等のホルモンが、植物の組織および器
官からの発根を促進することは、当業者に周知である。

レタスの再生芽の発根促進に０．０２〜４．９μＮのＩ
Ｂ＾が有効であることは既に報告されている（Ｍ、シビ
、Ａｎｎａｌｅｓ　Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ　ｄｅｓ
　ｐｌａｎｔｅｓ。

２６（４）、　ｐ、５２３〜５４７（１９７６）；　Ｋ
、ケバリーｅｔ　ａｌ。

Ｈｏｒｔｉｓｃｉｅｎｃｅ、　１３（４）、　Ｔ１．３
９−４１（１！１７８）；Ｉ］、Ａ、エバンス他編、「
植物細胞培養ハンドブック」の第４巻中の［第８章：レ
タス（Ｒ，Ｗ、ミラェルモアおよびＪ、＾、イーシュ著
）」、マクミラン出版社、ニューヨーク、１９８６年発
行、参照〕。本発明に関連して行われたテストにおいて
も、４．９μＭ　（１■１）のＩＢＭでの処理が、レタ
スの再生芽からの発根促進に有効であることが確認され
た（第１１表参照）。

発根促進のため、再生芽をＩＡＡまたＩＢ＾により処理
することは、従来技術により教示されるところであるが
、本発明の組織培養による植物生産を実施するに際し、
その１ステツプとしてＩＡＡまたはＩＢＭ処理を行うこ
とは、本発明の実施態様の１つである。後記実施例６Ｃ
に示されるように、このステップと、高いシュークロー
ス濃度での低温貯蔵処理とを組合せることにより、いず
れか一方のみを行った場合に比し、再生芽の生長率をさ
らに増大することができる。　ＩＡＡまたはＩＢＡ処理
と高シュークロース低温貯蔵との組合せは、従来技術か
らは予期されない全く新規なものであり、かつ、本願発
明の実用性を高めるものである。

（来夏以下余白） 最善の転換結果は、再生芽をＩＢＡ　１μ門とシューク
ロース２％または３％とを含む１００ＯＸハイボネツク
ス（Ｈｙｐｏｎｅｘ）液（「培地６」、第２表および第
３表参照）で３日間処理した時に達成された。

災施汎■且 他のテストにおいて、１０００　Ｘハイポネックス液を
２希釈ホアグランド（ｂＡｓｔｒｅｎｇｔｈ　Ｉｌｏａ
ｇｌａｎｄ’ｓ）液で置き換えると共に、シュークロー
スを除いた場合にも、有効に機能した（「培地７」、第
４表参照）。

実［ 本実施例では、Ｆ１ハイブリッドの芽を培地５の上で貯
蔵後、培地７で処理し、これを水耕システム中で栽培し
た後、温室内の土壌で栽培し、その生長を評価すること
により、培地５での貯蔵と培地７での処理の組合せによ
る効果を調べた。培地５で貯蔵し、かつ培地７で処理し
た芽が、植物体の体長および体重の両者において最も急
速な生長を示した。この場合、シュークロース含有培地
中での貯蔵、ＩＢＭでの前処理のいずれも行わなかった
植物体に比し、７０日間の期間内に植物体重が２４６％
の増を示した（第１２表参照）。

レタスの再生芽を完全植物体へ急速に変換・するための
この組合せ処理法は、これまで全く報告されていないも
のである。本発明の総合効率は、これら実施例で示され
るように、レタスの再生芽の、レタスの効率的大量増殖
への利用を初めて可能とするものである。

（来夏以下余白） 実４Ｉ津ル レタスのような作物の増殖システムにおいて、収穫作物
の均一性は極めて重要な一側面を構成する。この側面に
ついては、米国特許第４，０３８，７７８号には記載さ
れていないが、何人かの研究者は、カルスからの再生に
基づくレタス増殖システムにおける変動について報告し
ている〔Ｃ，ブラウンｅｔａ１．．　ｒ体細胞クローン
レタス（Ｌａｃｔｕｃａ　　５ａｔｉｖａ）の植物体お
よびその子孫の遺伝的変動の評価Ｉ　Ａｎｎ。

Ａｐｐｌ、　Ｂｉｏｌ、、１０９　　ｐ、３９１−４０
７（１９８６）　；Ｄ、Ｅ、イングラ−およびＲ，Ｇ、
グロガン、［プロトプラストから再生したレタス植物体
の変動ＪＪ、Ｈｅｒｅｄｉｔｙ＋　７５＋ｐ、４２６−
４３０（１９８４）；　ＲＪｌ、　　ミラェルモアおよ
びＪ、Ａ。

イーシュの前記文献；およびＮ、シビの前記文献参照〕
。

培地１上で維持したグリーンリーフ種の器官化増殖性組
織および培地２上で維持したグリーンリーフ種の器官化
増殖性組織から植物体を再生させた。この再生植物体を
温室土壌で栽培し、その均一性を評価した。

比較のため、グリーンリーフ種の種子を発芽させ、温室
中において栽培した。栽培は、芽を植物体に変換させた
時と同一の環境条件下において行い、再生植物体を温室
土壌に移植した時のサイズと同等になるまで行った。均
一性の評価は、若い植物体および成熟植物体の両者につ
いて評価するため、１グループについては３週間後、他
のグループについては７週間後に行った。評価は、植物
体長、葉の形および数、色、簡閲の長さ、収穫直後の植
物体頭部の重量、を含む項目について行った。

（来夏以下余白） 評価した１８５個の再生植物個体のうち、９８％が移植
に生き残った。３週間後に評価した植物個体の４％未満
、７週間後に評価した植物個体の６．２％未満のみが、
いずれかの項目で変動が認められた。種子からの植物個
体は、その１００％が均一であったが、上記再生植物個
体の均一性の高さも、工業生産に十分適するものである
。

従来技術によるレタスの組織培養では、再生植物個体の
変動が広く報告されているのに対し、本発明は、植物個
体の均一性において明らかに向上した結果を与える。従
来のレタスの組織培養法はいずれも、ここに開示した本
発明のように、表現型において正常なレタスを非常に高
い確立で再生することはできない。分裂性組織および表
皮組織からなる器官化増殖性組織を誘導し、これから多
数の芽を再生し、高い均一性の植物を得るとの本発明の
予測されない新規な効果は、従来技術に対する明らかな
進歩である。急速な組織の増殖のための培地、高い再生
効率芽の大量単体化法、貯蔵・成長促進法、広範な遺伝
子型への本発明の適用を可能とする方法、および選定し
た成熟植物の外植片からの培養を可能とする方法を含む
、本発明の種々の特徴は、いずれも新規であり、かつ従
来技術からは予期されないものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の１実施態様において実施される各ス
テップを図式的に説明したものである。 出願人　プラント・ジェネティックス・インク同　ＷＸ
麟麦酒株式会社 代理人　弁理士　平　木　祐　輔

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、外植片からクローンレタスを増殖する方法であって
   、 （ａ）レタスの外植片を、器官化増殖性組織（Ｏｒｇａ
   ｎｉｚｅｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｔｉｓｓｕ
   ｅ）を誘導する能力を有する誘導培地と、器官化増殖性
   組織を誘導するに充分な時間および条件下に接触させる
   ことにより、レタスの外植片から器官化増殖性組織を誘
   導し、 （ｂ）得られた器官化増殖性組織を、該組織の所望量を
   生産するに充分な時間および条件下に、誘導培地と接触
   させることにより、培養し、 （ｃ）得られた組織を、所望量の芽を生産するに充分な
   時間および条件下に、再生培地と接触させることにより
   、該組織から芽を再生させ、 （ｄ）得られた芽を、独立生長が可能な苗（ｐｌａｎｔ
   ｌｅｔｓ）を生産する充分な時間および条件下に培養す
   る、 各工程を含む方法。 ２、該誘導培地が、器官化増殖性組織を誘導するに十分
   な量の無機塩、窒素源、ビタミン、少なくとも１種の炭
   水化物、およびホルモンを含有する請求項１記載の方法
   。 ３、該誘導培地がフルクトース、シュークロースおよび
   マルトースからなる群から選択される少なくとも１つの
   炭水化物を含有する請求項２記載の方法。 ４、該誘導培地中の、ホルモンが少なくとも１種のオー
   キシンおよび少なくとも１種のサイトカイニンを含有す
   る請求項２記載の方法。 ５、少なくとも１つのオーキシンがインドール−３−酢
   酸、α−ナフタレン酢酸、２，６−ジクロロ−ｏ−アニ
   ス酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、２，４−ジフ
   ェノキシ酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸
   およびＰ−クロロフェノキシ酢酸からなる群から選択さ
   れる請求項４記載の方法。 ６、少なくとも１つのオーキシンがｐ−クロロフェノキ
   シ酢酸である請求項５記載の方法。 ７、該窒素源がＬ−グルタミンである請求項２記載の方
   法。 ８、該再生培地が、芽の再生を誘導するに十分な量の無
   機塩、ビタミン、窒素源、および少なくとも１種の炭水
   化物を含有する請求項１記載の方法。 ９、該再生培地が、フルクトース、シュークロースおよ
   びマルトースからなる群から選択される少なくとも１種
   の炭水化物を含有する請求項８記載の方法。 １０、工程（ｂ）の後、器官化増殖性組織を再生培地と
   接触させる前に、該器官化増殖性組織をホモジナイズす
   ることにより、芽の単体化（ｓｉｎｇｕｌａｔｉｏｎ）
   を促進する工程をさらに行う請求項１記載の方法。 １１、工程（ｃ）の後、独立して成長し得る苗を生産す
   るため、芽を培養する前に、該芽を単体化する工程をさ
   らに行う請求項１記載の方法。 １２、レタスの外植片が、成熟したレタスの若い生長中
   の葉（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　ｌｅａｖｅｓ）から得たも
   のである請求項１記載の方法。 １３、下記工程（ａ）および（ｂ）： （ａ）（ｉ）レタスの外植片を、器官化増殖性組織を誘
   導する能力を有する誘導培地と、器官化増殖性組織を誘
   導するに充分な時間および条件下に接触させることによ
   り、レタ スの外植片から器官化増殖性組織を誘導し、 （ｉｉ）得られた器官化増殖性組織を、該組織の所望量
   を生産するに充分な時間および条件下に、誘導培地と接
   触させることにより、培養し、 （ｉｉｉ）得られた組織を、所望量の芽を生産するに充
   分な時間および条件下に、再生培地と接触させることに
   より、該組織から芽を再生させることにより芽を生産す
   る工程、および （ｂ）芽を、温度２〜６℃で貯蔵培地（ｃｏｎｄｉｔｉ
   ｏｎｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ）と接触させることにより、
   芽の生長を遅延される工程、 を含むレタスの外植片から誘導した未成熟芽を貯蔵する
   方法。 １４、該貯蔵培地が、無機塩、ビタミン、および少なく
   とも１種の炭水化物を含有する請求項１３記載の方法。 １５、該炭水化物がシュークロースである請求項１３記
   載の方法。 １６、シュークロースの濃度が３〜２０重量％である請
   求項１５の方法。 １７、シュークロースの濃度が７重量％である請求項１
   ５の方法。 １８、下記工程（ａ）および（ｂ）： （ａ）（ｉ）レタスの外植片を、器官化増殖性組織を誘
   導する能力を有する誘導培地と、器官化増殖性組織を誘
   導するに充分な時間および条件下に接触させることによ
   り、レタスの外植片から器官化増殖性組織を誘導し、 （ｉｉ）得られた器官化増殖性組織を、該組織の所望量
   を生産するに充分な時間および条件下に、誘導培地と接
   触させることにより、培養し、 （ｉｉｉ）得られた組織を、所望量の芽を生産するに充
   分な時間および条件下に、再生培地と接触させることに
   より、該組織から芽を再生させることにより、芽を生産
   する工程、および （ｂ）芽を、コンバージョンを促進するに充分な時間、
   温度２〜６℃において貯蔵培地と接触させる工程 を含むことを特徴とする、芽が、独立して生長可能な苗
   へコンバージョンするのを促進する方法。 １９、該貯蔵培地が無機塩、ビタミン、および少なくと
   も１種の炭水化物を含有する請求項１８記載の方法。 ２０、該炭水化物がシュークロースである請求項１９記
   載の方法。 ２１、シュークロースの濃度が３〜２０重量％である請
   求項２０記載の方法。 ２２、シュークロースの濃度が７％である請求項２０の
   方法。 ２３、コンバージョンに充分な時間が１〜１２ヶ月であ
   る請求項２０記載の方法。 ２４、コンバージョンに充分な時間が１〜６ヶ月である
   請求項２０記載の方法。 ２５、外植片からクローンレタスを増殖する方法であっ
   て、 （ａ）レタスの外植片を、無機塩、窒素源、ビタミン、
   少なくとも１種の炭水化物、少なくとも１種のオーキシ
   ンおよび少なくとも１種のサイトカイニンを含有し、器
   官化増殖性組織を誘導する能力を有する誘導培地と、器
   官化増殖性組織を誘導するに充分な時間および条件下に
   接触させることにより、レタスの外植片から器官化増殖
   性組織を誘導し、 （ｂ）得られた器官化増殖性組織を、該組織の所望量を
   生産するに充分な時間および条件下に、無機塩、ビタミ
   ン、窒素源および少なくとも１種の炭水化物を含有する
   誘導培地と接触させることにより、培養し、 （ｃ）得られた組織をホモジナイズし、 （ｄ）ホモジナイズした組織を、所望量の芽を生産する
   に充分な時間および条件下に、無機塩、ビタミンおよび
   少なくとも１種の炭水化物を含有する再生培地と接触さ
   せることにより、該組織から芽を再生させ、 （ｅ）得られた芽を、温度２〜６℃において、その成熟
   を促進するに充分な条件下に、無機塩、ビタミンおよび
   シュークロースを含有する貯蔵培地と接触させることに
   より、芽の成熟化を促進し、 （ｆ）芽を、肥料および少なくとも１種のオーキシンを
   含有する発根培地と、発根に充分な時間および条件下に
   接触させることにより、該芽を発根させ、 （ｇ）発根芽を、独立して生長し得るレタスの苗を生産
   するに充分な時間および条件下に、肥料の水溶液を含む
   維持培地上で培養する 各工程を含む方法。 ２６、該誘導培地および該再生培地のうちの少なくとも
   一方の窒素源がＬ−グルタミンである請求項２５記載の
   方法。 ２７、外植片からクローンレタスを増殖する方法であっ
   て、 （ａ）レタスの外植片を、無機塩、窒素源、ビタミン、
   少なくとも１種の炭水化物、少なくとも１種のオーキシ
   ンおよび少なくとも１種のサイトカイニンを含有し、器
   官化増殖性組織を誘導する能力を有する誘導培地と、器
   官化増殖性組織を誘導するに充分な時間および条件下に
   接触させることにより、レタスの外植片から器官化増殖
   性組織を誘導し、 （ｂ）得られた器官化増殖性組織を、該組織の所望量を
   生産するに充分な時間および条件下に、無機塩、ビタミ
   ン、窒素源および少なくとも１種の炭水化物を含有する
   誘導培地と接触させることにより、培養し、 （ｃ）得られた組織をホモジナイズし、 （ｄ）ホモジナイズした組織を、所望量の芽を生産する
   に充分な時間および条件下に、無機塩、ビタミン、およ
   び少なくとも１種の炭水化物を含有する再生培地と接触
   させることにより、該組織から芽を再生させ、 （ｅ）芽を単体化し、 （ｆ）単体化した芽を、温度２〜６℃において、その成
   熟を促進するに充分な条件下に、無機塩、ビタミンおよ
   びシュークロースを含有する貯蔵培地と接触させること
   により、芽の成熟化を促進し、 （ｇ）芽を、肥料および少なくとも１種のオーキシンを
   含有する発根培地と、発根に充分な時間および条件下に
   接触させることにより、該芽を発根させ、 （ｈ）発根芽を、独立して生長し得るレタスの苗を生産
   するに充分な時間および条件下に、肥料の水溶液を含む
   維持培地上で培養する 各工程を含む方法。 ２８、該誘導培地および該再生培地の少なくとも一方の
   窒素源がＬ−グルタミンである請求項２７記載の方法。